CN115948331A - 一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法，能够通过一步法消化的方式从小鼠胆囊组织中分离获取小鼠胆囊MSCs，该方法全程在超净工作台内完成，获取胆囊组织后，将胆囊组织放入EP管中剪成小块，HBSS洗两次；弃去上清，加入1.5ml溶液I，用剪刀把胆囊组织剪碎，37℃水浴10分钟；4℃，300g离心5分钟；再次弃上清，加入1.5ml胰酶重悬沉淀后，37℃水浴60分钟，每隔10分钟摇晃一次；4℃，300g离心5分钟；弃去上清，用含10%FBS的DMEM高糖培养基重悬后，移到12孔板中，置于37℃的CO2培养箱中培养过夜。
Description
技术领域
本发明涉及生物科研技术领域，具体的说，一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是近年来备受关注的一种具有自我复制及多向分化潜能的成体组织干细胞，在适宜条件下可被诱导分化为骨、软骨和脂肪等细胞。研究发现，从脂肪、脐带、胎盘等组织中均可分离培养出MSCs。但目前尚无在胆囊壁内分离获取和鉴定间充质干细胞的任何研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法，能够通过一步法消化的方式从小鼠胆囊组织中分离获取小鼠胆囊MSCs。
本发明通过下述技术方案实现：一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法，包括下述步骤：
1）操作前处理及麻醉；
2）将小鼠固定，打开小鼠腹部，获取胆囊组织；
3）将胆囊组织放入1.5-3ml（优选的为2ml）的EP管中剪成小块，HBSS洗2-3次（优选的为2次）；
4）弃去步骤3）中的上清，加入1.5-3ml（优选的为1.5ml）溶液I，用剪刀把胆囊组织剪碎，37-40℃水浴10-15分钟，优选的37℃水浴10分钟；
5）经步骤4）后，0-4℃，300-500g离心5-10分钟；优选的经上述步骤后4℃，300g离心5min；
6）再次弃上清，加入1.5-3ml胰酶重悬沉淀后，37-40℃水浴60-80分钟；优选的，加入1.5ml胰酶重悬沉淀后，37℃水浴60min；
7）经步骤6）后，0-4℃，300-500g离心5-10分钟；优选的经上述后4℃，300g离心5min；
8）经步骤7）后，弃去上清，用含10%FBS的DMEM高糖培养基重悬后，移到12孔板中，置于37℃的CO2培养箱中培养过夜。
进一步的为更好地实现本发明所述的一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法，特别采用下述设置方式：所述步骤1）具体包括下述步骤：
1.1）1.1）操作前20-30分钟（优选为30min）打开超净台紫外灯和低温水平离心机，随后预热消化液；
1.2）麻醉小鼠，用75%酒精消毒后带入超净台。
进一步的为更好地实现本发明所述的一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法，特别采用下述设置方式：所述预热消化液至37-40℃，优选的预热消化液至37℃。
进一步的为更好地实现本发明所述的一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法，特别采用下述设置方式：所述步骤2）具体为：将小鼠用胶带固定，先利用剪刀打开小鼠腹部外皮和内皮；随后用棉签将肝脏拨到胸腔侧、肠组织拨到腹腔侧以暴露出胆囊；然后用镊子轻轻夹住胆囊，右手持剪刀自胆囊管和胆总管结合处剪断，即可获得胆囊组织。
进一步的为更好地实现本发明所述的一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法，特别采用下述设置方式：在打开小鼠腹部外皮和内皮时，避免器械混用，分别用一套剪刀进行打开处理，防止交叉感染。
进一步的为更好地实现本发明所述的一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法，特别采用下述设置方式：所述溶液I为EBSS/10mM EGTA/1% HEPEs。
进一步的为更好地实现本发明所述的一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法，特别采用下述设置方式：所述胰酶为0.05%Trypsin/EDTA / 100ug/ml DNase I。
进一步的为更好地实现本发明所述的一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法，特别采用下述设置方式：所述步骤6）在水浴时，每隔10-15分钟摇晃一次，优选的每隔10分钟摇晃一次。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
本发明通过一步消化法从小鼠胆囊组织中分离获取MSCs，无需传统组织块贴壁方式，具有操作简单，对细胞损伤较小和获取快速等优点。
附图说明
图1展示出胆囊分离培养的细胞具有MSCs样生长特征。
图2展示出胆囊组织中分离的细胞表达MSCs相关分子标志。
图3展示出胆囊组织分离的MSCs样细胞可被诱导分化为骨细胞和脂肪细胞。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，的属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征之“上”或之“下”可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”包括第一特征在第二特征正下方和斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
值得注意的是，在该技术领域内，当存在部分材料重叠的情况下，不能简单的认为其中的参数量变化仅仅是通过有限次实验即可完成，从而否定了技术方案的创造性。
实施例1：
一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法，通过一步消化法从小鼠胆囊组织中分离获取MSCs，无需传统组织块贴壁方式，具有操作简单，对细胞损伤较小和获取快速等优点，小鼠胆囊间充质干细胞，通过一步法消化获得，全部操作过程需要在超净工作台内完成，所需消化液最好提前一天配制，包括下述步骤：
（1）操作前20-30分钟打开超净台紫外灯和低温水平离心机，随后将消化液预热至37-40℃；
（2）麻醉小鼠，用75%酒精消毒后带入超净台；
（3）将小鼠用胶带固定，先利用剪刀打开小鼠腹部外皮和内皮（注意避免器械混用，内、外皮各用一套，防止交叉污染）；随后用棉签将肝脏拨到胸腔侧、肠组织拨到腹腔侧以暴露出胆囊；然后用镊子轻轻夹住胆囊，右手持剪刀自胆囊管和胆总管结合处剪断，即可获得胆囊组织；
（4）将胆囊组织放入1.5-3ml的EP管中剪成小块，HBSS洗2-3次，以洗去胆汁；
（5）弃去步骤（4）中的上清，加入1.5-2ml溶液I（EBSS/10mM EGTA/1% HEPEs），用剪刀把胆囊组织尽可能的剪碎，37-40℃水浴10-15分钟；
（6）经步骤（5）后，0-4℃，300-500g离心5-10分钟；
（7）再次弃上清，加入1.5-3ml胰酶（0.05%Trypsin/EDTA / 100ug/ml DNase I）重悬沉淀后，37-40℃水浴60-80分钟，在水浴时，每隔10-15分钟摇晃一次；
（8）经步骤（7）后，0-4℃，300-500g离心5-10分钟；
（9）经步骤（8）后，弃去上清（由于沉淀可能会特别粘稠，弃上清时需特别小心，不然会吸到沉淀），用含10%FBS的DMEM高糖培养基重悬后，移到12孔板中，置于37℃的CO2培养箱中培养过夜。
实施例2：
本实施例是在上述实施例的基础上进一步优化，与前述技术方案相同部分在此将不再赘述，一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法，小鼠胆囊间充质干细胞，通过一步法消化获得，全部操作过程需要在超净工作台内完成，所需消化液最好提前一天配制，包括下述步骤：
（1）操作前30分钟打开超净台紫外灯和低温水平离心机，随后将消化液预热至37℃；
（2）麻醉小鼠，用75%酒精消毒后带入超净台；
（3）将小鼠用胶带固定，先利用剪刀打开小鼠腹部外皮和内皮（注意避免器械混用，内、外皮各用一套，防止交叉污染）；随后用棉签将肝脏拨到胸腔侧、肠组织拨到腹腔侧以暴露出胆囊；然后用镊子轻轻夹住胆囊，右手持剪刀自胆囊管和胆总管结合处剪断，即可获得胆囊组织；
（4）将胆囊组织放入2ml的EP管中剪成小块，HBSS洗两次，以洗去胆汁；
（5）弃去步骤（4）中的上清，加入1.5ml溶液I（EBSS/10mM EGTA/1% HEPEs），用剪刀把胆囊组织尽可能的剪碎，37℃水浴10分钟；
（6）经步骤（5）后，4℃，300g离心5分钟；
（7）再次弃上清，加入1.5ml胰酶（0.05%Trypsin/EDTA / 100ug/ml DNase I）重悬沉淀后，37℃水浴60分钟，在水浴时，每隔10分钟摇晃一次；
（8）经步骤（7）后，4℃，300g离心5分钟；
（9）经步骤（8）后，弃去上清（由于沉淀可能会特别粘稠，弃上清时需特别小心，不然会吸到沉淀），用含10%FBS的DMEM高糖培养基重悬后，移到12孔板中，置于37℃的CO2培养箱中培养过夜。
后期结果验证：
如图1所示，对胆囊组织通过本方法所得到的细胞主要表现出成纤维样，符合MSCs贴壁时的形态，并且具有较强的增殖能力，可持续传代15代以上，其中，A：原代（P0）分离出来的胆囊组织分离的细胞培养时的形态（标尺：100um）；B：胆囊细胞在体外培养第5代（ P5）时的形态（标尺：100um）；C：胆囊细胞在体外培养第15代（P15）时的形态（标尺：100um），由此可知，胆囊分离的成纤维样细胞可在体外稳定扩增。
结合图2所示，将不同代数（P3、P5、P10和P12）的细胞提取RNA，基因水平检测结果显示，这些细胞表达MSCs的分子标志CD44、CD90和间质细胞标志αSMA，但不表达造血细胞表面标志CD45（图2A）。流式结果显示，分离培养的第五代（P5）胆囊间充质样干细胞表达MSCs相关分子标志CD44、CD90和CD105（比例分别为97.6%、96.5%和98.7%），不表达造血相关分子标志（图2B）。表明从胆囊中分离获得的这群成纤维样细胞是间充质干细胞。
其中，A：RT-PCR结果显示：胆囊组织中分离获得的成纤维样细胞P3、P5、P10和P12代时均表达MSCs相关分子标志CD44和CD90，以及间质细胞标志αSMA，但不表达血细胞表面分子标志CD45。其中h-Liver组织和Hela细胞为阳性对照，H2O为阴性对照。B：流式结果显示：胆囊间充质样细胞（P5）表达MSCs相关分子标志CD44、CD90和CD105，但不表达CD14、CD34和CD45等造血相关分子标志。
结合图3所示，将胆囊组织分离的MSCs在成骨细胞和成脂肪细胞诱导培养条件下培养，通过茜素红和油红染色显示，这些细胞可以被成功诱导分化成骨细胞（图3A）和脂肪细胞（图3B）。表明从胆囊中分离获得的这群间充质干细胞具有分化为骨细胞和脂肪细胞的能力。
其中，A：茜素红染色显示：胆囊MSCs可被诱导分化为骨细胞，诱导分化的骨细胞结节可被茜素红染成红色。B：油红染色显示：胆囊MSCs可被诱导分化为脂肪细胞，诱导分化的脂肪细胞内脂滴可被油红染成红色。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法，其特征在于：包括下述步骤：
1）操作前处理及麻醉；
2）将小鼠固定，打开小鼠腹部，获取胆囊组织；
3）将胆囊组织放入1.5-3ml的EP管中剪成小块，HBSS洗2-3次；
4）弃去步骤3）中的上清，加入1.5-3ml溶液I，用剪刀把胆囊组织剪碎，37-40℃水浴10-15分钟；
5）经步骤4）后，0-4℃，300-500g离心5-10分钟；
6）再次弃上清，加入1.5-3ml胰酶重悬沉淀后， 37-40℃水浴60-80分钟；
7）经步骤6）后，0-4℃，300-500g离心5-10分钟；
8）经步骤7）后，弃去上清，用含10%FBS的DMEM高糖培养基重悬后，移到12孔板中，置于37℃的CO2培养箱中培养过夜。
2.如权利要求1所述的一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法，其特征在于：所述步骤1）具体包括下述步骤：
1.1）操作前20-30分钟打开超净台紫外灯和低温水平离心机，随后预热消化液；
1.2）麻醉小鼠，用75%酒精消毒后带入超净台。
3.如权利要求2所述的一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法，其特征在于：所述预热消化液至37-40℃。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法，其特征在于：所述步骤2）具体为：将小鼠用胶带固定，先利用剪刀打开小鼠腹部外皮和内皮；随后用棉签将肝脏拨到胸腔侧、肠组织拨到腹腔侧以暴露出胆囊；然后用镊子轻轻夹住胆囊，右手持剪刀自胆囊管和胆总管结合处剪断，即可获得胆囊组织。
5.根据权利要求4所述的一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法，其特征在于：在打开小鼠腹部外皮和内皮时，分别用一套剪刀进行打开处理。
6. 根据权利要求1或2或3或5所述的一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法，其特征在于：所述溶液I为EBSS/10mM EGTA/1% HEPEs。
7. 根据权利要求1或2或3或5所述的一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法，其特征在于：所述胰酶为0.05%Trypsin/EDTA / 100ug/ml DNase I。
8.根据权利要求1或2或3或5所述的一种从小鼠胆囊中分离获取间充质干细胞的方法，其特征在于：所述步骤6）在水浴时，每隔10-15分钟摇晃一次。
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