CN114616317A - 细胞培养用基材及带有细胞的细胞培养用基材 - Google Patents

细胞培养用基材及带有细胞的细胞培养用基材 Download PDF

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Abstract

细胞培养用基材具有开口率为30％～70％的多孔膜和填充在多孔膜的孔内的细胞外基质。带有细胞的细胞培养用基材中，在细胞培养用基材的至少一面具有细胞层。

Description

细胞培养用基材及带有细胞的细胞培养用基材
技术领域
本发明涉及一种细胞培养用基材及带有细胞的细胞培养用基材。
背景技术
细胞培养技术不仅作为再生医疗，而且作为药物研发辅助工具备受关注。作为成为细胞培养的支架的细胞培养用基材，以往主要使用平面培养，但是根据提高活体模拟性等目的而尝试了各种改进。
在专利文献1中，作为用于容易且准确地评价细胞的浸润能力的培养基材，提出了用包含重构凝聚细胞外基质的组合物覆盖了径迹蚀刻PET(聚对苯二甲酸乙二酯)膜等多孔膜的覆盖膜。
在专利文献2中提出了通过非共价键将细胞外基质分子、生长因子、信号转导分子等生物活性分子取入到多孔性水凝胶内的细胞培养用支架材料。
在专利文献3中，作为具备优异的活体亲和性的同时具有机械强度的多孔体，提出了用包含丝纤蛋白及醇的组合物覆盖了多孔体的被覆多孔体。并且，公开了能够将上述被覆多孔体应用于细胞培养支撑体等。
在专利文献4中，以制造细胞层叠体为目的，提出了在多孔膜的两面培养细胞而在多孔膜的两面形成细胞层的方法。
专利文献1：日本特开2002-320472号公报
专利文献2：日本特表2006-500953号公报
专利文献3：日本特开2017-52829号公报
专利文献4：国际公开第2018/225835号
发明内容
发明要解决的技术课题
近年来，已知通过在细胞培养期间对细胞施加机械刺激而能够提高活体模拟性等。并且，在药剂毒性的评价等中，对培养细胞施加模仿活体的机械刺激的同时进行评价有时有效。若能够使作为支架的细胞培养用基材变形，则能够通过上述变形对细胞施加伸展张力等机械刺激，因此发明人等尝试了开发适合于变形的细胞培养用基材。
在以往的平面培养技术中，适合于变形的细胞培养用基材是未知的。并且，在使用了多孔膜的以往的细胞培养用基材中，也未获得适合于变形并且具有良好的细胞粘附性的细胞培养用基材。例如，如专利文献1所记载那样，径迹蚀刻PET膜被广泛用作细胞培养用多孔膜，但是径迹蚀刻PET膜的开口率通常低至例如2％～20％左右，不易变形。若使用开口率更高的多孔膜，则能够获得更适合于变形的细胞培养用基材，但是细胞与细胞培养用基材的接触面积减小，因此开口率高的多孔膜不易确保细胞的粘附性。
鉴于上述情况，本发明的一实施方式的课题在于提供一种可容易变形并且具有良好的细胞粘附性的细胞培养用基材及可容易变形并且细胞良好地粘附于基材的带有细胞的细胞培养用基材。
用于解决技术课题的手段
用于解决上述课题的方法包括以下方式。
＜1＞一种细胞培养用基材，其具有开口率为30％～70％的多孔膜和填充在多孔膜的孔内的细胞外基质。
＜2＞根据＜1＞所述的细胞培养用基材，其中，
多孔膜的平均开口直径为1μm～200μm。
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的细胞培养用基材，其厚度为20μm以下。
＜4＞根据＜1＞至＜3＞中任一项所述的细胞培养用基材，其中，
基于细胞外基质的孔的填充率为80％以上。
＜5＞根据＜1＞至＜4＞中任一项所述的细胞培养用基材，其中，
细胞外基质为凝胶状或者能够在湿润环境下形成凝胶。
＜6＞根据＜1＞至＜5＞中任一项所述的细胞培养用基材，其中，
通过基于JIS K 7161-1：2014及JIS K 7127：1999的拉伸试验求出的杨氏模量为2.0MPa以下。
＜7＞根据＜1＞至＜6＞中任一项所述的细胞培养用基材，其中，
通过基于JIS K 7161-1：2014及JIS K 7127：1999的拉伸试验求出的最大伸长率为150％以上。
＜8＞根据＜1＞至＜7＞中任一项所述的细胞培养用基材，其中，
多孔膜的至少一面被细胞外基质覆盖。
＜9＞一种带有细胞的细胞培养用基材，其中，
在＜1＞至＜8＞中任一项所述的细胞培养用基材的至少一面具有细胞层。
发明效果
根据本发明的一实施方式，可提供一种可容易变形并且具有良好的细胞粘附性的细胞培养用基材及可容易变形并且细胞良好地粘附于基材的带有细胞的细胞培养用基材。
附图说明
图1A是表示具有蜂窝结构的多孔膜的一例的立体图。
图1B是从上表面侧观察图1A中的多孔膜的俯视图。
图1C是沿图1B中的多孔膜的c-c线剖切的剖视图。
图2是实施例1中用于细胞培养用基材的制作的蜂窝薄膜的扫描型电子显微镜(SEM)像。
图3是实施例1中所制作的细胞培养用基材的扫描型电子显微镜(SEM)像。
图4是实施例2中所制作的基材A(左图)及基材C(右图)的显微镜像。
图5是实施例2中培养并且用VE-钙粘蛋白进行了染色的细胞的显微镜像。
图6是表示实施例3中所使用的基材的杨氏模量及最大伸长率的图表。
图7是表示实施例3中所使用的基材的杨氏模量及最大伸长率的表。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。这些说明及实施例例示实施方式，并不限制发明的范围。
在本发明中，使用“～”来表示的数值范围表示将“～”的前后所记载的数值分别作为下限值及上限值而包含的范围。
在本发明中，“工序”这一术语不仅包含独立的工序，即使在无法与其他工序明确区分的情况下，只要可实现该工序的预期目的，则也包含于本术语中。
在本发明中，在提及组合物中的各成分的量时，在组合物中存在多种相当于各成分的物质的情况下，只要无特别说明，则是指在组合物中存在的多种物质的总量。
在本发明中，两种以上的优选方式的组合为更优选的方式。
在本发明中，用百分比表示变动系数。变动系数是对某一集团将标准偏差除以平均而得的值，并且是表示该集团的偏差的程度的指标。
在本发明中参考附图对实施方式进行说明的情况下，该实施方式的结构并不限定于附图中所示的结构。并且，各图中的部件的大小是概念性的，部件之间的大小的相对关系并不限定于此。并且，在各附图中，对于具有实质上相同的功能的部件，在所有附图中标注相同的符号，有时会省略重复说明。
＜＜细胞培养用基材＞＞
本发明的细胞培养用基材具有开口率为30％～70％的多孔膜和填充在多孔膜的孔内的细胞外基质。本发明的细胞培养用基材具有开口率为30％以上的多孔膜，因此与具有开口率更低的膜的情况相比，即使施加用于变形的应力，也不易破坏，变形性优异。另一方面，本发明的细胞培养用基材具有开口率为30％以上的具有相对高的开口率的多孔膜，并且在多孔膜的孔内填充有细胞外基质，因此能够确保大的细胞粘附面积，并且细胞粘附性优异。并且，本发明的细胞培养用基材在培养细胞时或使细胞培养用基材变形以施加伸展张力等机械刺激时，也可减少细胞脱落到孔的内侧等不良情况，从而能够保持良好的细胞粘附性。
并且，本发明的细胞培养用基材的多孔膜的开口率为70％以下，因此如上所述，本发明的细胞培养用基材具有优异的变形性并且能够确保自支撑性。
并且，在使用具有高开口率的以往的多孔膜进行细胞培养的情况下，细胞与支架的接触面积小，因此培养细胞的形态、功能等有时与平面培养的情况不同。另一方面，从能够在接近平面培养的条件下进行细胞培养的观点出发，本发明的细胞培养用基材也有效。
以下，对多孔膜及细胞外基质进行详细叙述。
＜多孔膜＞
本发明的细胞培养用基材中所使用的多孔膜作为细胞粘附的支架发挥作用。对于多孔膜的种类，只要是开口率为30％～70％的多孔膜，则并无特别限制。在本发明中，多孔膜的“孔”是指存在于膜内的、相互被隔壁区划的空间。但是，相邻的孔彼此可以局部连通。
多孔膜的材质并无特别限制。作为多孔膜的材质，可举出聚丁二烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚酯(例如，聚乳酸、聚己内酯、聚乙醇酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚乳酸-聚己内酯共聚物、聚对苯二甲酸乙二酯、聚萘二甲酸乙二醇酯、聚乙烯丁二酸酯、聚丁二酸丁二醇酯、聚-3-羟基丁酸酯等)、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚偏氟乙烯、聚六氟丙烯、聚乙烯醚、聚乙烯咔唑、聚乙酸乙烯酯、聚四氟乙烯、聚内酯、聚酰胺、聚酰亚胺、聚氨酯、聚脲、聚芳烃、聚砜、聚醚砜、聚环己烷衍生物、纤维素酰化物(例如，三乙酰纤维素、醋酸丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素)等聚合物。
从对溶剂的溶解性、光学物性、电物性、膜强度、弹性等观点出发，根据需要，聚合物可以设为均聚物、共聚物、共混聚合物或聚合物合金。聚合物可以单独使用1种，也可以并用2种以上。
作为多孔膜的材质，从自支撑性的观点出发，优选选自包含聚丁二烯、聚氨酯、聚苯乙烯及聚碳酸酯的组中的至少1个聚合物。从容易保持细胞层的植入的观点出发，优选选自包含聚乳酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物及聚乳酸-聚己内酯共聚物的组中的至少1个聚合物。从实现更良好的变形性的观点出发，优选聚丁二烯、聚氨酯等弹性体。
以下，参考附图，对多孔膜的一例进行说明。在以下说明中，“长径”是指轮廓上的任意2点间距离中的最大长度，但是在确定了方向的情况下，是指该方向的任意2点间距离中的最大长度。
在图1A～图1C中示出作为多孔膜的一例的多孔膜20。图1A是多孔膜20的立体图，图1B是从上表面侧观察图1A中的多孔膜20的俯视图，图1C是沿图1B中的c-c线剖切的多孔膜20的剖视图。
在多孔膜20的整个主表面配置有孔22。但是，在多孔膜20中存在细胞不能接触的区域的情况下，可以在细胞不能接触的区域不配置孔22。在多孔膜20中，相邻的孔22彼此由隔壁24隔开。
另外，在图1A～图1C中，相邻的孔22彼此未连通，相邻的孔22彼此可以通过连通孔局部连通。另外，即使在相邻的孔22彼此通过连通孔局部连通的情况下，也视为被隔壁24区划的独立的孔。
在图1A～图1C中，孔22是贯穿孔，但是孔22也可以是非贯穿孔。在进行在多孔膜的两面分别培养相同种类或不同种类的细胞的双面培养的情况下，从促进多孔膜两面上的细胞间相互作用的观点出发，多孔膜的孔优选为贯穿孔。并且，从进一步提高变形性的观点出发，孔22也优选为贯穿孔。
图1A～图1C中所示的多孔膜20具有蜂窝结构。蜂窝结构是指将孔配置成蜂窝状的结构。蜂窝状的配置是将平行六边形(优选为正六边形)或与其近似的形状作为单位，并且开口的重心位于这些图形的顶点及对角线的交点的配置。“开口的重心”是指主表面上的开口的二维图形的重心。通过多孔膜20具有蜂窝结构，能够提高开口率，能够获得更良好的变形性。并且，在使用多孔膜22对细胞进行双面培养的情况下，从可有效地进行各面上的细胞之间的相互作用的观点出发，也优选提高开口率。
另外，多孔膜20的孔的配置并不限定于蜂窝结构，多孔膜20可以具有格子状的配置、面心格子状的配置等。
格子状的配置为将平行四边形(当然包括正方形、矩形、菱形。优选为正方形)或与其近似的形状作为单位，并且开口的重心位于这些图形的顶点的配置。
面心格子状的配置为将平行四边形(当然包括正方形、矩形、菱形。优选为正方形)或与其近似的形状作为单位，并且开口的重心位于这些图形的顶点及对角线的交点的配置。
从提高形成于多孔膜上的细胞层的均匀性的观点出发，多孔膜20中的孔22优选有规则地配置。作为有规则地配置的标准，与作为配置单位的平行六边形或平行四边形的面积相关，可举出其变动系数为10％以下的配置。对于任意10个配置单位，求出变动系数。
孔22的形状并无特别限制。作为孔22的形状，例如，可举出缺失球体的一部分的球缺形状、筒形状、圆柱形状或棱柱形状。
作为孔22的开口形状，例如，可举出圆形、椭圆形或多边形。多孔膜20的开口是指形成于多孔膜20的2个主表面中的至少1个上的孔22的入口部分。
以下，对多孔膜20的尺寸进行说明。
多孔膜20的开口率为30％～70％。由于多孔膜的开口率为30％以上，因此能够制作变形性优异的细胞培养用基材。并且，由于多孔膜的开口率为70％以下，因此自支撑性优异。从上述观点出发，多孔膜的开口率优选为30％～60％，更优选为35％～50％。
在本发明中，多孔膜的开口率是指，多孔膜的开口面(即，多孔膜的具有开口的面)的俯视图中的、开口的总面积在细胞培养区域的总面积(也包括开口的面积)中所占的比例。细胞培养区域是指通过播种而细胞能够接触的区域。在多孔膜20的开口面中，细胞不能接触的区域不包含在细胞培养区域中。在多孔膜的两面存在开口的情况下，至少一个面上的开口率为30％～70％。
孔22的间距P1为相邻的开口的中心之间的距离。关于间距P1，优选根据在多孔膜20上培养的细胞的大小来设定。间距P1例如可以是1μm～50μm。
开口直径Da为孔22的开口的长径。相对于所播种的细胞的长径(例如，10μm～50μm)，开口直径Da的平均值、即平均开口直径例如可以是10％～150％。关于平均开口直径，能够根据目的来适当设定。从良好的变形性的观点出发，平均开口直径优选为1μm以上，更优选为2μm以上，进一步优选为3μm以上。从多孔膜20的强度的观点出发，平均开口直径优选为200μm以下，更优选为50μm以下，进一步优选为10μm以下。从以上观点出发，平均开口直径优选为1μm～200μm，更优选为2μm～50μm，进一步优选为3μm～10μm。平均开口直径作为任意10个孔22的开口直径Da的算术平均值而求出。
开口直径Da的变动系数优选为20％以下，越小则越优选。开口直径Da的变动系数越小，则形成于多孔膜20上的细胞层的均匀性趋于变高。对于任意10个孔，求出开口直径Da的变动系数。
隔壁24的宽度W为连接相邻的开口的中心彼此的线段上的、隔壁24的宽度的长度。从保持多孔膜的自支撑性，并且提高处理性的观点出发，宽度W优选为0.5μm以上，更优选为1μm以上，进一步优选为3μm以上。
从制作适当的厚度的细胞培养用基材的观点出发，多孔膜20的厚度优选为40μm以下，更优选为20μm以下，进一步优选为8μm以下，尤其优选为5μm以下，最优选为3μm以下。并且，同样地，从制作适当的厚度的细胞培养用基材的观点出发，多孔膜20的厚度优选为0.5μm以上，更优选为1μm以上，进一步优选为1.5μm以上。从以上观点及可容易变形并且可获得良好的细胞粘附性的观点出发，多孔膜20的厚度优选为0.5μm～40μm，更优选为1μm～20μm，进一步优选为1.5μm～8μm，尤其优选为1.5μm～5μm，最优选为1.5μm～3μm。
图1A～图1C中所示的多孔膜20是单层膜，但是可以将层叠多个多孔膜而成的层叠膜供于细胞培养。
〔多孔膜的制造方法〕
多孔膜的制造方法并无特别限制。作为多孔膜的制造方法，可举出对树脂制膜实施蚀刻加工、喷射加工或冲孔加工而形成贯穿孔来制成多孔膜的制造方法；日本专利第4734157号公报、日本专利第4945281号公报、日本专利第5405374号公报、日本专利第5422230号公报及日本特开2011-74140号公报中所记载的、在含有聚合物及溶剂的涂膜中形成水滴而形成贯穿孔的制造方法等。
＜细胞外基质＞
在本发明的细胞培养用基材中，在多孔膜的孔内填充有细胞外基质。细胞外基质为存在于细胞的外侧的活体高分子。细胞外基质除了作为细胞培养的支架发挥作用以外，还能够对细胞的增殖、分化及表型表达发挥作用。通过多孔膜的孔内被细胞外基质填充，能够确保宽的细胞粘附面，并且能够适当地获得基于细胞外基质的所期望的作用。
作为细胞外基质，可举出选自包含纤连蛋白、胶原蛋白(例如，I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白或V型胶原蛋白)、层粘蛋白、玻连蛋白、明胶、串珠蛋白聚糖、巢蛋白、蛋白聚糖、骨桥蛋白、腱生蛋白、肾连蛋白、基底膜基质及聚赖氨酸的组中的至少1种细胞外基质。作为基底膜基质，能够以市售品(例如，MATRIGEL(注册商标)、Geltrex(注册商标))获得。
在本发明中，所谓细胞外基质“填充”在多孔膜的孔内，在孔为贯穿孔的情况下，表示细胞外基质以贯穿孔被堵住而成为非贯穿的程度保持在孔内，在孔为非贯穿孔的情况下，表示细胞外基质保持在非贯穿孔的容积的至少一部分而填埋孔。
细胞外基质“填充”在多孔膜的孔内并不一定是指在多孔膜内的孔的整个容积填满细胞外基质。
并且，多孔膜的孔内的细胞外基质可以是湿润状态，也可以是干燥状态。细胞外基质“填充”在多孔膜的孔内是指在将细胞外基质以湿润状态放置的情况下为上述定义的“填充”状态。因此，例如即使细胞外基质为干燥状态，在使细胞外基质处于湿润状态时贯穿孔被堵住而成为非贯穿的情况下，也可以说细胞外基质“填充”在多孔膜的孔内。
细胞外基质可以被冷冻干燥。若在多孔膜的孔内填充有细胞外基质的状态下进行冷冻干燥，则细胞外基质趋于在孔内保持形状的状态下成为干燥状态。
通过将干燥状态的细胞培养用基材浸润在水、培养基等液体中、或者使用孵化器等将其配置在高湿度下，能够获得湿润状态的细胞外基质填充在多孔膜的孔内的细胞培养用基材。
根据细胞培养用基材的制作操作等，有时会发生细胞外基质不均匀地配置于多孔膜的整面，而配置于多孔膜的面的一部分且未配置于另一部分、即细胞外基质的配置不均。即使在该情况下，本领域技术人员也可理解，只要通过局部配置的细胞外基质可发挥本发明的细胞培养用基材的效果，则在本发明的细胞培养用基材的范围内。
基于细胞外基质的孔的填充率优选为60％以上，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上，尤其优选为100％。
在本发明中，孔的填充率以下述方式进行测定。
通过能够对上述细胞外基质进行染色的方法，对细胞培养用基材中的细胞外基质进行染色。使用显微镜(倍率为100～200倍)，对多孔膜的任意剖面进行剖面观察。在显微镜照片中，将孔内的细胞外基质所占的总面积与任意100个孔所占的总面积的比例作为孔的填充率。
在本发明中，孔的填充率为100％是指在观察视野中的孔内整个区域填充有细胞外基质。
另外，在细胞培养用基材为干燥(包括冷冻干燥)状态的情况下，填充率设为使细胞培养用基材处于湿润状态之后测定的值。
作为能够对细胞外基质进行染色的方法，例如，可举出基于天狼猩红染色试剂盒的染色。
在本发明的一实施方式中，细胞培养用基材可以是多孔膜的至少一面被细胞外基质覆盖的状态的基材，也可以是多孔膜的两面被细胞外基质覆盖的状态的基材。从进一步提高与细胞培养用基材的粘附性的观点出发，细胞培养用基材优选为多孔膜的两面被细胞外基质覆盖的状态的基材。
多孔膜的面“被细胞外基质覆盖”是指，在多孔膜的孔内填充细胞外基质之后，进一步在多孔膜的表面也覆盖有细胞外基质的状态。通过多孔膜的至少一面被细胞外基质覆盖，趋于能够进一步提高在上述被覆盖的面培养的细胞与细胞培养用基材的粘附性(即，细胞粘附性)。
在多孔膜的至少一面被细胞外基质覆盖的情况下，覆盖多孔膜的至少一个面的细胞外基质在多孔膜表面上的厚度并无特别限制，相对于多孔膜的厚度，例如可以是0.01％～30％的厚度，也可以是0.01％～20％的厚度，还可以是0.01％～10％的厚度。
填充在多孔膜的孔内的细胞外基质优选为凝胶状、或者能够在湿润环境下形成凝胶的状态。通过使用凝胶状的细胞外基质，细胞外基质能够良好地保持在孔内，并且能够良好地确保细胞的粘附面积，因此细胞粘附性优异。
在本发明中，“凝胶”及“凝胶状”分别表示，将液体作为分散介质的胶体分散系统失去流动性而固化的物质及状态、或高分子交联而具有三维网眼结构并且在溶剂中吸收溶剂而溶胀但不溶解的属于固体与液体的中间的物质及状态。
在优选的一实施方式中，细胞培养用基材可以包括具有贯穿孔的多孔膜和填充并保持在上述多孔膜的孔内的凝胶状的细胞外基质。
〔细胞培养用基材的制作方法〕
细胞培养用基材的制作方法并无特别限制。例如，作为将凝胶状的细胞外基质填充在多孔膜的孔内的制作方法，可以通过(1)准备开口率为30％～70％的多孔膜，(2)在含有细胞外基质的溶液中浸渍多孔膜，(3)使细胞外基质凝胶化来制作细胞培养用基材。
在含有细胞外基质的溶液中浸渍多孔膜的情况下，优选多孔膜其整个厚度都浸渍于含有细胞外基质的溶液中。通过该方法，能够适当地制作具有平面状的面的细胞培养用基材。更优选为以多孔膜其整个厚度都浸渍于含有细胞外基质的溶液中并且含有细胞外基质的溶液为最小量的方式在含有细胞外基质的溶液中浸渍多孔膜。通过该方法，不过度消耗细胞外基质而能够适当地制作平面状的细胞培养用基材，趋于能够减少制造成本。
细胞外基质溶液的浓度能够适当调整。作为一例，在细胞外基质为胶原蛋白的情况下，胶原蛋白溶液的浓度可以是0.3mg/mL～10mg/mL，也可以是1.0mg/mL～10mg/mL，还可以是4.0mg/mL～10mg/mL。
在含有细胞外基质的溶液中浸渍多孔膜时，优选事先用乙醇等清洗多孔膜。通过该方法，趋于能够抑制在多孔膜与细胞外基质之间残留空隙。
凝胶化的方法并无特别限制，例如，可举出加热及冷却、调整pH、添加交联剂等方法。例如，在细胞外基质为胶原蛋白的情况下，可以通过使用氨、氢氧化钠溶液等进行碱化处理来进行凝胶化。
另外，可以将含有细胞外基质的溶液涂布于多孔膜，来代替在含有细胞外基质的溶液中浸渍多孔膜的工序。
〔细胞培养用基材的性质〕
(厚度)
细胞培养用基材的厚度优选为40μm以下，更优选为20μm以下，进一步优选为8μm以下，尤其优选为5μm以下，最优选为3μm以下。若厚度为40μm以下，则例如在双面培养时，一个面的细胞与另一面的细胞能够良好地相互作用。并且，从细胞培养用基材的强度的观点出发，细胞培养用基材的厚度优选为0.5μm以上，更优选为1μm以上，进一步优选为1.5μm以上。从以上观点及可容易变形并且可获得良好的细胞粘附性的观点出发，细胞培养用基材的厚度优选为0.5μm～40μm，更优选为1μm～20μm，进一步优选为1.5μm～8μm，尤其优选为1.5μm～5μm，最优选为1.5μm～3μm。
对于例如不使用多孔膜的平面状的细胞外基质膜，若减小厚度，则无法保持自支撑性而处理性差，但是对于本发明的细胞培养用基材，即使将厚度设为例如40μm以下、优选为20μm以下、更优选为8μm以下、进一步优选为5μm以下、尤其优选为3μm以下，也能够保持自支撑性，因此从即使减小厚度，也能够兼具变形性和自支撑性的观点出发是有效的。
细胞培养用基材的厚度能够通过显微镜观察来测定。
(杨氏模量)
通过基于JIS K 7161-1：2014及JIS K 7127：1999的拉伸试验求出的细胞培养用基材的杨氏模量优选为2.0MPa以下，更优选为1.5MPa以下，进一步优选为1.2MPa以下。上述杨氏模量为2.0MPa以下，这表示细胞培养用基材的变形性优异。上述杨氏模量的下限值并无特别限制，从细胞培养用基材的强度的观点出发，优选为0.1MPa以上。
从保持细胞培养用基材的强度的同时变形性也优异的观点出发，作为上述杨氏模量，优选为0.1MPa～2.0MPa，更优选为0.1MPa～1.5MPa，进一步优选为0.1MPa～1.2MPa。
具体而言，杨氏模量能够通过实施例中所记载的方法来求出。
(最大伸长率)
通过基于JIS K 7161-1及JIS K 7127：1999的拉伸试验求出的细胞培养用基材的最大伸长率优选为130％以上，更优选为140％以上，进一步优选为150％以上。上述最大伸长率为130％以上、优选为140％以上、更优选为150％以上，这表示即使使细胞培养用基材伸长，也不易破损。上述最大伸长率的上限并无特别限制，从细胞培养用基材的处理性的观点出发，最大伸长率可以是500％以下。
具体而言，最大伸长率能够通过实施例中所记载的方法来求出。
〔细胞培养用基材的用途〕
细胞培养用基材的用途并无特别限制。细胞培养用基材能够广泛用于活体内的移植材料、药物评价用或病情评价用组织模型或者代替动物实验的试验用组织的制作等。尤其，能够适用于在培养时或评价时对细胞施加机械刺激有效的用途。并且，根据本发明的细胞培养用基材，能够进行接近平面培养的培养，能够抑制细胞穿过多孔膜的孔而脱落等现象，因此适合于制作洞等缺陷少的组织。
供于培养的细胞的种类并无特别限制。例如，细胞可以是分裂细胞，也可以是非分裂细胞。在本发明中，“培养”无需一定伴随细胞的增殖，不管有无增殖，只要可保持细胞的生存，则包括在本术语中。
作为供于培养的细胞，例如，可举出选自包含实质细胞(例如，肝脏实质细胞或胰腺实质细胞)、间质细胞(例如，周皮细胞)、肌细胞(例如，平滑肌细胞、心肌细胞或骨骼肌细胞)、成纤维细胞、神经细胞、内皮细胞(例如，血管内皮细胞或淋巴管内皮细胞)、上皮细胞(例如，肺泡上皮细胞、口腔上皮细胞、胆管上皮细胞、肠管上皮细胞、胰腺管上皮细胞、肾上皮细胞、尿小管上皮细胞或胎盘上皮细胞)及能够分化为它们中的任一个的细胞(例如，前体细胞、间充质干细胞或多能干细胞)的组中的至少1个细胞。
作为多能干细胞，例如，可举出胚胎干细胞(embryonic stem cell；ES细胞)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell；iPS细胞)、胚胎生殖细胞(embryonic germcell；EG细胞)、胚胎癌细胞(embryonal carcinoma cell；EC细胞)、多能成体祖细胞(multipotent adult progenitor cell；MAP细胞)、成体多能干细胞(adult pluripotentstem cell；APS细胞)、Muse细胞(multi-lineage differentiating stress enduringcell：多系分化持续应激细胞)等。能够将分化衍生成目标体细胞的分化衍生因子添加到培养基来使多能干细胞分化为体细胞。
作为供于培养的细胞，为了再现病情，可以使用具有基因突变的细胞或源自患者的细胞。
细胞培养用基材可以用于1种细胞的单一培养，也可以用于多种细胞的共同培养。通过不仅单纯培养1种细胞，而且共同培养多种细胞，有时借由细胞间相互作用，细胞在更接近活体的环境下生长及增殖，从而活体模拟性会变高。
细胞培养用基材可以用于单面培养，也可以用于双面培养。在进行双面培养的情况下，在各面培养的细胞的种类可以相同，也可以不同。尤其，在多孔膜为具有贯穿孔的多孔膜的情况下，双面培养时的各面的细胞彼此能够经由细胞外基质良好地进行相互作用。
在一实施方式中，可以在细胞培养用基材的一个面上培养第1细胞而形成第1细胞层，并在与其相反的一侧的面上培养与第1细胞不同的第2细胞而形成第2细胞层。
更具体而言，例如，作为第1细胞使用血管内皮细胞层，作为第2细胞使用平滑肌细胞，通过多孔膜共同培养两种细胞，由此可以制作血管模拟结构(血管壁模型)。根据该方法，能够通过血管内皮细胞与平滑肌细胞之间的相互作用来提高血管壁模型的活体模拟性。而且，细胞培养用基材具有良好的细胞粘附性，因此能够制作洞等缺陷少的活体膜。
在血管壁模型中，优选化学物质不会自由地穿过血管内皮细胞层的细胞之间，即具有阻挡功能。据推测，能够使用本发明的细胞培养用基材制作的血管壁模型中，血管内皮细胞的细胞间粘附发展为靠近活体内的血管壁的状态。为了使用血管壁模型更准确地进行药物评价，期望血管壁模型具有近似于活体内的血管壁的结构及功能，其结果，能够使用本发明的细胞培养用基材制作的血管壁模型可以成为药物评价的优异机构。
关于细胞，通过使其悬浮于液体培养基中而可以作为细胞悬浮液播种到细胞培养用基材中。关于细胞悬浮液的制备或细胞培养中所使用的液体培养基，根据作为对象的细胞种类来选择。作为具体的培养基，例如，可举出在DMEM(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium：杜氏改良伊格尔培养基)、DMEM：F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12)、EMEM(Eagle's minimal essential medium：伊格尔最低必需培养基)、MEMα(Minimum Essential Medium Alpha：最低必需培养基α)、BME(Basal MediumEagle：伊格尔基础培养基)等哺乳动物细胞用基础培养基中添加细胞生长因子，并根据细胞种类最佳化的培养基。
这种培养基能够作为市售品而获得。液体培养基可以是混合有多种培养基的培养基。液体培养基的pH例如为pH7.0～8.0。
＜＜带有细胞的细胞培养用基材＞＞
本发明的带有细胞的细胞培养用基材中，在前述细胞培养用基材的至少一面具有细胞层。带有细胞的细胞培养用基材例如能够通过将悬浮于液体培养基中的细胞播种到细胞培养用基材中并培养细胞来获得。细胞层中的细胞及细胞培养用基材的详细内容能够应用前述的事项。
实施例
以下，举出实施例，对本发明的实施方式详细地进行说明。本发明的实施方式不应由以下所示的实施例限定性地进行解释。
＜＜实施例1：细胞培养用基材的制作＞＞
在细胞培养用基材的制作中使用了以下多孔膜。
·聚丁二烯制蜂窝薄膜(具有蜂窝结构的多孔膜，按照日本专利第4945281号公报等、公知的方法，由Fujifilm Corporation制作)：平均开口直径为5μm，厚度为1.7μm，开口率为36％，开口直径的变动系数为2％，间距为7.2μm，孔为贯穿孔，相邻的孔彼此被隔壁区划，通过连通孔而连结。
用乙醇清洗上述蜂窝薄膜之后，浸渍于胶原蛋白I(鼠尾，Corning公司)溶液中。关于胶原蛋白溶液，用PBS(Phosphate Buffered Saline：磷酸盐缓冲生理盐水)和灭菌水稀释至1mg/mL而使用。添加1N(mol/L)的氢氧化钠水溶液以使胶原蛋白溶液的pH达到8.5，混合并进行了冰冷。将蜂窝薄膜浸渍于冰冷的胶原蛋白溶液中之后取出，然后，将蜂窝薄膜在37℃下静置30分钟，由此使胶原蛋白凝胶化，从而制作了在蜂窝薄膜的孔内填充有胶原蛋白凝胶的细胞培养用基材(以下，还表示为HCF+Colgel)。
并且，作为对照，准备了未浸渍于胶原蛋白I溶液中的蜂窝薄膜(以下，还称为“未处理的蜂窝薄膜”)。
将基于扫描型电子显微镜(SEM)的未处理的蜂窝薄膜的观察照片示于图2，将上述制作的细胞培养用基材(HCF+Colgel)的观察照片示于图3。
另外，通过SEM观察，图2中所示的未处理的蜂窝薄膜及图3中所示的HCF+Colgel为干燥状态，但是图3中所示的细胞培养用基材在湿润状态下为平面状的细胞培养用基材。可知图2中所示的未处理的蜂窝薄膜的孔内未被胶原蛋白凝胶填充。可知图3中所示的HCF+Colgel的孔内被胶原蛋白凝胶填充。
＜＜实施例2：细胞培养用基材上的细胞培养＞＞
准备了下述3种细胞培养用基材。
(基材A)在蜂窝薄膜上覆盖了胶原蛋白I的细胞培养用基材(HCF)
将与实施例1中所使用的蜂窝薄膜相同的蜂窝薄膜浸渍于胶原蛋白I溶液中，用胶原蛋白I进行覆盖处理之后，用灭菌水清洗而制作了基材A。
另外，基材A中，蜂窝薄膜的表面被胶原蛋白I覆盖，但是胶原蛋白I未进行凝胶化，孔内未被胶原蛋白填充。
(基材B)在蜂窝薄膜中填充了少量胶原蛋白凝胶的细胞培养用基材(HCF+Colgel_低)
通过实施例1中所记载的方法，制作了在蜂窝薄膜的孔内填充有胶原蛋白凝胶的细胞培养用基材。将浸渍蜂窝薄膜时的胶原蛋白溶液的量设为少量，设为仅浸渍蜂窝薄膜的底部并且孔内的一部分被胶原蛋白溶液填满的量。将胶原蛋白溶液的浓度设为0.4mg/mL。
基于胶原蛋白凝胶的孔的填充率为60％左右。并且，细胞培养用基材的厚度为1.7μm。
(基材C)在蜂窝薄膜填充了大量胶原蛋白凝胶的细胞培养用基材(HCF+Colgel_高)
通过实施例1中所记载的方法，制作了在蜂窝薄膜的孔内填充有胶原蛋白凝胶的细胞培养用基材。将浸渍蜂窝薄膜时的胶原蛋白溶液的量设为在蜂窝薄膜的整个孔内填满胶原蛋白溶液的量(即，整个蜂窝薄膜浸渍于胶原蛋白溶液中的量)。
将胶原蛋白溶液的浓度设为4.0mg/mL。基于胶原蛋白凝胶的孔的填充率约为100％。并且，细胞培养用基材的厚度为1.7μm。
将通过天狼猩红染色试剂盒对胶原蛋白凝胶进行染色，并通过光学显微镜观察的基材A及基材C的剖面图像示于图4。左图中所示的基材A的孔内未被胶原蛋白凝胶填充，但是右图中所示的基材C的孔内被胶原蛋白凝胶填充。
将大鼠的血管内皮细胞及平滑肌细胞分别播种到基材A～C各自的一面，并进行了共同培养。8天之后，用VE-钙粘蛋白对培养细胞进行染色，通过显微镜观察了培养面。将各培养面的显微镜像示于图5。
通过下述式计算出血管内皮细胞覆盖细胞培养用基材的培养面的比例(以下，还称为覆盖率)。另外，在下述式中，细胞培养面的面积表示细胞培养用基材中进行了细胞播种的部分的面积。即，覆盖率越高，则可以说细胞粘附性越优异。
覆盖率(％)＝{(经染色的培养细胞所占的面积)/(细胞培养面的面积)}×100
以下示出所获得的覆盖率。
基材A……82.7±13.1％
基材B……90.4±0.4％
基材C……98.9±1.0％
根据上述结果可知，与使用基材A进行细胞培养时的覆盖率相比，使用基材B或基材C进行细胞培养时的覆盖率得到了提高。尤其确认到，使用基材C进行细胞培养时的覆盖率最高，因此细胞粘附性也高，蜂窝薄膜孔内的胶原蛋白凝胶的填充率越高，则越能够良好地培养平滑肌细胞。
＜＜实施例3：细胞培养用基材的机械性质＞＞
准备了下述5种细胞培养用基材。
(基材D)聚丁二烯制蜂窝薄膜(HCF-PB)
详细内容与实施例1中所使用的蜂窝薄膜相同，在蜂窝薄膜孔内未填充胶原蛋白凝胶。
(基材E)在聚丁二烯制蜂窝薄膜孔内填充了胶原蛋白凝胶的细胞培养用基材(胶原蛋白为湿润状态)(还表示为HCF-PB+胶原蛋白凝胶(溶胀)或HCF-PB+Colgel)
制作方法与实施例2的基材C相同。
(基材F)径迹蚀刻膜(TEM,Merck公司制造)
开口率为20％以下。
(基材G)聚碳酸酯制蜂窝薄膜(HCF-PC，按照日本专利第4945281号公报等、公知的方法，由Fujifilm Corporation制作)
(基材H)胶原蛋白Vitrigel(胶原蛋白为湿润状态)(还表示为Vitrigel(溶胀)或Vitrigel。KANTO CHEMICAL CO.,INC.制造)
对于基材D～H，根据JIS K 7161-1：2014及JIS K 7127：1999，通过以下步骤进行拉伸试验，求出了杨氏模量(Young's modulus)及最大伸长率(max elongation或Maximumelongation)。具体而言，使用IMADA Co.,Ltd.制测力计，对切成10mm×30mm的长条状的样品实施了拉伸试验。根据所获得的应力应变曲线的弹性区域的斜率获得了杨氏模量，根据断裂时应变获得了最大伸长率。试验共实施3次，求出了所获得的值的平均值。将结果示于图6及图7。
根据图6及图7可知，基材E与基材F～H相比杨氏模量低，最大伸长率高。并且，基材E与基材D相比也具有相同程度的杨氏模量及最大伸长率。根据以上结果已知，基材E具有优异的变形性。
即，实施例所示的本发明所涉及的细胞培养用基材及带有细胞的细胞培养用基材可容易变形，并且细胞粘附性优异。
于2019年10月25日申请的日本专利申请第2019-194541号的公开其整体通过参考而被编入本说明书中。
本说明书中所记载的所有文献、专利申请及技术标准与各文献、专利申请及技术标准通过参考而被具体且分别记载的情况相同程度地，通过参考而被编入本说明书中。

Claims (9)

1.一种细胞培养用基材，其具有开口率为30％～70％的多孔膜和填充在所述多孔膜的孔内的细胞外基质。
2.根据权利要求1所述的细胞培养用基材，其中，
多孔膜的平均开口直径为1μm～200μm。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养用基材，其厚度为20μm以下。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞培养用基材，其中，
基于细胞外基质的孔的填充率为80％以上。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的细胞培养用基材，其中，
细胞外基质为凝胶状或者能够在湿润环境下形成凝胶。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞培养用基材，其中，
通过基于JIS K 7161-1：2014及JIS K 7127：1999的拉伸试验求出的杨氏模量为2.0MPa以下。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的细胞培养用基材，其中，
通过基于JIS K 7161-1：2014及JIS K 7127：1999的拉伸试验求出的最大伸长率为150％以上。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的细胞培养用基材，其中，
多孔膜的至少一面被细胞外基质覆盖。
9.一种带有细胞的细胞培养用基材，其中，
在权利要求1至8中任一项所述的细胞培养用基材的至少一面具有细胞层。
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