KR102184516B1 - 전기화학 반응을 이용한 세포 패터닝 방법 및 세포가 패터닝된 세포 패턴 기판을 포함하는 약물 스크리닝 장치 - Google Patents
전기화학 반응을 이용한 세포 패터닝 방법 및 세포가 패터닝된 세포 패턴 기판을 포함하는 약물 스크리닝 장치 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 전기화학 반응을 이용한 세포 패터닝 방법 및 세포가 패터닝된 세포 패턴 기판을 포함하는 약물 스크리닝 장치에 관한 것으로, 전기화학 반응을 이용하여 선택적 세포 사멸에 의해 원하는 형태의 세포 패턴을 갖는 소형화된 바이오칩을 제공할 수 있으며, 이를 미세 유체 칩과 결합시켜 약물의 효능 및 독성 평가가 가능한 새로운 방식의 약물 스크리닝 장치(플랫폼)을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 전기화학 반응을 이용한 세포 패터닝 방법 및 세포가 패터닝된 세포 패턴 기판을 포함하는 약물 스크리닝 장치에 관한 것이다.
최근 유전체학, 단백질체학, 세포학 및 대사학의 발전에 힘입어 고속 대량 스크리닝(High Throughput Screening, HTS)을 이용한 신약 개발 수요가 지속적으로 증가하고 있다. 제약학적으로 가치 있는 후보물질들이 다량으로 발굴되는 단계인 만큼 중요성이 매우 크지만, 기술 구현의 복잡성이 여전히 커다란 장벽으로 작용하여 개발 속도를 늦춤과 동시에 R&D 생산성까지도 떨어뜨리는 추세이다. 그 이유로 세 가지를 들 수 있는데, 이는 ① HTS 기술을 구현하기 위해 필수적으로 갖추어야 할 장비들 (robotic hand, automatic pump, sensitive detectors, handling equipment. etc) 이 고가라는 점과, ② screening에 쓰이는 생물 시료 및 시약이 비싸다는 점, 그리고 ③ 임상시험 단계에서의 실패율이 높기 때문이다. 따라서 세 가지 단점을 해결하기 위하여 새롭게 요구되는 HTS 기술의 모습으로는 (i) 복잡한 장비 없이도 간결하게 기술을 구현해낼 수 있을 것, (ii) 분석에 필요한 시료 부피를 줄임과 동시에 증발 없이 극미량 액체 시료를 정확하게 제어할 수 있을 것, (iii) 임상시험 전 단계인 cell-based assay를 정확하게 해낼 것을 들 수 있다.
이에 대안으로 떠오른 것이 신약 개발을 위한 미세유체 장치 (Microfluidic device, MF) 이며, MF를 이용한 신기술을 cell-based HTS 플랫폼에 적용시켜 신약을 개발하기 위해 이루어지고 있는 많은 연구를 크게 세 가지로 분류할 수 있다; a) continuous flow mode, b) Droplet mode, c) Microarray mode. 이 중 microarray mode는 약물 스크리닝 뿐만 아니라 유전자 발현, 단백질 분석에도 쓰이는 분석법으로써, 한꺼번에 수백-수천개의 assay가 가능하지만 그만큼 극미량의 시료를 다루어야 하며 동시에 빠르게 증발할 우려가 있기 때문에 이를 정확하게 제어할 커다란 장비가 필요하다는 단점이 함께 존재한다. 이와 비슷하게, 신약 개발 초기 단계에서 필수적으로 행하여지는 전통적인 96/384/1536 well plate 분석법은 시간 소모적이고 노동 집약적이며 고가의 장비를 필요로 한다는 한계점이 있다. 때문에 자동화된 장비 없이도 기존과 유사한 고감도의 결과를 단시간에 얻을 수 있고, 시간 및 비용 절감 측면에서 보다 효율적인 분석법 개발의 필요성이 대두되고 있는 가운데, 고밀도로 집적화된 세포 군집을 소형화된 칩 위에 구현하는 세포 패터닝 기술이 이를 위한 대표적인 핵심 기술로써 주목받고 있다.
이를 위하여 물리적/화학적으로 표면을 개질하여 세포를 선택적으로 부착시키는 방법과 microcontact spotting을 이용하여 소형 세포 배열을 만드는 방법 등이 연구되어 왔으나, 복잡한 화학적 수식 과정이나 물리적 틀의 제조가 필수로 선행되어야만 한다는 번거로움이 존재하였다. 특히 spotting 기술을 구현하기 위해서는 고가의 장비가 요구될 뿐만 아니라 spotting solution의 증발 문제, 절차의 복잡함, 많은 시간이 소요되기 때문에 이에 반하는, 간단한 제조 공정 하에 쉽고 빠르게 패턴 구현이 가능하며 높은 해상도와 우수한 재현성을 가지는 세포 패터닝 방법의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 전기화학 반응에 의한 세포의 사멸을 이용하여 간단하고 신속하게 이루어지는 전기화학 반응을 이용한 세포 패터닝 방법 및 세포가 패터닝된 세포 패턴 기판을 포함하는 약물 스크리닝 장치를 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 일 실시예에 따르면,
산화물 패턴층이 형성된 기판에 양이온성 고분자를 코팅하는 단계;
양이온성 고분자가 코팅된 기판에 세포를 배양하여 세포를 부착하는 단계; 및
상대전극이 있는 전해액 내에서 상기 세포가 부착된 기판을 작업전극으로 사용하고, 상기 작업전극에 양의 전압을 인가하여, 상기 세포가 부착된 기판을 전기화학적으로 산화시켜 세포 패턴을 형성하는 단계; 를 포함하며,
상기 세포 패턴을 형성하는 단계는, 산화물 패턴층에 부착된 세포가 전압 인가에 의하여 사멸되어, 기판에 세포 패턴이 형성되며,
전해액은 세포배양배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 전기화학반응을 이용한 세포 패터닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면,
세포 패터닝 방법에 의한 세포 패턴을 갖는 세포 패턴 기판; 및
세포 패턴 기판의 일면에 위치하는 마이크로 플루이딕 칩(micro fluidic chip)을 포함하는 약물 스크리닝 장치를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학 반응을 이용한 세포 패터닝 방법 및 세포가 패터닝된 세포 패턴 기판을 포함하는 약물 스크리닝 장치는 전기화학 반응을 이용하여 선택적 세포 사멸에 의해 원하는 형태의 세포 패턴을 갖는 소형화된 바이오칩을 제공할 수 있으며, 이를 미세 유체 칩과 결합시켜 약물의 효능 및 독성 평가가 가능한 새로운 방식의 약물 스크리닝 장치(플랫폼)을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학반응을 이용한 세포 패터닝 방법의 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 약물 스크리닝 장치의 모식도이다.
도 3는 실시예에서 전기화학적 세포 패터닝 과정을 보여주는 모식도이다.
도 4은 본 발명의 실시예에서 약물 스크리닝 장치를 제조하는 과정을 보여주는 도면이다.
도 5는 실시예 1 내지 5에서 패터닝된 세포 기판의 세포 패턴을 위상차 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 6는 실시예 2에서 세포 기판에 전압인가 시간에 따라 패터닝된 세포 패턴을 위상차 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 7은 실험예 2에서 SK-MEL28을 다양한 모양으로 세포 패터닝하고, 세포 패턴을 위상차 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 8은 실험예 3에서 피부암세포(SK-MEL28), 대식세포(RAW2647) 및 전지방세포(3T3-L1) 를 세포 패터닝하고, 세포 패턴을 위상차 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 9(a) 는 패터닝된 세포 기판과 MF 필름 칩이 결합된 약물 처리장치(약물 스크리닝 장치) 플랫폼(좌)과 약물을 처리하기 전 정상 세포 패턴의 형광현미경 사진(우)을 보여주는 사진이다. 도 9(b-d)는 각각 0 μM, 78 μM, 200 μM의 사포닌을 10분간 처리한 후의 세포 패턴 L/D staining 형광현미경 사진을 보여주며, 도 9(e)는 약물 스크리닝 장치의 유효성 검증을 위해 처리할 사포닌의 LD0, 50, 100 값을 파악하고자 하여 먼저 시행하였던 96 well에서의 sk-mel28 세포에 대한 사포닌의 독성 실험결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 약물 스크리닝 장치의 모식도이다.
도 3는 실시예에서 전기화학적 세포 패터닝 과정을 보여주는 모식도이다.
도 4은 본 발명의 실시예에서 약물 스크리닝 장치를 제조하는 과정을 보여주는 도면이다.
도 5는 실시예 1 내지 5에서 패터닝된 세포 기판의 세포 패턴을 위상차 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 6는 실시예 2에서 세포 기판에 전압인가 시간에 따라 패터닝된 세포 패턴을 위상차 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 7은 실험예 2에서 SK-MEL28을 다양한 모양으로 세포 패터닝하고, 세포 패턴을 위상차 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 8은 실험예 3에서 피부암세포(SK-MEL28), 대식세포(RAW2647) 및 전지방세포(3T3-L1) 를 세포 패터닝하고, 세포 패턴을 위상차 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 9(a) 는 패터닝된 세포 기판과 MF 필름 칩이 결합된 약물 처리장치(약물 스크리닝 장치) 플랫폼(좌)과 약물을 처리하기 전 정상 세포 패턴의 형광현미경 사진(우)을 보여주는 사진이다. 도 9(b-d)는 각각 0 μM, 78 μM, 200 μM의 사포닌을 10분간 처리한 후의 세포 패턴 L/D staining 형광현미경 사진을 보여주며, 도 9(e)는 약물 스크리닝 장치의 유효성 검증을 위해 처리할 사포닌의 LD0, 50, 100 값을 파악하고자 하여 먼저 시행하였던 96 well에서의 sk-mel28 세포에 대한 사포닌의 독성 실험결과를 보여주는 그래프이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 발명에서, “포함한다” 또는 “가지다” 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
산화물 패턴층이 형성된 기판에 양이온성 고분자를 코팅하는 단계(S100);
양이온성 고분자가 코팅된 기판에 세포를 배양하여 세포를 부착하는 단계(S200); 및
상대전극이 있는 전해액 내에서 상기 세포가 부착된 기판을 작업전극으로 사용하고, 상기 작업전극에 양의 전압을 인가하여, 상기 세포가 부착된 기판을 전기화학적으로 산화시켜 세포 패턴을 형성하는 단계(S300); 를 포함하며,
상기 세포 패턴을 형성하는 단계는, 산화물 패턴층에 부착된 세포가 전압 인가에 의하여 사멸되어, 기판에 세포 패턴이 형성되며,
전해액은 세포배양배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 전기화학반응을 이용한 세포 패터닝 방법에 관한 것이다(도 1 참조).
본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학반응을 이용한 세포 패터닝 방법은 전기화학적 반응을 이용하여 세포를 사멸하는 기술에 관한 것으로, 이러한 경우 포토마스크 디자인에 따라 원하는 형상의 세포 패턴을 매우 정확하고 신속하게 형성할 수 있다.
또한, 전기화학적 세포 사멸법을 이용하면 물리적 틀이나 복잡한 화학적 처리 없이도 고밀도의 세포 패턴을 높은 해상도와 우수한 재현성을 갖도록 형성할 수 있다. 이러한 세포 패터닝 방법에 의한 세포 패턴을 갖는 바이오칩은 약물 독성/효능 평가 및 분석 분야에 유용하게 적용될 수 있다.
본 발명에서 "세포 패터닝(cell patterning)" 은, 마이크로미터 수준으로 여러 세포들을 특정한 위치 또는 방향으로 고정시키는 것을 의미한다. 상기 세포는 살아있는 세포일 수 있다.
또한, 본 발명에서 "전기화학적 세포 사멸법" 이라 함은, 세포가 부착된 기판에 전압을 인가하여 전도성을 띄는 영역에 부착된 세포를 사멸시킬 수 있는 방법이다. 보다 상세하게는, 전기화학적 세포 사멸법은 전압을 인가하였을 때 발생하는 전기장의 영향으로, 세포 내/외부 이온 불균형이 발생하고, 이에 따른 세포막 투과성 변경과 막 손상이 일어나는 등의 세포의 사멸이 유도되는 것을 의미한다. 참고로, 본 발명에서 세포 사멸은 물리적으로 세포가 떨어져 나가는 세포 탈착과는 다른 것으로, 세포가 기판으로부터 탈거되지 않고 부착되어 있는 상태에서 사멸된 것을 의미할 수 있다.
이하, 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
먼저, 본 발명의 일 실시예에 따른 산화물 패턴층이 형성된 기판에 양이온성 고분자를 코팅하는 단계(S100)는 산화물 패턴층이 형성된 기판 표면이 전하를 띠도록 양이온성 고분자를 도포하는 단계이다.
기판은, 유리, 실리콘, PET 필름 및 메타크릴레이트 수지(PMMA)로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 일반적으로 널리 쓰이는 기판 소재군이 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 일 실시예에 따른 기판은 유리 기판일 수 있다.
산화물 패턴층은 기판상에 패턴이 형성된 산화물층을 의미하는 것으로, 불소 주석 산화물(Fluorine-doped Tin Oxide, FTO), 인듐 주석 산화물(indium tin oxide; ITO), 인듐 아연 산화물(indium zinc oxide; IZO), 알루미늄 아연 산화물(aluminum zinc oxide; AZO), 아연 주석 산화물(zinc tin oxide; ZTO), 갈륨 아연 산화물(gallium zinc oxide; GZO), 안티모니 주석 산화물(antimony tin oxide; ATO), A-IGZO(In2O3:Ga2O3:ZnO) 이산화티탄(TiO2), 산화인듐(In2O3), 산화아연(ZnO) 및 산화주석(SnO2)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전도성 산화물로 이루어질 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니며 일반적으로 널리 쓰이는 산화물 소재군이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 산화물 패턴층은 불소 주석 산화물 Fluorine-doped Tin Oxide, FTO) 로 형성될 수 있다.
한편, 산화물 패턴층이 형성된 기판은 산화물층이 적층된 기판 상에 포토레지스트 층을 형성하는 단계; 포토레지스트 층에 노광 및 현상 공정을 진행하여, 산화물층의 일부 영역이 노출되도록 포토레지스트 패턴을 형성하는 단계; 및 포토레지스트 패턴을 마스크로 산화물층을 식각하는 단계; 에 의해 제조되는 것일 수 있다. 이때, 포토레지스트 패턴은 구현하고자 하는 세포 패턴과 대응되도록 형성할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, FTO가 코팅된 10×20mm 의 유리기판에 세척한 후, 포토레지스트(PR, AZ P4620) 를 스핀코팅하여 약 30 ㎛ 의 포토레지스트층을 형성하였고, 상기 포토레지스트층을 포토마스크를 사용하여 UV(약 365 nm)로 노광하고, 현상액(AZ 400K)을 사용하여 1분 동안 현상하여 포토레지스트 패턴을 형성할 수 있다. 포토레지스트 패턴이 형성된 기판에 아연(zinc) 가루를 코팅하듯이 도포하고, 상기 기판에 식각용액(2M HCl) 을 떨어뜨려 3분간 반응시킨 후 포토레지스트 패턴에 의해 노출된 FTO 를 문질러 닦아내는 방식으로 FTO 층(산화물 패턴층)을 문질러 닦아내는 방식으로 FTO 에칭 처리를 수행하여 기판상에 패터닝된 FTO 층을 형성할 수 있다.
그리고, 산화물 패턴층이 형성된 기판에 양이온성 고분자를 코팅할 수 있다. 상기 기판에 양이온성 고분자를 코팅하는 것은 상기 기판에 세포를 보다 용이하게 부착하기 위함이다.
아울러, 상기 양이온성 고분자는 양전하를 띠는 고분자로, 수용액 내에서 용해되어 해리되면 양전하를 띠는 고분자일 수 있다. 기판상에 안정적으로 코팅되는 것을 고려하여, 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 폴리-D-라이신(poly-D-lysine), 폴리-L-오르니틴(poly-l-ornithine), 폴리에틸렌이민 (polyethyleneimine, PEI), 키토산(chitosan) 및 폴리아미노에스터(polyaminoester)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 기판을 양이온성 고분자 수용액에 담가 기판의 표면이 양전하를 띠도록 할 수 있다. 예를 들면, 산화물 패턴층이 형성된 기판을 0.01% 의 폴리-L-라이신 수용액에 담가 기판의 표면이 양전하를 띠도록 37 ℃ 에서 30분 동안 코팅할 수 있다.
다음으로, 양이온성 고분자가 코팅된 기판에 세포를 배양하여 세포를 부착하는 단계(S200)를 포함한다.
한편, 대부분의 세포들은 당지질과 당단백질이 존재하는 세포막으로 인해 세포 표면은 음전하를 나타낸다. 이에 따라, 양이온성 고분자가 코팅된 기판과 상기 세포 사이에는 정전기적 인력이 발생하고, 이에 따라 세포가 양이온성 고분자 표면에 부착하게 된다.
이때, 양이온성 고분자가 코팅된 기판에 배양되는 세포는, 부착세포일 수 있다. 보다 구체적으로, 지방 전구 세포, 지방세포, 대식세포 및 암세포 등의 부착세포일 수 있으며, 이러한 성질을 가지고 있는 세포라면 어떠한 종류라도 무관하다. 예를 들면, 상기 세포는 3T3-L1, SK-MEL28 또는 RAW 264.7 일 수 있으며, 3T3-L1 일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 양전하를 띠는 기판에 6×104 내지 2×105 cells/ml 일 수 있다. 일 예로, 6×104 cells/ml 의 세포를 분주하여 약 37℃ 및 5% 의 CO2 조건에서 12 시간 내지 24시간 배양하여, 상기 기판에 세포를 부착할 수 있다.
나아가, 상대전극이 있는 전해액 내에서 상기 세포가 부착된 기판을 작업전극으로 사용하고, 상기 작업전극에 양의 전압을 인가하여, 상기 세포가 부착된 기판을 전기화학적으로 산화시켜 세포 패턴을 형성하는 단계 (S300)를 포함한다. 특히, 상기 세포 패턴을 형성하는 단계, 산화물 패턴층에 부착된 세포가 전기화학반응을 통해 세포가 사멸되어, 기판에 세포 패턴을 형성할 수 있다.
하나의 양태로서, 세포 패턴을 형성하는 단계는 작업전극 및 상대전극을 포함하는 2전극 시스템에서 수행될 수 있으며, 상기 세포가 부착된 기판을 작업전극으로 하여 전압을 인가할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 세포 패턴을 형성하는 단계는 작업전극, 상대전극 및 기준전극을 포함하는 3전극 시스템에서 수행될 수 있으며, 상기 세포가 부착된 기판을 작업전극으로 하여 전압을 인가할 수 있다.
구체적으로, 상기 세포가 부착된 기판 및 상대전극을 전해액 내에 담그고, 상기 기판에 양의 전압을 인가하고 상대전극에 음의 전압을 인가하여, 상기 산화물 패턴층에 부착된 세포를 전기화학적으로 산화 및 식각한다. 여기서, 세포가 부착된 기판은 작업전극으로 사용될 수 있다. 전해액의 온도는 0 내지 45 ℃ 일 수 있고, 상기 세포가 부착된 기판과 상기 상대전극 사이의 전계는 1 내지 20 V일 수 있으며, 상기 전기화학반응 시간은 1초 내지 10분 일 수 있다. 바람직하게는, 전해액의 온도는 0 내지 37 ℃ 또는 10 내지 37 ℃ 일 수 있고, 상기 세포가 부착된 기판과 상기 상대전극 사이의 전계는 1 내지 10 V, 1 내지 5 V 또는 평균 3 V 일 수 있으며, 상기 전기화학반응 시간은 1초 내지 20분, 1초 내지 10분, 5초 내지 5분, 5초 내지 30초 또는 10 초 내지 20초일 수 있다.
이때, 상기 전해액은 산성 용액, 염기성 용액, 또는 중성용액일 수 있으나, 바람직하게는 세포배양 배지를 상기 전해액으로 사용할 수 있다. 여기서 세포배양 배지라 함은 실질적으로 상기 세포 패터닝시 사용되는 세포를 배양하는 배지일 수 있으며, 구체적으로, 세포배양배지는, DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), MEM (Minimum essential medium), RPMI1640 (Rosewell Park Memorial Institute), BME (Basal medium Eagle's) 및 IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's medium) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 나아가, 상기 FBS(fetal bovine serum)를 더 포함할 수 있다.
예를 들면, 세포배양배지는 DMEM 배지에 약 10% FBS(fetal bovine serum)를 포함할 수 있다.
여기서, 상기 FBS(fetal bovine serum)는 세포부착인자를 제공할 수 있으며, 성장 및 기능에 관여하는 호르몬을 제공할 수 있다.
한편, 부착세포는 부착 조건을 유지해주어야 정상적인 생리조건을 유지할 수 있다. 아울러, 세포와 세포간에는 접착단백질에 의해 밀착연접(tight junction)을 이루고 있는데, 일반적으로, 상기 접착단백질은 Ca2+ 이온을 필요로 한다. 탈착 현상없이 기판에 붙어 있는 세포의 세포 사멸 유도를 위하여 Ca2+ 이온이 포함되어 있는 세포배양 배지를 전해액으로 사용하는 것이 바람직하다. 만일 Ca2+ 이온을 미포함하는 전해액을 사용하는 경우, 세포와 기판 사이에 거품이 발생하여 세포가 기판으로부터 탈거될 수 있다.
상기 상대전극은 다른 기판(미도시) 상에 형성된 백금일 수 있다.
이를 통해 하기의 반응식과 같은 반응으로 산화환원공정이 수행될 수 있다.
<반응식>
산화전극(anode, +극)의 반응:
환원전극(cathode, -극)의 반응:
보다 상세하게는, 전기화학적 세포 사멸법은 전기적 자극에 의하여 세포막의 투과성이 바뀌고, 막 표면에 구멍이 생겨 세포 사멸(Necrosis)이 유도되는 전기 천공법(electroporation)에 의거한 것이다.
상기와 같이 제조된 세포가 패터닝된 기판은 바이오칩(세포칩) 등으로 유용하게 사용될 수 있다. 이러한 세포 패터닝 방법에 의한 세포 패턴을 갖는 바이오칩은 약물 독성/효능 평가 및 분석 분야에 유용하게 적용될 수 있다.
본 발명은 약물 스크리닝 장치를 제공한다.
도 2를 참조하면, 상술한 세포 패터닝 방법에 의한 세포 패턴을 갖는 세포 패턴 기판; 및 세포 패턴 기판의 일면에 위치하는 마이크로 플루이딕 칩(micro fluidic chip)을 포함하는 약물 스크리닝 장치를 제공한다.
보다 구체적으로, 약물 스크리닝 장치는 마이크로 플루이딕 칩의 일측에 시료 주입을 위해 형성되는 유체 주입부; 시료 주입부의 타측에 형성되는 유체 배출구; 및 상기 유체 주입부에서부터 유체 배출구가지 연통하여 마이크로 플루이딕 칩 내부에 형성되는 마이크로 채널을 포함하며, 상기 마이크로 채널은 세포 패턴 기판의 세포 패턴과 접촉되도록 구성된다.
한편, 상기 마이크로 플루이딕 칩은 폴리머 필름을 적층시켜 제조할 수 있으며, 구체적으로, 마이크로 플루이딕 칩은 Polystyrene 또는 polyester film로 이루어질 수 있다.
상기 마이크로 플루이딕 칩은 마이크로 채널과 유체 주입구 및 유체 배출 구 등은 상기 필름에 레이저 커터 장비를 이용하여 필름을 자른 후 각각의 층을 순서대로 적층시켜 마이크로 플루이딕 칩을 제조할 수 있다. 그리고, 상기 세포 패턴 기판의 일면에 상기 마이크로 플루이딕 칩을 적층시켜 약물 스크리닝 장치를 제조할 수 있다.
이때, 상기 마이크로 채널은 세포 패턴 기판의 세포 패턴과 접촉되도록 적층시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1. 전기화학적 세포 패터닝
도 3는 실시예에서 전기화학적 세포 패터닝 과정을 보여주는 모식도이다.
실시예 1에서 전기화학 반응을 이용하여 세포 패턴을 형성하였으며, 도 3를 참조하여, 실시예 1에서 전기화학 반응을 이용한 세포 패터닝 과정을 설명한다.
먼저, FTO (Fluorine tin oxide)가 코팅된 10×20mm의 유리기판을 70% 에탄올 및 DI water로 세척하였다.
FTO가 코팅된 유리기판(이하, FTO 기판) 상에 포토레지스트(PR, AZ P4620)를 스핀코팅하여 약 30㎛의 포토레지스트층을 형성하였다. 그리고, 상기 포토레지스트층은 포토마스크를 사용하여 UV(약 365nm)로 노광하고, 현상액(AZ 400K)을 사용하여 1분동안 현상하여 포토레지스트 패턴을 형성하였다. 이 때, 포토레지스트 패턴은 구현하고자 하는 세포 패턴과 대응하도록 형성하였다.
포토레지스트 패턴이 형성된 기판에 아연(Zinc) 가루를 코팅하듯이 도포하고, 상기 기판 위에 2M HCl 용액을 고루 떨어뜨려 3분간 반응시킨 후 면봉으로 표면(포토레지스트 패턴에 의해 노출된 FTO)을 문질러 닦아내는 방식으로 FTO 에칭 처리를 수행하여 기판상에 패터닝된 FTO층을 형성하였다.
그리고, 패터닝된 FTO층 위에 남아있는 포토레지스트 패턴을 아세톤으로 제거한 후 DI water로 세척하였다.
다음으로, 기판을 0.01%의 poly-L-lysine 수용액에 담가 표면이 양전하를 띄도록 37℃에서 30분 동안 코팅하였다. DI water로 두 차례의 추가적인 표면 세척 과정을 거친 후, 상기 기판 상에 6×104 cells/mL의 seeding density로 세포를 분주하여 37℃ 및 5% CO2 조건에서 12시간 배양하였다.
그리고, 세포 부착이 확인된 기판을 미리 데워둔 30 ℃ 내지 37 ℃의 세포 배양 용액(DMEM) 내에 담궜다. 이때, 세포 부착된 기판을 작업전극으로 하고, 상대전극으로써 백금(platinium, Pt) 와이어, 기준전극으로써 Ag/AgCl(3M NaCl)을 사용하는 3전극 시스템을 사용하였다. 다음으로, 상기 작업전극에 +1V의 양의 전압을 +0.0001 C 내지 +1.0 C 의 전하량을 약 10초 동안 인가하였다. 이때, 전기화학적 세포 사멸을 위하여, 전압 인가 과정에서 전기화학 장비(CHI660C)를 사용하였다. 이러한 과정은 식각(엣칭)되지 않고 남아있어 전도성을 띄는 FTO 층 표면에 부착되어 있는 세포를 사멸시키는 방식으로, 세포 패턴을 형성하였다.
상기 세포가 패턴된 기판을 전해질 용액으로부터 꺼낼 때에는 표면의 거품들을 모두 pipetting으로 제거한 후 건져내었다.
실시예 2~5
세포 부착이 확인된 기판(작업전극)에 +3V, +5V, +7V, +9V의 양의 전압을 인가한 것을 제외하곤, 실시예 1과 동일한 방법으로 기판에 세포 패턴을 형성하였다.
실시예 6. 약물 처리장치의 제조
도 4은 본 발명의 실시예에서 약물 처리장치를 제조하는 과정을 보여주는 도면이다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 약물 처리장치는 필름 기반의 마이크로 플루이딕(Microfluidic, MF) 칩을 제조하고, 이를 세포 패턴 기판과 결합시켰다.
폴리머 필름의 종류는 세 가지로, 친수성 필름, 단면 접착필름, 양면 접착필름이 있으며 모두 투명하다는 특징이 있다. MF 칩을 구성하는 레이어 중 상부의 레이어를 cover, 중간부의 레이어를 channel, 하부의 레이어를 bottom이라 칭하며, 이 때 bottom layer는 세포칩과의 결합을 위하여 용액이 세포에 처리되기를 원하는 면적과 모양대로 디자인하였다. 레이어 디자인은 모두 AutoCAD 2019를 이용하여 진행하였고, 레이저 커터 장비 (C40 60W, Coryart, South Korea)를 이용하여 필름을 자른 후 순서에 맞게 이어붙였다.
제일 하단의 레이어 (bottom layer) 디자인을 적용시킨 거름종이를 추가로 잘라낸 후, 실시예 2에서 제조한 세포가 패턴된 칩 위에 살포시 얹어 액체 배지를 흡수시키고 표면의 물기를 제거하여 MF 필름 칩을 부착할 수 있는 기반을 마련해주었다.
거름종이로 물기를 닦아낸 세포 패턴 칩 바로 위에, 조립이 완료된 MF 필름 칩을 그대로 올려놓고, 중간의 cell channel 부분에 닿지 않도록 하며 포셉으로 눌러주어 빈틈없이 부착 및 고정시켰다. 그 후 신속하게 inlet에 액체배지를 흘려주었고 디바이스 내부 채널의 워싱은 outlet에 거름종이를 댐으로써 진행하였는데, 이는 모세관 현상에 의한 것이며 흘려주는 media는 세포 배양용 인큐베이터에 미리 넣어두어 CO2가 충분히 녹아든 상태여야 한다.
<실험예>
실험예 1. 세포 패턴의 형성
전압 크기에 따른 세포 패턴 형성
실시예 1 내지 5에서 형성된 세포 패턴의 생사 여부 및 정확성을 정성적으로 평가하기 위하여 Live/dead cell staining (LD staining)을 시행하였고, 얻어진 결과를 사진과 함께 도 5에 나타내었다.
구체적으로, staining dye로는 calcein-AM (Calcein acetoxymethylester) 과 Ethidium 1-homodimer (EthD-1)를 사용하였다.
참고로, Calcein-AM은 살아있는 세포 내로 유입되어 esterase에 의해 가수분해되면서 green fluorescent를 방출하기 때문에 세포가 살아있음을 확인하는 지표가 되며, Ethidium 1-homodimer는 세포막이 손상된 세포 혹은 죽은 세포 내로 유입되어 핵과 강하게 결합하면서 red fluorescent를 방출하기 때문에 세포가 죽거나 손상되었음을 확인하는 지표가 된다. Live/dead staining에서는 두 가지 염료의 동시 염색 및 형광 현미경 이미징을 통하여 세포 생사를 정성적으로 평가할 수 있다.
도 5는 실시예 1 내지 5에서 패터닝된 세포 기판의 세포 패턴을 위상차 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 5를 참조하면, 실시예 2의 +3 V 크기의 전압을 가하는 조건에서 의도한 모양대로의 세포 패턴이 명확하게 형성되는 것을 확인할 수 있다. 실시예 1의 +1 V 의 전압을 가하였을 때는 사멸 세포가 전혀 관찰되지 않았고 세포 패턴 또한 형성되지 않았다. 아울러, 실시예 3-5의 경우, +5 내지 +9 V를 가하였을 때 관찰되는 세포 패턴의 손상이 발견되었는데, 이는 전압을 인가한 결과 형성된 전기장으로 인해 세포 내외의 이온 균형이 흐트러지면서 야기된 결과로 판단된다.
전압 인가 시간에 따른 세포 패턴 형성
실시예 2의 세포 기판 형성시 전압 인가 시간에 따른 세포 패턴을 관찰하였다. 구체적으로, 세포를 페터닝할 때, 상기 기판에 +3V 의 전압을 인가하였으며, 이때, 5초 내지 60초 동안 +0.02 내지 +0.5 C 의 전하 전달량만큼 인가하였다.
그리고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6는 실시예 2에서 세포 기판에 전압인가 시간에 따라 패터닝된 세포 패턴을 위상차 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 6를 참조하면, +10 초의 시간만큼 전압을 가하는 조건에서 의도한 모양대로의 세포 패턴이 명확하게 형성되었다. 그리고, +5 초 동안 전압을 가하였을 때는 사멸 세포가 부분적으로 관찰되었으며, 세포 패턴이 명확하게 형성되지 않았다. 또한, +20 내지 +60 초 동안 전압을 가하였을 때 관찰되는 세포 패턴의 손상이 발견되었는데, 이는 전압 인가 결과 형성된 전기장으로 인해 세포 내외의 이온 균형이 흐트러지면서 야기된 결과로 판단된다.
따라서, 인가하는 전압의 크기와 시간을 조절함으로써 최종적으로 형성되는 세포 패턴의 정확성을 제어할 수 있고, 이러한 과정을 통하여 명확한 세포 패턴을 구현할 수 있음을 확인하였다. 구체적으로, 최적 전압 크기 및 시간 조건은 +3 V 및 +10 초인 것을 확인하였다.
실험예 2. 다양한 모양의 세포 패터닝 구현여부 확인
실험예 1에 의해 맞추어진 방법 및 최적 조건대로, 포토마스크 디자인을 달리 하여 FTO를 원하는 모양대로 엣칭하였고, FTO 기판 상의 부분적인 전압 인가에 따라 원하는 모양대로의 부분적인 세포 사멸, 즉 다양한 모양의 세포 패턴이 구현되는가를 실험예 1의 경우와 동일한 L/D staining으로 평가하였다. 먼저 (A) 지름 1.2 mm의 원 array (5*8), (B) 1*14.5 mm의 line array (6*1), (C) 한 변이 1 mm인 세모 array (5*4) 모양의 포토마스크를 제작하였고, 상기 명시된 방법을 통해 세포 패턴을 구현한 후 L/D staining을 통해 패턴을 시각화하였으며 생사를 확인하였다. 이 때 사용된 세포 종류는 SK-MEL28이었다.
그리고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7은 실험예 2에서 SK-MEL28을 다양한 모양으로 세포 패터닝하고, 세포 패턴을 위상차 형광현미경으로 관찰한 사진이다.
도 7을 참조하면, SK-MEL28 이 다양한 모양으로 세포 패터닝된 것을 확인할 수 있다.
실험예 3. 다양한 종류의 세포 패터닝 구현여부 확인
실험예 1에 의해 맞추어진 방법 및 최적 조건대로, 지름 1 mm 의 circle array 디자인대로 FTO를 원하는 모양대로 엣칭하였고, FTO 기판 상의 부분적인 전압 인가에 따라 다양한 종류의 세포 패턴이 구현되는가를 L/D staining으로 평가하였다.
피부암세포 (SK-MEL28) 뿐만 아니라 대식세포 (RAW264.7), 전지방세포 (3T3-L1) 를 예비 패턴된 FTO 기판 위에 부착시켰고, 상기 명시된 방법을 통해 세포 패턴을 구현한 후 L/D staining을 통해 패턴을 시각화하였으며 생사를 확인하였다.
그리고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8은 실험예 3에서 피부암세포(SK-MEL28), 대식세포(RAW2647) 및 전지방세포(3T3-L1) 를 세포 패터닝하고, 세포 패턴을 위상차 형광현미경으로 관찰한 사진이다. 도 8을 참조하면, 다양한 종류의 세포 패턴이 구현되는 것을 알 수 있다.
도 8을 참조하면, 다양한 모양으로 세포를 패터닝을 구현할 수 있음을 확인 하였다. 특히, 피부암세포 (SK-MEL28) 뿐만 아니라 대식세포 (RAW264.7), 전지방세포 (3T3-L1) 를 예비 패턴된 FTO 기판 위에 부착시켰고, 상기 명시된 방법을 통해 세포 패턴을 구현한 후 L/D staining을 통해 패턴을 시각화하였으며 생사를 확인하였다.
실험예 4. 약물 처리장치를 이용한 약물 평가
실시예 6에서 제조한 약물 처리장치를 이용하여 약물을 평가하였다.
실시예 6에서 제조한 약물 처리장치는 마이크로 플루이딕 필름 칩과 실시예 2에서 제조한 세포 패턴 기판을 결합시켜, 약물이 세포에 미치는 독성을 평가히기 위한 플랫폼으로써의 기능을 확인하였다. 구체적으로, +3 V 를 10초 동안 가해 만든 세포 패턴 기판 위에, 완성된 마이크로 플루이딕 필름 구조체를 부착하였고, 각 채널에 다른 농도의 사포닌 용액을 흘려주어 처리한 후 L/D staining을 진행하여 세포를 시각화하고 생사를 확인하였다.
그리고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9(a) 는 패터닝된 세포 기판과 MF 필름 칩이 결합된 약물 처리장치(약물 스크리닝 장치) 플랫폼(좌)과 약물을 처리하기 전 정상 세포 패턴의 형광현미경 사진(우)을 보여주는 사진이다. 아울러, 도 9(b-d)는 각각 0 μM, 78 μM, 200 μM의 사포닌을 10분간 처리한 후의 세포 패턴 L/D staining 형광현미경 사진을 보여주며, 도 9(e)는 약물 스크리닝 장치의 유효성 검증을 위해 처리할 사포닌의 LD0, 50, 100 값을 파악하고자 하여 먼저 시행하였던 96 well에서의 sk-mel28 세포에 대한 사포닌의 독성 실험결과를 보여주는 그래프이다.
세포에 처리한 모든 용액(media, staining dye, drug, etc.)은 모두 inlet을 통해 흘려주는 방식으로, 약물 처리장치 플랫폼의 채널 상에서 진행되었다.
도 9을 참조하면, 0 μM의 사포닌을 처리하였을 때 손상되거나 죽은 세포가 거의 발견되지 않은 반면에 세포 사멸을 100% 유도하는 농도인 200 uM을 처리하였을 때에는 오직 죽은 세포만 발견됨을 알 수 있다. LD50 농도에 해당하는 약 78 uM을 처리하였을 때에는, 이 두 가지 양상이 함께 나타나는 것으로 보아 사포닌에 의해 세포막이 파괴되었지만 생존력은 잃지않은 상태임을 알 수 있다.
Claims (10)
- 산화물 패턴층이 형성된 기판에 양이온성 고분자를 코팅하는 단계;
양이온성 고분자가 코팅된 기판에 세포를 배양하여 세포를 부착하는 단계; 및
상대전극이 있는 전해액 내에서 상기 세포가 부착된 기판을 작업전극으로 사용하고, 상기 작업전극에 양의 전압을 인가하여, 상기 세포가 부착된 기판을 전기화학적으로 산화시켜 세포 패턴을 형성하는 단계; 를 포함하며,
상기 세포 패턴을 형성하는 단계는, 산화물 패턴층에 부착된 세포가 전압 인가에 의하여 사멸되어, 기판에 세포 패턴이 형성되며,
전해액은 세포배양배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 전기화학반응을 이용한 세포 패터닝 방법.
- 제1항에 있어서,
산화물 패턴층이 형성된 기판은, 산화물층이 적층된 기판 상에 포토레지스트 층을 형성하는 단계;
포토레지스트 층에 노광 및 현상 공정을 진행하여, 산화물층의 일부 영역이 노출되도록 포토레지스트 패턴을 형성하는 단계; 및
포토레지스트 패턴을 마스크로 산화물층을 식각하는 단계; 에 의해 제조되는 것인, 전기화학반응을 이용한 세포 패터닝 방법.
- 제1항에 있어서,
산화물 패턴층은, 불소 주석 산화물(Fluorine-doped Tin Oxide, FTO), 인듐 주석 산화물(indium tin oxide; ITO), 인듐 아연 산화물(indium zinc oxide; IZO), 알루미늄 아연 산화물(aluminum zinc oxide; AZO), 아연 주석 산화물(zinc tin oxide; ZTO), 갈륨 아연 산화물(gallium zinc oxide; GZO), 안티모니 주석 산화물(antimony tin oxide; ATO), A-IGZO(In2O3:Ga2O3:ZnO) 이산화티탄(TiO2), 산화인듐(In2O3), 산화아연(ZnO) 및 산화주석(SnO2)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전도성 산화물로 이루어진 것을 특징으로 하는 전기화학반응을 이용한 세포 패터닝 방법.
- 제1항에 있어서,
양이온성 고분자는, 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 폴리-D-라이신(poly-D-lysine), 폴리-L-오르니틴(poly-l-ornithine), 폴리에틸렌이민 (polyethyleneimine, PEI), 키토산(chitosan) 및 폴리아미노에스터(polyaminoester)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 전기화학반응을 이용한 세포 패터닝 방법. - 제1항에 있어서,
양이온성 고분자가 코팅된 기판에 배양되는 세포는, 부착세포인 것을 특징으로 하는 세포 패터닝 방법.
- 제1항에 있어서,
세포배양배지는, DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), MEM(Minimum essential medium), RPMI1640 (Rosewell Park Memorial Institute), BME (Basal medium Eagle's) 및 IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's medium) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 전기화학반응을 이용한 세포 패터닝 방법.
- 제6항에 있어서,
세포배양배지는 FBS(fetal bovine serum)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 전기화학반응을 이용한 세포 패터닝 방법.
- 제1항에 있어서,
세포가 부착된 기판에 전압을 인가하는 단계는, 1 내지 20 V 의 전압 범위 내에서, 1 초 내지 10 분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 전기화학반응을 이용한 세포 패터닝 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 세포 패터닝 방법에 의한 세포 패턴을 갖는 세포 패턴 기판; 및
세포 패턴 기판의 일면에 위치하는 마이크로 플루이딕 칩(micro fluidic chip)을 포함하는 약물 스크리닝 장치.
- 제9항에 있어서,
마이크로 플루이딕 칩의 일측에 시료 주입을 위해 형성되는 유체 주입부;
시료 주입부의 타측에 형성되는 유체 배출구; 및
상기 유체 주입부에서부터 유체 배출구가지 연통하여 마이크로 플루이딕 칩 내부에 형성되는 마이크로 채널을 포함하며,
상기 마이크로 채널은 세포 패턴 기판의 세포 패턴과 접촉되는 것을 특징으로 하는 약물 스크리닝 장치.
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| KR102184516B1 true KR102184516B1 (ko) | 2020-11-30 |
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