KR102141496B1 - 투명화된 거대조직의 면역염색용 조성물 및 이를 이용한 투명화된 거대 생체 조직의 면역염색 방법 - Google Patents
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Abstract
투명화된 거대조직의 면역염색용 조성물 및 이를 이용한 투명화된 거대 생체 조직의 면역염색 방법이 개시된다. 상기 투명화된 거대조직의 면역염색용 조성물은 투명화된 생체 조직 특히, 두께 3mm 이상의 거대 생체 조직에서, 항체 투과도를 향상시켜 두꺼운 조직에 항체가 깊이 침투하여 종래 방법들이 가지고 있는 면역염색 문제점인 항체의 투과 한계성을 극복하고, 거대 조직의 면역 염색에 걸리는 시간을 단축하여, 간단하고 신속하게 거대 생체 조직의 고 해상도를 가지는 3차원 바이오 이미징이 가능하고, 구조화적 이미지를 통하여 다양한 질환의 원인의 규명, 치료법의 개발 및 약물의 효과 및 독성을 예측하는데 유용하게 사용할 수 있다. 또한. 이를 다양한 의료기기에 접목시켜 사용할 수 있고, 특히, 키트로 제작하여 체외 진단 기기로 유용하게 사용할 수 있다.
Description
투명화된 거대조직의 면역염색용 조성물 및 이를 이용한 투명화된 거대 생체 조직의 면역염색 방법에 관한 것이다.
x-ray를 통한 의료 진단 기술은 CT나 MRI와 같은 2차원 스캐닝 후 3차원으로 재구성하는 기술에 의하여 입체적으로 관찰, 정교하게 진단할 수 있는 기술로 발전하여 왔다. 광원이 아니라 초음파 등을 활용하는 경우 역시 3차원적 영상을 구현하는 기술이 진단에 활발하게 이용되고 있다. 그러나 현재 개발된 기술 대부분은 밀리미터 수준의 상대적으로 마크로 해상력을 가진 기술들로, 세포 수준에서의 분석이 가능한 마이크로 수준의 3차원 측정하는 기술은 상대적으로 그 발전이 미흡하여, 현재 대부분의 세포 수준 분석은 전통적인 2차원 기술을 이용하고 있다. 즉, 생검 또는 부검 조직 등 생체조직을 고정액으로 고정한 후, 파라핀 또는 폴리머로 포매한 후 수 마이크로미터 또는 나노미터 두께로 절편을 만들어 빛이나 전자파가 투과할 수 있도록 한 후, 투과 이미지를 광학 또는 전자현미경을 이용하여 취득하는 기술을 사용하여 미세구조를 분석한다.
이러한 미세 이미징 기술을 이용하여 3차윈 이미지를 획득하기 위해서는 콘포칼 현미경 등을 이용해야 하며, 이 경우 일반적으로 수십 마이크로미터 수준의 두께 정보를 획득할 수 있다. 대략적으로 이 두께는 광원이 침투할 수 있는 깊이에 의하여 그 한계가 그어진다. 그러나 대부분의 생체 조직 내 유의미한 구조물들이 수백 마이크로미터 이상의 크기를 가지고 있으므로, 이와 같은 방법으로는 일부의 정보만을 취득할 수 있다. 따라서, 보다 두꺼운 조직 내 이미지를 획득하기 위해서는 수십 마이크로 두께의 연속적인 절편을 제작하고, 이를 일일이 현미경으로 통하여 이미징 한 후, 다시 재구성하는 일련의 과정을 필요로 한다. 특히 뇌조직의 경우 하나의 뉴런 전체를 이미징한다고 할 때, 경우에 따라서는 하나의 뉴런이 수 ｍ까지도 그 액손(Axon)을 뻗기 때문에, 조직을 자르고 붙이는 일련의 과정을 진행하면서 일어날 수 있는 문제점이 기하급수적으로 발생한다.
조직 투명화 기술은 조직의 손상없이 조직 내부 구조 및 단백질 분포를 확인할 수 있어 기존의 기술의 관찰 한계를 뛰어넘어 더 깊은 곳까지 조직 구조를 관찰하고 다양한 기관계(system)로부터 통합적인 구조와 분자 정보의 접근을 가능하게 하므로 최근 다양한 방법으로 조직을 투명화하는 기술이 개발되었다.
그러나, 상기 방법은 하이드로젤 지지체를 조직에 침투시키게 되는데, 하이드로젤의 농도가 높아지면 단백질과의 결합도가 많아지며 보다 촘촘한 그물형 구조가 만들어지기 때문에 조직이 더 단단해진다. 반면 조직이 단단해지면 계면활성제에 의해서 지질이 빠져나가기 어려워지기 때문에 투명화에 걸리는 시간이 길어진다. 또한, 상기 방법은 조직 표면에 공기 및 검은 입자 침착을 야기하거나, 조직을 노랗게 변색시키는 문제점이 있다. 뿐만 아니라 한번에 하나의 뇌만 투명화하는 것이 가능하므로 경제적, 시간적으로 많은 손실이 유발된다. 보다 큰 문제는 항체를 이용한 염색이 그물망 구조를 이루는 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide)의 사이를 투과하기에 어려움이 있다.
최근 본 연구자가 개발한 CHAPS+Urea를 기반으로 하는 SunHyun 3D image Kit을 이용한 방법은 조직 투명화 있어서 기존의 방법이 가지고 있는 유해하거나, 특별한 기술이나 장비 및 노하우가 요구하지 않도록 하며, protocol에 제시된 순서에 따라 용액을 활용해 쉽게 조직을 투명화 시킬 수 있고 기존의 조직 투명화 방식보다 비교적 높은 항체 투과도를 가지고 투명화된 조직의 면역염색이 가능한 새로운 기술을 개발하였다
하지만 SunHyun 3D image Kit을 이용한 조직투명화 방법과 앞선 방법들에서 현재 까지 가지고 있는 가장 큰 문제점은 항체를 이용해 1mm이상 조직을 면역염색을 가능하게 하는 방법에 한계를 가지고 있다. 그 원인은 투명화를 위해 사용된 용액, Hydrogel-hybridized form, 그리고 거대 조직 두께등으로 인해 항체의 확산 및 투과에 어려움 때문이다. 가장 최근에 면역염색의 한계를 넘기 위한 노력들이 이루어지고 있다. 대표적으로 CLARITY에서 사용되어진 Hydrogel-hybridized form에서 항체의 투과성에 큰 문제가 제기 되어 2016년 최근에 Magnified analysis of the proteome (MAP)방식에서 기본 조직에 비해 크기를 4배 가까이 키워서 항체의 투과도 증가함을 보여주었다. 하지만 이방식에는 치명적 단점이 형광의 밝기가 기존에 비해 1/64로 현저히 감소하고 95도 이상으로 조직을 끓이며 투명화 과정을 진행히기 때문에 단백질, DNA, 그리고 RNA가 거의 손상되어 없어진다. 유기 용매를 이용한 한계를 넘기 위해 개발된 uDisco방법의 경우 1mm의 조직에서 항체를 투과시켜 면역염색을 하는데 한 달 이상 걸린다. 하지만 이 방법들도 연구자들이 일반적으로 적용하거나 연구 결과를 도출한 경우가 없고 또한 상용화된 방법은 아니다. 2차원적 박편시료에서 이용하는 면역염색 방법은 3차원적 거대 투명화 조직 적용에는 한계가 있다는 것을 의미한다. 따라서 거대 투명화 조직에서 면역염색을 이용한 3차원적 바이오 이미지를 얻기 위해서는 거대 투명화 조직에 맞는 면역염색 조성물 및 방법 개발이 필연적으로 필요하다.
Chung K, et al. (2013) Nature 497(7449):332-337.
Lee H, et al. BMC Developmental Biology 2014 14:781.
Taeyun Ku., et al.Nat Biotech. 2016, doi:10.1038/nbt.3641.
Pan C, et al. Nat Methods. (2016) 10 (13): 859-67.
본 발명의 일 목적은 투명화된 거대조직의 면역염색용 조성물을 제공하는 것이다
본 발명의 다른 목적은 투명화된 생체조직의 면역염색 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 일 측면에 따라, DMSO(Dimethyl Sulfoxide), Triton X-100 및 1차항체(primary antibody)가 용해된 수용액을 포함하는 투명화된 생체조직의 면역염색용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 투명화된 생체조직의 면역염색용 조성물을 투명화된 생체조직에 처리하는 단계(단계 1); 및
상기 단계 1의 처리된 생체 조직에 2차항체를 처리하는 단계(단계 2);를 포함하는 투명화된 생체조직의 면역염색 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 면역염색용 조성물을 포함하는, 투명화된 생체조직 면역염색용 키트가 제공된다.
DMSO(Dimethyl Sulfoxide), Triton X-100 및 1차항체(primary antibody)가 용해된 수용액을 포함하는 투명화된 생체조직의 면역염색용 조성물은 투명화된 생체 조직 특히, 두께 3mm 이상의 거대 생체 조직에서, 항체 투과도를 향상시켜 두꺼운 조직에 항체가 깊이 침투하여 종래 방법들이 가지고 있는 면역염색 문제점인 항체의 투과 한계성을 극복하고, 거대 조직의 면역 염색에 걸리는 시간을 단축하여, 간단하고 신속하게 거대 생체 조직의 고 해상도를 가지는 3차원 바이오 이미징이 가능하고, 구조화적 이미지를 통하여 다양한 질환의 원인의 규명, 치료법의 개발 및 약물의 효과 및 독성을 예측하는데 유용하게 사용할 수 있다. 또한. 이를 다양한 의료기기에 접목시켜 사용할 수 있고, 특히, 키트로 제작하여 체외 진단 기기로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 제조예 1에서 제조한 투명화된 마우스의 뇌의 이미지이다.
도 2는 투명화된 뇌 조직에 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 이용하여 DNA를 염색한 이미지이다.
도 3은 뉴런의 마커로 이용되는 뉴런 핵염색 항체인 NeuN을 1차 항체로 이용하고, Donkey Anti-rabbit IgG Alexa Fluor-647를 2차 항체로 이용하여 수행한 면역 염색 결과를 MicroscopyLightsheet Z.1에서 5X 대물렌즈로 관찰한 염색이미지이다.
도 2는 투명화된 뇌 조직에 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 이용하여 DNA를 염색한 이미지이다.
도 3은 뉴런의 마커로 이용되는 뉴런 핵염색 항체인 NeuN을 1차 항체로 이용하고, Donkey Anti-rabbit IgG Alexa Fluor-647를 2차 항체로 이용하여 수행한 면역 염색 결과를 MicroscopyLightsheet Z.1에서 5X 대물렌즈로 관찰한 염색이미지이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 목적은 투명화된 생체조직의 면역염색용 조성물을 제공하는 것으로, 구체적으로, 항체 투과도가 증가되어 1차 항체의 침투성이 향상되어, 두께 3mm 이상의 거대 생체조직의 면역염색의 내부까지 선명한 높은 해상도의 3차원 이미징이 가능한 면역염색용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 일 측면은, DMSO(Dimethyl Sulfoxide), Triton X-100 및 1차항체(primary antibody)가 용해된 수용액을 포함하는 투명화된 생체조직의 면역염색용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 DMSO를 5 내지 50 부피부로 포함할 수 있고, 10 내지 40 부피부로 포함할 수 있고, 20 부피부로 포함할 수 있다.
상기 DMSO가 5 부피부 미만으로 포함될 경우, 투명화된 생체 조직내부로 1차 항체가 충분히 깊숙히 투과되지 않아 두께 3mm 이상의 거대 생체조직의 면역염색의 내부까지 선명한 높은 해상도의 3차원 이미징이 가능한 면역염색용 조성물을 얻을 수 없다. 또한, 50 부피부 초과로 포함될 경우, 1차 항체의 퀀칭이 일어나 면역염색이 어려울 수 있다.
상기 조성물은 Triton X-100를 0.01 내지 10 부피부로 포함할 수 있고, 0.1 내지 5 부피부로 포함할 수 있고, 1 부피부로 포함할 수 있다.
상기 Triton X-100이 0.01 부피부 미만으로 포함될 경우, 세포막에 구멍을 내는데 문제가 있을 수 있고, 10 부피부 초과로 포함될 경우, 조직의 크기가 너무 작아져 항체 투과도가 감소하는 문제가 있을 수 있다.
투명화된 생체조직의 면역염색용 조성물은 과량으로 포함된 DMSO가 1차 항체를 퀀칭하는 것을 방지하는 목적으로, Tris(tris(hydroxymethyl)aminomethane)를 더 포함할 수 있으나, Tris의 포함이 필수적인 것은 아니다.
상기 Tris는 조성물 내에 0.01 내지 10 %(w/v)로 더 포함될 수 있다. 일례로, 조성물 전체를 100 mL로 볼 때, 0.01 내지 10 g으로 포함될 수 있다
또한, 상기 Tris는 조성물 내에 0.1 내지 5 %(w/v)로 더 포함될 수 있고, 1 %(w/v)로 포함될 수 있다. 상기 Tris는 DMSO가 1차 항체를 퀀칭하는 것을 방지할 수 있다. Tris가 0.01 %(w/v) 미만으로 포함될 경우, 항체의 변성이 일어나는 문제가 있을 수 있고, 10 %(w/v) 초과로 포함될 경우, 조직의 크기를 작게하여 항체 투과도에 문제가 있을 수 있다.
상기 생체 조직은 생체로부터 분리한 뇌(brain), 혈관(blood vessel), 간(liver), 폐(lung), 신장(kidney), 췌장(pancreas), 심장(heart), 장(intestine) 등으로부터 유래한 세포로 만들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 생체조직은 두께 3mm이상의 거대조직일 수 있다.
상기 조성물은 3 mm 이상의 투명화된 거대 생체조직에서 항체 투과도를 증가시키고, 면역염색의 해상도를 향상시킬 수 있다.
상기 투명화는 통상적인 조직의 투명화를 통하여 수행할 수 있으며, 본 발명의 조성물은 조직의 투명화 자체에 특징이 있는 것이 아닌 바, 투명화 방법은 특히 한정되지 않는다.
상기 투명화된 생체조직의 면역염색용 조성물을 사용하여 투명화된 생체 조직의 면역염색을 수행한 결과, 3mm 이상의 두께를 가진 투명화된 거대 생체 조직에서, 면역염색의 깊이가 3mm 이상으로 염색된 것을 확인하였다. 또한, MicroscopyLightsheet Z.1에서 5X 대물렌즈를 이용하여 면역 염색이미지와 GFP(Green Fluorescent Protein)신호를 확인하였다(실험예1 및 도 3 참조).
이는 기존의 조직 투명화 방법의 문제점인 항체의 투과도 문제를 해결한 것을 보여준다. 또한, 면역염색의 이미지도 고화질로 구현되어 해상도가 높은 이미지를 얻을 수 있다는 것을 보여준다.
이로인해, 본 발명의 투명화된 조직의 면역염색 조성물을 이용할 경우 다양한 질환의 마커 발견 및 인산화 활성측정을 이용한 메커니즘 연구에 활용 할 수 있으며 다양한 뇌 지도연구에도 적용할 수 있을 것이다.
따라서, DMSO(Dimethyl Sulfoxide), Triton X-100 및 1차항체(primary antibody)가 용해된 수용액을 포함하는 투명화된 생체조직의 면역염색용 조성물은 투명화된 생체 조직, 특히, 두께 3mm 이상의 거대 생체 조직에서, 항체 투과도를 향상시켜 두꺼운 조직에 항체가 깊이 침투하여 종래 방법들이 가지고 있는 면역염색 문제점인 항체의 투과 한계성을 극복하고, 거대 조직의 면역 염색에 걸리는 시간을 단축하여, 간단하고 신속하게 거대 생체 조직의 고 해상도를 가지는 3차원 바이오 이미징이 가능하고, 구조화적 이미지를 통하여 다양한 질환의 원인의 규명, 치료법의 개발 및 약물의 효과 및 독성을 예측하는데 유용하게 사용할 수 있다. 또한. 이를 다양한 의료기기에 접목시켜 사용할 수 있고, 특히, 키트로 제작하여 체외 진단 기기로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은,
DMSO(Dimethyl Sulfoxide), Triton X-100 및 1차항체(primary antibody)가 용해된 수용액을 포함하는 투명화된 생체조직의 면역염색용 조성물을 투명화된 생체조직에 처리하는 단계(단계 1); 및
상기 단계 1의 처리된 생체 조직에 2차항체를 처리하는 단계(단계 2);를 포함하는 투명화된 생체조직의 면역염색 방법을 제공한다.
본 발명의 면역염색 방법은 DMSO(Dimethyl Sulfoxide), 항체 투과도를 현저히 증가시키는 효과가 있는 DMSO(Dimethyl Sulfoxide), Triton X-100 및 1차항체(primary antibody)가 용해된 수용액을 포함하는 투명화된 생체조직의 면역염색용 조성물을 사용함으로써,
효과적인 면에서, 종래 투명화된 생체조직 면역염색 기술이 투명화를 위해 사용된 용액, Hydrogel-hybridized form, 그리고 거대 조직 두께등으로 인해 항체의 확산 및 투과가 어려워 항체를 이용해 1mm이상 조직을 면역염색을 수행하는 것이 어려운 문제가 있다. 본 발명은 이러한 문제점을 해결하여, 3mm 이상의 두께를 가지는 거대 생체조직에서도 본 발명의 조성물을 사용함으로써, 항체의 확산 및 투과가 용이하게 되어, 거대 생체 조직의 내부까지 1차 항체가 생체 조직 내부 깊숙히 침투하여 추후 2차항체를 처리하였을 때, 조직의 깊은 내부까지 선명한 고해상도의 3차원 이미지를 얻을 수 있는 장점이 있다.
또한, 면역염색에 소요되는 시간적인 면에서, 종래 투명화된 생체조직 면역 염색 기술은 1mm 이상의 두께를 가지는 조직을 면역 염색할 때, 항체 투과도를 증가시키기 위하여 전처리 단계를 수행하여야 하며, 두꺼운 조직이 아닌 경우에도, 장시간의 전처리 과정을 수행하여야 하여야 하는 경우가 많아, 본원 발명보다 방법의 단계가 더 추가될 뿐만 아니라, 전체적인 방법 수행 시간이 길게는 수개월이 소요되는 문제가 있다. 본 발명은 이러한 문제점을 해결하여, 본 발명의 조성물을 사용함으로써, 전처리 단계를 전혀 수행하지 않고 면역 염색을 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 3mm 이상의 두께를 가진 거대 조직의 면역염색도 종래 기술에 비해 시간을 현저히 단축하여 조직의 깊은 내부까지 선명한 고해상도의 3차원 이미지를 얻을 수 있는 장점이 있다. 즉, 본 발명의 방법은 전처리과정이 전혀 필요 없이, 본 발명의 조성물을 사용함으로써, 항체 투과도를 간단하고 용이하게 증가시킬 수 있는 장점이 있다.
이하, 상기 면역염색 방법에 대하여 구체적으로 설명한다.
상기 면역염색 방법의 단계 1은 DMSO(Dimethyl Sulfoxide), Triton X-100 및 1차항체(primary antibody)가 용해된 수용액을 포함하는 투명화된 생체조직의 면역염색용 조성물에 생체 조직을 담지하여 1차 항체를 생체 조직 내부로 침투시키는 단계이다.
구체적으로,
상기 조성물은 DMSO를 5 내지 50 부피부로 포함할 수 있고, 10 내지 40 부피부로 포함할 수 있고, 20 부피부로 포함할 수 있다.
상기 DMSO가 5 부피부 미만으로 포함될 경우, 투명화된 생체 조직내부로 1차 항체가 충분히 깊숙히 투과되지 않아 두께 3mm 이상의 거대 생체조직의 면역염색의 내부까지 선명한 높은 해상도의 3차원 이미징이 가능한 면역염색용 조성물을 얻을 수 없다. 또한, 50 부피부 초과로 포함될 경우, 1차 항체의 퀀칭이 일어나 면역염색이 어려울 수 있다.
상기 조성물은 Triton X-100를 0.01 내지 10 부피부로 포함할 수 있고, 0.1 내지 5 부피부로 포함할 수 있고, 1 부피부로 포함할 수 있다.
상기 Triton X-100이 0.01 부피부 미만으로 포함될 경우, 세포막에 구멍을 내는데 문제가 있을 수 있고, 10 부피부 초과로 포함될 경우, 조직의 크기가 너무 작아져 항체 투과도가 감소하는 문제가 있을 수 있다.
상기 조성물은 Tris(tris(hydroxymethyl)aminomethane)를 더 포함할 수 있다.
이에, 본 발명의 면역염색 방법은 상기 범위로 DMSO 및 Triton X-100가 포함된 투명화된 생체조직의 면역염색용 조성물을 사용하여야 단계 1을 원활히 수행하여 단계 2를 수행할 수 있으며, 두께 3mm 이상의 거대 생체조직을 면역염색하여 조직 내부까지 선명하고 고 해상도를 나타내는 3차원 이미징이 가능할 수 있다.
상기 단계 1에서, 투명화된 생체조직의 면역염색용 조성물은 과량으로 포함된 DMSO가 1차 항체를 퀀칭하는 것을 방지하는 목적으로, Tris(tris(hydroxymethyl)aminomethane)를 더 포함할 수 있으나, Tris의 포함이 필수적인 것은 아니다.
상기 Tris는 조성물 내에 0.01 내지 10 %(w/v)로 더 포함될 수 있다. 일례로, 조성물 전체를 100 mL로 볼 때, 0.01 내지 10 g으로 포함될 수 있다
또한, 상기 Tris는 조성물 내에 0.1 내지 5 %(w/v)로 더 포함될 수 있고, 1 %(w/v)로 포함될 수 있다. 상기 Tris는 DMSO가 1차 항체를 퀀칭하는 것을 방지할 수 있다. Tris가 0.01 %(w/v) 미만으로 포함될 경우, 항체의 변성이 일어나는 문제가 있을 수 있고, 10 %(w/v) 초과로 포함될 경우, 조직의 크기를 작게하여 항체 투과도에 문제가 있을 수 있다.
또한, 상기 단계 1에서 생체조직의 투명화는 통상적인 조직의 투명화를 통하여 수행할 수 있으며, 본 발명의 방법은 조직의 투명화 자체에 특징이 있는 것이 아닌 바, 투명화 방법은 특히 한정되지 않는다.
상기 면역염색 방법의 단계 2는 단계 1의 수행으로 인해 1차 항체가 조직에 침투된 생체 조직에 2차 항체를 처리하는 단계이다.
본 발명의 면역염색 방법은 단계 1에 그 특징이 있는 바, 2차 항체를 처리하는 단계는 특정 방법에 한정되지 않으며, 당업자가 사용하는 통상적인 방법으로 수행할 수 있다.
상기 생체 조직은 생체로부터 분리한 뇌(brain), 혈관(blood vessel), 간(liver), 폐(lung), 신장(kidney), 췌장(pancreas), 심장(heart), 장(intestine) 등으로부터 유래한 세포로 만들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 생체조직은 두께 3mm이상의 거대조직일 수 있다.
상기 조성물은 3 mm 이상의 투명화된 거대 생체조직에서 항체 투과도를 증가시키고, 면역염색의 해상도를 향상시킬 수 있다.
상기 투명화된 생체조직의 면역염색 방법을 사용하여 투명화된 생체 조직의 면역염색을 수행한 결과, 3mm 이상의 두께를 가진 투명화된 거대 생체 조직에서, 면역염색의 깊이가 3mm 이상으로 염색된 것을 확인하였다. 또한, MicroscopyLightsheet Z.1에서 5X 대물렌즈를 이용하여 면역 염색이미지와 GFP(Green Fluorescent Protein)신호를 확인하였다(실험예1 및 도 3 참조).
이는 기존의 조직 투명화 방법의 문제점인 항체의 투과도 문제를 해결한 것을 보여준다. 또한, 면역염색의 이미지도 고화질로 구현되어 해상도가 높은 이미지를 얻을 수 있다는 것을 보여준다.
이로인해, 본 발명의 면역염색 방법을 이용할 경우 다양한 질환의 마커 발견 및 인산화 활성측정을 이용한 메커니즘 연구에 활용 할 수 있으며 다양한 뇌 지도연구에도 적용할 수 있을 것이다.
따라서, DMSO(Dimethyl Sulfoxide), Triton X-100 및 1차항체(primary antibody)가 용해된 수용액을 포함하는 투명화된 생체조직의 면역염색용 조성물은 투명화된 생체 조직, 특히, 두께 3mm 이상의 거대 생체 조직에서, 항체 투과도를 향상시켜 두꺼운 조직에 항체가 깊이 침투하여 종래 방법들이 가지고 있는 면역염색 문제점인 항체의 투과 한계성을 극복하고, 거대 조직의 면역 염색에 걸리는 시간을 단축하여, 간단하고 신속하게 거대 생체 조직의 고 해상도를 가지는 3차원 바이오 이미징이 가능하고, 구조화적 이미지를 통하여 다양한 질환의 원인의 규명, 치료법의 개발 및 약물의 효과 및 독성을 예측하는데 유용하게 사용할 수 있다. 또한. 이를 다양한 의료기기에 접목시켜 사용할 수 있고, 특히, 키트로 제작하여 체외 진단 기기로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 면역염색용 조성물을 포함하는, 투명화된 생체조직 면역염색용 키트를 제공한다.
이하, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1> 투명화된 생체 조직의 제조
투명화된 생체 조직을 하기와 같은 방법으로 제조하였다. 단, 본 명세서 내에서 모든 동물 실험 과정은 안전성평가연구소 동물 자원 대학위원회의 지침서(Approval No. RS17003)에 따라 수행하였다.
먼저, 흡입 마취제인 Isoflurane (1cc/min) 을 사용하여 성체 생쥐(8주령)를 마취시키고, 쥐의 혈관을 염색하기 위해 tail vein으로 Lectin-488 (Cat# DL1174)을 주입하였다. Lectin을 주입하고 5분 경과 후, 경심 관류로 얼음처럼 차가운 1X 인산완충용액 (phosphate-buffered saline) 50 mL을 관류시킨 후, 얼음처럼 차가운 4% PFA가 포함된 PBS를 관류시켰다. 그 다음 기관을 적출하고 4%의 Paraformaldehyde, PFA용액에 담근 후 4℃에서 12 h 동안 인큐베이션 하였다. 이때, 상기 얼음처럼 차가운 온도 범위는 특별히 제한되는 것은 아니지만 -20℃ 내지 40℃ 범위일 수 있다.
다음으로, 상기 샘플을 50ml의 PBS로 2번 Washing을 하였다. 상기 고정화된 샘플을 20% CHAPS w/v% 과 60 w/v% 우레아의 PBS 혼합용액에서 37℃ 온도에서 220 rpm으로 3일 동안 인큐베이션하였다.
또한, CHAPS와 Urea의 혼합물에서 뇌를 3차 증류수로 옮기고, 50ml의 3차 증류수로 12 h 동안 3번 Washing한 후, mounting 용액인 CHAPS와 Urea의 혼합물에 뇌를 옮긴 후, 뇌의 투명화를 관찰하였으며 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1은 제조예 1에서 제조한 투명화된 마우스의 뇌의 이미지이다.
도 1 에 나타난 바와 같이, 마우스 뇌 조직의 투명화가 잘 이루어진 것을 알 수 있다.
<실시예 1> 투명화된 생체조직의 면역염색용 조성물을 이용한 생체 조직의 면역염색
본 발명의 투명화된 생체조직의 면역염색용 조성물을 사용하여 하기와 같은 방법을 통해 상기 제조예 1에서 얻은 투명화된 생체조직을 면역염색하였다.
단계 1: 투명화된 생체 조직의 면역염색용 조성물의 제조
20 %(v/v) DMSO + 1%(v/v) Triton X-100 + 50 mM Tris 및 증류수로 구성된 조성물(20 mL의 DMSO, 79 mL의 증류수, 1 mL의 Triton X-100 및 0.65 g의 Tris) 용액에 넣은 후 1차 항체로 뉴런 마커 항체인 NeuN(Cat#ab177487)을 1:100 비율로 처리하여 투명화된 생체조직의 면역염색용 조성물을 제조하였다.
단계 2: 투명화된 생체조직의 면역염색용 조성물의 처리(1차 항체 처리)
상기 제조예 1에서 얻은 투명화된 조직을 50 mL 증류수에 3번 교체해줌으로써 12시간 인큐베이션하고, 상기 조직 샘플을 상기 단계 1에서 얻은 면역염색용 조성물에 담지하여 1차항체를 처리하였다. 1차항체 처리 후, 4℃에서 7일 동안 인큐베이션 하였다.
단계 3: 2차 항체의 처리
상기 단계 2의 1차항체 처리 후, 다시 조직 샘플을 증류수에 12h 동안 세척 하여, PBS (phosphate buffered saline), 0.1% TrionX-100, 및 DAPI(Cat# D5942 Sigma) 및 2차 항체로서 Donkey Anti-rabbit IgG Alexa Fluor-647가 각각 용해된 수용액을 처리하여 7일 동안 4℃ 에서 shaking하면서 인큐베이션하였다. 7일 후 샘플에 있는 비특이적 항체 결합을 제거하기 위해 PBS와 0.1% TrionX-100가 용해된 수용액을 이용하여 4℃ 에서 shaking하면서 12h 내지 24시간 동안 세척을 하였다. 세척을 마친 샘플은 다시 mounting용액인 CHAPS과 우레아의 혼합용액에 담고 12시간 인큐베이션하였다. 이때, 상기 DAPI 처리군은 화학적 염색군으로, 면역염색과 화학적 염색에서의 항체 투과성을 비교하기 위한 비교군이다.
<비교예 1> Trion X-100를 이용한 생체 조직의 면역염색
Trion X-100를 사용하여 하기와 같은 방법을 통해 상기 제조예 1에서 얻은 투명화된 생체조직을 면역염색하였다.
상기 실시예 1의 단계 2에서, 20% DMSO + 1% Triton X-100 + 50 mM Tris 및 증류수로 구성된 조성물 대신 1% Trion X-100 + PBS용액을 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 생체 조직을 면역염색하였다.
<실험예 1> 면역염색된 생체 조직의 형광 확인
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 면역염색된 생체 조직의 형광을 확인하기 위해 Microscopy Lightsheet Z.1에서 5X 대물렌즈를 이용하여 마우스 뇌의 DAPI 및 신경세포 마커로 사용되는 NeuN 항체 면역 염색 형광신호를 확인하였다. DAPI(Cat# D5942 Sigma)(화학적염색)를 사용한 면역염색 조직은 도 2에, Donkey Anti-rabbit IgG Alexa Fluor-647(항체염색)를 사용한 면역염색 조직은 도 3에 나타내었다.
도 2는 투명화된 뇌 조직에 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 이용하여 DNA를 염색한 이미지이다.
도 2에 나타난 바와 같이,
DAPI와 같은 화학적 염색의 경우, 두 조성물에서 큰 차이가 없음을 보여준다.
도 3은 뉴런의 마커로 이용되는 뉴런 핵염색 항체인 NeuN을 1차 항체로 이용하고, Donkey Anti-rabbit IgG Alexa Fluor-647를 2차 항체로 이용하여 수행한 면역 염색 결과를 MicroscopyLightsheet Z.1에서 5X 대물렌즈로 관찰한 염색이미지이다.
반면, 도 3에 나타난 바와 같이,
Donkey Anti-rabbit IgG Alexa Fluor-647를 사용한 항체 염색의 경우, 비교예 1(1% Trion X-100을 1X PBS 조성물)에 담지한 샘플에서는 0.5 mm 깊이가 면역염색이 된것과 비교하여, 본 발명에 따른 투명화된 생체조직의 면역염색용 조성물인 실시예 1(20% DMSO+1% Triton X-100+ 50 mM Tris를 증류수에 혼합한 조성물)은 면역염색의 깊이가 3mm 이상으로 염색된 것을 볼 수 있다.
이는 기존의 조직 투명화 방법의 문제점인 항체의 투과도 문제를 해결한 것을 보여준다. 또한, 면역염색의 이미지도 고화질로 구현되어 해상도가 높은 이미지를 얻을 수 있다는 것을 보여준다.
또한, 도 3에서는, MicroscopyLightsheet Z.1에서 5X 대물렌즈를 이용하여 면역 염색이미지와 GFP(Green Fluorescent Protein)신호를 확인하였다. 따라서, 본 발명의 투명화된 조직의 면역염색 조성물을 이용할 경우 다양한 질환의 마커 발견 및 인산화 활성측정을 이용한 메커니즘 연구에 활용 할 수 있으며 다양한 뇌 지도연구에도 적용할 수 있을 것이다.
따라서, DMSO(Dimethyl Sulfoxide), Triton X-100 및 1차항체(primary antibody)가 용해된 수용액을 포함하는 투명화된 생체조직의 면역염색용 조성물은 투명화된 생체 조직 특히, 두께 3mm 이상의 거대 생체 조직에서, 항체 투과도를 향상시켜 두꺼운 조직에 항체가 깊이 침투하여 종래 방법들이 가지고 있는 면역염색 문제점인 항체의 투과 한계성을 극복하고, 거대 조직의 면역 염색에 걸리는 시간을 단축하여, 간단하고 신속하게 거대 생체 조직의 고 해상도를 가지는 3차원 바이오 이미징이 가능하고, 구조화적 이미지를 통하여 다양한 질환의 원인의 규명, 치료법의 개발 및 약물의 효과 및 독성을 예측하는데 유용하게 사용할 수 있다. 또한. 이를 다양한 의료기기에 접목시켜 사용할 수 있고, 특히, 키트로 제작하여 체외 진단 기기로 유용하게 사용할 수 있다.
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- DMSO(Dimethyl Sulfoxide), Triton X-100 및 1차항체(primary antibody)를 포함하는 생체조직의 면역염색용 조성물을 투명화된 두께 1 mm 이상의 생체조직에 처리하는 단계(단계 1); 및
상기 단계 1의 처리된 생체 조직에 2차항체를 처리하는 단계(단계 2);를 포함하면서,
상기 투명화는 CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)와 우레아의 혼합물을 이용하여 투명화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 투명화된 생체조직의 면역염색 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 단계 1을 통하여 생체조직 내부에 1차항체가 침투되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 방법으로 3 mm이상의 두께를 가지는 투명화된 거대 생체조직의 3차원 이미징이 가능한 것을 특징으로 하는 방법.
- CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate) 및 우레아의 혼합물을 포함하는 생체조직 투명화용 조성물 및 상기 생체조직 투명화용 조성물에 의하여 투명화된 두께 1 mm 이상의 생체조직을 면역염색하기 위한 DMSO(Dimethyl Sulfoxide), Triton X-100 및 1차항체(primary antibody)를 포함하는 생체조직의 면역염색용 조성물을 포함하는, 생체조직 면역염색용 키트.
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