CN115728101A - 一种生物组织透明膨胀方法和成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物组织透明膨胀方法和成像方法。所述生物组织透明膨胀方法包括:(1)对固定后的生物组织样品进行脱脂处理;(2)将脱脂后的生物组织样品浸泡在凝胶单体分子溶液中,使单体分子渗透入脱脂后的生物组织样品中;(3)诱发渗透入生物组织样品内的单体分子发生聚合反应形成聚合物凝胶;(4)将凝胶化处理后生物组织样品放入水中进行膨胀。根据本发明的生物组织透明膨胀方法避免了造成荧光淬灭和生物组织破坏的加热和酶消化的样品处理步骤,因此具有内源荧光蛋白保留率高、膨胀后的生物组织机械强度高、和样品处理时间短等优点,同时还通过改变单体试剂的成分实现了膨胀比例可调节的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物组织透明化处理技术领域,具体涉及一种生物组织透明膨胀方法和成像方法。
背景技术
使用荧光显微镜对多细胞生物组织中的细胞形态、蛋白分布、和基因表达进行亚微米到纳米级的高分辨率三维成像具有十分重要的意义。
然而,对生物组织进行高分辨率三维荧光成像十分困难。首先,由于大多数生物组织不透明,荧光显微镜通常只能对生物组织表面以下数十微米深度内的生物组织进行成像,因此无法满足对生物组织的整体进行三维成像的需求。其次,由于光学衍射极限的限制,传统荧光显微镜只能获得微米到亚微米级的空间分辨率,而能够获得纳米级超衍射极限分辨率的荧光显微镜往往只具有二维平面成像能力,或者仅能对数微米厚度的单细胞样品进行三维成像。因此,传统的荧光显微镜成像技术无法满足对大体积、多细胞生物组织进行亚微米级到纳米级的高空间分辨率的三维成像的需求。
基于水凝胶的生组织膨胀技术为生物组织的高分辨率三维成像提供了一种新的解决方案{Chen,2015}。基于水凝胶的生物组织膨胀技术的基本原理是将被成像的生物组织中的蛋白分子交联到由水凝胶分子所组成聚合物的框架结构上,然后通过将水凝胶聚合物的框架结构进行各向同性的膨胀来增大交联到聚合物框架上蛋白分子间的空间距离,其效果等同于增加了交联到聚合物上的蛋白分子所对应的生物组织三维结构的物理尺寸。同时,由于生物组织中的其他分子被去除并被水凝胶化学分子取代,生物组织在膨胀的同时也变的透明。因此,生物组织膨胀技术不但允许荧光显微镜对膨胀后的透明生物组织进行三维成像,也同时由于生物组织三维结构的膨胀而使得成像可以获得高于荧光显微镜本身光学分辨率的实际成像空间分辨率,从而极大的降低了使用荧光显微镜对多细胞生物组织进行的亚微米到纳米级高空间分辨率三维成像的难度。
最初的水凝胶的生物组织膨胀技术通过将生物组织蛋白分子与丙烯酰胺单体分子进行共价结合,并对丙烯酰胺单体分子进行凝胶聚合和膨胀来增加生物组织中标记荧光蛋白分子的空间距离,使得成像结果突破荧光显微镜~200纳米的光学空间分辨率,达到~50纳米的实际成像空间分辨率。此后,多个实验室通过使用不同的生物组织处理流程和凝胶单体分子的开发了更多的生物组织膨胀技术,例如ProExM{Tillberg,2016},MAP{Ku,2016},ExFISH{Chen,2016},iExM{Chang,2017},SHIELD{Park,2018},CUBIC-X{Murakami,2018}等技术。使用这些生物组织膨胀技术可以对不同类型的生物组织进行不同比例的膨胀,从而使科研人员可以利用传统的显微镜对多种生物组织进行从亚微米级到纳米级分辨率的三维荧光成像。
然而,已有的生物组织膨胀技术有一些共同的缺点。大部分已有的生物组织膨胀技术需要通过加热或是酶消化等蛋白质变性方法对生物组织进行处理,以保证凝胶后的生物组织可以进行各向同性的均匀膨胀。然而,这些蛋白质变性方法都极易造成对生物组织进行标记的内源荧光蛋白分子的破坏,导致荧光淬灭,使得对膨胀后生物组织的三维荧光成像变得极其困难。其次,已有的生物组织膨胀技术处理后的生物组织通常机械强度较低,导致膨胀后的生物组织极易被破坏,从而无法使用通常的荧光显微镜对膨胀后的生物样品进行成像,为膨胀后生物组织的三维成像制造了很多障碍。此外,多数生物组织膨胀技术只能对生物组织进行固定比例的膨胀,因此无法根据成像系统的成像能力和对成像分辨率的实际需求来调整样品的膨胀比例。最后,大部分已有的生物组织膨胀技术往往需要数周,甚至更久的时间才可以完成对生物组织的透明和膨胀。这些缺点都严重的限制了生物组织膨胀技术在生命科学中的应用。
因此,需要开发新的快速生物组织透明膨胀方法。
发明内容
已有的透明组织膨胀技术通常包括生物组织固定、单体溶液浸泡、凝胶包埋、蛋白质变性、组织膨胀和免疫荧光染色(可选)这几个环节。这样的处理流程具有一些显著的缺点。第一,固定后的新鲜生物组织结构致密,因此直接对固定后的生物组织进行凝胶单体分子渗透的效率很低,单体分子需要较长的时间才可以均匀渗透到生物组织内部。第二,在单体凝胶以后进行的蛋白质变性环节通常通过加热或是酶消化等方法来完成。这些蛋白质变性方法不但会对内源荧光蛋白造成严重的破坏,还会影响生物组织的机械强度,为膨胀后生物组织的三维成像制造了严重的障碍。同时,由于内源荧光的淬灭,对于传统方法膨胀处理后的样品必须再次进行荧光染色才可以对样品进行成像,从而极大的延长了样品处理的时间。
为了克服已有生物组织膨胀技术的上述缺点,本发明人开发了一种新型的快速生物组织透明膨胀方法(CMAP)。CMAP通过对生物组织依次进行固定、透明化、单体渗透、凝胶和膨胀的独特处理流程来实现生物组织的透明化和膨胀。在一些实施方式中,与已有的生物组织膨胀方法相比,CMAP避免了造成荧光淬灭和生物组织破坏的加热和酶消化的样品处理步骤,因此具有内源荧光蛋白保留率高、膨胀后的生物组织机械强度高、和样品处理时间短等优点。在一些实施方式中,该方法还通过改变单体试剂的成分实现了膨胀比例可调节的优点。
本发明中,所述生物组织可以是选自脑、脊髓、肺脏、肾脏、脾脏、心脏等的生物组织,所述生物组织样品可以是上述组织的整体或其一部分。所述生物可以是选自生物研究模式动物中的一种或多种。所述生物研究模式动物例如可以为线虫、斑马鱼、涡虫、果蝇、爪蟾、蝾螈、小鼠、兔、猪、猴等。或者,所述生物可以是脊椎动物,包括哺乳动物、爬行动物、鸟等。所述哺乳动物例如可以是人、鼠、兔、猪、猴等。
本发明提供了一种生物组织透明膨胀方法,所述方法包括如下步骤:
(1)生物组织样品脱脂:对固定后的生物组织样品进行脱脂处理;
(2)单体浸泡渗透:将脱脂后的生物组织样品浸泡在凝胶单体分子溶液中,使单体分子渗透入脱脂后的生物组织样品中;
(3)凝胶化:诱发渗透入生物组织样品内的单体分子发生聚合反应形成聚合物凝胶;
(4)膨胀:将凝胶化处理后生物组织样品放入水中进行膨胀。
在步骤(1)生物组织样品脱脂(有时也称为去脂)中,生物组织样品的固定没有特别限制,可以采用本领域中适用的固定方法。例如,可以使用多聚甲醛(例如4%的多聚甲醛溶液)对新鲜取材的生物组织样品进行固定。
在步骤(1)生物组织样品脱脂中,脱脂处理的方法没有特别限制,可以采用以CUBIC系列方法为代表的亲水型透明化方法中的脱脂处理方法,例如采用CUBIC-L去脂溶液,在CN202110879793.9中的脱脂试剂等进行脱脂处理,但不限于此。
在一些实施方式中,脱脂处理采用如下的脱脂试剂进行,所述脱脂试剂为一种水溶液,其中以质量百分浓度计,包含约5-15%的N-丁基二乙醇胺和约5-15%的曲拉通X-100。优选地,所述脱脂试剂中,N-丁基二乙醇胺和曲拉通X-100的重量比为约1:0.8~1.2,优选为约1:1。特别地,所述脱脂试剂为以质量百分浓度计,包含约10%的N-丁基二乙醇胺和约10%的曲拉通X-100的水溶液。在采用所述脱脂试剂的情况下,在具有高溶脂能力的同时,还可以保持内源荧光蛋白分子的稳定{Tainaka 2018}。
在一些实施方式中,脱脂处理可以在震荡条件下(例如在摇床上)进行。
在一些实施方式中,脱脂处理中,可以定期或不定期更换脱脂试剂。例如,可以每隔6小时、每隔12小时或每隔24小时更换脱脂试剂,但是本发明不限于此。
在脱脂处理中,脱脂试剂的单次用量没有特别限制,只要可以浸没生物组织样品即可。特别地,可以基于生物组织样品的体积决定具体用量,例如脱脂试剂的单次用量可以为样品体积的约5-25倍,优选为约10至20倍,特别为约15倍。
脱脂处理的时间可以为5分钟以上,1小时以上,1天以上等,但不限于此。具体脱脂处理的时间可以根据生物组织样品的体积、年龄,脱脂试剂的用量等而适当变化。例如,对于厚度200微米的小鼠脑片而言,可以在约10分钟实现脱脂;对于成年小鼠整脑和脊髓而言,可以在约5天实现脱脂。
在进行脱脂处理的同时可以实现脱色(血红素、黑色素等)。
经过脱脂处理后,生物组织样品体积会发生膨胀,例如膨胀约1.3-1.5倍,但不限于此。在脱脂处理后,生物组织变得透明。
经过脱脂处理的生物组织样品由于去除了大部分脂质分子,因此在下面的步骤(2)中,凝胶单体分子更容易渗透入经过脱脂处理的生物组织样品,与生物组织样品中的蛋白质分子发生交联。
在步骤(2)单体浸泡渗透中,将脱脂后的生物组织样品浸泡在凝胶单体分子溶液中,使单体分子渗透入脱脂后的生物组织样品中。
所述凝胶单体分子溶液包括凝胶单体、引发剂和溶剂,但不限于此。
所述凝胶单体没有特别限制,可以为以CLARITY为代表的水凝胶型透明化方法中采用的任何凝胶单体。
特别地,凝胶单体可以包括选自丙烯酰胺类单体、丙烯酸类单体等中的一种或多种亲水性单乙烯基单体和作为交联剂的一种或多种亲水性双乙烯基单体。所述丙烯酰胺类单体例如可以为丙烯酰胺(AA)、N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)、甲基丙烯酰胺、乙基丙烯酰胺、异丙基丙烯酰胺等,但不限于此。特别地,所述丙烯酰胺类单体可以是丙烯酰胺。所述丙烯酸类单体例如可以是丙烯酸、甲基丙烯酸、乙基丙烯酸、它们的碱金属盐(例如丙烯酸钠(SA))等,但不限于此。特别地,所述丙烯酸类单体可以是丙烯酸钠(SA)。所述亲水性双乙烯基单体可以是在分子中具有两个选自上述丙烯酰胺类单体、丙烯酸类单体中的单体结构的单体,例如可以为N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(BA)等,但不限于此。
在一个实施方式中,凝胶单体包括作为丙烯酰胺、丙烯酸钠和作为交联剂的N,N′-亚甲基双丙烯酰胺。
所述引发剂可以为热引发剂或者紫外引发剂。
所述热引发剂可以为在30-100℃下能够诱发凝胶单体分子的聚合反应的热引发剂。例如热引发剂可以为选自偶氮类引发剂(例如偶氮二异丁腈(AIBN)、偶氮二异庚腈);过氧类引发剂(例如过硫酸铵和过硫酸钾)等中的一种或多种,但不限于此。
所述紫外引发剂可以为在低温环境(例如4℃以下,例如在冰浴上)下使用紫外光照射后能够诱发凝胶单体的聚合反应的紫外引发剂。例如紫外引发剂可以为选自偶氮类引发剂,例如偶氮二异丁基脒盐酸盐(AIBA)、偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐(AIBI,VA-044)、偶氮二氰基戊酸(简称ACVA,V-501)、偶氮二异丙基咪唑啉(AIP,VA-061引发剂);芳香碳酰类引发剂,如苯乙酮类引发剂;轻烷基酮类引发剂等中的一种或多种,但不限于此。
所述溶剂可以为PBS溶液,例如约0.01M PBS溶液。
在一个实施方式中,以质量(g)/体积(ml)浓度计,凝胶单体分子溶液包含约30%的丙烯酰胺,约0.1%的N,N′-亚甲基双丙烯酰胺,约10%的丙烯酸钠和约0.5%的偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐,溶剂为约0.01M PBS溶液。
在单体浸泡渗透处理中,可以基于生物组织样品的体积决定凝胶单体分子溶液的具体用量,例如凝胶单体分子溶液的用量可以为样品体积的约5-20倍,优选为约8-15倍,特别为约10倍。
单体浸泡渗透处理的时间可以为5分钟以上,1小时以上,1天以上等,但不限于此。具体单体浸泡渗透处理的时间可以根据生物组织的体积、年龄,凝胶单体分子溶液的浓度和用量等而适当变化。例如,对于厚度200微米的小鼠脑片而言,可以浸泡约10分钟;对于成年小鼠整脑和脊髓而言,可以浸泡约2天。
经过单体浸泡渗透处理浸泡后,生物组织膨胀倍数会有所缩小,甚至恢复至原初大小,重新变得不透明。
同时,通过使用不同化学成分的单体试剂,最终可以获得不同膨胀倍数和机械强度的水凝胶聚合物。例如实验结果表明,在采用丙烯酰胺(AA)、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(BA)和丙烯酸钠(SA)的凝胶单体体系中,调整凝胶单体中AA、SA的比例可以改变生物组织的膨胀倍数,调整BA的比例可以改变膨胀后生物组织的机械强度。在一定范围内,膨胀生物组织的膨胀比例随AA或SA浓度的增加而增大,其机械强度随着BA浓度增加而增强。
在步骤(3)凝胶化中,通过诱发渗透入生物组织内的单体分子发生聚合反应形成聚合物凝胶。
对于诱发单体分子发生聚合反应的方式不限,只要能够产生适合的凝胶即可。例如可以通过加热引发聚合或者通过用紫外光照射引发聚合。通过发生聚合反应,可以形成结构和强度均匀的聚合物凝胶。
在一些实施方式中,可以采取恒温加热引发聚合产生凝胶。此时,可以将单体浸泡渗透处理后的生物组织样品置于30-100℃的恒温环境中,诱发单体分子的聚合反应,得到结构和强度均匀的聚合物凝胶。
在另一些实施方式中,可以通过用紫外光照射引发聚合。此时,可以将单体浸泡渗透处理后的生物组织样品使用紫外光照射,诱发单体分子的聚合反应,形成结构和强度均匀的聚合物凝胶。特别地,用紫外光照射引发聚合可以在低温环境中,例如4℃以下,例如在冰浴上进行。在低温环境下使用紫外光诱发单体聚合反应,不但速度快于上述恒温加热引发聚合产生凝胶的方法,而且避免了凝胶过程中所产生的高温对生物组织中内源荧光蛋白的破坏,从而更快速并更好保护内源荧光蛋白。例如,对于经过相同单体浸泡处理过的鼠脑,使用恒温加热法需要2小时才可以完成聚合反应,而使用紫外光诱发聚合方式,仅需要1分钟就可以完成聚合反应。
步骤(3)凝胶化还可以包括包埋步骤。生物组织样品的包埋可以与凝胶化同时完成,即一次性加入凝胶单体分子溶液直至完全覆盖生物组织样品,然后引发聚合形成凝胶,完成包埋。
或者包埋可以分步完成,此时也可以称为分层式生物组织凝胶包埋法。所述分层式生物组织凝胶包埋法包括以下步骤:(1)制备底层凝胶:将少量凝胶单体分子溶液注入容器中覆盖容器底部,引发聚合生成底层凝胶;(2)然后将经过单体浸泡渗透处理的生物组织样品放置于容器中的底层凝胶上,并向容器中注入凝胶单体分子溶液,直至完全覆盖生物组织样品;(3)引发聚合形成凝胶,完成包埋。通过分步完成凝胶包埋,在完成生物组织凝胶的同时将生物组织包埋入成分相同的凝胶中,以便于使用荧光显微镜对获得的膨胀生物组织样品的进行三维成像。
图2显示根据一个实施方式的分层式生物组织凝胶包埋法,其中①准备凝胶容器;②将凝胶容器的底部用纳米胶带密封;③将少量凝胶单体分子溶液注入容器中覆盖容器底部,用紫外光照射引发聚合生成底层凝胶;④将经过单体浸泡渗透处理的生物组织样品放置于容器中的底层凝胶上;⑤向容器中注入凝胶单体分子溶液,直至完全覆盖生物组织样品;⑥用盖玻片将凝胶容器的上部盖上;⑦用紫外光照射引发聚合;⑧形成凝胶;⑨取出完成凝胶包埋的生物组织。
由于生物组织样品已经经过脱脂处理,因此,根据本发明的方法在生物组织样品完成凝胶包埋以后无须再对生物组织样品进行蛋白质变性处理,从而进一步保护了生物组织样品中的内源荧光蛋白。
在步骤(4)膨胀中,将凝胶包埋后生物组织样品放入水中进行膨胀。凝胶中的阴离子间产生的静电排斥力使得凝胶发生各向同性的膨胀,最终得到折射率均匀、透明、膨胀,且具有一定机械强度的水凝胶蛋白分子复合物。
在一些实施方式中,膨胀处理可以在震荡条件下(例如在摇床上)进行。
在一些实施方式中,膨胀处理中,可以定期或不定期更换水。例如,可以每隔6小时、每隔12小时或每隔24小时更换水,但是本发明不限于此。
在膨胀处理中,水的单次用量没有特别限制,只要可以浸没凝胶样品即可。特别地,可以基于凝胶样品的体积决定具体用量,例如水的单次用量可以为凝胶样品的约10至1000倍,优选约100至500倍,特别是约200倍。
对膨胀处理的时间没有特别限制,直到实现生物组织样品的充分膨胀,最终获得折射率接近水的生物组织样品即可。一般而言,膨胀处理的时间可以为30分钟以上,1小时以上,2小时以上等,但不限于此。对于膨胀处理的时间的上限没有限制,但是过长的时间会增加时间和设备成本,一般而言,可以为5天以下,4天以下,3天以下,48小时以下等。具体脱脂处理的时间可以根据生物组织样品的体积、年龄,水的用量等而适当变化。例如,对于厚度200微米的小鼠脑片而言,可以在约120分钟实现完全膨胀;对于成年小鼠整脑和脊髓而言,可以在约2天实现完全膨胀。
根据本发明的生物组织透明膨胀方法既适用于内源荧光蛋白标记的生物组织,也适用于免疫荧光标记的生物组织。
因此,在一些实施方式中,根据本发明的生物组织透明膨胀方法还包括,在步骤(1)生物组织样品脱脂后,进行荧光染色的步骤。
进行荧光染色的方法没有特别限制,可以采用本领域中任何适合的免疫荧光染色或者其他染色方法对生物组织进行荧光标记。因此,对于需要进行免疫荧光标记的生物组织,可以在生物组织完成透明化后按照进行相应的生物组织免疫荧光标记流程对生物组织进行荧光标记。例如,可以在生物组织样品完成脱脂处理以后使用碘化丙啶(PI,sigma-P4170-25MG)对生物组织样品中的细胞核进行标记。
图1是使用根据本发明方法的制备透明膨大的小鼠全脑(A)和全脊髓(B)样品的流程示意图,其中主要包括以下步骤:(1)生物组织样品取材;(2)用约4%的多聚甲醛溶液进行固定;(3)对生物组织样品进行脱脂(脱色)处理;(4)可选地对生物组织样品进行染色处理;(5)对生物组织样品进行单体浸泡渗透处理;(6)对生物组织样品进行凝胶化处理,例如将容器置于冰上用紫外光照射,可选地同时进行包埋;(7)将经过凝胶化处理的生物组织样品在去离子水中膨胀。
本发明再一方面提供一种生物组织样品的成像方法,所述方法包括:
用根据本发明的生物组织透明膨胀方法对生物组织样品进行处理;
对处理后的生物组织样品进行成像。
对于成像没有特别限制,可以使用任何合适的成像系统按照相应的成像流程进行。例如将生物组织样品固定于成像显微镜的样品架上进行。
在上文中已经详细地描述了本发明,但是上述实施方式本质上仅是例示性,且并不欲限制本发明。此外,本文并不受前述现有技术或发明内容或以下实施例中所描述的任何理论的限制。
在本文中,所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征或条件仅是为了简洁及方便。据此,数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值。
在本文中,在可实现发明目的的前提下,数值应理解成具有该数值有效位数的精确度。举例来说,数字40.0则应理解成涵盖从39.50至40.49的范围。除了在详细描述最后提供的工作实施例之外,本申请文件(包括所附权利要求)中的参数(例如,数量或条件)的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“大约”修饰,不管“大约”是否实际出现在该数值之前。“大约”表示所述的数值允许稍微不精确(在该值上有一些接近精确;大约或合理地接近该值;近似)。如果“大约”提供的不精确性在本领域中没有以这个普通含义来理解,则本文所用的“大约”至少表示可以通过测量和使用这些参数的普通方法产生的变化。例如,“大约”可以包括小于或等于10%,小于或等于5%,小于或等于4%,小于或等于3%,小于或等于2%,小于或等于1%或者小于或等于0.5%的变化,并且在某些方面,小于或等于0.1%的变化。
以上描述旨在是说明性的而不是限制性的。例如,上述实施方式(或其一个或更多特征)可以彼此组合使用。例如本领域普通技术人员在阅读上述描述时可以使用其它实施方式。另外,在上述具体实施方式中,各种特征可以被分组在一起以简化本公开。这不应解释为一种不要求保护的公开的特征对于任一权利要求是必要的意图。相反,本公开的主题可以少于特定的公开的实施方式的全部特征。从而,权利要求书作为示例或实施例在此并入具体实施方式中,其中每个权利要求独立地作为单独的实施例,并且考虑这些实施例可以以各种组合或排列彼此组合。本公开的范围应参照所附权利要求以及这些权利要求赋权的等同形式的全部范围来确定。
有益效果
根据本发明的生物组织透明膨胀方法通过对生物组织样品的固定、透明化、染色(可选)、单体溶液浸泡、凝胶包埋和膨胀这一独特的样品处理流程来获得折射率均匀的透明膨胀生物组织,并且克服已有方法的缺点。根据本发明的生物组织透明膨胀方法对生物组织处理的流程和流程中各环节的功能如下参见图1,其中A和B分别是对小鼠全脑和全脊髓进行处理的流程。
与已有的生物组织膨胀技术不同,根据本发明的生物组织透明膨胀方法在对生物组织进行单体渗透前先进行透明化处理,因此避免了其他膨胀技术中生物组织在单体渗透后所需进行的加热、洗涤剂处理、或是酶消化等蛋白质变性操作,从而有效的保护了生物组织的内源性荧光蛋白。同时,在单体渗透以后,根据本发明的生物组织透明膨胀方法通过使用紫外光对置于低温环境中的生物组织进行照射的方式引发单体分子的凝胶聚合反应,从而进一步避免了其他膨胀技术中使用高温诱发凝胶反应时高温对内源荧光蛋白的破坏。因此,和已有的生物组织膨胀技术相比,根据本发明的生物组织透明膨胀方法具有内源荧光蛋白保留率高、样品处理时间短、膨胀后的生物组织机械强度高等优点。此外,根据本发明的生物组织透明膨胀方法还可以通过调节凝胶单体溶液的成分对生物组织的膨胀倍数进行调节。根据本发明的生物组织透明膨胀方法的这些优点为使用荧光显微镜对大体积、多细胞生物组织进行的亚微米到纳米级的空间分辨率三维成像的提供了极大的便利。
附图说明
图1是使用根据本发明方法的制备透明膨大的小鼠全脑(A)和全脊髓(B)样品的流程示意图。
图2是使用根据本发明方法的分层式生物组织凝胶包埋法流程示意图。
图3显示根据本发明方法的实施例1中对小鼠全脑进行透明膨胀处理的流程和小鼠全脑在处理中各环节的形态,标尺:5mm。
图4显示根据本发明方法的实施例2中对小鼠脊髓进行透明膨胀处理的流程和小鼠脊髓在处理中各环节的形态,标尺:5mm。
图5显示根据本发明的CMAP和根据现有技术的MAP两方法对小鼠组织的内源荧光蛋白保留效果的比较,标尺:5mm。
图6显示结合不同凝胶单体溶液的CMAP对成年Thy1-eGFP小鼠全脑进行透明膨大处理中各环节的形态,标尺:5mm。
图7显示膨胀的Thy1-eGFP小鼠大脑海马体区域的三维成像结果,其中(A)膨胀后Thy1-eGFP小鼠大脑海马体9×11×5mm3区域的三维成像结果;(B)A中所示成像区域的轴向投影;(C,D)A中标记的两个2×2×5mm3区域的三维成像结果;(E-G)图C中所示XY横向截面的截面图;(H-J)图D中所示XY横向截面的截面图;(K,L)图C和D中所示的XZ轴向截面的截面图;(M-P)图E-G和K中选定区域的放大图;(Q-T)图H-J和L中选定区域的放大图。标尺:1mm(A),200μm(E,K),50μm(M)。
图8显示膨胀的小鼠脊髓局部区域的三维成像结果,其中A显示膨胀后小鼠脊髓9×8×3mm3区域的三维成像结果;B显示A中所示截面的截面图;C-F显示B中所示区域中的局部放大图。
具体实施方式
以下,为了更好地理解本发明而提供下列实施例。然而,提供以下的实施例仅用于更容易地理解本发明,且本发明的范围并不限于此。此外,本文并不受前述现有技术或发明内容或以下实施例中所描述的任何理论的限制。实施例中所采用的方法、试剂和条件,除非另有说明,否则为本领域常规的方法、试剂和条件。
材料与方法
1.材料
氯化钠(NaCl,Sangon Biotech-A610476),氯化钾(KCl,Sangon Biotech-A100395),磷酸二氢钾(KH2PO4,Sangon Biotech-A100781),十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O,Sangon Biotech-A607793-0500),浓盐酸(HCl,国药-10011008),戊巴比妥钠(Pentobarbital sodium),肝素钠(Heparin sodium,Sangon Biotech-A603251),氢氧化钠(NaOH,国药-10019718),多聚甲醛(Paraformaldehyde,PFA,sigma-1058357),曲拉通(Triton X-100,Sangon Biotech-A110694-9001),N-丁基二乙醇胺(N-butyldiethanolamine,TCI-B0725-500ML),丙烯酰胺(Acrylamide,AA,Sangon Biotech-A100341-0500),N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(Bis Acrylamide,BA,Sigma-274135-100ML),丙烯酸钠(Sodium acrylate,SA,MACKLIN-S833838-100G),偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐(2,2'-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]dihydrochloride,VA-044,HAWN-R008695),十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS,sigma-V9008590),三(羟甲基)氨基甲烷(Tris,sigma-50046)。
2.配制试剂
1.0.01M PBS
将8克氯化钠(NaCl)、0.2克氯化钾(KCl)、1.44克Na2HPO4和0.24克KH2PO4溶于900毫升双蒸馏水(dd H2O)中,调节pH至7.4,定容到1升。然后高压蒸汽灭菌,室温保存。
2.4%多聚甲醛(S1)
将40克多聚甲醛(PFA)加入900毫升0.01M PBS中,边搅拌边加入少量氢氧化钠促进PFA溶解,待PFA完全溶解后,通过滴加浓盐酸调节pH至7.4,并加入0.01M PBS定容到1升。4%PFA可在4℃保存1个月,建议使用前新鲜配制。
3.脱脂试剂(Clearing solution,CS)
将100克N-丁基二乙醇胺和100克曲拉通溶入800克dd H2O中。室温搅拌使溶质完全溶解后进行消泡处理。配置好的试剂可以在20℃保存1个月。
4.凝胶单体溶液(Monomer solution,MS)。
将30克丙烯酰胺、0.1克N,N′-亚甲基双丙烯酰胺、10克丙烯酸钠和0.5克偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐加入90毫升的0.01M PBS中,冰水中超声使溶质完全溶解。之后滴加0.01MPBS定容到100毫升。然后,使用离心机1000rpm离心5分钟,保留上清溶液并4℃保存。
5.MAP相关试剂参考{Ku,2016}配制。
MAP灌流试剂一:将4克丙烯酰胺、0.05克N,N′-亚甲基双丙烯酰胺、0.8克丙烯酸钠加入装有90毫升的0.01M PBS中,冰上搅拌使其完全溶解,滴加0.01M PBS定容到100毫升。然后1000rpm离心3分钟保留透明的上清溶液,避光保存于4℃,现配现用。
MAP灌流溶液二:将30克丙烯酰胺、0.1克N,N′-亚甲基双丙烯酰胺、10克丙烯酸钠、0.1克偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐和4克多聚甲醛加入装有90毫升的0.01M PBS中,冰上搅拌使其完全溶解,滴加0.01M PBS定容到100毫升。然后1000rpm离心3分钟保留透明的上清溶液,避光保存于4℃,现配现用。
MAP组织变性试剂:将57.7克十二烷基磺酸钠、11.7克氯化钠、6.1克三(羟甲基)氨基甲烷加入装有900毫升的ddH2O中,加热搅拌(30℃)使其完全溶解,浓盐酸调节PH到9.0,然后滴加ddH2O定容到1升。室温保存。
实施例1成年小鼠全脑的透明膨胀处理
以内源荧光蛋白标记的Thy1-eGFP成年小鼠全脑的透明膨胀处理为例,对使用根据本发明的生物组织透明膨胀方法(CMAP)进行生物组织透明膨胀处理的流程和具体操作方法做进一步详细说明。
如图3流程所示对小鼠全脑进行透明膨胀处理,同时显示了小鼠全脑在处理中各环节的形态,标尺:5mm。
1.小鼠全脑取材并固定(1.5天)
a.2%戊巴比妥钠(150mg/kg)腹腔注射深度麻醉小鼠(雄鼠,3月龄)。
b.依次用10ml含10U/ml肝素钠的预冷0.01M PBS(pH7.4)和25ml预冷的S1对小鼠进行心脏灌流。
c.解剖获得小鼠全脑,将其浸入装有40毫升S1的离心管中,置于4℃摇床18小时进行固定处理。
d.第二天使用0.01M PBS清洗样品三次,每次两小时,彻底去除残留的S1,获得固定的样品。
2.小鼠全脑脱脂(脱色)处理(5天)
固定后的小鼠全脑浸入装有40毫升脱脂试剂CS的容器中,置于37℃摇床进行脱脂脱色处理。每2天更换一次新鲜脱脂试剂CS,直到小鼠整脑完全透明。经脱脂处理的小鼠全脑均匀透明,同时透明后样品每一个方向的尺寸膨胀至原始尺寸的1.5倍左右。
3.免疫荧光染色(1天)
使用PI(sigma-P4170-25MG)对鼠脑中的细胞核进行标记。在小鼠全脑透明试剂CS中加入PI水溶液(终浓度为10微克/毫升)进行37℃染色1天。该步骤可以与脱脂步骤同时进行,在脱脂最后一天,脱脂试剂中直接加入染料;或者也可以在脱脂后单独进行。
4.单体溶液浸泡(2天)
将完成脱脂和染色后的小鼠全脑浸入装有15毫升凝胶单体溶液的离心管中,置于4℃摇床浸泡2天,使单体溶液充分进入鼠脑组织内。经过单体溶液浸泡后,鼠脑恢复至原初大小,重新变得不透明。
5.凝胶(不包埋)(10分钟)
a.将经过单体浸泡的样品置于60mm培养皿上,并将培养皿置于冰上。
b.使用紫外光(5w)持续照射样品1分钟左右,诱发渗入小鼠脑内的单体分子发生凝胶反应。
6.膨胀(2天)
将经过凝胶的鼠脑放入盛有足量的去离子水(pH 9.5)的容器中。将容器置于20℃摇床使鼠脑均匀膨胀。期间每12小时更换一次新鲜的去离子水(pH 9.5),直至鼠脑充分膨胀。此步骤后得到折射率接近水的透明、膨胀、具有良好的机械强度的鼠脑。
实施例2.成年小鼠脊髓的透明膨胀处理
以内源荧光蛋白标记的Thy1-eGFP成年小鼠脊髓的透明膨胀处理为例,对使用根据本发明的生物组织透明膨胀方法(CMAP)进行生物组织透明膨胀处理的流程和具体操作方法做进一步详细说明。
如图4流程所示对成年小鼠脊髓进行透明膨胀处理,同时显示了小鼠脊髓在处理中各环节的形态,标尺:5mm。
1.小鼠脊髓的取材和固定(1.5天)
a.2%戊巴比妥钠(150mg/kg)腹腔注射深度麻醉小鼠(雄鼠,3月龄)。
b.使用10ml含10U/ml肝素钠的预冷PBS(pH7.4)和25ml预冷的4%多聚甲醛(pH7.4)依次对小鼠进行心脏灌流。
c.解剖获得小鼠脊髓,将其固定于POM聚甲醛孔板和100目尼龙网之间(保证后固定时脊髓不会弯曲且PFA能够充分接触样品),并浸泡于装有40毫升S1的离心管中,置于4℃摇床18小时进行固定处理。
d.第二天使用0.01M PBS清洗样品三次,每次两小时,彻底去除残留的S1,获得固定的样品。
2.小鼠脊髓脱脂(脱色)处理(5天)
a.将样品浸入装有40毫升脱脂试剂CS的离心管中,置于37℃摇床进行脱脂脱色处理。每2天更换一次新鲜CS试剂,直到小鼠脊髓完全透明。经脱脂处理的小鼠脊髓均匀透明,同时透明后样品每一个方向的尺寸膨胀至原始尺寸的1.5倍左右。
3.免疫荧光染色
使用PI(sigma-P4170-25MG)对鼠脑中的细胞核进行标记。在小鼠全脑脱脂试剂CS中加入PI水溶液(终浓度为10微克/毫升)进行37℃染色1天。该步骤可以与脱脂步骤同时进行,在脱脂最后一天,脱脂试剂中直接加入染料;或者也可以在脱脂后单独进行。
4.凝胶单体溶液浸泡(2天)
将完成脱脂和染色后的小鼠脊髓浸入装有凝胶单体溶液的容器中。将容器置于4℃摇床浸泡2天,使单体溶液充分进入脊髓组织内。经凝胶单体溶液浸泡后的小鼠脊髓恢复至原初大小,同时变得不透明。
5.凝胶和包埋(20分钟)
使用与小鼠脊髓体积形状相匹配的模具对经过单体浸泡的小鼠脊髓进行分层式凝胶和包埋。
加入适量的凝胶单体溶液MS覆盖模具底部1-2毫米深度。使用紫外光(5W)照射30秒,诱发凝胶单体分子发生聚合反应,形成粘稠但不完全凝固的凝胶层。
将上述步骤4浸泡后的小鼠脊髓平整放置于模具中半凝固的凝胶层上,然后加入足量的凝胶单体溶液MS直至覆盖小鼠脊髓并充满整个模具。静置去除凝胶溶液中的气泡。
使用一片盖玻片覆盖模具上表面,并保证盖玻片与模具中的单体溶液间没有空气间隙。
将凝胶模具置于冰上,使用紫外光(5W)持续照射模具中的脊髓样品和单体溶液1分钟左右,诱发凝胶单体分子发生聚合反应,完成脊髓的凝胶和包埋。
6.膨胀。
将完成凝胶包埋的小鼠脊髓从模具中剥离,并放入盛有足量的去离子水(pH 9.5)的容器中。将容器置于20℃摇床,使小鼠脊髓均匀膨胀。期间每12小时更换一次新鲜的去离子水(pH 9.5),直至小鼠脊髓充分膨胀。最终获得折射率接近水的透明、膨胀、具有良好的机械强度的小鼠脊髓。
对比例1成年小鼠全脑的透明膨胀处理
使用Thy1-eGFP成年小鼠全脑按照文献{Ku,2016}所介绍的流程(MAP法)进行处理,具体如下。
MAP处理成年小鼠全脑的流程如下:
1.小鼠全脑取材、固定和凝胶包埋
a.将成年小鼠(雄鼠,3月龄)进行戊巴比妥钠深度麻醉(150mg/kg)。
b.用10ml预冷的MAP灌流试剂一和25ml预冷的MAP灌流试剂二,以10ml/min的速度依次对小鼠进行心脏灌流。
c.解剖小鼠全脑,并放入盛有20mlMAP灌流试剂二的离心管中。
d.将离心管放置于4℃摇床孵育2天,之后在室温摇床孵育24小时,确保整个样品中均匀的化学扩散和反应。
e.用Easy-Gel(LifeCanvas Technologies,组织凝胶杂交系统)将组织在氮气中45℃孵育2小时,形成凝胶。
2.组织变性
a.将凝胶包埋后的组织放入装有50ml MAP组织变性试剂的离心管中,37℃摇床孵育过夜。
b.转移样品到EasyClear(LifeCanvas Technologies)中,70℃孵育2天,95℃孵育1天。
3.膨大
将变性的组织放入100ml去离子水中,室温下摇床孵育48小时,每3–5小时更换一次去离子水。
对比例2成年小鼠脊髓的透明膨胀处理
使用Thy1-eGFP成年小鼠脊髓按照文献{Ku,2016}所介绍的流程(MAP法)进行处理,具体如下。
MAP处理成年小鼠脊髓的流程如下:
1.小鼠脊髓取材、固定和凝胶包埋。
a.将成年小鼠(雄鼠,3月龄)进行戊巴比妥钠深度麻醉(150mg/kg)。
b.用10ml预冷的MAP灌流试剂一和25ml预冷的MAP灌流试剂二(4%PFA,30%AA,0.05%BA,5%SA,和0.1%VA-044.),以10ml/min的速度依次对小鼠进行心脏灌流。
c.解剖小鼠全脊髓,并放入盛有20mlMAP灌流试剂二的离心管中。
d.将离心管放置于4℃摇床,固定48小时,得到固定的小鼠全脊髓样品,确保整个样品中均匀的化学扩散和反应。
e.用Easy-Gel(LifeCanvas Technologies,组织凝胶杂交系统)将组织在氮气中50℃孵育2小时,形成凝胶。
2.组织变性
a.将水凝胶包埋后的组织放入装有50ml MAP组织变性试剂的离心管中,70℃孵育24小时,95℃孵育12小时。
3.膨大
将变性组织放入100ml去离子水中,室温摇床孵育36小时,每3–5小时更换一次去离子水。
实施例3-6成年小鼠肺脏、肾脏、脾脏、心脏的透明膨胀处理
使用B6-zsGreen小鼠,按照与实施例1相同的方法对成年小鼠肺脏、肾脏、脾脏、心脏进行透明膨胀处理。
对比例3-6成年小鼠肺脏、肾脏、脾脏、心脏的透明膨胀处理
使用B6-zsGreen小鼠,按照与对比例1相同的方法对成年小鼠肺脏、肾脏、脾脏、心脏进行透明膨胀处理。
对根据本发明的CMAP方法的实施例1-6和根据文献{Ku,2016}的MAP法的对比例1-6所处理的生物组织各环节的形态进行拍照和荧光成像,结果见图5。
拍照如下进行:使用Zeiss荧光体视显微镜(Axio Zoom.V16),明场拍摄,选择曝光强度为150ms。
荧光成像如下进行:使用Zeiss荧光体视显微镜(Axio Zoom.V16),荧光拍摄,曝光强度,膨胀前所有组织器官均为100ms,膨胀后的全脑和脊髓选用3s,膨胀后的肺脏、肾脏、脾脏、心脏选用100ms。
图5显示使用根据本发明的CMAP和根据文献{Ku,2016}的MAP两方法处理不同组织的各步骤中组织的形态和荧光强度变化过程,以比较这两种透明膨胀方法对内源荧光蛋白的保留程度。
实验结果表明,CMAP处理获得的终样品较好得保留了内源荧光蛋白,而MAP处理获得的终样品的内源荧光蛋白基本淬灭。因此,CMAP对生物组织内源荧光蛋白的保留程度极大优于另外一种使用相似凝胶单体分子的组织膨胀方法MAP。
实施例7不同凝胶单体溶液对透明膨胀处理的影响
除了按照下表1中的质量体积比(m/v)以外,按照上述凝胶单体溶液(MS)的配制方法配制不同的凝胶单体溶液1-6。
膨胀倍数如下测量:利用ImageJ软件对明场拍摄获得的小鼠全脑进行面积测量,膨胀前的全脑(多聚甲醛固定后的小鼠全脑)面积为A,膨胀后的全脑(经水膨胀后的小鼠全脑)面积为B,膨胀倍数(ER)=Sqar(A/B)。
机械强度按照如下标准进行测量:在1cm2的面积上施加约20gf的压力,观察样品的形变。
强:产生轻微的弹性形变。
中:产生相对较大的弹性形变,但是在压力取消后样品形状复原。
弱:产生塑形形变,在压力取消后样品不恢复原始形状。
除了使用所配制的单体溶液1-6以外,按照与实施例1相同的方法对Thy1-eGFP成年小鼠全脑进行CMAP透明膨胀处理,并观察所获得的膨胀小鼠全脑的特性,结果见表1和图6。
表1.使用不同凝胶单体溶液获得不同膨胀倍数。
单体溶液 | AA(m/v) | BA(m/v) | SA(m/v) | VA-044(m/v) | 放大倍数 | 机械强度 |
单体溶液1 | 15% | 0.05% | 10% | 0.5% | 4.01 | 中 |
单体溶液2 | 15% | 0.1% | 10% | 0.5% | 3.78 | 中 |
单体溶液3 | 30% | 0.1% | 10% | 0.5% | 3.73 | 强 |
单体溶液4 | 30% | 0.1% | 15% | 0.5% | 3.71 | 强 |
单体溶液5 | 15% | 0.1% | 7.5% | 0.5% | 3.64 | 中 |
单体溶液6 | 30% | 0.1% | 5% | 0.5% | 3.15 | 强 |
实验结果表明,调整凝胶单体中AA、SA的比例可以改变生物组织的膨胀倍数,调整作为交联剂的BA的比例可以改变膨胀后生物组织的机械强度。在一定范围内,膨胀生物组织的膨胀比例随AA或SA浓度的增加而增大,其机械强度随着BA浓度增加而增强。因此膨胀倍数和机械强度是AA、SA和BA三者的协同作用。可以通过实验改变AA、SA和BA三者的比例,来得到所需的膨胀倍数和机械强度。
实施例8成像
为了检验使用CMAP进行膨胀后的生物组织的透明度和对内源荧光蛋白的保留能力,使用平铺光片显微镜以不同的空间分辨率对经过CMAP膨胀处理的成年Thy1-eGFP小鼠的鼠脑(实施例1)和脊髓(实施例2)的部分组织进行了三维成像。
首先用0.25NA空气物镜,以水作为成像缓冲液,以2×2×5μm3的三维空间分辨率对膨胀~5倍后的小鼠大脑海马区9×11×5mm3体积的样品进行了三维成像。由于小鼠大脑膨胀了~5倍,因此对应的实际空间分辨率为~0.4×0.4×1μm3。
结果见图7,其中,A显示膨胀后Thy1-eGFP小鼠大脑海马体9×11×5mm3区域的三维成像结果;B显示A中所示成像区域的轴向投影;C和D显示A中标记的两个2×2×5mm3区域的三维成像结果;E-G显示C中所示XY横向截面的截面图;H-J显示D中所示XY横向截面的截面图;K和L显示C和D中所示的XZ轴向截面的截面图;M-P显示E-G和K中选定区域的放大图;Q-T显示H-J和L中选定区域的放大图。标尺:1mm(A),200μm(E,K),50μm(M)。
图7结果表明,尽管小鼠大脑海马的具有很高的细胞密度,小鼠大脑中的细胞和亚细胞的神经元结构,例如单个神经元轴突和树突棘,都可以被清晰的观察到。与此同时,膨胀的小鼠大脑组织也具有足够的机械强度,因此有效的避免成像过程中所可能引起的样品变形,使得整个样品可以被准确的三维成像。
进一步用0.6NA的水浸物镜,以水作为成像缓冲液,以0.6×0.6×2μm3的三维空间分辨率对膨胀~4倍后的小鼠脊髓9×8×3mm3体积的样品进行了三维成像。由于小鼠脊髓膨胀了~4倍,因此对应的实际空间分辨率为~0.15×0.15×0.5μm3。
结果见图8,其中A显示膨胀后小鼠脊髓9×8×3mm3区域的三维成像结果;B显示A中所示截面的截面图;C-F显示B中所示区域中的局部放大图。
图8结果表明,通过对小鼠脊髓的透明膨胀处理和高分辨率成像,小鼠脊髓神经元的形貌、投射、和神经元间的突触,都可以被清晰的观察到。
实验结果表明,根据本发明的CMAP除了可以将样品进行膨胀,提高成像的三维空间分辨率,还对内源荧光蛋白具有良好的保留能力。使用CMAP处理的生物组织还具有良好的透明度和机械强度。这些优点对于生物组织的高分辨率三维荧光成像具有重要的意义。
以上实施例仅为本公开的示例性实施例,不用于限制本公开,本公开的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本公开的实质和保护范围内,对本公开做出各种修改或等同替换,这种修改或等同替换也应视为落在本公开的保护范围内。
参考文献
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Claims (19)
1.一种生物组织透明膨胀方法,包括如下步骤:
(1)生物组织样品脱脂:对固定后的生物组织样品进行脱脂处理;
(2)单体浸泡渗透:将脱脂后的生物组织样品浸泡在凝胶单体分子溶液中,使单体分子渗透入脱脂后的生物组织样品中;
(3)凝胶化:诱发渗透入生物组织样品内的单体分子发生聚合反应形成聚合物凝胶;
(4)膨胀:将凝胶化处理后生物组织样品放入水中进行膨胀。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,在步骤(1)中,脱脂处理采用如下的脱脂试剂进行,所述脱脂试剂为一种水溶液,其中以质量百分浓度计,包含5-15%的N-丁基二乙醇胺和5-15%的曲拉通X-100。
3.根据权利要求2所述的方法,其中,所述脱脂试剂中,N-丁基二乙醇胺和曲拉通X-100的重量比为1:0.8~1.2。
4.根据权利要求2所述的方法,其中,所述脱脂试剂为以质量百分浓度计,包含10%的N-丁基二乙醇胺和10%的曲拉通X-100的水溶液。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,在步骤(2)中,所述凝胶单体分子溶液包括凝胶单体、引发剂和溶剂。
6.根据权利要求5所述的方法,其中,
所述凝胶单体包括选自丙烯酰胺类单体、丙烯酸类单体等中的一种或多种亲水性单乙烯基单体和作为交联剂的一种或多种亲水性双乙烯基单体;
所述引发剂选自热引发剂和紫外引发剂;
所述溶剂为PBS溶液。
7.根据权利要求6所述的方法,其中,
所述丙烯酰胺类单体选自丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、乙基丙烯酰胺、异丙基丙烯酰胺;
所述丙烯酸类单体选自丙烯酸、甲基丙烯酸、乙基丙烯酸和它们的碱金属盐;
所述亲水性双乙烯基单体是在分子中具有两个选自上述丙烯酰胺类单体、丙烯酸类单体中的单体结构的单体;
所述热引发剂为在30-100℃下能够诱发凝胶单体分子的聚合反应的热引发剂;
所述紫外引发剂选自在4℃以下的温度下使用紫外光照射后能够诱发凝胶单体的聚合反应的紫外引发剂。
8.根据权利要求6所述的方法,其中,所述丙烯酰胺类单体为丙烯酰胺;所述丙烯酸类单体是丙烯酸钠;所述亲水性双乙烯基单体是N,N′-亚甲基双丙烯酰胺。
9.根据权利要求5所述的方法,其中,所述引发剂为紫外引发剂。
10.根据权利要求9所述的方法,其中,所述紫外引发剂为选自偶氮类引发剂,芳香碳酰类引发剂;轻烷基酮类引发剂中的一种或多种。
11.根据权利要求9所述的方法,其中,所述紫外引发剂为选自偶氮二异丁基脒盐酸盐、偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐、偶氮二氰基戊酸、偶氮二异丙基咪唑啉、苯乙酮类引发剂中的一种或多种。
12.根据权利要求1所述的方法,其中,以质量(g)/体积(ml)浓度计,所述凝胶单体分子溶液包含30%的丙烯酰胺,0.1%的N,N′-亚甲基双丙烯酰胺,10%的丙烯酸钠和0.5%的偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐,溶剂为0.01M PBS溶液。
13.根据权利要求1所述的方法,其中,在步骤(2)中,凝胶单体分子溶液的用量为样品体积的5-20倍。
14.根据权利要求1所述的方法,其中,在步骤(3)中,采取恒温加热引发聚合产生凝胶,或者通过用紫外光照射引发聚合。
15.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤(3)凝胶化还包括包埋步骤。
16.根据权利要求15所述的方法,其中,
包埋与凝胶化同时完成,一次性加入凝胶单体分子溶液直至完全覆盖生物组织样品,然后引发聚合形成凝胶,完成包埋;或者
包埋分步完成,包括如下步骤:(1)制备底层凝胶:将少量凝胶单体分子溶液注入容器中覆盖容器底部,引发聚合生成底层凝胶;(2)然后将经过单体浸泡渗透处理的生物组织样品放置于容器中的底层凝胶上,并向容器中注入凝胶单体分子溶液,直至完全覆盖生物组织样品;(3)引发聚合形成凝胶,完成包埋。
17.根据权利要求1所述的方法,其中,在步骤(4)中,水的单次用量为凝胶样品的10至1000倍。
18.根据权利要求1所述的方法,其中,所述方法还包括,在步骤(1)生物组织样品脱脂后,进行荧光染色的步骤。
19.一种生物组织样品的成像方法,所述方法包括:
用根据权利要求1-18中任一项所述的方法对生物组织样品进行处理;
对处理后的生物组织样品进行成像。
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