CN118139965A - 细胞保持器材、传感器、框架部件和细胞保持方法 - Google Patents

Abstract

提供不使细胞附着的支架成为细胞观察时的障碍并能够保持细胞的细胞保持器材和其细胞保持方法。本发明的一个方式为细胞保持器材，其具备：框架部件，其包围能保持多个细胞聚集的细胞群的预定保持区的至少一部分或全部；以及膜状的所述细胞群，其占有所述预定保持区的至少一部分并被所述框架部件保持；其中，所述细胞群的边缘部的至少一部分与所述框架部件接触，并且所述细胞群中占有所述预定保持区的部分处于空中悬浮的状态。

Description

细胞保持器材、传感器、框架部件和细胞保持方法

技术领域

本发明涉及细胞保持器材。本发明进一步还涉及包含细胞保持器材的传感器。

背景技术

细胞伴随外界环境的变化做出特异且高敏感度的应答。通过根据该细胞的形态和该细胞中表达的荧光蛋白的局部存在或表达量等的变化来检测此应答反应，希望可以实现迄今未有的高性能分析。非专利文献1中公开了可以用光学显微镜检测活细胞内葡萄糖动力学的荧光蛋白型传感器。另外，非专利文献2中公开了检测细胞外存在的上皮生长因子等液体性因子的细胞内蛋白型传感器。另外，还开发了利用细胞的应答机制的、使用B细胞的病原体和生物毒素的检测系统(非专利文献3)，和使用藻类细胞的水质污染早期检测传感器(非专利文献4)等。这些利用细胞的传感器可以消除以往利用半导体器件和酶反应的化学传感器中成为问题的如信号漂移等长时间测量时的不稳定性。

进一步，上述利用细胞的传感器通过与细胞培养技术结合，期待以往化学传感器无法达到的效果。例如，专利文献1中公开了低成本细胞培养技术。通过与这样的细胞培养技术结合，认为可以实现比以往的化学传感器成本更低的传感器。

对于这样的利用细胞的传感器等而言，将细胞稳定保持在希望位置上的方法是必要的。非专利文献5中公开了在内径约为1mm的多个腔室中配备了悬浮在凝胶中的活细胞的细胞传感器，其用3D打印机制作。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：专利第6111510号公报

非专利文献

非专利文献1：Mita,et al.,“Green Fluorescent Protein-Based GlucoseIndicators Report Glucose Dynamics in Living cells”.Anal.Chem.,2019,vol.91,No.7,p4821-4830

非专利文献2：Kim,et al.,“Intensiomertric biosensors visualise theactivity of multiple small GTPases in vitro”,Nat.Commun.vol.10,Arti clenumber:211(2019)

非专利文献3：Banerjee,ey al.,“Anovel and simple cell-based detectionsystem with acollagen-encapsulated B-lymphocyte cell line as a biosensor forrapid detection of pathogens and toxins”,Lab.Invest.2008,Feb,88(2),196 -206

非专利文献4：Ferro,et al.,“Development of a biosensor forenvironmental monitoring based on microalgae immobilised in silicahygrogels”,Sensors(Basel).,2012,Dec 6,12(12),16879-16891

非专利文献5：Oda,et al.,“Cell-based Biohybrid Sensor Device forChemical Source Direction Estimation”,Cyborg and Bioni c Systems,Volume 2021,Article ID 8907148

发明内容

发明要解决的课题

以往的细胞保持技术由于需要使细胞附着的支架，因此存在细胞附着的支架成为细胞观察时的障碍的问题。本发明鉴于上述情况，以提供不使细胞附着的支架成为细胞观察时的障碍并能够保持细胞的细胞保持器材和其细胞保持方法为目的。

用于解决课题的手段

本发明人等进行了深入研究，结果发现通过将包围该细胞群的预定保持区的至少一部分或全部的框架部件浸渍在含有可能形成球状体的多个细胞聚集的细胞群或该细胞群形成的球状体的培养基中，可以解决上述的问题。进一步，本发明人等发现根据上述方法，可以长时间在该细胞保持器材保持细胞，并完成了本发明。

即，根据本发明的第一方面，

提供细胞保持器材，其具备：

框架部件，其包围能保持多个细胞聚集的细胞群的预定保持区的至少一部分或全部；以及

膜状的上述细胞群，其占有上述预定保持区的至少一部分并被上述框架部件保持；

其中，上述细胞群的边缘部的至少一部分与上述框架部件接触，并且上述细胞群中占有上述预定保持区的部分处于空中悬浮的状态。

根据本发明的第二方面，

提供框架部件，其为用于将多个细胞聚集的细胞群的部分保持在空中悬浮的状态的框架部件，

其包围能保持上述细胞群的预定保持区的至少一部分或全部。

根据本发明的第三方面，

提供细胞保持方法，其为将多个细胞聚集的细胞群的部分保持在空中悬浮的状态的方法，

其中，其包括将包围上述细胞群的预定保持区的至少一部分或全部的框架部件浸渍在含有上述细胞群或上述细胞群形成的球状体的培养基中的工序。

上述第一方面中，在与上述预定保持区面正交的一截面中的上述框架部件的外围可以被上述细胞群至少部分覆盖。

上述第一方面中，上述细胞群可以占有上述预定保持区的面积的50％以上。

上述第一方面中，上述预定保持区可以为大致圆形或大致椭圆形。

上述第一方面中，上述框架部件可以包围上述预定保持区的全部。

上述第一方面中，上述细胞群的细胞可以为原代细胞。

上述第一方面中，上述细胞群的细胞可以为以选自肝脏、胃、肺、心脏或脑的脏器作为来源的细胞。

上述第一方面中，上述预定保持区的面积可以为1000-600000μm²。

上述第一方面、第二方面和第三方面中，上述预定保持区的面积可以为1000-6000μm²。

上述第一方面和第三方面中，上述细胞群形成球状体时的球状体尺寸可以为0.2-1.0mm²。

上述第一方面中，上述细胞保持器材可以被包含在传感器中。

发明效果

根据本发明，能够提供不使细胞附着的支架成为细胞观察时的障碍并能够保持细胞的细胞保持器材和其细胞保持方法。进一步，根据本发明，能够提供不使细胞附着的支架成为细胞观察时的障碍并能够长时间保持细胞的细胞保持器材和其细胞保持方法。

附图说明

[图1]图1(a)和(b)分别为实施方式1中涉及的细胞保持器材的简略平面示意图和图1(a)中所示细胞保持器材沿A-A’线的截面图。

[图2]图2为实施方式2中涉及的细胞保持器材的简略平面示意图。

[图3]图3为将HEK293T细胞的接种细胞数和球状体尺寸显示在log-log图的图。

[图4]图4(a)-(f)分别是框架部件的预定保持区的面积为1256μm²、5024μm²、31400μm²、125600μm²、282600μm²和502400μm²时，HEK293T细胞的经过1天培养后的光学显微镜照片。

[图5]图5(a)和(b)分别为框架部件的预定保持区的面积为5024μm²时，HEK293T细胞的从开始培养经过28天后的明视野照片和荧光照片。

[图6]图6为经过各培养时间后、预定保持区的各面积和各球状体尺寸时的HEK293T细胞的细胞群在预定保持区的面积中的占有率的示意图。

[图7]图7为将来源于鸡胚胎(E12)肝脏的细胞的接种细胞数和球状体尺寸显示在log-log图的图。

[图8]图8为经过各培养时间后的来源于鸡胚胎(E12)肝脏的细胞的光学显微镜照片。

[图9]图9为在预定保持区的各面积下的来源于鸡胚胎(E12)各脏器的细胞的经过1天培养后的光学显微镜照片。

[图10]图10为在预定保持区的面积为1256μm²时，来源于鸡胚胎(E12)各脏器的细胞的经过各培养时间后的光学显微镜照片。

[图11]图11为在预定保持区的面积为5024μm²时，来源于鸡胚胎(E12)各脏器的细胞的经过各培养时间后的光学显微镜照片。

[图12]图12为在预定保持区的面积为31400μm²时，来源于鸡胚胎(E12)各脏器的细胞的经过各培养时间后的光学显微镜照片。

[图13]图13为在预定保持区的面积为125600μm²时，来源于鸡胚胎(E12)各脏器的细胞的经过各培养时间后的光学显微镜照片。

[图14]图14为在预定保持区的面积为282600μm²时，来源于鸡胚胎(E12)各脏器的细胞的经过各培养时间后的光学显微镜照片。

[图15]图15为在预定保持区的面积为502400μm²时，来源于鸡胚胎(E12)各脏器的细胞的经过各培养时间后的光学显微镜照片。

[图16]图16为经过各培养时间后和预定保持区的各面积时的来源于鸡胚胎(E12)各脏器的细胞的细胞群在预定保持区的面积中的占有率的示意图。

[图17]图17为使用海绵质海绵(sponge)作为框架部件时的HEK293T细胞的明视野照片、荧光照片和两者的合并照片。

具体实施方式

以下，参照附图并详细说明本发明。在以下参照的附图中，用共通的参照符号表示具有实际相同功能的构成部件，有时省略其说明。并且，为方便说明以下的实施方式中引用的附图的尺寸比例被夸大，有时与实际的比例不同。另外，为方便说明以下的实施方式中引用的附图以结构的简略化或模式化显示，省略了部分构成部件。

(实施方式1)

图1显示了实施方式1涉及的细胞保持器材。图1(a)为细胞保持器材的简略平面示意图。图1(b)为图1(a)中所示细胞保持器材沿A-A'线的截面图。如图1(a)所示，细胞保持器材10配备了框架部件20和细胞群30。

框架部件20包围能保持多个细胞聚集的细胞群的预定保持区22的全部。关于被框架部件20保持的细胞和细胞群，在下文说明。

框架部件20的材料只要不具有细胞毒性则没有特别限制。在本实施方式中，通过框架部件20被细胞群30至少部分覆盖，细胞群30被框架部件20保持。因此，框架部件20的材料可以为具有细胞附着性的基材，也可以为不具细胞附着性的基材。从提高保持力的观点出发，优选具有细胞附着性的基材。作为可以使用的基材，可举出例如聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚酰胺、聚酰亚胺、聚氨酯、聚碳酸酯、多肽等高分子材料或合成树脂材料；不锈钢、磷灰石、磷酸钙等无机化合物；或海绵、纤维素、大豆蛋白、多糖类、明胶、蛋清、菌丝体、脱细胞化组织等天然材料。从细胞附着性的角度来看，基材优选为聚酰亚胺、海绵。

图1(b)中框架部件20的截面形状虽为圆形，但并没有特别限制。关于框架部件20的截面形状，可举出多边形、大致圆形或大致椭圆形。框架部件20的截面径(与预定保持区正交的框架部件截面长度的最大值)没有特别限制。框架部件20的截面径的下限值例如为0.1μm以上、1μm以上、3μm以上、10μm以上。框架部件20的截面径的上限值例如为10mm以下、1mm以下、100μm以下。在一个实施方式中框架部件20的截面径例如可以为25μm或60μm。

预定保持区22为在培养基中框架部件20的内侧部分形成的面，可以为平面也可以为曲面。另外，在图1(a)中，平面观察框架部件20时，预定保持区22的形状虽为圆形，但没有特别限制。平面观察框架部件20时，关于预定保持区22的形状，可举出多边形、大致圆形或大椭圆形等，适宜为大致圆形或大椭圆形。

预定保持区22的面积只要是能将框架部件20浸渍在培养基中的大小则没有特别限制，具体地，例如为1000000μm²以下，适宜为500-600000μm²，更适宜为1000-600000μm²，特别适宜为1000-6000μm²。通过预定保持区22在这样的范围内，可以将细胞群在预定保持区内以高占有率保持。

框架部件20上安装有棒状的棒部件24。棒部件24的基材没有特别限制。棒部件24可以由与框架部件20同样的基材制成，也可以与框架部件20一体成型制造。棒部件24的形状只要能够抓握则没有特别限制。通过抓握棒部件24，可以轻松地操作框架部件20。换句话说，通过抓握棒部件24，可以将被框架部件保持的细胞群30轻松移动等。因此，易于向显微镜观察或检测等提供细胞群30。

细胞群30为膜状的细胞聚集体，其占有预定保持区22的至少一部分并被框架部件20保持。图1(a)中细胞群30虽占有预定保持区22的全部，但细胞群30也可以占有预定保持区22的一部分。细胞群30占有预定保持区22的面积优选为50％以上，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上，最优选占有预定保持区22的全部。

细胞群30的边缘部的至少一部分与框架部件20接触。细胞群30的边缘部与框架部件20之间不需要化学结合。如图1(b)所示，在设定的截面中，框架部件20的外围全部可以被细胞群30的一部分覆盖(参照图1(b)左侧)，框架部件20的外围一部分也可以被细胞群30的一部分覆盖(参照图1(b)右侧)。从提高保持力的观点出发，优选在设定的截面中，框架部件20的外围全部被细胞群30的一部分覆盖。

如图1(b)所示，细胞群30中占有预定保持区22的部分处于空中悬浮的状态。并且，“空中悬浮”是指细胞群30中占有预定保持区22的部分的一面和另一面暴露，是在该细胞群30的一面和另一面存在没有干扰物的空间的状态。由此，例如在观察细胞时没有支架等障碍物。

构成细胞群30的细胞只要是能形成球状体的多个细胞则没有特别限制。“球状体”是指数个以上细胞的大致球状聚集体，也称为凝集体、凝集块。能够形成一个球状体的细胞数下限值例如为10个以上、100个以上、1000个以上、3000个以上。能够形成一个球状体的细胞数上限值例如为1000000个以下、500000个以下、100000个以下、20000个以下。球状体的大小用球状体尺寸表示。球状体尺寸是指使用显微镜等拍摄的球状体外缘内的面积(水平投影面积)。球状体的拍摄可以使用例如相位差显微镜，面积的测量可以使用分析软件。作为相位差显微镜，可以使用例如集成荧光显微镜BZ-X810(KEYENCE公司)，作为分析软件，可以使用例如Leafareacounter Plus。球状体尺寸具体例如为0.01-10.0mm²，适宜为0.1-3.0mm²，进一步适宜为0.2-1.0mm²。若球状体尺寸在这样的范围内，则可以将细胞长时间保持在细胞保持器材。并且，在细胞种类不同的情况下，由于每1个细胞的尺寸不同，因此有即使是同尺寸的球状体，每一个球状体的细胞数也不同的情况。由此，有必要根据细胞种类设定最适细胞数。

另外，本实施方式中涉及的细胞的细胞种类虽没有特别限制，但可举出精子和卵子等生殖细胞；构成生物体的体细胞；正常细胞株；癌细胞株；原代细胞；前体细胞；干细胞；从生物体分离并人为诱导分化的细胞；从生物体分离并人为改变基因的细胞等。作为细胞的细胞种类，可以使用例如HEK293T细胞。这些细胞的来源虽也没有特别限制，但优选来源于人、大鼠、小鼠、豚鼠、兔子等哺乳动物，更优选来源于鸡、家鸭等家禽动物的细胞，进一步优选来源于鸡的细胞。另外，细胞的来源脏器没有特别限制，可举出来源于肝脏、来源于胃、来源于肺、来源于心脏、来源于脑等。并且，本实施方式涉及的细胞的细胞种类只要能形成球状体则不需要一定是单一种类的细胞，细胞群30也可以由多种类的细胞构成。并且，根据细胞的结合特异性，预定保持区22中细胞群30的占有率不同，由于占有率变高，因此优选结合特异性匹配的细胞。作为结合特异性匹配的细胞，可举出构成相同脏器的细胞群即原代细胞，优选特别是来源于肝脏、胃、肺、心脏和脑的原代细胞。

(细胞培养)

细胞的培养可以使用适合要培养的细胞的培养基和培养容器，通过公知的方法例如在37℃、5％CO₂条件下进行。另外，以下说明的培养方法也包括细胞保持器材制作前的细胞在准备阶段中的培养和细胞保持器材制作中的细胞培养的任意一种培养方法。培养可以为静置培养、振荡培养或搅拌培养等任意一种。培养中可以使用调整为期望的温度的孵育箱和恒温槽等。培养可以为附着培养，但优选在至少一部分时间以非附着状态进行培养(例如悬浮培养)。“非附着状态”是指全部或大部分细胞不附着在培养容器表面的状态，包括全部或大部分的细胞远离培养容器表面存在的状态和即使与培养容器表面接触的情况下，不使用器具或酶等通过培养容器的涂层和培养基的对流等可以轻易从培养容器表面剥离的状态。

培养基为可以培养细胞的培养基即可，可以根据使用的细胞种类适当选择并使用。例如，可举出Eagle最低必需培养基(EMEM)、达尔伯克改良Eagle培养基(DMEM)、RPMI-1640培养基、Ham’s F-12培养基等，但并不限于这些。进一步，可以在这些培养基中适当使用有益于细胞培养的公知的材料和添加剂。具体地，例如也可以在这些培养基中添加血清和各种生长因子、诱导分化因子。作为血清，可以使用例如牛胎儿血清(FBS)。在培养期间也可以定期更换培养基。

培养容器虽可以使用任意的容器，但为了促进球状体和/或细胞群的形成，优选不进行提高细胞附着性的处理，进一步优选进行了细胞非(低)附着处理或由细胞非(低)附着材料构成。作为提高细胞附着性的处理，可举出例如用细胞外基质等在容器表面进行涂层的处理。另一方面，作为细胞非(低)附着处理，可举出例如用水凝胶在容器表面进行涂层的处理、用MPC(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)聚合物进行涂层的处理等。

(细胞保持方法)

对细胞保持器材的制作方法进行说明。

首先，准备培养基、细胞和框架部件20(参照图1)。并且，准备的细胞既可以为形成球状体前各个细胞分散的状态，也可以为形成球状体后的状态。无论是哪种状态的细胞，细胞群30被框架部件20保持。

其次，将框架部件20浸渍在含有细胞(或球状体)的培养基中。框架部件20的浸渍时间没有特别限制，可以设为例如1小时以上、2小时以上、5小时以上、10小时以上或24小时以上。并且，若框架部件20上安装棒部件24，则本工序的浸渍和后述工序的取出将变得容易。

将框架部件20浸渍，可以制得在预定保持区内形成膜状的细胞群30的细胞保持器材10。通过上述说明的细胞保持方法，可以轻易制作细胞保持器材。

通过根据上述方法制作的细胞保持器材，可以在不使细胞附着的支架成为细胞观察的障碍的情况下保持细胞，因此对微米级单位的细胞群的操作变得容易。细胞保持器材可以在制作的培养容器内使用，也可以将其取出使用。并且，使用时不必使构成细胞群的每个细胞都存活，构成细胞群的一部分或全部细胞可以为死细胞。

本实施方式涉及的被细胞保持器材保持的细胞群可以被长时间保持。保持时间例如在一个实施方式中可以为开始保持后14天以上，另外在其他的实施方式中可以为开始保持后21天以上或28天以上。

(实施方式2)

图2为实施方式2涉及的细胞保持器材的简略平面示意图。本实施方式涉及的细胞保持器材10的基本结构与实施方式1相同。以下针对与实施方式1不同的结构进行说明。

本实施方式涉及的框架部件20包围预定保持区22的一部分。如此，框架部件20为开放结构时，包括将此开放结构部分的端点彼此以最短距离连接的线而视为框架部件的内侧部分，并规定预定保持区22。

根据本实施方式的细胞保持器材10，在框架部件20的切口部分中，使测量细胞群30的膜厚度和从与预定保持区22平行方向观察变为可能。

(细胞保持器材的用途)

本实施方式涉及的细胞保持器材对微米级单位的细胞群的操作简便，因此可以作为利用细胞生理活性的细胞传感器等利用。换句话说，细胞传感器等传感器包含本实施方式涉及的细胞保持器材。作为细胞传感器可以进行例如培养基成分的有无和/或含有量的推测。另外，也可以作为将细胞外环境的信息转换为电信号和光信号、包含细胞外囊泡的细胞释放物质等的中间装置利用。另一方面，也可以从被细胞保持器材保持的细胞向培养基中提供生长因子。进一步，本实施方式中涉及的细胞保持器材可以作为利用细胞脂质双层膜中存在的转运蛋白等膜蛋白活性的细胞传感器利用。另外，利用在保持的死细胞的细胞膜上形成的脂筏，可以作为病毒和细菌等的分子识别元件利用。

本实施方式涉及的细胞保持器材通过使保持不同的细胞种类的细胞保持器材互相接触，可以制作多细胞组织。这样的多细胞组织可以作为再生医疗和药代动力学评估的工具利用。

本发明并不局限于上述的实施方式，依据本领域技术人员的知识，可以加入各种设计变更等的变形，加入这样的变形的实施方式也包括在本发明的范围内。

本实施方式涉及的细胞保持器材还可以包含多个上述框架部件。包含多个框架部件时，可以为二维的框架部件排列状态，也可以为三维的编织结构。

实施例

《通过聚酰亚胺制框架部件保持HEK293T细胞》

<细胞数和球状体尺寸的关系评估>

为了评估接种细胞数和球状体尺寸的关系，使用实施了细胞非(低)附着处理的培养容器，诱导表达荧光蛋白的HEK293T细胞(编号JCRB9068，独立行政法人医药基盘研究所JCRB细胞库)的球状体形成。具体来说，将设定细胞数的细胞悬浮在含有10％FBS(产品编号S1580-500，biowest公司)的DMEM(产品编号043-30085，富士胶片和光纯药株式会社)中接种，并在37℃、5％CO₂条件下培养。

从培养开始经过1天后，确认到在任意细胞数下都形成了球状体。从通过光学显微镜(集成荧光显微镜BZ-X810，KEYENCE公司)拍摄的照片，使用分析软件(LeafareacounterPlus)测量此时球状体的尺寸。将此时接种细胞数和球状体尺寸显示在log-log图的结果如图3所示。

由图3所示结果可知，将接种细胞数和球状体尺寸绘制在log-log图时，有线性关系。

<细胞保持评估>

将荧光蛋白表达HEK293T细胞悬浮在含有10％FBS的DMEM中，分别以成为设定球状体尺寸的方式接种在实施了细胞非(低)附着处理的培养容器中。同时，作为包围椭圆形预定保持区的全部的框架部件，将预定保持区的面积为设定尺寸的LithoLoops Round(WAKENBTECH株式会社；聚酰亚胺树脂制，框架结构部的截面径：25μm)分别浸渍在接种细胞的孔内(各条件n＝3)。将此孔板静置在孵育箱内并开始在37℃、5％CO₂条件下培养。

在开始培养经过1天后，通过光学显微镜观察孔内的情况并评估细胞是否保持在LithoLoops Round中。图4中分别显示了此时孔内的情况{框架部件的预定保持区的面积为(a)1256μm²；(b)5024μm²；(c)31400μm²；(d)125600μm²；(e)282600μm²；(f)502400μm²}。

当框架部件的预定保持区的面积为1256μm²时，在所有球状体尺寸下细胞都被框架部件保持。同样地，在预定保持区的面积为5024μm²时，球状体尺寸在0.20mm²以上的全部；预定保持区的面积为31400μm²、125600μm²和282600μm²时，球状体尺寸在0.36mm²以上的全部；预定保持区的面积为502400μm²时，球状体尺寸在0.64mm²以上的全部的条件中细胞被框架部件保持。表1中示出各条件中的细胞保持的有无。

表1

<细胞的预定保持区占有率和保持时间的评估>

将在上述细胞保持评估中观察的各LithoLoops Round取出，分别静置在向每个孔添加2mL上述培养基的24孔板(产品编号MS-80120，住友电木株式会社)的培养基中，将此孔板静置在孵育箱中并在37℃、5％CO₂的条件下继续培养。

对于各LithoLoops Round，在开始培养经过设定时间后，用光学显微镜获得明视野照片和荧光照片。作为获得照片的一例，图5中分别显示了在开始培养经过28天后，框架部件的预定保持区的面积为5024μm²时的(a)明视野照片(b)荧光照片。并且，图5(b)中显示的“环形区”为该框架部件的预定保持区。由此结果确认到，细胞群在保持荧光活性的状态下被框架部件保持。进一步，确认到此时全部框架部件被细胞群覆盖；换句话说，在与预定保持区面正交的框架部件全部截面中外围被细胞群覆盖。

接着，使用分析软件，由这些照片算出在预定保持区的面积中细胞群的占有率。图6中显示在各条件下细胞群的预定保持区占有率。各图中，横轴表示球状体尺寸，纵轴表示细胞群的预定保持区占有率。

从图6所示的结果来看，在框架部件的预定保持区的面积为1256μm²和5024μm²且球状体尺寸为0.20mm²、0.36mm²和0.64mm²的条件中，从开始培养经过28天后细胞的预定保持区占有率为50％以上。特别是在框架部件的预定保持区的面积为1256μm²且球状体尺寸为0.36mm²的条件和框架部件的预定保持区的面积为5024μm²且球状体尺寸为0.36mm²和0.64mm²的条件中，从开始培养经过28天后细胞的预定保持区占有率为80％以上。另外，框架部件的预定保持区的面积为1256μm²、球状体尺寸为0.36mm²且从开始培养经过14天后和框架部件的预定保持区的面积为5024μm²、球状体尺寸为0.36mm²且从开始培养经过21天后，细胞的预定保持区占有率为90％以上。根据以上，可确认到细胞群经过开始培养后14天以上的长时间保持在细胞保持器材的预定保持区内。

《通过聚酰亚胺制框架部件保持原代细胞》

<细胞数和球状体尺寸的关系评估>

对于其他种类细胞，为了评估细胞保持器材的预定保持区内是否保持细胞群，使用来源于肝脏的细胞，进行了以下的实验。首先，为了评估接种细胞数与球状体尺寸的关系，使用实施了细胞非(低)附着处理的培养容器，诱导来源于从鸡胚胎(E12)摘出的肝脏的细胞的球状体形成。具体而言，首先，关于来源于肝脏的细胞，从孵蛋第12天的鸡蛋中取出鸡胚胎并摘出肝脏。其次，将摘出的肝脏用网眼尺寸为100μm的细胞过滤器(产品编号93100，SPL Life Science公司)分散，获得来源于肝脏的细胞。将设定细胞数的细胞悬浮在含有10％FBS的DMEM中，并在37℃、5％CO₂的条件下培养。

从培养开始经过1天后，确认到在任意细胞数下都形成了球状体。从用光学显微镜拍摄的照片，使分析软件测量此时的球状体尺寸。将此时接种细胞数和球状体尺寸显示在log-log图的结果如图7所示。

由图7所示结果可知，对于来源于鸡胚胎(E12)的肝脏的细胞而言，与荧光蛋白表达HEK293T细胞同样地，将接种细胞数和球状体尺寸绘制在log-log图时，有线性关系。

<细胞保持评估>

将来源于鸡胚胎(E12)肝脏的细胞悬浮在含有10％FBS的DMEM中，分别以球状体尺寸成为0.20mm²的方式接种在实施了细胞非(低)附着处理的培养容器2个孔中。同时，将预定保持区的面积为1256μm²和5024μm²的LithoLoops Round作为框架部件分别浸渍在接种细胞的孔内。将此孔板静置在孵育箱内并开始在37℃、5％CO₂条件下培养。

从培养开始经过1天后，将各LithoLoops Round取出，分别静置在向每个孔添加2mL上述培养基的24孔板的培养基中。将此孔板静置在孵育箱中并在37℃、5％CO₂的条件下继续培养。

在开始培养经过设定时间后，通过光学显微镜观察孔内的情况并评估细胞是否被框架部件保持。图8中显示了此时孔内的情况。

由图8所示结果来看，来源于鸡胚胎(E12)肝脏的细胞的球状体尺寸为0.20mm²且框架部件的预定保持区的面积为1256μm²和5024μm²时，细胞被框架部件保持。进一步，在任意的条件下均确认到，从开始培养经过14天后，细胞群保持在框架部件的预定保持区内。

<来源于多种脏器的细胞的评估>

进一步对于其他细胞种类，也评估了细胞保持器材的预定保持区内是否保持细胞群。具体而言，首先，用与上述来源于肝脏的细胞相同的方法，获得来源于肝脏、胃、肺、心脏和脑的细胞。在图6中，将开始培养经过28天后形成细胞保持率最高的球状体尺寸的细胞数设定为来源于各脏器的细胞的细胞接种数。表2中显示来源于各脏器的细胞的设定细胞数。这里，如表2所示，来源于脑的细胞的设定细胞数与来源于其他脏器的细胞不同。由此，显示来源于脑的细胞可能占有的预定保持区的面积有可能与其他细胞可能占有的预定保持区的面积不同。

表2

将上述设定了细胞数的来源于各脏器的细胞悬浮在含有10％FBS的DMEM中，并分别接种在实施了细胞非(低)附着处理的培养容器2个孔中。同时，将具有设定的预定保持区的面积的LithoLoops Round作为框架部件分别浸渍在接种细胞的孔内。将此孔板静置在孵育箱内并开始在37℃、5％CO₂条件下培养。

从培养开始经过1天后的各孔内情况如图9所示。对于任意来源于脏器的细胞，在框架部件预定保持区的所有面积且所有球状体尺寸下，细胞均被框架部件保持。接着，将各LithoLoops Round取出，分别静置在向每个孔添加2mL上述培养基的24孔板的培养基中。将此孔板静置在孵育箱中并在37℃、5％CO₂的条件下继续培养。

对于各LithoLoops Round，在开始培养经过设定时间后，用光学显微镜获得明视野照片。显示了在框架部件预定保持区的面积分别为1256μm²(图10)、5024μm²(图11)、31400μm²(图12)、125600μm²(图13)、282600μm²(图14)和502400μm²(图15)中的从培养开始经过1、7、14天后的明视野照片。

接着，使用分析软件，由这些照片算出在预定保持区的面积中细胞群的占有率。此时，在各照片中去除预定保持区内气泡重叠的部分而计算。图16中显示在各条件下细胞群的预定保持区占有率。各图中，纵轴表示细胞群的预定保持区占有率。另外，表3中显示各细胞从开始培养经过14天后的预定保持区占有率。并且，在图6中显示HEK293T细胞从开始培养经过28天后形成细胞保持率最高的球状体尺寸的细胞数下的预定保持区占有率。

表3

从表3中所示的结果来看，即使在HK293T细胞中预定保持区占有率不足50％的框架部件的预定保持区的面积为282600μm²和502400μm²时，对于任意来源于脏器的细胞，从开始培养经过14天后，预定保持区占有率也都在50％以上。特别是在框架部件的预定保持区的面积为282600μm²时，来源于心脏、胃、脑和肺的细胞的条件下；在面积为502400μm²时，来源于胃、脑和肺的细胞的条件下，在开始培养经过14天后，细胞群占有预定保持区的全部。

《通过海绵制框架部件保持HEK293T细胞》

对于聚酰亚胺制框架部件以外，为了评估框架部件的预定保持区内是否保持细胞群，使用海绵质海绵(海绵制框架部件；框架结构部的截面径：约30-60μm)，进行了以下的实验。将荧光蛋白表达HEK293T细胞悬浮在含有10％FBS的DMEM中，分别以球状体尺寸成为0.36mm²的方式接种在各个实施了细胞非(低)附着处理的培养容器中。同时，将海绵质海绵(ROSYROSA公司)作为框架部件浸渍在接种细胞的孔内。将此孔板静置在孵育箱内并开始在37℃、5％CO₂条件下培养。

在开始培养经过1天后，通过光学显微镜观察孔内的情况并确认到细胞被框架部件保持。接着，将观察的各细胞保持器材取出，静置在向每个孔添加2mL上述培养基的24孔板的培养基中。对于此时海绵质海绵的情况，用光学显微镜获得明视野照片和荧光照片。图17中显示此时明视野照片(左上)、荧光照片(右上)和它们的合并照片(下)。

通过图17中所示的结果，确认到海绵质海绵的框架结构部的一部分保持着细胞群。进一步，对于此框架结构部，使用分析软件，计算该框架结构部形成的预定保持区的面积和该预定保持区的面积中细胞群的占有率。其结果，该框架结构部形成的预定保持区的面积为4717μm²，该预定保持区的面积中细胞群的占有率为100％。由以上表明通过海绵制框架部件也能保持细胞。

产业上的利用可能性

本发明可以利用于细胞保持器材的制造，上述细胞保持器材可以作为利用细胞生理活性的细胞传感器、再生医疗和药代动力学评估的工具等使用。

符号说明

10：细胞保持器材，

20：框架部件，

22：预定保持区，

24：棒部件，

30：细胞群。

Claims (16)

1.细胞保持器材，其具备：

框架部件，其包围能保持多个细胞聚集的细胞群的预定保持区的至少一部分或全部；以及

膜状的所述细胞群，其占有所述预定保持区的至少一部分并被所述框架部件保持；

其中，所述细胞群的边缘部的至少一部分与所述框架部件接触，并且所述细胞群中占有所述预定保持区的部分处于空中悬浮的状态。

2.根据权利要求1所述的细胞保持器材，其中在与所述预定保持区面正交的一截面中的所述框架部件的外围被所述细胞群至少部分覆盖。

3.根据权利要求1或2所述的细胞保持器材，其中所述细胞群占有所述预定保持区的面积的50％以上。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的细胞保持器材，其中所述预定保持区为大致圆形或大致椭圆形。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的细胞保持器材，其中所述框架部件包围所述预定保持区的全部。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的细胞保持器材，其中所述细胞群的细胞为原代细胞。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的细胞保持器材，其中所述细胞群的细胞为以选自肝脏、胃、肺、心脏或脑的脏器作为来源的细胞。

8.根据权利要求6或7所述的细胞保持器材，其中所述预定保持区的面积为1000-600000μm²。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的细胞保持器材，其中所述预定保持区的面积为1000-6000μm²。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的细胞保持器材，其中所述细胞群形成球状体时的球状体尺寸为0.2-1.0mm²。

11.传感器，其包含权利要求1-10中任一项所述的细胞保持器材。

12.框架部件，其为用于将多个细胞聚集的细胞群的一部分保持在空中悬浮的状态的框架部件，

其包围能保持所述细胞群的预定保持区的至少一部分或全部。

13.根据权利要求12所述的框架部件，其中所述预定保持区的面积为1000-6000μm²。

14.细胞保持方法，其为将多个细胞聚集的细胞群的一部分保持在空中悬浮的状态的方法，

其包括将包围所述细胞群的预定保持区的至少一部分或全部的框架部件浸渍在含有所述细胞群或所述细胞群形成的球状体的培养基中的工序。

15.根据权利要求14所述的细胞保持方法，其中所述预定保持区的面积为1000-6000μm²。

16.根据权利要求14或15所述的细胞保持方法，其中所述细胞群形成球状体时的球状体尺寸为0.2-1.0mm²。