KR101746156B1 - 세포 패터닝용 물질, 이의 제조 방법, 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
일 양상에 따른 세포 패터닝용 물질, 세포 패터닝용 물질을 제조하는 방법, 세포 패터닝용 물질을 이용한 세포 패터닝 방법, 세포 패터닝 방법에 의해 패턴이 형성된 세포를 포함하는 바이오센서를 제공한다. 이에 따르면, 편리하고 효율적으로 세포를 패터닝할 수 있고, 패터닝된 세포를 이용하여 세포의 상태 모니터링 및 고효율 스크리닝이 가능하다.
Description
세포 패터닝용 물질, 이의 제조 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.
세포 패터닝(cell patterning) 기술은 마이크로미터 수준의 특정 영역에 선택적으로 세포를 고정화시키는 기술로서, 세포-세포, 세포-표면, 또는 세포-매트릭스 사이의 상호작용과 같은 세포 생물학을 연구하는데 필요한 모델 시스템을 제공하고, 바이오센서(biosensor) 및 바이오칩(biochip) 개발을 위한 기반 기술이다. 최근, 시험관 내 분석, 진단, 및 신약 개발에 소요되는 비용을 절감하고 높은 효율을 위해 고효율 검색(high throughput screening)의 필요성이 강조되면서, 세포 패터닝 기술을 이용하여 세포를 어레이화 및 소형화하려는 노력이 진행중이다.
최근, 세포 패터닝 방법으로, 금속이나 플라스틱과 같은 2차원 표면을 포토리소그래피(photolithography) 또는 소프트 리소그래피(soft lithography)를 이용하여 마이크로패터닝하고, 패터닝된 표면 위에서 세포를 배양하여 세포의 성장 및 배양을 제어하는 마이크로컨택트 프린팅(microcontact printing) 방법이 널리 이용되고 있다.
그러나, 마이크로패터닝된 기질 표면 위에서 세포를 배양하는 것은 세포 배양 조건이 변경되고, 세포 패터닝에 의한 물리적 자극의 강도 또는 조건 등을 제어하기 어려운 문제가 있다.
따라서, 간단한 방법으로 세포 배양 환경을 유지하면서 세포 패터닝에 의한 자극을 조절할 수 있는 세포 패터닝 방법 및 이를 이용한 바이오센서를 개발할 필요가 있다.
세포 패터닝용 물질을 제공한다.
세포 패터닝용 물질을 제조하는 방법을 제공한다.
세포 패터닝 방법을 제공한다.
패터닝된 세포를 포함하는 바이오센서를 제공한다.
일 양상은 트랜스웰 챔버의 하단부에 부착된 알기네이트 히드로겔을 포함하는 세포 패터닝용 물질을 제공한다.
상기 트랜스웰 챔버(transwell chamber)는 하단부에 미세다공성 막을 포함하는 챔버를 말한다. 상기 트랜스웰 챔버는 트랜스웰 상부 챔버(transwell upper chamber) 또는 트랜스웰 인서트(transwell insert)로도 지칭된다. 상기 미세다공성 막은 완충액, 세포성 물질, 또는 배양 배지 등의 물질이 투과하지만 세포는 투과할 수 없는 지지체이다. 미세다공성 막의 포어 크기는 당업자가 적절히 채택할 수 있고, 예를 들어 0.4 ㎛ 내지 0.8 ㎛이다. 예를 들어, 미세다공성 막은 폴리카르보네이트, 폴리에스테르, 및 콜라겐-코팅된 폴리테트라플루오로에틸렌이다. 상기 트랜스웰 챔버는 당해 기술분야에서 널리 사용되는 것으로, 상업적으로 시판되는 제품일 수 있다.
상기 알기네이트 히드로겔(alginate hydrogel)은 패턴이 형성된 것일 수 있다. 알기네이트 히드로겔에 형성된 패턴의 홈의 너비는 약 0.1 ㎛ 내지 약 50 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 50 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 40 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 30 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 20 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 10 ㎛, 또는 약 10 ㎛일 수 있다. 알기네이트 히드로겔에 형성된 패턴의 마루의 너비는 약 0.1 ㎛ 내지 약 50 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 50 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 40 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 30 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 20 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 10 ㎛, 또는 약 10 ㎛일 수 있다. 알기네이트 히드로겔에 형성된 패턴의 홈과 마루 사이의 높이는 0.1 ㎛ 내지 50 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 40 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 30 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 20 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 10 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 2 ㎛, 또는 0.1 ㎛ 내지 0.5 ㎛일 수 있다.
상기 알기네이트는 N-말단으로부터 아르기닌-글리신-아스파르트산의 아미노산 서열(Arg-Gly-Asp: RGD)을 갖는 폴리펩티드를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. RGD 아미노산 서열은 알기네이트와 세포의 부착을 매개하는 결합제 또는 리간드일 수 있다.
상기 알기네이트 히드로겔은 트랜스웰 챔버의 하단부에 부착될 수 있다. 예를 들어, 상기 알기네이트 히드로겔은 트랜스웰 챔버의 하단부의 바깥쪽 바닥면에 부착될 수 있다. 상기 알기네이트 히드로겔은 막의 형태일 수 있다.
세포 패터닝(cell patterning)은 마이크로미터 수준으로 여러 세포들을 특정한 위치 또는 방향으로 고정시키는 것을 말한다. 상기 세포는 살아있는 세포일 수 있다.
일 양상은 패턴이 형성된 고분자 몰드에 알기네이트 용액을 위치시키는 단계; 상기 고분자 몰드에 위치한 알기네이트 용액에 트랜스웰 챔버를 접촉시키는 단계; 상기 트랜스웰 챔버에 칼슘 용액을 가하여 알기네이트 용액을 알기네이트 히드로겔로 겔화시키는 단계; 및 기 트랜스웰 챔버에 부착된 알기네이트 히드로겔과 고분자 몰드를 분리는 단계를 포함하는, 트랜스웰 챔버의 하단부에 부착된 알기네이트 히드로겔을 포함하는 세포 패터닝용 물질을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 트랜스웰 챔버, 알기네이트 히드로겔, 및 알기네이트는 전술한 바와 같다.
상기 방법은 패턴이 형성된 고분자 몰드에 알기네이트 용액을 위치시키는 단계를 포함한다.
상기 패턴이 형성된 고분자 몰드는 당해 기술분야에 알려진 방법에 따라 제조된 것일 수 있다. 고분자 몰드에 형성된 패턴의 홈의 너비는 약 0.1 ㎛ 내지 약 50 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 50 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 40 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 30 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 20 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 10 ㎛, 또는 약 10 ㎛일 수 있다. 상기 고분자 몰드에 형성된 패턴의 마루의 너비는 약 0.1 ㎛ 내지 약 50 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 50 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 40 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 30 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 20 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 10 ㎛, 또는 약 10 ㎛일 수 있다. 상기 고분자 몰드에 형성된 패턴의 홈과 마루 사이의 높이는 0.1 ㎛ 내지 50 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 40 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 30 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 20 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 10 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 2 ㎛, 또는 0.1 ㎛ 내지 0.5 ㎛일 수 있다.
상기 고분자 몰드는 알킬실록산(alkylsiloxane), 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리락트산, 폴리히드록시산, 폴리아미드, 폴리아미노산, 폴리아세탈, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리우레탄, 폴리피롤, 폴리에스테르, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리카르보네이트. 폴리에폭시에탄, 또는 이들의 조합일 수 있다. 알킬실록산은 예를 들어 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane: PDMS)일 수 있다.
상기 패턴이 형성된 고분자 몰드에 졸(sol) 상태의 알기네이트 용액을 위치시킬 수 있다. 예를 들어, 패턴이 형성된 몰드 위에 졸(sol) 상태의 알기네이트 용액을 떨어트릴 수 있다. 알기네이트 용액은 RGD 아미노산 서열을 포함하거나 포함하지 않는 알기네이트의 용액일 수 있다.
상기 방법은 고분자 몰드에 위치한 알기네이트 용액에 트랜스웰 챔버를 접촉시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 고분자 몰드에 위치한 알기네이트 용액 위에 트랜스웰 챔버를 올려놓을 수 있다.
상기 방법은 트랜스웰 챔버에 칼슘 용액을 가하여 알기네이트 용액을 알기네이트 히드로겔로 겔(gel)화시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 트랜스웰 챔버의 내부에 칼슘 용액을 가하면 칼슘 용액이 트랜스웰 챔버의 미세다공성 막을 투과하고, 투과된 칼슘 용액이 알기네이트 용액을 겔화시킬 수 있다. 패턴이 형성된 고분자 몰드에 알기네이트 용액이 위치하므로, 알기네이트 용액이 겔화되면 고분자 몰드의 패턴에 반대되는 상을 갖는 알기네이트 히드로겔을 수득할 수 있다.
상기 칼슘 용액은 CaCl2, CaSO4, CaCO3, 또는 이들의 조합의 용액일 수 있다.
상기 방법은 트랜스웰 챔버에 부착된 알기네이트 히드로겔과 고분자 몰드를 분리하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 고분자 몰드로부터 트랜스웰 챔버에 부착된 알기네이트 히드로겔을 떼어낼 수 있다.
일 양상은 세포와, 트랜스웰 챔버의 하단부에 부착된 알기네이트 히드로겔을 포함하는 세포 패터닝용 물질을 접촉시키는 단계; 상기 세포 패터닝용 물질의 트랜스웰 챔버에 알기네이트 분해 효소 또는 칼슘 킬레이트 제제를 가하여 알기네이트 히드로겔을 제거하는 단계; 및 상기 세포와 트랜스웰 챔버를 분리하는 단계를 포함하는, 세포 패터닝 방법을 제공한다.
상기 트랜스웰 챔버, 알기네이트 히드로겔, 알기네이트, 및 세포 패터닝용 물질은 전술한 바와 같다.
상기 방법은 세포와, 트랜스웰 챔버의 하단부에 부착된 알기네이트 히드로겔을 포함하는 세포 패터닝용 물질을 접촉시키는 단계를 포함한다.
상기 세포는 근육 세포, 신경 세포, 줄기 세포, 결합 조직 세포, 혈관 세포, 또는 상피 세포일 수 있다.
상기 세포와 상기 세포 패터닝용 물질을 접촉시키는 시간은 약 1 분 내지 약 24 시간, 약 1 분 내지 약 18 시간, 약 1 분 내지 약 12 시간, 약 1 분 내지 약 6 시간, 약 1 분 내지 약 1 시간, 약 1 분 내지 약 30 분, 또는 약 1 분 내지 약 5 분일 수 있다. 세포와 상기 세포 패터닝용 물질을 접촉에 의해 알기네이트 히드로겔은 세포에 물리적인 자극을 가할 수 있다. 따라서, 세포 패터닝용 물질의 알기네이트 히드로겔의 패턴에 따라 세포가 패터닝될 수 있다.
상기 방법은 세포 패터닝용 물질의 트랜스웰 챔버에 알기네이트 분해 효소 또는 칼슘 킬레이트 제제를 가하여 알기네이트 히드로겔을 제거하는 단계를 포함한다. 세포 패터닝용 물질의 트랜스웰 챔버의 안 또는 밖에 알기네이트 분해 효소 또는 칼슘 킬레이트 제제를 첨가하여 알기네이트 히드로겔을 제거시킬 수 있다. 알기네이트 분해 효소는 트랜스웰 챔버의 하단부에 부착된 알기네이트 히드로겔을 분해시킬 수 있다. 칼슘 킬레이트 제제는 트랜스웰 챔버의 하단부에 부착된 알기네이트 히드로겔을 졸(sol) 상태의 알기네이트 용액으로 변형시킬 수 있다. 상기 칼슘 킬레이트 제제는 시트레이트(Citrate), 에틸렌디아민 테트라아세트산(ethylenediamine tetraacetic acid: EDTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(ethyleneglycol tetraacetic acid: EGTA), BAPTA-AM, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 방법은 트랜스웰 챔버에 알기네이트 분해 효소 또는 칼슘 킬레이트 제제를 가한 후 인큐베이션하는 단계를 더 포함할 수 있다. 인큐베이션하는 시간은 약 1 분 내지 약 48 시간, 약 1 분 내지 약 36 시간, 약 1 분 내지 약 24 시간, 약 1 분 내지 약 12 시간, 약 1 분 내지 약 6 시간, 또는 약 1 분 내지 약 1 시간일 수 있다. 알기네이트 히드로겔에 의해 일정 시간 또는 일정 자극을 세포에 가하고, 알기네이트 분해 효소 또는 칼슘 킬레이트 제제를 이용하여 알기네이트 히드로겔을 제거할 수 있다. 따라서, 세포 패터닝에 의한 물리적 자극의 강도 또는 조건 등을 제어할 수 있다.
상기 방법은 세포와 트랜스웰 챔버를 분리하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 세포를 포함한 배양액에서 트랜스웰 챔버를 떼어낼 수 있다. 상기 세포는 세포 패턴을 약 1 분 내지 약 15 일, 약 1 분 내지 약 10 일, 약 1 분 내지 약 7 일, 약 1 분 내지 약 3 일, 또는 약 1 분 내지 약 1 일을 유지할 수 있다. 세포 패터닝용 물질을 제거한 후에도 세포 배양 환경을 유지하면서 세포가 세포 패턴을 유지하므로, 세포의 배양 환경에서 간편하게 세포 어레이, 바이오칩, 또는 바이오센서 등을 제조할 수 있다.
일 양상은 전술한 방법으로 패터닝된 세포를 포함하는 바이오센서를 제공한다.
바이오센서(biosensor)는 생물이 가지고 있는 기능을 이용하여 물질이나 세포의 성질 등을 조사하는 장치를 말한다. 상기 바이오센서는 전술한 방법으로 패턴이 형성된 세포 및 그 세포기 부착된 배양 용기를 포함하는 장치일 수 있다.
일 양상에 따른 세포 패터닝용 물질, 세포 패터닝용 물질을 제조하는 방법, 세포 패터닝용 물질을 이용한 세포 패터닝 방법, 세포 패터닝 방법에 의해 패터닝된 세포를 포함하는 바이오센서에 따르면, 편리하고 효율적으로 세포를 패터닝할 수 있고, 패터닝된 세포를 이용하여 세포의 상태 모니터링 및 고효율 스크리닝이 가능하다.
도 1a는 패턴이 형성된 알기네이트 히드로겔을 준비하는 방법을 나타내는 모식도이고, 도 1b는 준비된 PDMS 몰드의 전자현미경 사진 및 알기네이트 히드로겔의 위상차 광학현미경 사진이다.
도 2a는 알기네이트 히드로겔 스탬핑(stamping)을 통한 세포 패터닝 방법을 나타내는 모식도이고, 도 2b는 스탬핑된 세포의 이미지이다.
도 3은 알기네이트 히드로겔의 높이 및 스탬핑 시간에 따른 세포의 이미지이다(음성 대조군: PDMS 몰드로 스탬핑한 세포).
도 4는 스탬핑된 세포를 각각 세포골격 및 항-MF20 항체로 면역염색하여 수득한 이미지이다.
도 5는 패턴이 형성된 알기네이트 히드로겔을 사용하여 세포를 스탬핑한 후 알기네이트 히드로겔을 제거하는 경우, 0일, 3일, 또는 7일 동안 배양된 세포를 면역염색하여 수득한 이미지이다.
도 2a는 알기네이트 히드로겔 스탬핑(stamping)을 통한 세포 패터닝 방법을 나타내는 모식도이고, 도 2b는 스탬핑된 세포의 이미지이다.
도 3은 알기네이트 히드로겔의 높이 및 스탬핑 시간에 따른 세포의 이미지이다(음성 대조군: PDMS 몰드로 스탬핑한 세포).
도 4는 스탬핑된 세포를 각각 세포골격 및 항-MF20 항체로 면역염색하여 수득한 이미지이다.
도 5는 패턴이 형성된 알기네이트 히드로겔을 사용하여 세포를 스탬핑한 후 알기네이트 히드로겔을 제거하는 경우, 0일, 3일, 또는 7일 동안 배양된 세포를 면역염색하여 수득한 이미지이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
히드로겔
스탬핑을
통한 세포 패터닝
1. 패턴이 형성된
히드로겔
판의 준비
소프트 리소그래피 기술을 이용하여, 이방성(anisotropic) 패턴이 형성된 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane: PDMS) 몰드(Dowcorning, Sylgard 184 elastomer kit)를 준비하였다. 제작된 PDMS에서, 홈(groove)의 길이는 10 ㎛이고, 마루(ridge)의 길이 10 ㎛이고, 및 홈과 마루 사이의 높이는 0 ㎛(평평함), 0.5 ㎛, 2 ㎛, 또는 20 ㎛이다.
2%(w/v)의 RGD-변형된 알기네이트(PRONOVA™ UP MVG, Cat. No. 4200106) 용액을 준비된 PDMS 몰드 위에 올려놓았다. PDMS 몰드 상의 알기네이트 용액 위에 트랜스웰(transwell)(Millipore® Millicell®cell culture plate inserts, 포어 크기 0.4 ㎛, 직경 30 mm, Sigma-Aldrich, Cat. No. Z353086)을 위치시켰다. 트랜스웰에 1 mM의 CaCl2 용액 (Sigma-Aldrich)을 가하여 알기네이트를 겔화시켰다. 그 후, PDMS 몰드를 제거하여, 트랜스웰에 히드로겔이 부착되고 패턴이 형성된 알기네이트 히드로겔(이하, 'RGD-변형된 알기네이트 히드로겔'이라 함)을 준비하였다. 한편, RGD를 포함하지 않는 소듐 알기네이트을 사용하여 패턴이 형성된 알기기네이트 히드로겔(이하, '플레인(plain) 알기네이트 히드로겔'이라 함)을 준비하였다.
패턴이 형성된 알기네이트 히드로겔을 준비하는 방법을 나타내는 모식도를 도 1a에 나타내었다(점선: 확대 이미지). 또한, 준비된 PDMS 몰드 및 알기네이트 히드로겔의 전자현미경 사진을 도 1b에 나타내었다(흰 막대의 길이: 50 ㎛). 도 1b에 나타난 바와 같이, 준비된 알기네이트 히드로겔에 패턴이 형성된 것을 확인하였다.
2.
알기네이트
히드로겔
스탬핑을
통한 세포 패터닝의 확인
C2C12 마우스 근육 근아세포(ATCC, Cat.No. CRL-1772)를 배양 접시에 접종하고, 세포가 접종된 배양 접시에 10%(v/v) 우태아 혈청(FBS)과 1%(w/v) 페니실린-스트렙토마이신(Gibco®, Life Technologies)을 포함한 DMEM 배지를 첨가하였다. 접종된 세포를 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 24 시간 동안 배양하였다.
1.에서 준비된 알기네이트 히드로겔을 배양 접시의 세포 위에 올려놓고, 세포를 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 12 내지 24 시간 동안 배양하였다. 음성 대조군으로 플레인 알기네이트 히드로겔을 이용하였다.
배양 접시 위에 세포층이 위치하고, 그 위에 패턴이 형성된 알기네이트 히드로겔이 위치된다. 알기네이트 히드로겔이 세포에 물리적인 자극을 가함으로써, 알기네이트 히드로겔의 패턴에 따라 패턴이 형성된 세포층을 생성할 수 있다. 그 후, 배양 접시에 4 유닛/㎖의 알기네이트 분해효소(Sigma, a1603)를 첨가하였다. 배양 접시를 37℃의 온도에서 60 분 이상 인큐베이션하여 알기네이트 히드로겔을 분해시키고, 배양 접시에서 트랜스웰을 제거하였다.
이와 같은, 알기네이트 히드로겔 스탬핑(stamping)을 통한 세포 패터닝 방법을 나타내는 모식도를 도 2a에 나타내었다(점선: 세포의 상태를 나타내는 모식도).
알기네이트 히드로겔을 이용하여 스탬핑한 세포를 파라포르말린으로 고정하고, 로다민-팔로이딘(Rhodamine-phalloidin)을 사용하여 세포 골격을 염색하였다. 염색된 세포를 형광 현미경으로 관찰하고, 그 이미지를 도 2b에 나타내었다(흰 막대: 50 ㎛). 높이 0 ㎛의 플레인 알기네이트 히드로겔 또는 RGD-변형된 알기네이트 히드로겔로 스탬핑한 세포는 거의 방향성이 없고, 높이가 증가할수록 플레인 알기네이트 히드로겔 또는RGD-변형된 알기네이트 히드로겔로 스탬핑한 세포의 방향성이 증가하였다. 따라서, 패턴이 형성된 알기네이트 히드로겔을 이용하여 세포 패터닝이 가능함을 확인하였다.
3.
알기네이트
히드로겔
스탬핑에
의한 세포 패턴의 특성 확인
(1)
알기네이트
히드로겔의
높이 및
스탬핑
시간에 따른 세포 패턴 변화
2.에 기재된 방법과 같이, 높이 0 ㎛, 0.5 ㎛, 2 ㎛, 또는 20 ㎛의 플레인 알기네이트 히드로겔 또는 RGD-변형된 알기네이트 히드로겔을 사용하여, 0 분, 5 분, 30 분, 또는 60 분 동안 세포를 스탬핑하였다. 그 후, 배양 접시에 4 유닛/㎖의 알기네이트 분해효소(Sigma, a1603)를 첨가하고, 배양 접시를 37℃의 온도에서 120 분 동안 인큐베이션하여 알기네이트 히드로겔을 분해시켰다. 배양 접시에서 트랜스웰을 제거하고, 배양 접시의 세포를 로다민-팔로이딘(Invitrogen, R415)을 이용하여 세포를 염색하였다. 음성 대조군으로, 플레인 PDMS 몰드, 또는 피브로넥틴(fibronectin: FN)으로 코팅한 PDMS 몰드로 스탬핑한 세포를 사용하였다.
염색된 세포를 형광 현미경으로 확인하고 그 이미지를 도 3에 나타내었다(흰 막대: 200 ㎛). 도 3에 나타난 바와 같이, 알기네이트 히드로겔의 높이와 스탬핑한 시간이 증가할수록 세포가 정렬되었다. 따라서, 패턴이 형성된 알기네이트 히드로겔에서 스탬핑한 세포는 알기네이트 히드로겔의 높이 및 스탬핑 시간에 따라 세포패터닝을 조절할 수 있음을 확인하였다.
(2)
알기네이트
히드로겔을
이용하여
스탬핑된
세포의 분화 특성
2.에 기재된 방법과 같이, 높이 0 ㎛, 0.5 ㎛, 2 ㎛, 또는 20 ㎛의 플레인 알기네이트 히드로겔 또는 RGD-변형된 알기네이트 히드로겔을 사용하여, 12 내지 24 시간 동안 세포를 스탬핑하였다. 그 후, 배양 접시에 4 유닛/㎖의 알기네이트 분해효소(Sigma, a1603)를 첨가하고, 배양 접시를 37℃의 온도에서 120 분 동안 인큐베이션하여 알기네이트 히드로겔을 분해시켰다. 배양 접시에서 트랜스웰을 제거하고, 파라포름알데하이드를 사용하여 세포를 고정하였다.
세포 골격과 근육 세포의 분화 시 나타나는 근관(myotube)의 마커인 F-actin과 MF20을 검출하기 위해, 고정된 세포에 각각 로다민-팔로이딘(Invitrogen, R415)와 항-MF20 항체(Developmental Studies Hybridoma Bank, MF20)를 가하여 면역 염색하였다. 면역염색 후 세포를 형광 현미경으로 관찰하고, 항-팍실린 항체 및 항-MF20 항체으로 면역염색된 세포의 이미지를 도 4 (흰 막대: 100 ㎛)에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 플레인 알기네이트 히드로겔을 사용하여 세포를 스탬핑한 세포보다 RGD-변형된 알기네이트 히드로겔을 사용하여 스탬핑한 세포 및 세포 내 근관이 더 정렬되어 있고, 알기네이트 히드로겔의 높이에 따라 세포 및 근육 분화 시 나타나는 근섬유가 패턴의 방향에 맞게 정렬됨을 확인하였다.
(3)
알기네이트
히드로겔의
제거 후 세포 패턴의 유지
패턴이 형성된 알기네이트 히드로겔을 사용하여 세포를 스탬핑한 후 알기네이트 히드로겔을 제거하는 경우, 이미 형성된 세포 패턴이 유지될 수 있는지 확인하였다.
2(2)에 기재된 방법과 같이, 높이 0 ㎛, 0.5 ㎛, 2 ㎛, 또는 20 ㎛의 플레인 알기네이트 히드로겔 또는 RGD-변형된 알기네이트 히드로겔을 사용하여, 12 내지 24 시간 동안 세포를 스탬핑하고, 알기네이트 분해효소를 사용하여 알기네이트 히드로겔을 분해시켰다. 트랜스웰을 제거하고, 스탬핑된 세포를 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 0일, 3일, 또는 7일 동안 배양하였다. 배양된 세포를 파라포름 알데히드를 사용하여 세포를 고정하였다.
고정된 세포에 세포 골격 염색약을 이용하여, 형광 현미경으로 관찰하여 염색된 세포의 이미지를 도 5에 나타내었다(흰 막대: 50 ㎛). 도 5에 나타난 바와 같이, 플레인 알기네이트 히드로겔 또는 RGD-변형된 알기네이트 히드로겔을 사용하여 세포를 스탬핑하고 알기네이트 히드로겔을 제거한 경우, 7 일이 경과하여도 세포가 정렬되었다. 따라서, 패턴이 형성된 알기네이트 히드로겔을 사용하면, 알기네이트 히드로겔을 제거한 후에도 세포의 패턴이 유지됨을 확인하였다.
Claims (18)
- 트랜스웰 챔버의 하단부에 부착된 알기네이트 히드로겔을 포함하고,
상기 알기네이트 히드로겔의 하부 표면은 세포의 상단부와 접촉하는 세포 패터닝용 물질. - 청구항 1에 있어서, 상기 알기네이트 히드로겔은 패턴이 형성된 것인 세포 패터닝용 물질.
- 청구항 2에 있어서, 상기 알기네이트 히드로겔의 홈의 너비는 0.1 ㎛ 내지 50 ㎛이고, 마루는 0.1 ㎛ 내지 50 ㎛이고, 및 홈과 마루 사이의 높이는 0.1 ㎛ 내지 50 ㎛인 것인 세포 패터닝용 물질.
- 청구항 3에 있어서, 홈과 마루 사이의 높이는 0.1 ㎛ 내지 20 ㎛인 것인 세포 패터닝용 물질.
- 청구항 1에 있어서, 상기 알기네이트는 N-말단으로부터 아르기닌-글리신-아스파르트산의 아미노산 서열(Arg-Gly-Asp: RGD)을 갖는 폴리펩티드를 포함하거나 포함하지 않는 것인 세포 패터닝용 물질.
- 패턴이 형성된 고분자 몰드에 알기네이트 용액을 위치시키는 단계;
상기 고분자 몰드에 위치한 알기네이트 용액에 트랜스웰 챔버를 접촉시키는 단계;
상기 트랜스웰 챔버에 칼슘 용액을 가하여 알기네이트 용액을 알기네이트 히드로겔로 겔화시키는 단계; 및
상기 트랜스웰 챔버에 부착된 알기네이트 히드로겔과 고분자 몰드를 분리하는 단계를 포함하는, 청구항 1의 세포 패터닝용 물질을 제조하는 방법. - 청구항 6에 있어서, 상기 고분자 몰드의 홈의 너비는 0.1 ㎛ 내지 50 ㎛이고, 마루는 1 ㎛ 내지 50 ㎛이고, 및 홈과 마루 사이의 높이는 0.1 ㎛ 내지 50 ㎛인 것인 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 고분자 몰드는 알킬실록산, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 폴리락트산, 폴리히드록시산, 폴리아미드, 폴리아미노산, 폴리아세탈, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리우레탄, 폴리피롤, 폴리에스테르, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리카르보네이트. 폴리에폭시에탄, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 알킬실록산은 폴리디메틸실록산인 것인 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 알기네이트는 RGD 아미노산 서열을 포함하거나 포함하지 않는 알기네이트인 것인 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 칼슘 용액은 CaCl2, CaSO4, CaCO3, 또는 이들의 조합 용액인 것인 방법.
- 세포와 청구항 1의 세포 패터닝용 물질을 접촉시켜 알기네이트 히드로겔의 하부 표면과 세포의 상단부를 접촉시키는 단계;
상기 세포 패터닝용 물질의 트랜스웰 챔버에 알기네이트 분해 효소 또는 칼슘 킬레이트 제제를 가하여 알기네이트 히드로겔을 제거하는 단계; 및
상기 세포와 트랜스웰 챔버를 분리하는 단계를 포함하는, 세포 패터닝 방법. - 청구항 12에 있어서, 상기 세포는 근육 세포, 신경 세포, 줄기 세포, 결합 조직 세포, 혈관 세포, 또는 상피 세포인 것인 방법.
- 청구항 12에 있어서, 세포와 청구항 1의 세포 패터닝용 물질을 접촉시키는 시간은 1 초 내지 24 시간인 것인 방법.
- 청구항 12에 있어서, 상기 트랜스웰 챔버에 알기네이트 분해 효소 또는 칼슘 킬레이트 제제를 가한 후 인큐베이션하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 청구항 15에 있어서, 상기 칼슘 킬레이트 제제는 시트레이트(Citrate), 에틸렌디아민 테트라아세트산(ethylenediamine tetraacetic acid: EDTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(ethyleneglycol tetraacetic acid: EGTA), BAPTA-AM, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
- 청구항 15에 있어서, 상기 인큐베이션은 1 분 내지 2 일 동안 수행되는 것인 방법.
- 청구항 12의 방법으로 패턴된 세포를 포함하는 바이오센서.
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