CN109337857A - 融合蛋白E-钙粘素-Fc、VE-钙粘素-Fc和VEGF-Fc的用途 - Google Patents
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Abstract
融合蛋白E‑钙粘素‑Fc、VE‑钙粘素‑Fc和VEGF‑Fc的用途。本发明涉及细胞分化领域。具体地,涉及上皮细胞钙粘素(E‑钙粘素)‑Fc融合蛋白和/或血管内皮细胞钙粘素(VE‑钙粘素)‑Fc融合蛋白和/或内皮细胞生长因子(VEGF)‑Fc融合蛋白的新用途,其促进干细胞向肝样细胞、内皮样细胞、胰岛样细胞或胆管上皮样细胞分化。
Description
技术领域
本发明涉及细胞分化领域。更具体地,涉及上皮细胞钙粘素(E-钙粘素) -Fc融合蛋白和/或血管内皮细胞钙粘素(VE-钙粘素)-Fc融合蛋白和/或内皮细胞生长因子(VEGF)-Fc融合蛋白的新用途,其促进干细胞向肝样细胞、内皮样细胞、胰岛样细胞或胆管上皮样细胞分化。
背景技术
哺乳动物的器官发生是一个高度动态变化的过程,其受多种信号分子共同构建的微环境影响。近年来,基于干细胞三维培养的类器官(organoid) 技术有望在体外模拟器官发生发育的全过程,逐渐成为了干细胞技术和再生医学的新一代研究热点。具有复杂三维结构和功能的肝脏是人体中最重要的内分泌和外分泌器官之一,其在体内的发育过程受到多种因素的共同调控。肝实质细胞(肝细胞)和肝非实质细胞(如胆管上皮细胞、Kupffer细胞、 NK细胞)是构成肝组织结构和功能的基本单位,在这些细胞中,肝细胞和胆管上皮细胞是在肝脏内部承担主要的功能,它们是在不同的细胞因子调控下由肝母细胞分化而成。现已有文献报道,肝脏发育过程中,早期内皮细胞及其分泌的因子TGF β不仅会在肝脏发育后期控制肝母细胞分化命运(向肝细胞和胆管上皮细胞分化),其还会在肝脏发育早期促进肝内胚层细胞迁移进入横隔间充质并促进肝芽的形成。因而在体外诱导肝类器官(liverorganoid) 的形成过程中,如何精确调控干细胞经时向血管内皮细胞和肝细胞/胆管上皮细胞分化并自组装形成具有一定结构和功能的肝细胞聚集体是该技术的主要技术瓶颈。
细胞分选(cell sorting out)是肝类器官形成的第一步,该过程和细胞表面粘附因子(cell adhesion molecular)有关。钙粘素(cadherin,在本文中缩写为“Cad”)是一种细胞特异性粘附因子,通过同类细胞表面相同亚型钙粘素的同源结合形成细胞间粘附连接(Adhesion Junction),从而影响细胞分化。另外,钙粘素在胚胎发育中的细胞识别、迁移、组织分化以及成体组织器官构成中起到主要作用。上皮细胞钙粘素(E-cadherin)是哺乳动物发育过程中第一个表达的钙粘素,其对胚胎干细胞分裂球的紧密结合及上皮细胞分化有着重要的影响,而血管内皮细胞钙粘素(VE-cadherin)对干细胞/内皮祖细胞向内皮细胞分化及其功能实现具有重要作用。
已有多种基于Fc段的钙粘素融合蛋白应用于组织工程及再生医学的研究当中,例如E-Cadherin-Fc、N-Cadherin-Fc等作为细胞外基质的改性成分之一用于研究对细胞行为调控的影响。研究表明血管内皮细胞钙粘素蛋白 (VE-Cadherin)作为内皮细胞之间粘附连接的重要组成成分,在血管的新生过程中起着十分重要的作用。
南开大学的杜凤仪、许可博士生物合成了由人内皮细胞钙粘素蛋白的胞外域与免疫球蛋白IgG的Fc结构域组成的融合蛋白(hVE-cad-Fc),考察并优化了其在聚苯乙烯培养板表面的固定及其调控血管内皮细胞粘附、增殖、迁移及分化功能表达的生物活性(杜凤仪、许可,博士学位论文,2011、2016 年,南开大学)。
但目前为止,现有技术中并没有任何关于人内皮细胞钙粘素蛋白-Fc融合蛋白促进干细胞向肝细胞分化的报道。
发明内容
本发明在于发现了将上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白(例如,人上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白,缩写为hE-cad-Fc)、血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白 (例如,人血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白,缩写为hVE-cad-Fc)和内皮细胞生长因子融合蛋白(例如人VEGF165-Fc融合蛋白,缩写为hVEGF-Fc) 固定在基质上,在二维水平将干细胞培养在固定于基质表面的融合蛋白上或者在三维水平将表面固定有融合蛋白的基质引入到干细胞聚集体内部,通过细胞表面钙粘素与基质表面同种类型钙粘素-Fc的结合调控基质表面干细胞的粘附、迁移和分选,进一步调控干细胞的分泌功能并协同外源细胞分化因子,仿生构建细胞外微环境,调控干细胞的分化。通过将E-cad-Fc、VE-cad-Fc 和VEGF-Fc固定在同一个基质上或固定在不同的基质上,提高了干细胞向肝样细胞、内皮样细胞、胰岛样细胞、胆管上皮样细胞的分化效率。
在整个诱导分化过程中,融合蛋白主要起到以下作用:
1.利用基质材料表面固定不同亚型钙粘素融合蛋白介导干细胞组装多细胞聚集体,实现钙粘素亚型依赖性细胞粘附并促进干细胞构建组织特异性细胞外微环境;
2.再协同相应外源细胞因子定向诱导干细胞向内皮及上皮分化。 VE-cad-Fc与内外源VEGF协同作用,促进干细胞向内皮样细胞快速分化,同时,通过其分泌的细胞外基质、细胞因子及内皮壁龛的形成,进一步协同 E-cad-Fc调控干细胞向上皮样细胞的分化。在E-cad-Fc、外源添加细胞因子和内皮壁龛及其内源性TGFβ的作用下,调控干细胞分别向肝样细胞或者胆管上皮样细胞分化。该过程主要通过融合蛋白种类及浓度等的调控,更好地在体外仿生模拟了肝脏发育过程;
3.在分化过程中,E-cad-Fc持续性激活干细胞的EGF受体磷酸化,进而替代外源EGF的使用;VE-cad-Fc不仅持续性上调干细胞VEGF的表达,同时能有效激活干细胞的VEGF受体磷酸化,进而减少干细胞向内皮细胞定向分化对外援添加VEGF的依赖性;
4.E-cad-Fc上调干细胞表达HNF4α,促进干细胞发生MET转化,有利于干细胞向肝样细胞分化;
5.E-cad-Fc不仅下调干细胞表达β-连环蛋白并使其更多的定位于胞浆中,从而有利于干细胞向肝样细胞的分化;
6.E-cad-Fc和VE-cad-Fc通过调控YAP蛋白的表达及其胞内分布,促进干细胞向内皮及上皮定向分化;
7.E-cad-Fc和VE-cad-Fc改善干细胞聚集体结构与功能的稳定性,模拟体内细胞微环境,促进干细胞体外定向分化;
8.E-cad-Fc和VE-cad-Fc介导干细胞聚集组装多细胞聚集体,可有效调控干细胞定向分化并提高分化效率,为肝、胆、胰类器官的构建及其在再生医学、药物研发等领域的应用提供了新的思路和技术。
具体地,本发明涉及E-cad-Fc、VE-cad-Fc和VFGF-Fc在肝样细胞、内皮样细胞、胆管上皮样细胞、胰岛样细胞分化中的应用。
在本发明的一个方面,涉及E-cad-Fc在激活细胞中存在的EGFR中的应用。
在本发明的一个方面,涉及E-cad-Fc在促进干细胞向肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞分化中的应用。
在本发明的一个实施方案中,所述E-cad-Fc用于替代EGF。
在本发明的一个实施方案中,所述E-cad-Fc固定在基质上。
在本发明的一个方面,涉及VE-cad-Fc在促进干细胞向内皮样细胞、肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞分化中的应用。
在本发明的一个实施方案中,所述VE-cad-Fc固定在基质上。
在本发明的一个实施方案中,所述VE-cad-Fc与VEGF-Fc组合使用。
在本发明的一个实施方案中,所述VE-cad-Fc和所述VEGF-Fc固定在基质上,优选固定在同一个基质上或不同的基质上。
在本发明的一个方面,涉及E-cad-Fc和VE-cad-Fc在促进细胞向内皮样细胞、肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞分化中的应用。
在本发明的一个实施方案中,所述E-cad-Fc与所述VE-cad-Fc的比例为 3∶1至1∶3,优选1∶3,3∶1或1∶1。
在本发明的一个实施方案中,所述VE-cad-Fc与VEGF-Fc融合蛋白组合使用。
在本发明的一个实施方案中,所述VE-cad-Fc和所述VEGF-Fc融合蛋白固定在基质上,优选固定在同一个基质上或不同的基质上。
在本发明的一个方面,涉及制备肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞的方法,其特征在于,在存在E-cad-Fc和/或VE-cad-Fc的情况下培养干细胞。
在本发明的一个方面,涉及制备内皮样细胞的方法,其特征在于,在存在VE-cad-Fc的情况下培养干细胞。
在本发明的一个实施方案中,在另外存在VEGF-Fc融合蛋白的情况下培养干细胞。
在本发明的一个实施方案中,所述E-cad-Fc和所述VE-cad-Fc固定在基质上,优选固定在同一个基质上或不同的基质上。
在本发明的一个实施方案中,所述干细胞为间充质干细胞,iPS细胞或胚胎干细胞。
在本发明的一个实施方案中,所述干细胞来源于哺乳动物,优选人、鼠、猪。
在本发明的一个实施方案中,所述上皮细胞钙粘素为人上皮细胞钙粘素,优选为SEQ ID NO:9所示的序列。
在本发明的一个实施方案中,所述血管内皮细胞钙粘素为人血管内皮细胞钙粘素,优选序列为SEQ ID NO:5所示的序列。
在本发明的一个实施方案中,所述Fc为人IgG(优选IgG1)的Fc,优选为SEQ ID NO:4所示的序列。
在本发明的一个实施方案中,所述血管内皮细胞生长因子为人 VEGF165,优选VEGF的序列为SEQ ID NO:81。
在本发明的一个方面,涉及用于培养细胞的改性基质,其包含上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和/或血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白,其中优选地,所述上皮细胞钙粘素为人上皮细胞钙粘素,优选为SEQ ID NO:9所示的序列,所述血管内皮细胞钙粘素为人血管内皮细胞钙粘素,优选序列为SEQ ID NO:5所示的序列。
在本发明的实施方案中,所述基质用于促进细胞向内皮样细胞、肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞分化,优选地,所述干细胞为间充质干细胞, iPS细胞或胚胎干细胞,更优选地,所述干细胞来源于哺乳动物,优选人、鼠、猪。
在本发明的实施方案中,当改性基质包含血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白时,还进一步包含VEGF-Fc融合蛋白,优选地,所述VEGF为人 VEGF165,更优选VEGF的序列为SEQID NO:81。
在本发明的另一个方面,涉及所述的改性基质在促进细胞(优选干细胞,更优选间充质干细胞,iPS细胞或胚胎干细胞)分化(优选促进向内皮样细胞、肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞分化)中的应用。本发明的另一个方面,涉及制备改性基质的方法,包含通过将上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和/或血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白与基质混合来改性所述基质。
在本发明的实施方案中,所述基质是用于促进细胞向内皮样细胞、肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞分化的基质,优选地,所述干细胞为间充质干细胞,iPS细胞或胚胎干细胞,更优选地,所述干细胞来源于哺乳动物,优选人、鼠、猪。
本本发明的实施方案中,其中当使用血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白改性基质时,还进一步使用VEGF-Fc融合蛋白改性基质,优选地,所述VEGF 为人VEGF165,更优选VEGF的序列为SEQ ID NO:81。
在本发明上述各个方面的实施方案中,所述基质选自细胞培养板、细胞培养皿、水凝胶,多孔支架(优选PLGA支架或PGL支架)或者微球,优选所述微球粒径大小为10-50微米(优选15-30,15-20微米),优选疏水性微球或亲水性微球,更优选所述微球是PLGA微球,更优选粒径大小为10-50微米(优选15-30,15-20微米)的PLGA微球;或者所述微球为聚苯乙烯球,更优选粒径大小为10-50微米(优选15-30,15-20微米)的聚苯乙烯微球。
在本发明上述各个方面的的实施方案中,所述多孔支架,薄膜或微球为亲水性的或疏水性的。在一个实施方案中,当所述多孔支架,薄膜或微球为亲水性的多孔支架,薄膜或微球时,所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白或所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白通过接头(优选Fc-结合肽)连接于所述多孔支架、,薄膜或微球。优选地,所述Fc结合肽选自CHWRGWV(SEQ ID NO:93),HYFKFD(SEQ ID NO:94,参见参考资料3和4),HFRRHL(SEQ ID NO:95,参见参考资料3和4),FYWHCLDE(SEQ ID NO:96,参见参考资料1和2)或SpA(staphylococcal蛋白A,参见参考资料1和2)。
在本发明的上述各个方面的实施方案中,所述水凝胶优选是透明质酸水凝胶,更优选丙稀酰肼化的透明质酸水凝胶或PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶。
在本发明的实施方案中,所述丙稀酰肼化的透明质酸水凝胶是通过己二酸二酰肼和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺对透明质酸修饰而制备。
在本发明的实施方案中,其中所述PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶是通过PAMAM树枝状大分子与巯基化透明质酸发生迈克尔加成反应而制备。
参考资料
1.Biomimetic design of affinity peptide ligands for human IgG basedon protein A-IgG complex,Biochemical Engineering Journal,88(2014(1-11)
2.FYWHCLDE-based affinity chromatography of IgG:Effect of liganddensity and purifications of human IgG and monoclonal antibody,Journal ofChromatography A,1355(2014)107-114.
3.Performance of hexamer peptide ligands for affinity purification ofimmunoglobulin G from commercial cell culture media,Journal of ChromatographyA,1218(2011)1691-1700
4.Purification of human immunoglobulin G via Fc-specific smallpeptide ligand affinity chromatography,Journal of Chromatography A 1216(2009)910-918
附图说明
图1:hVE-cad-Fc构建的示意图及鉴定。其中图1A表示 pcDNA3.1-hVE-cad-Fc的结构示意图;图1B表示纯化的hVE-cad-Fc的 SDS-PAGE和Western blot分析,其中M:蛋白标准;P:人IgG(阳性对照, Sigma目录编号No.M15154);R:还原态下纯化的hVE-cad-Fc融合蛋白;N:非还原态下纯化的hVE-cad-Fc融合蛋白。
图2:hE-cad-Fc构建的示意图及鉴定。其中图2A表示hE-cad-Fc融合蛋白表达载体的酶切鉴定,M:蛋白标准;1:酶切hE-cad-Fc融合蛋白基因片段;2:酶切hE-cad胞外域基因片段;3:酶切Fc基因片段;4:未酶切的质粒载体;图2B表示hE-cad-Fc融合蛋白的Westernblotting鉴定,M:marker; 1:还原态人E-钙粘素融合蛋白;2:非还原态人E-钙粘素融合蛋白。
图3:胶原溶液、hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc混合溶液分别处理基质及TCPS 基质表面培养细胞24小时相关因子基因表达。
图4:胶原溶液、hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc混合溶液分别处理基质及TCPS 基质表面培养细胞48小时相关因子基因表达。
图5:胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hVE-cad-Fc溶液分别处理基质不同时间培养细胞总EGF受体和EGF受体磷酸化蛋白表达。
图6:hE-cad-Fc溶液处理基质在不同浓度EGF的作用下培养细胞总EGF 受体、EGF受体磷酸化、Oct4、CK18、CK19及β-肌动蛋白表达。
图7:hVE-cad-Fc溶液与不同浓度hVEGF-Fc溶液共同处理基质培养细胞总VEGFR2受体、VEGFR2受体磷酸化、Oct4、CD31、VE-钙粘素及β- 肌动蛋白表达。
图8:胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞的形态。
图9:胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞Oct4、FoxA2及Sox17基因表达。
图10:胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞CK18、AFP及ALB基因表达。
图11:胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞OATP及MRP2基因表达。
图12:胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞G6Pase及α1-AT基因表达。
图13:胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞CD31、VE-钙粘素及VEGFR2 基因表达。
图14:胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞ALB分泌及Urea合成。
图15:胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化4周时细胞表达ALB免疫荧光染色。
图16:胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞相关蛋白表达。
图17:胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞分泌相关因子基因表达。
图18:胶原溶液、hE-cad-Fc、hVE-cad-Fc混合溶液分别处理基质及TCPS 基质表面培养细胞48小时细胞表达YAP蛋白免疫荧光染色结果。
图19:胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞MET转化相关基因表达。
图20:hE-cad-Fc溶液、hVE-cad-Fc溶液和hVEGF-Fc混合溶液的固定量、稳定性及在微球表面分布。
图21:不同比例细胞与微球制备的细胞聚集体形态。
图22:不同比例细胞与微球制备的细胞聚集体定向诱导分化1周时相关基因表达。
图23:胶原溶液、不同比例hE-cad-Fc与hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc修饰微球与细胞的聚集体分化1周时相关基因表达。
图24:胶原溶液、不同比例hE-cad-Fc修饰微球与hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc 修饰微球与干细胞的聚集体分化1周时相关基因表达。
图25:不含有微球的细胞聚集体、含胶原溶液修饰微球的细胞聚集体、含hE-cad-Fc修饰微球与hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc修饰微球的细胞聚集体及含 hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液修饰微球的干细胞聚集体诱导分化4周期间相关基因表达。
图26:不含有微球的细胞聚集体、含胶原溶液修饰微球的细胞聚集体、含hE-cad-Fc修饰微球与hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc修饰微球的细胞聚集体及含 hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液修饰微球的干细胞聚集体诱导分化2周时细胞ALB和CD31的免疫荧光染色。
图27:含人脐静脉内皮细胞与hMSC的细胞聚集体、含hE-cad-Fc修饰微球与hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc修饰微球的干细胞聚集体及含 hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液修饰微球的干细胞聚集体诱导分化4周期间相关基因表达情况及ALB分泌。
图28:胶原溶液、hE-cad-Fc溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc混合溶液分别处理基质表面定向诱导分化细胞Oct4、PDX-1、INS、MAFA、 CPA1及β-肌动蛋白基因表达。
图29:不含微球的细胞聚集体、含PLGA微球的细胞聚集体和含 hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc修饰微球的细胞聚集体分别诱导分化1周时相关基因及蛋白表达。其中图29A表示分化1周时内皮细胞相关标志物基因及蛋白的表达;图29B表示分化1周内相关因子及基质基因的表达。
图30:PAMAM树枝状大分子合成路线图及hVE-cad-Fc融合蛋白对水凝胶的功能化改性,其中图30A为PAMAM树枝状大分子合成路线图;图30B为三种不同PAMAM树枝状大分子的核磁共振氢谱图;图30C为 hVE-cad-Fc融合蛋白在含有/不含有Fc-bp的水凝胶中的14天时间内固定量的百分比;图30D为HUVEC与hMSC在不同方式改性水凝胶上的黏附及增殖。
图31:水凝胶理化性质表征,其中图31A为hVE-cad-Fc改性前后水凝胶分别在培养基、透明质酸酶、hMSC和HUVEC上清液中不同时间点剩余量百分比;图31B为hVE-cad-Fc改性前后水凝胶在PBS中的溶胀性检测;图31C为hVE-cad-Fc改性前后水凝胶流变仪性质检测;图31D为hVE-cad-Fc 改性前后水凝胶形貌特征检测。
图32:hVE-cad-Fc功能化改性水凝胶对HUVEC生存影响研究,其中图32A为HUVEC在不同改性水凝胶上二维培养3天的光镜观察图;图32B为 HUVEC在不同改性水凝胶上二维培养3天的死活染色图;图32C为HUVEC 在不同改性水凝胶上二维培养4、24、48和72小时的CCK-8检测的黏附增殖;图32D为HUVEC在不同改性水凝胶之上二维培养3天的骨架染色;图32E为HUVEC在不同改性水凝胶三维培养1、3、5和7天黏附增殖;图32F 为HUVEC在不同改性水凝胶中三维培养7天死活染色。
图33:hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性水凝胶对HUVEC血管功能化的影响,其中图33A,33B分别为HUVEC在不同改性水凝胶上培养24、48、 72小时后蛋白质印迹实验检测vWF与eNOS蛋白的表达;图33C为HUVEC 在不同改性水凝胶上培养4、24、48、72小时后一氧化氮释放量;图33D为 HUVEC在不同改性水凝胶上培养72小时后激光共聚焦显微镜对低密度脂蛋白的吞噬检测。
图34:丙烯酰肼化透明质酸的核磁共振氢谱检测,其中图34A为HA的核磁共振氢谱;图34B为HA-ADH的核磁共振氢谱;图34C为HA-AC的核磁共振氢谱。
图35:融合蛋白hVE-cad-Fc在水凝胶中固定的1周时间内的酶联免疫吸附测定实验。
图36:水凝胶成胶性、稳定性及降解性理化性质表征,其中图36A是不同交联剂下的成胶图;图36B是不同交联密度水凝胶在PBS溶液中的稳定性分析及低交联度水凝胶流变性分析;图36C是hVE-cad-Fc功能化改性水凝胶(DTT交联和MMP交联)前后溶胀性分析研究。
具体实施方式
下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解的是,下述实施例是举例说明的目的,其不应以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。
实施例1:构建和表达人hVE-cad-Fc融合蛋白
参见杜凤仪,博士论文,南开大学,2011年11月。主要如下:
1.1血管内皮细胞钙粘素胞外区基因VE-cad的克隆和序列分析
根据UniProt数据库收录人VE钙粘素蛋白序列和功能分区,结合 GenBank收录的基因(NCBI Reference Sequence:NM_001795.3)序列设计特异性PCR引物,扩增hVE钙粘素蛋白胞外区(EC1-EC5)。上游引物(P1); 5′-CCGGATATCATGCAGAGGCTCATGATGCTCC-3′(SEQID NO:1),引入EcoR V酶切位点(下划线),下游引物:(P2) 5′-AAGCGGCCGCTCTGGGCGGCCATATC-3′(SEQ ID NO:2),引入Not I酶切位点(下划线)。引物合成及测序均由Invitrogen有限公司完成。
人脐静脉内皮细胞(HUVEC,ScienCell公司,美国)总mRNA提取:按照《分子克隆实验指南》(第三版)的常规方法提取mRNA。测O.D值定量RNA纯度和浓度。反转录按照购买的BD公司试剂盒 MicroRNAAssays中操作,反转录体系如下:
反转录程序如下:
以HUVEC mRNA反转录形成的cDNA为模板,扩增出VE-cad基因片段,PCR 反应体系如下:
扩增条件如下:94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,共35个循环,最后72℃延伸10min。向反应液中补加380μL ddH2O,再用等体积的苯酚/ 氯仿/异戊醇抽提一次,加1/10体积的3M NaAc(pH 5.0),2倍体积的无水乙醇,-20℃中放置1h;4℃,12000rpm离心10min,DNA沉淀用70%乙醇洗涤两次,真空干燥,将沉淀溶于适量TE中。
1.2pcDNA3.1-hVE-cad-Fc真核表达载体的构建
(1)EcoRV、Not I双酶切纯化后的PCR产物
酶切体系如下:
37℃过夜反应,65℃灭活酶15min,向反应液中补加350μL ddH2O,再用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次,加1/10体积的3M NaAc(pH5.0),2倍体积的无水乙醇,-20℃中放置1h。4℃,12000rpm离心10min,DNA沉淀用70%乙醇洗涤两次,真空干燥,将沉淀溶于10μLTE中。
(2)pcDNA/3.1的EcoRV和Not I酶切;
pcDNA/3.1(Thermo Fisher Scientific,美国,货号V79020)的双酶切体系(3×50μL)如下:
37℃过夜反应。将酶切产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳分离,紫外灯下切下目的片段,使用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(TaKaRa,日本,货号9762)进行回收,回收片段溶于25μLddH2O中。
(3)载体与目的片段的连接反应及转化反应
反应体系如下:
16反应16h。然后CaCl2转化感受态细胞BL21(DE3)37℃过夜培养16~18h。挑取转化子,小量提取质粒检测。
将回收的目的基因hVE-钙粘素胞外区和带有Fc片段载体pcDNA3.1,在 37℃恒温下分别进行双酶切(EcoR V和Not I)。电泳胶回收后,将回收产物混合,在T4DNA连接酶的催化下,于16℃过夜连接。将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞后,用氨苄青霉素(Amp+)进行抗性筛选。提取质粒后双酶切鉴定,初步鉴定为正确的重组质粒进行DNA序列分析。将构建的重组质粒命名为pcDNA3.1/hVE-cad-Fc(见图1A)。经测序验证序列正确。hVE-cad-Fc融合蛋白序列为SEQ ID NO:3所示,其中Fc的序列如SEQ ID NO:4所示,
hVE-cad的序列如SEQ ID NO:5所示。
1.3细胞转染与蛋白纯化
将pcDNA3.1/hVE-cad-Fc转染293F细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)。
利用免疫球蛋白Fc段与rProtein A的特异性结合,通过GE Healthcare公司的Hitrap rProtein A FF柱子进行目的蛋白纯化。
1.4Western blotting分析
纯化的hVE-cad-Fc融合蛋白质以10%SDS-PAGE胶电泳后转移至PVDF 膜,5%脱脂奶封闭2小时,一抗兔抗人VE-钙粘素胞外域的单克隆抗体(RD,美国,1∶400稀释)孵育4℃过夜,HRP标记的羊抗兔二抗(abcam,美国, 1∶10000稀释)室温孵育1h,TBST洗膜,DAB试剂曝光显影定影分析。检测Fc形成二聚体时上样缓冲液中不加β巯基乙醇。结果参见图1B。
从图1B可以看出在非还原态情况下可以在~240KD处看到一条条带和在还原态情况下在~120KD可以看到一条条带,这些结果暗示了hVE-cad-Fc融合蛋白以二聚体的形式。
实施例2:构建和表达人hE-cad-Fc融合蛋白
参见徐建斌,博士论文,南开大学,2013年12月。主要如下。
2.1上皮细胞钙粘素胞外区基因E-cad的克隆和序列分析
根据UniProt数据库收录人E钙粘素蛋白序列和功能分区,结合GenBank 收录的基因(NCBI Reference Sequence:NM 004360.3)序列设计特异性PCR引物,扩增E钙粘素蛋白胞外区。上游引物 (P1):5’-CGCAAGCTTATGGGCCCTTG-GAGCCGCAGC-3’,SEQ ID NO:6;下游引物:(P2)5’-TTGCGGCCGCAGGCAGGAATTTGCAATCCTGC-3’,SEQ ID NO:7。引物合成及测序均由Invitrogen有限公司完成。
L-02(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)细胞总mRNA提取:按照《分子克隆实验指南》(第三版)的常规方法提取mRNA。测O.D值定量RNA纯度和浓度。反转录按照购买的BD公司试剂盒 MicroRNA Assays中操作。反转录体系如下
反转录程序如下:
以L-02mRNA反转录形成cDNA为模板,扩增出E-cad基因片段,PCR反应体系如下:
扩增条件如下:94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,共35个循环,最后72℃延伸10min。向反应液中补加380μL ddH2O,再用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次,加1/10体积的3M NaAc(pH 5.0),2倍体积的无水乙醇, -20℃中放置1h;4℃,12000rpm离心10min,DNA沉淀用70%乙醇洗涤两次,真空干燥,将沉淀溶于适量TE中。
2.2pcDNA3.1-hE-cad-Fc真核表达载体的构建
(1)Hind III、Not I双酶切纯化后的PCR产物
酶切体系如下:
37℃过夜反应,65℃灭活酶15min,向反应液中补加350μL ddH2O,再用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次,加1/10体积的3M NaAc(pH5.0),2倍体积的无水乙醇,-20℃中放置1h。4℃,12000rpm离心10min,DNA沉淀用70%乙醇洗涤两次,真空干燥,将沉淀溶于10μLTE中。
(2)pcDNA/3.1的Hind III和Not I酶切;
37℃过夜反应。将酶切产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳分离,紫外灯下切下目的片段,使用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒(TaKaRa)进行回收,回收片段溶于25μL ddH2O中。
(3)载体与目的片段的连接反应及转化反应
反应体系如下:
16℃反应16h。然后CaCl2转化感受态细胞BL21(DE3)37℃过夜培养 16~18h。挑取转化子,小量提取质粒检测。
将回收的目的基因E-钙粘素胞外区和带有Fc片段载体pcDNA3.1,在 37℃恒温下分别进行双酶切(Hind III和Not I)。电泳胶回收后,将回收产物混合,在T4DNA连接酶的催化下,于16℃过夜连接。将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞后,用氨苄青霉素(Amp+)进行抗性筛选。提取质粒后双酶切鉴定,初步鉴定为正确的重组质粒进行DNA序列分析(图2A所示)。将构建的重组质粒命名为pcDNA3.1/hE-cad-Fc。经测序验证序列正确。hE-cad-Fc融合蛋白序列为SEQ ID NO:8所示,其中hE-cad的序列如SEQ ID NO:9所示,Fc 的序列如SEQ ID NO:4所示。
2.3细胞转染与蛋白纯化
将pcDNA3.1/hE-cad-Fc转染293F细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)。
利用免疫球蛋白Fc段与rProtein A的特异性结合,通过GE Healthcare公司的Hitrap rProtein A FF柱子进行目的蛋白纯化。
2.4Western blotting分析
纯化的hE-cad-Fc融合蛋白质以10%SDS-PAGE胶电泳后转移至PVDF 膜,5%脱脂奶封闭2h,一抗兔抗人E-钙粘素胞外域的单克隆抗体(RD,美国,1∶400稀释)孵育4℃过夜,HRP标记的羊抗兔二抗(abcam,美国,1∶10 000稀释)室温孵育1h,TBST洗膜,DAB试剂曝光显影定影分析。检测Fc形成二聚体时上样缓冲液中不加β巯基乙醇。结果参见图2B。
从图2B可以看出在非还原态情况下可以在~240KD处看到一条条带和在还原态情况下在~120KD处可以看到一条条带,这些结果暗示了hE-cad-Fc 融合蛋白以二聚体的形式。
在以下实施例中,除非另外说明,所涉及的PCR反应如下:
利用TransGen Biotech提供的PCR试剂盒按照下表向无RNase/DNase的 PCR管中加入如下各组分:
PCR仪的程序设定:95℃5min 1个循环,95℃5min退火温度1min 72℃45s 35个循环,72℃10min 1个循环,4℃保温,利用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物的表达情况
实施例3.hMSC在不同修饰的基质表面细胞因子及细胞外基质分泌的检测
用0.01M PBS(pH=7.2)将I型胶原(collagen,BD,美国,货号354249)、 hE-cad-Fc、hVE-cad-Fc及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc混合溶液(两种融合蛋白比例为1∶1)分别稀释至终浓度为10μg/mL,向6孔细胞培养板中分别加入1.5mL 稀释后的胶原溶液及hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc混合溶液,置于细胞培养箱中 37℃孵育2h,取出后弃上清,并用0.01M PBS(pH=7.2)清洗3遍。
随后按照细胞密度105细胞/孔将hMSC(赛业生物,中国)接种于TCPS 培养板和上述溶液孵育后的培养板中,用含有10%胎牛血清(FBS,BI,美国)的DMEM/Ham′s F12 1∶1(DF12,BI,美国)培养基在细胞培养箱中(37℃,5%CO2)进行培养。分别培养24h和48h后,弃培养基,用0.01M PBS(pH=7.2) 清洗细胞3次后,每孔加入1mL Trizol(Invitrogen,美国,货号15596026),按照产品说明书提取RNA。利用Biodrop测定RNA样品浓度,取2μg RNA 按照Roche反转录试剂盒(货号4655877001)说明书利用试剂盒中的随机引物进行反转录获得cDNA(PCR仪的程序设定:55℃30min 1个循环,85℃ 5min 1个循环,4℃保温)。利用Roche荧光定量PCR试剂盒(货号4914058001) 进行基因表达量分析,所用的引物序列及退火温度见下表1(PCR仪的程序设定:95℃5min 1个循环,95℃5min退火温度1min 72℃45s 35个循环,72℃10min 1个循环,4℃保温),将上述样品混匀后置于荧光定量PCR仪 (Biorad)中进行检测,获得的数据以TCPS组为对照组,利用2-ΔΔCt法进行处理。其中培养24h的检测结果见图3;培养48h的检测结果见图4。
从PCR结果可以看出,hE-cad-Fc和hVE-cad-Fc两种融合蛋白联合使用可以显著提高hMSC自分泌细胞外基质蛋白和细胞因子的能力,有利于 hMSC在外源细胞因子的作用下发生定向诱导分化。
实施例4.不同修饰的基质表面EGF受体激活时间的评价
按照实施例3的方法处理6孔细胞培养板,按照105细胞/孔的细胞密度将hMSC分别接种于I型胶原、hE-cad-Fc和hVE-cad-Fc修饰的培养板表面,用维持培养基在细胞培养箱中(37℃,5%CO2)培养4h。I型胶原修饰的基质表面的细胞用含有10ng/mL EGF(Peprotech,美国,货号AF-100-15)的维持培养基培养,hE-cad-Fc和hVE-cad-Fc分别修饰的基质表面的细胞用维持培养基(不含EGF)培养,培养0min、10min、30min、60min、90min和 120min时用100μL细胞强裂解液(碧云天)裂解细胞并如下提取蛋白,通过 western blotting检测不同样品不同时间总EGF受体(total EGF receptor,CST,美国,1∶1000稀释)和EGF磷酸化受体(phospho-EGF receptor Tyr 1068,1068 位进行磷酸化,CST,美国,1∶1000稀释)表达情况。结果见图5。
蛋白提取:
①按照每2×106细胞加入100μL裂解液的比例加入裂解液,利用细胞刮进一步裂解细胞释放细胞中的总蛋白质,4℃13000rpm离心10min,取上清;
②按照BCA试剂盒(碧云天,货号P0010)测试上清中蛋白质的含量;
③按照1∶5的比例向上清中加入5×上样缓冲液(碧云天,货号P0015),煮沸5min,按照每孔20μg蛋白的上样量分装煮沸后的蛋白质,置于 -80℃冰箱保存及完成细胞总蛋白的提取。
从图5可以看出,在胶原蛋白修饰的基质上hMSC的EGF受体磷酸化受到培养基中添加的EGF刺激在60min之内保持激活状态,在60min之后EGF 受体磷酸化开始失活;而在hE-cad-Fc修饰的基质表面的hMSC EGF受体磷酸化在2h内一直维持激活状态;hVE-cad-Fc修饰的基质表面的hMSC的 EGF受体磷酸化不会被激活,这就说明hE-cad-Fc可以特异性地、持续性的激活EGF受体及其磷酸化。
实施例5.hE-cad-Fc修饰的基质表面不同浓度EGF对于hMSC定向分化的影响
按照105细胞/孔的细胞密度将hMSC接种在如实施例3所述制备的 hE-cad-Fc修饰的的6孔板表面,利用维持培养基培养过夜后向不同的孔中加入1.5mL含有不同浓度EGF(0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL 和25ng/mL)的肝定向分化培养基(DF12+2%FBS+10ng/mL FGF4+20ng/mL HGF+1*ITS,其中FGF4来自于Peprotech,美国,货号为100-31;HGF来自于Peprotech,美国,货号为100-39H;ITS来自于Sigma,美国,货号为I3146),每两天换液,培养7天后提取蛋白利用western blotting检测不同样品Oct4 (abcam,美国,1∶1000稀释)、总EGF受体(CST,美国,1∶1000稀释)、磷酸化-EGF受体Tyr 1068(CST,美国,1∶1000稀释)、CK18(abcam,美国,1∶1000稀释)及CK19(abcam,美国,1∶1000稀释)的表达情况。结果见图6。
从图6中可以看出,在加入分化培养基1周后,不含有EGF的分化培养基的实验组向肝细胞定向诱导分化的效率最高,说明hE-cad-Fc基质在hMSC 向肝细胞定向分化过程中可以替代EGF的相关功能,持续刺激EGF受体磷酸化,提高hMSC向肝细胞诱导分化的效率。
实施例6.hVE-cad-Fc修饰的基质表面固定不同浓度hVEGF-Fc对于hMSC 定向分化的影响
制备配置含有不同终浓度hVEGF-Fc(SEQ ID NO:26,由金斯瑞公司合成) 0μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、2.5μg/mL,其中hVEGF 的序列为SEQ ID NO:81)的hVE-cad-Fc溶液(终浓度为10μg/mL),按照 105细胞/孔的细胞密度将hMSC接种培养板上,利用维持培养基培养过夜后更换成内皮细胞分化培养基(DF12+2%FBS+10ng/mL FGF2,FGF2来自于 Peprotech,美国,货号100-18B)进行培养,每两天换液。培养7天后利用western blotting检测不同样品Oct4(abcam,MA,美国,1∶1000稀释)、总 VEGF受体(CST,美国,1∶1000稀释)、磷酸化-VEGF受体Tyr 1175(CST,美国,1∶1000稀释)、CD31(CST,美国,1∶1000稀释)及hVE-cadherin(abcam,美国,1∶1000稀释)的表达情况。结果见图7。从图7中可以看出,在加入分化培养基1周后,当hVEGF-Fc的固定量为2μg/mL时,hMSC向血管内皮样细胞分化的效率是最高的,说明一定浓度的hVE-cad-Fc基质和 hVEGF-Fc融合蛋白在hMSC向血管内皮样细胞分化的过程中起到了协同调控分化的作用,其可持续刺激VEGF受体磷酸化,提高hMSC向血管内皮样细胞分化的效率。
用于不同修饰的基质表面分化培养基的最优组分为:
(1)胶原:DF12+2%FBS+10ng/mL FGF-4+10ng/mL FGF-2+20ng/mL HGF+1*ITS+20ng/mL EGF+40ng/mL hVEGF
(2)hE-cad-Fc:DF12+2%FBS+10ng/mL FGF-4+10ng/mL FGF-2+20ng/mL HGF+1*ITS+40ng/mL hVEGF
(3)hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc:DF12+2%FBS+10ng/mL FGF-4+10ng/mLFGF-2+20ng/mL HGF+1*ITS
实施例7.不同修饰的基质表面hMSC向肝细胞诱导分化的检测
按照实施例3的方法制备胶原溶液和hE-cad-Fc分别修饰的6孔细胞培养板。制备hE-cad-Fc终浓度为10μg/mL、hVE-cad-Fc终浓度为10μg/mL及 hVEGF-Fc终浓度为2μg/mL的混合溶液修饰的6孔细胞培养板。按照105细胞/孔的细胞密度将hMSC接种在培养板表面,利用维持培养基培养过夜后更换为特定的分化培养基(培养基组分见实施例6的培养基(1)-(3)),每两天换液,连续培养28天,在第0天、第7天、第14天、第21天和第28天时观察细胞形态,从图8中可以看出,加入分化培养基后,在不同基质表面的hMSC均开始发生形态变化,分化1周时细胞出现收缩,分化4周时细胞呈现卵圆形,在分化的全过程中,融合蛋白基质表面的细胞数量要明显多于胶原组且更早的发生形态变化,说明融合蛋白可以促进hMSC的定向分化,提高分化效率。同时,在上述时间点提取各组细胞RNA,进行反转录,PCR 检测相关转胚层基因、肝细胞基因、肝极性蛋白基因、代谢酶基因和内皮细胞基因的表达情况。相关基因的引物序列、退火温度见下表。
Oct4,FoxA2,Sox17和β-肌动蛋白(内参)的PCR扩增结果及随着分化时间mRNA的相对表达量见图9(如无特殊说明,以下实施例中C表示培养于胶原表面的细胞,E表示培养在hE-cad-Fc表面的细胞,E+V表示培养在hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc表面的细胞)。
CK18,CK19,AFP,ALB和β-肌动蛋白(内参)的PCR扩增结果及随着分化时间mRNA的相对表达量见图10。
OATP,MRP2和β-肌动蛋白(内参)的PCR扩增结果及随着分化时间 mRNA的相对表达量见图11。
G6Pase,α1-AT和β-肌动蛋白(内参)的PCR扩增结果及随着分化时间mRNA的相对表达量见图12。
CD31,VE-钙粘素,VEGFR2和β-actin(内参)的PCR扩增结果及随着分化时间mRNA的相对表达量见图13。
从PCR结果可以看出将hMSC培养在hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc 共修饰的基质表面及hE-cad-Fc修饰的基质表面可以显著提高hMSC表达肝样细胞标志物AFP、ALB和血管内皮样细胞标志物CD31,可以促进细胞极性蛋白OATP和MRP2的表达和维持,促进细胞表达与肝功能相关的某些代谢酶G6Pase和α1-AT的表达,且在共修饰的基质表面的诱导分化效率最佳。同时从图13也可以看出,血管内皮样细胞的标记物CD31在1周时即开始表达,其表达时间要早于肝样细胞标记物ALB和AFP的表达时间(图10),与肝脏在体内发育过程类似(即先发育形成内皮细胞随后发育形成上皮细胞)。这就说明了hMSC在这种融合蛋白基质表面可以通过融合蛋白调控 hMSC自分泌、旁分泌等功能,仿生构建细胞外微环境,实现肝细胞在体内的发育过程的模拟,提高分化效率,缩短分化时间,所获得的细胞可更好地维持和表达肝样细胞和血管样内皮细胞的功能。
在上述时间点,取细胞上清液进行ELISA检测ALB和Urea的表达量。 ELISA结果见图14。从图14中可以看出,通过Elisa对分化后细胞的白蛋白分泌及尿素合成进行检测,发现分化第14天起其表达量逐步提高,且 hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc组始终表达量高于hE-cad-Fc及胶原组。
实施例8.不同修饰的基质表面hMSC向肝细胞定向诱导分化的检测——免疫荧光染色
按照实施例7的方法处理激光共聚焦培养皿并利用不同的诱导分化培养基对hMSC进行诱导分化培养,连续培养28天后进行免疫荧光染色。细胞经过固定、打孔和封闭后,按照1∶500的稀释比例加入稀释后的100μL ALB 抗体(abcam,美国),4℃孵育过夜后按照1∶1000的稀释比例加入100μL FITC标记的山羊抗兔IgG抗体(Thermo Fisher Scientific,美国,货号 A27034),37℃室温孵育2h后加入含有DAPI的抗荧光淬灭剂 (SouthernBiotech,美国,货号0100-20),4℃避光保存,利用激光共聚焦显微镜(Leica)进行取像。结果见图15。
从图15可知,hMSC在不同基质表面连续分化4周之后通过免疫荧光染色可以看出,在hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc共修饰的基质表面细胞更多的表达了肝样细胞的标记物ALB(箭头所示),说明在这种基质表面hMSC 向肝样细胞定向分化效率最高,且其肝功能表达最强。
免疫荧光染色步骤如下:
①弃培养基后利用冷0.01M PBS清洗细胞3次,弃PBS后加入新鲜配制的 4%多聚甲醛,室温孵育10min;
②弃多聚甲醛后用冷0.01M PBS清洗细胞3次,若目标蛋白位于细胞质中,则需要用含有0.1%Triton X-100的PBS溶液室温孵育10min,冷0.01M PBS清洗细胞3次,若目标蛋白位于细胞膜上,则无需此步;
③用10%山羊血清室温孵育30min,弃上清后将一抗(ALB抗体)按照1∶500 比例用0.01M PBS溶液稀释后加入到培养皿中,4℃过夜;
④弃上清并用0.01M PBS清洗细胞3次,每次5min;
⑤将二抗(山羊抗兔IgG抗体)按照1∶500比例用0.01M PBS溶液稀释后加入到培养皿中,避光37℃孵育2h;
⑥弃上清并用0.01M PBS避光清洗细胞3次,每次5min;
⑦弃上清,加入含有DAPI的抗荧光淬灭剂,4℃避光保存,利用激光共聚焦显微镜(Leica)进行取像。
实施例9.不同修饰的基质表面细胞定向诱导分化机制的研究——细胞因子、基质蛋白的分泌及调控分化相关蛋白的表达
按照实施例7的方法培养细胞、诱导分化并在第0天、第7天、第14 天、第21天和第28天提取RNA和蛋白。提取的RNA进行反转录后通过利用荧光定量PCR检测相关细胞因子和基质蛋白的表达情况(引物序列及退火温度见实施例3),获得的数据以胶原组为对照组,利用2-ΔΔCt法进行处理;提取的蛋白利用western blotting检测β-连环蛋白(BD,美国,1∶1000稀释)、α-连环蛋白(BD,美国,1∶1000稀释)、总VEGF受体2(CST,美国,1∶1000 稀释)、磷酸化-VEGF受体(Tyr 1175位进行磷酸化)(CST,美国,1∶1000 稀释)、总EGF受体(CST,美国,1∶1000稀释)和磷酸化-EGF受体(Tyr 1068位继续磷酸化)(CST,美国,1∶1000稀释)的表达情况。
从图16可以看出,在分化过程中细胞的β-连环蛋白的表达持续下降,且在hE-cad-Fc和hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc共同修饰的基质表面,细胞表达β- 连环蛋白的水平最低,其有利于hMSC向上皮细胞的分化。同时,在没有额外添加可溶性EGF和VEGF的条件下,相较于胶原组和hE-cad-Fc修饰组, hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc共同修饰组细胞的EGF受体和VEGF受体磷酸化持续阳性表达,说明hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc会持续性激活 EGF受体和VEGF受体,有利于hMSC向上皮细胞和内皮细胞的分化。
从图17可见,诱导分化过程中,与胶原表面相比,融合蛋白表面培养的 hMSC持续高表达细胞外基质蛋白组分(粘连蛋白、胶原及层粘连蛋白)、细胞因子(TGFβ和HGF)、IL-6在诱导分化初期的高表达、VEGF经时低表达,该结果表明融合蛋白基质具有调控干细胞分泌功能、并重构细胞微环境的功能,其利于仿生肝脏发育进程调控干细胞向上皮和内皮细胞的定向分化。
实施例10.不同修饰的基质表面细胞定向诱导分化机制的研究——YAP蛋白表达与分布
同实施例3的方法处理激光共聚焦培养皿并利用维持培养基培养hMSC 48小时后,利用实施例8的方法进行免疫荧光染色,按照1∶1000的稀释比例加入100μL稀释后的YAP抗体(Santa Cruz,美国),4℃孵育过夜后按照1∶1000的稀释比例加入100μL FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Thermo Fisher Scientific,美国,货号A32723),37℃室温孵育2h后加入含有DAPI 的抗荧光淬灭剂(SouthernBiotech,美国,货号0100-20),4℃避光保存,利用激光共聚焦显微镜(Leica)进行取像。结果见图18。
从图18可知,将hMSC培养在融合蛋白修饰的基质表面,可以看到YAP 蛋白更多的分布在细胞质中;而在TCPS和胶原基质表面,YAP蛋白更多的倾向于在细胞核与细胞质中均匀分布,这些结果显示融合蛋白修饰的基质可以调控YAP蛋白在细胞中的分布,进而促进干细胞向上皮细胞分化。
实施例11.不同修饰的基质表面细胞定向诱导分化机制的研究——MET途径相关基因的表达
同实施例7的方法培养细胞、诱导分化并在第0天、第7天、第14天、第21天和第28天时提取RNA,进行反转录,利用PCR检测相关基因的表达情况(引物序列及退火温度见下表),结果见图19。从图19可见,融合蛋白可以促进肝细胞核内转录因子HNF4α的表达,从而进一步促进细胞表达α-连环蛋白和E-钙粘素、抑制细胞表达Snail、波形蛋白和Twist,促进细胞发生MET转化。
实施例12.PLGA微球表面融合蛋白的固定及稳定性检测
按照实施例3的方法分别制备终浓度为10μg/mL hE-cad-Fc、10μg/mL hVE-cad-Fc及终浓度分别为0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL 和25μg/mL hVEGF-Fc混合溶液,利用上述混合溶液分别浸泡1mg PLGA微球粉末(sigma,美国,货号805114),充分震荡后置于37℃水平摇床中以 150rpm孵育2h后,弃上清,用PBS震荡洗涤(3次)未被稳定固定的融合蛋白。随后进行固定量的检测,加入300μL 5%BSA溶液,置于37℃水平摇床中以150rpm封闭2h,随后按照1∶10000的稀释比例加入100μL稀释后的 HRP标记的山羊抗人IgG(Abcam,美国),置于37℃水平摇床中以150rpm 避光封闭1h,0.01M PBS洗涤5次后,每管加入300μLTMB(索莱宝,货号 PR1200)显色液,置于37℃水平摇床中以150rpm避光反应30min,加入300μL 终止液,取200μL溶液加入到96孔板中,于452nm下测定吸光度值确定3 种融合蛋白共固定在微球表面的最大固定量。随后将hE-cad-Fc、hVE-cad-Fc 和hVEGF-Fc按照上述方法以最大固定量在PLGA表面共固定后,分别用 PBS、DF12培养基和DF12+10%FBS浸泡28天,然后分别在第0、7、14、 21、28天时按照上述方法检测上清液的吸光度以评估融合蛋白在微球表面的固定时间。分别用DyLightTM 550 Antibody Labeling Kit(ThermoFisher,货号84530)、DyLightTM 488 Microscale Antibody Labeling Kit(ThermoFisher,货号53025)和DyLightTM 405 Antibody Labeling Kit(ThermoFisher,货号53020) 分别标记hE-cad-Fc、hVE-cad-Fc和hVEGF-Fc(标记流程如下),后按照最大固定量共固定三种荧光标记的蛋白于PLGA微球表面,利用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在微球表面的分布。结果见图20。
从图20可以看出,当10μg/mL hE-cad-Fc和10μg/mL hVE-cad-Fc共固定在同一个PLGA微球表面之后,伴随着VEGF-Fc浓度的提高,整个体系的吸光度逐渐提高,说明三种融合蛋白可以同时固定在微球表面;当将其浸泡在常用的PBS、培养基或含有血清的培养基一段时间后,可发现上清液的吸光度变化不大,说明融合蛋白可以稳定的存在于微球表面长达4周;通过将带有荧光素的融合蛋白固定在微球表面并利用激光共聚焦检测可发现,三种融合蛋白可以均匀的分布在微球表面。
融合蛋白荧光标记步骤:
①取40μL 0.67M硼酸盐缓冲液与500μL 2mg/mL的融合蛋白溶液混合均匀;
②将上述溶液加入到预装有50μg荧光染料的试管中,轻轻涡旋后用移液器吹打混匀,避光室温孵育60分钟;
③取250μL均匀混合后的吸附树脂置于含有离心柱的离心管中,1000g离心 1min,弃上清,将离心柱转移到新的离心管中;
④加入250μL上述步骤②反应后的溶液于步骤③的离心柱中,轻微涡旋使反应液与吸附树脂混合;
⑤1000g离心1分钟,收集纯化后的溶液即完成融合蛋白的标记,4℃或者 -80℃避光保存。
实施例13.细胞聚集体的制备及PLGA微球与细胞混合比例的确定
分别将8×105hMSC细胞与PLGA微球以3∶1、1∶1和1∶3的比例进行混合,加入到AggrewellTM(Stemcell Technologies,货号27845)培养板中, 1000rpm离心5min后置于细胞培养箱中37℃培养过夜,显微镜观察细胞聚集体形态。结果见图21。从图21中可以看出微球和细胞的比例在1∶1-1∶3的时候,培养18小时后所获得的聚集体结构完整,大小均一。
随后用1000μL的钝移液器头将聚集体吹出,置于15mL离心管中自然沉降收集沉淀,用200μL 2%海藻酸溶液重悬沉淀并滴加到0.1M CaCl2溶液中孵育10min以形成海藻酸水凝胶,弃上清后用生理盐水清洗海藻酸水凝胶,将含有不同比例微球的细胞聚集体置于6孔培养板中,用分化培养基 (DF12+2%FBS+10ng/mL FGF-4+10ng/mL FGF-2+20ng/mL HGF+1*ITS +20ng/mL EGF+40ng/mL hVEGF)连续培养7天,每2天换液一次,在第7 天时用0.1MEDTA溶液裂解海藻酸水凝胶,收集细胞聚集体后加入1mL Trizol提取RNA,并按照实施例7的方法检测上皮细胞基因和内皮细胞相关基因的表达。结果见图22。从图22可见,加入定向诱导分化培养基培养1 周后可以看出,微球与hMSC的比例为1∶3时,聚集体表达肝样细胞基因 (CK18、ALB和ASGPR)和血管内皮样细胞基因(CD31和VEGFR2)的能力最强,说明此时干细胞聚集体向上皮细胞和内皮细胞分化的效率最高,因而选取此比例进行后续实验。
实施例14.PLGA微球表面不同浓度融合蛋白的确定
将hE-cad-Fc和hVE-cad-Fc按照浓度为3∶1(hE-cad-Fc:15μg/mL, hVE-cad-Fc:5μg/mL)、1∶1(hE-cad-Fc:10μg/mL,hVE-cad-Fc:10μg/mL) 和1∶3(hE-cad-Fc:5μg/mL,hVE-cad-Fc:15μg/mL)进行稀释,随后加入终浓度为2μg/mL的hVEGF-Fc,按照实施例12的方法分别利用上述不同比例的融合蛋白修饰PLGA微球和10μg/mL胶原修饰的PLGA微球。随后按照比例hMSC:微球=3∶1混合微球和hMSC,按照实施例13的方法制备细胞聚集体并进行分化,第7天时按照实施例7的方法提取RNA,进行反转录并检测相关基因的表达。结果见图23(其中mcp表示含有胶原修饰微球的细胞聚集体,E:VE/VEGF-Fc表示含有不同比例融合蛋白修饰在同一个微球的细胞聚集体)。从图23可见,加入定向诱导分化培养基培养1周后可以看出,同一个PLGA微球表面hE-cad-Fc与hVE-cad-Fc的比例为1∶1时,聚集体表达肝样细胞基因(HNF4α、ALB、OATP、α1-AT和G6Pase)和血管内皮样细胞基因(CD31和VE-钙粘素)的能力最强,说明此时干细胞聚集体向肝样细胞和血管内皮样细胞分化的效率最高,因而选取此比例进行后续实验。
实施例15.不同融合蛋白修饰的微球比例的确定
按照实施例12的方法,用10μg/mL胶原溶液修饰PLGA微球,用10μg/mL hE-cad-Fc溶液制备hE-cad-Fc修饰的PLGA微球,用10μg/mL hVE-cad-Fc 和2μg/mL hVEGF-Fc溶液制备hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc修饰的PLGA微球,随后两种微球按照3∶1、1∶1和1∶3的比例进行混合,按照比例hMSC∶微球=3∶1混合微球与hMSC,按照实施例13的方法制备细胞聚集体并进行分化,第7天时按照实施例7的方法提取RNA,进行反转录并检测相关基因的表达。结果见图24(其中mcp表示含有胶原蛋白的修饰微球的细胞聚集体,mEp:m (VE/VEGF)p表示含有不同比例融合蛋白修饰的微球的细胞聚集体)。从图 24可见,加入定向诱导分化培养基培养1周后可以看出,当hE-cad-Fc修饰的PLGA微球和hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc修饰的微球比例为1∶1时,聚集体表达肝样细胞基因(HNF4α、OATP和ASGPR)和血管内皮样细胞基因(CD31) 的能力最强,向肝样细胞和血管内皮样细胞分化的效率最高,因而选取此比例进行后续实验。
实施例16.聚集体定向诱导分化的研究
按照实施例12的方法制备利用不同蛋白溶液(hE-cad-Fc融合蛋白, hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc融合蛋白或者胶原)修饰的微球,修饰情况如下:
(1)10μg/mL胶原修饰PLGA微球;
(2)10μg/mL hE-cad-Fc、10μg/mL hVE-cad-Fc和2μg/mL hVEGF-Fc融合蛋白共同修饰在同一个PLGA微球上;
(3)10μg/mL hE-cad-Fc修饰一个PLGA微球,10μg/mL hVE-cad-Fc和 2μg/mLhVEGF-Fc修饰另外一个PLGA微球,将两种微球等比例混合。
按照实施例13的方法以hMSC∶微球=3∶1的比例将细胞和微球共混后制备不同的聚集体:含有胶原修饰微球的聚集体(简记为mcp);含有hE-cad-Fc、 hVE-cad-Fc及hVEGF-Fc共同修饰微球的聚集体(简记为m(E/VE/VEGF)p);含有等比例混合的不同融合蛋白分别修饰的微球聚集体(简记为 m(E+VE/VEGF)p),以不含有微球的hMSC聚集体(简记为m)作为对照,利用下面特定的分化培养基连续培养分化28天,在第0天、第7天、14天、 21天和28天提取RNA,进行PCR检测,具体引物序列见实施例7。结果见图25。
从图25可见,含有融合蛋白的聚集体更早的表达FoxA2和Sox17,说明融合蛋白可以更早启动向内胚层分化;含有融合蛋白的聚集体更早的表达肝细胞相关基因HNF4α、CK18、AFP和ALB及内皮细胞相关基因CD31、 VE-钙粘素和VEGF受体2,说明融合蛋白可以促进干细胞向上皮细胞和内皮细胞发生分化;含有融合蛋白的聚集体更早的表达肝细胞极性蛋白基因 (MRP2、OATP及ASGPR)和相关代谢酶相关基因(G6Pase及α1-AT),说明融合蛋白可以促进肝细胞结构与功能。相较于实施例7的2D培养方式,聚集体分化效率要明显提高,所需分化时间大大缩短;与2D培养相比,3D 培养可以显著提高肝细胞极性基因OATP和MRP2的表达,并且细胞更有效协同内外源环境要素促进向胆管上皮细胞定向分化;含有融合蛋白共固定于同一个PLGA微球表面的hMSC聚集体中细胞更好的表达与分化相关的指标,促进hMSC聚集体的定向诱导分化。
分化培养基:
m、mcp:DF12+2%FBS+10ng/mL FGF-4+10ng/mL FGF-2+20ng/mL HGF+1*ITS+20ng/mL EGF+40ng/mL hVEGF;
m(E/VE/VEGF)p、m(E+VE/VEGF)p:DF12+2%FBS+10ng/mL FGF-4+10ng/mL FGF-2+20ng/mL HGF+1*ITS
实施例17.类器官染色
按照实施例16的方法制备4种聚集体(分别是m,mcp,m(E/VE/VEGF)p 和m(E+VE/VEGF)p)并进行诱导分化,分化2周后用含有0.9%NaCl溶液的 0.1M EDTA裂解液裂解海藻酸后收集聚集体沉淀。以下所有步骤均需用 PBSB溶液(含有5%BSA的0.01M PBS溶液)处理过的移液器头进行操作。用冷0.01M PBS溶液洗涤类器官3次,弃上清后加入300μL新鲜配制的4%多聚甲醛溶液室温孵育至少30min,收集沉淀后用冷0.01M PBS溶液洗涤类器官3次,弃上清后加入300μL PBSDT溶液(0.01M PBS+1%BSA+1%山羊封闭血清+0.5%Triton X-100+1%DMSO)4℃封闭过夜,弃上清后加入100μL 用PBSDT溶液按照一定比例稀释后的一抗(稀释比例见下),4℃反应24-48h 后弃上清,用冷0.01M PBS溶液洗涤类器官3次,上清后加入100μL用PBSDT 溶液按照一定比例稀释后的二抗(稀释比例见下),弃上清用冷0.01M PBS溶液洗涤类器官3次,弃上清后加入100μL含有DAPI的抗荧光淬灭剂,4℃避光保存,利用激光共聚焦显微镜(Leica)进行取像观察。结果见图26。将含有不同材料的hMSC聚集体连续分化2周之后通过免疫荧光染色可以看出,在hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc共固定的基质表面细胞更多的表达了肝样细胞的标志物ALB及内皮细胞的标志物CD31(如箭头所示),说明在这种基质表面hMSC向肝样细胞及内皮样细胞分化的效率最高。
抗体 | 来源及货号 | 稀释比例 |
Anti-白蛋白抗体(一抗) | Abcam(ab207327) | 1∶1000 |
Anti-CD31抗体(一抗) | CST(3528) | 1∶1000 |
山羊抗小鼠IgG抗体,Alexa Fluor 488 | Invitrogen(A-10680) | 1∶500 |
山羊抗兔IgG抗体,DyLight 594 | Invitrogen(35560) | 1∶500 |
实施例18.与内皮细胞共培养体系对比
将8×105按照2∶8比例混合的脐静脉内皮细胞(HUVEC,赛业生物)与 hMSC加入到aggrewell培养板中(简记为HM),与已经优化的实验组m(E/VE/VEGF)p和m(E+VE/VEGF)p进行对比,按照实施例16的方法,利用定向诱导分化培养基连续培养2周,在2周时提取样品RNA及培养基上清,利用PCR分别检测相关基因的表达情况(ALB、MRP2、OATP、α1-AT、 CD31和VE-钙粘素)及利用ELSIA检测细胞分泌ALB能力。结果见图27。
从图27可见,加入定向诱导培养基2周后,通过PCR检测可以看出,对照组HM中相关内皮细胞标志物CD31和VE-钙粘素的表达要优于实验组,而实验组在融合蛋白表面诱导分化2周后出现CD31和VE-钙粘素阳性细胞,显示聚集体内有内皮样细胞,同时实验组肝分化功能相关基因表达(ALB、 MRP2和α1-AT)水平高于HM组。进一步,ELISA检测肝分化功能白蛋白分泌,其结果显示实验组要明显优于HM对照组,并且m(E/VE/VEGF)p组肝细胞相关指标表达水平最高。
实施例19.不同修饰的基质表面hMSC向胰岛细胞诱导分化能力的检测
按照实施例7的方法制备不同融合蛋白修饰的6孔细胞培养板,按照105细胞/孔的细胞密度将hMSC接种在培养板表面,利用维持培养基培养过夜后更换为特定的分化培养基(10ng/mL EGF,10ng/mL FGF-2,10mM尼克酰胺,1X ITS-G的DMEM分化培养基定向诱导一周;后更换为添加有10 ng/mL HGF,10ng/mL FGF-2,10mM尼克酰胺,1X ITS-G的DMEM分化培养基定向诱导两周)每两天换液,连续培养21天,按照实施例7的方法,在第21天时提取RNA,利用PCR检测相关基因的表达情况。结果见图28。从图28可以看出将hMSC培养在hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc修饰的基质表面可以显著提高hMSC向胰岛样细胞分化的效率和胰岛样细胞的成熟度。在胰腺发育过程中,上皮细胞分泌的信号分子与内皮细胞分泌的信号分子在调节内分泌细胞与外分泌细胞命运的过程中起着至关重要的作用。而在成熟的胰岛中,无论是胰岛β细胞分泌的胰岛素还是α细胞分泌的胰高血糖素都需要通过内皮信号及血管网络。通过图28所示结果可以推断, hE-cad-Fc/hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc融合蛋白的存在,结合生长因子促进细胞向不同命运分化,尤其是内皮信号与内皮细胞的存在,为解决胰岛细胞在体外功能的维持提供了新思路。
相关基因的引物序列及退火温度见下表:
实施例20.聚集体向内皮细胞定向诱导分化的研究
按照实施例12的方法,用10μg/mL hVE-cad-Fc和2μg/mL hVEGF-Fc溶液制备hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc修饰的PLGA微球,按照实施例13的方法以 hMSC∶微球=3∶1的比例将细胞和微球共混后制备不同的聚集体:以不含有微球的细胞聚集体(简记为m)和含有PLGA微球的细胞聚集体(简记为 mp)作为对照组;含有hVE-cad-Fc与hVEGF-Fc共同修饰微球的细胞聚集体(简记为mvp)为研究组,利用内皮定向诱导分化培养基 (DF12+2%FBS+10ng/mLFGF-2)进行培养,每两天换液,连续诱导分化培养7天,在第7天时提取RNA和蛋白,利用PCR检测相关内皮细胞标志物 (vWF、CD31和VE-钙粘素)的表达及细胞分泌基质与因子(纤连蛋白、 VEGF、IL-8、IL-6、MCP-1、IGFBP-3和血管生成素)的变化,具体引物序列见实施例3、实施例7及下表;利用western blotting检测相关内皮细胞标志物CD31、VE-钙粘素和vWF(abcam,美国,1∶1000稀释)的表达情况。结果见图29。
从图29A中可以看出,相较于m组和mp组,含有hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc 修饰的PLGA微球的细胞聚集体mvp组在基因层面以及蛋白层面表达vWF、 CD31、VE-钙粘素等内皮细胞标记物的能力均出现显著提升,说明 hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc融合蛋白可以显著促进hMSC分化成血管内皮样细胞并表达内皮细胞标志物,且随诱导分化时间的延长,相较于对照组,mvp研究组细胞的内皮细胞标志物表达量持续上调,表明hVE-cad-Fc/hVEGF-Fc可协同培养基中的分化因子以持续促进hMSC向内皮细胞的分化及其功能表达。从图29B中可看出,在分化的过程的早期mvp组细胞表达纤连蛋白、 VEGF、IL-8、IL-6、MCP-1、IGFBP-3及血管生成素等细胞因子的水平高于两对照组,说明融合蛋白可以显著改善细胞分泌内皮特异性相关细胞因子与细胞外基质,从而构建内皮细胞微环境,促进hMSC向内皮细胞的分化。
实施例21PAMAM/透明质酸水凝胶的功能化改性
G5-Ac-DVS,G5-Ac-DVS-RGD,G5-Ac-DVS-Fc-bp的合成,具体如下:第5代PAMAM(PAMAM G5)树枝状大分子(502mg,0.0197mmol,购自 Dendritech Inc.Midland,MI,USA)溶解于甲醇(60mL),加入三乙胺(259mL, 1.846mmol),室温搅拌10分钟。向反应混合液中滴加溶液乙酸酐(140mL, 1.477mmol)的甲醇(40mL)溶液中。反应过夜,通过截留分子量为10000的膜透析,PBS(10mL×3次)和去离子水(10mL×3次)清洗。冻干得到G5-Ac产物。
G5-Ac(333mg,0.0116mmol)溶解于去离子水(20mL)。加入2-亚氨氢氯化硫醇(80.05mg,0.582mmol)。氮气保护室温反应24小时。通过截留分子量为10000的膜透析,PBS(10mL×3次)和去离子水(10mL×3次) 清洗。冻干得到G5-Ac-SH产物。
G5-Ac-SH(213.4mg,0.00661mmol)溶解于去离子水(15mL)。加入二乙烯砜(DVS,132.5μL,1.321mmol)。氮气保护室温反应2天。通过截留分子量为10000的膜透析,PBS(10mL×3次)和去离子水(10mL×3次) 清洗。冻干得到G5-Ac-DVS。
G5-Ac-DVS(58.5mg,0.00166mmol)溶解于去离子水(5mL)。RGD 多肽CGRGDS(SEQID NO:92,6.9mg,0.0116mmol)溶解于去离子水(1mL),两种溶液混合。室温反应1小时。通过截留分子量为10000的膜透析,PBS (10mL×3次)和去离子水(10mL×3次)清洗。冻干得到G5-Ac-DVS-RGD。
G5-Ac-DVS(164mg,0.00513mmole),Fc结合多肽(4.83mg,0.00513 mmol,CHWRGWV,SEQ ID NO:93,在本文中缩写为Fc-bp)各溶解于无氧水5mL与1mL中。然后多肽溶液慢慢加入到树枝状分子溶液中并不断搅拌。混合溶液室温搅拌反应1小时。反应混合液通过截留分子量为10000的膜过滤。剩余物分别用PBS(15mL×3次)和水(15mL×3次)清洗。最后冻干得到产率为95.9%的G5-Ac-DVS-Fc-bp产物。合成路线图如图30-A所示。核磁共振氢谱如图30-B所示。
透明质酸水凝胶功能化改性,具体如下。
首先,G5-Ac-DVS-Fc-bp树枝状大分子25mg于500μL无氧PBS中完全溶解待用,取50μL上述溶液加入10μL初始浓度200μg/mL的hVE-cad-Fc 融合蛋白,37℃孵育1h,之后加入50μL巯基化透明质酸(Bio Time Inc),加入96孔板;对照组为G5-Ac-DVS树枝状大分子,其余操作步骤相同。待形成稳定水凝胶之后,每孔加入100μL PBS浸没水凝胶,分别在1、3、5、7、10、14日取上清液,ELISA试剂盒(R&D)方法检测hVE-cad-Fc融合蛋白释放量。按照试剂盒的说明具体方法如下:标准品孔:每孔加入稀释好的标准品50μL,零孔加入标准品/样品稀释液50μL,然后加入酶标试剂50μL。样品孔:加入样品50μL,然后加入酶标试剂50μL。轻轻摇晃,盖上封板膜, 37℃孵育60分钟。小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,重复5次,拍干。每孔先加显色剂A 50μL,再加入显色剂 B 50μL,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10分钟。每孔加终止液50μL,终止反应。于452nm下测定吸光度。结果表明hVE-cad-Fc通过Fc-bp的连接2 周时间内在水凝胶固定率达到了85%左右,而没有通过Fc-bp连接的 hVE-cad-Fc在水凝胶中固定率只达到了40%左右(图30-C)。分别将上述两种不同方式改性的水凝胶前液均匀加入到48孔板中,待形成稳定水凝胶之后,每孔分别接种2×104个HUVEC(美国ScienCell公司)和hMSC细胞(广州赛业有限公司),24小时之后相差显微镜分别观察两种细胞的黏附及形态特征,结果表明hVE-cad-Fc通过Fc-bp固定方式改性的水凝胶相比于无Fc-bp 水凝胶体系,能够显著促进细胞的黏附(图30-D)。
实施例22融合蛋白功能化改性的透明质酸水凝胶理化性质表征
制备两种不同水凝胶。
一种为hVE-cad-Fc融合蛋白改性水凝胶:
G5-Ac-DVS-Fc-bp树枝状大分子25mg于500μL无氧PBS中完全溶解待用,取50μL上述溶液加入10μL初始浓度200μg/mL的hVE-cad-Fc融合蛋白,室温孵育1h,之后加入50μL巯基化透明质酸,形成hVE-cad-Fc融合蛋白改性水凝胶;
一种为没有改性的水凝胶,G5-Ac-DVS树枝状大分子25mg于500μL无氧PBS中完全溶解待用,取50μL上述溶液,之后加入50μL巯基化透明质酸,形成没有改性水凝胶。
水凝胶降解实验,具体如下:两种不同水凝胶分别在PBS、透明质酸酶 (生工)、HUVEC培养基(ScienCell公司,成分包含500mL基础培养基, 25mLFBS,5mL内皮细胞生长因子,5mL青霉素/链霉素)上清液、hMSC培养基(HyClone,包含DMEM培养基和F12培养基的1∶1混合物)上清液中浸泡2周时间,初始水凝胶重量记为M0,分别在1、3、5、7、10、14日时间点用吸水纸吸掉多余PBS,称重剩余水凝胶重量记为Mt,代入公式M%=(M0-Mt)/M0。结果表明,水凝胶在PBS中基本没有发生降解,在透明质酸酶溶液中24小时内基本降解完全,在细胞培养基上清液中,降解到70%左右。hVE-cad-Fc改性后的水凝胶降解性没有发生改变(图31-A)。
水凝胶溶胀性实验,具体如下:两组不同水凝胶分别在PBS中浸没时间 2周,初始水凝胶重量记为M0,分别在1、3、5、7、10、14日时间点用吸水纸轻轻的吸掉多余的PBS,称重剩余水凝胶重量记为Mt,计算方法同上。水凝胶在PBS溶液中基本没有发生溶胀,hVE-cad-Fc改性后水凝胶的溶胀性没有发生改变(图31-B)。
水凝胶流变性实验,准备上述两种水凝胶前液样品(融合蛋白改性水凝胶,未改性水凝胶)各500μL,利用流变仪(AR 2000ex)检测水凝胶粘弹性。首先打开空压机,气罐压力自动上升到0.5MP时顺时针调节输出压力到 0.45MP,检查流变仪压力调节阀,使之在30Pis处稳定5min;其次,打开循环水,测试站空气轴承保护锁,安装平行夹板;然后,打开流变仪主机,电脑测试流变程序,仪器校准;最后,根据不同的实验需求设置一定的参数,配制样品开始测试。具体参数设置:平行夹板4cm,间隙设定500μm,温度 25℃。动态时间扫描:时间7200s,每隔20s取一个点,频率是1rad/s,应力是1%;应变扫描范围0.1-10%,频率1rad/s;动态频率扫描范围0.1-100 rad/s,应力1%。在测试样品时,取500μL待测试样品加入到托盘中,降低平行板夹具间隙为500um,进而开始测试样品。结果表明,透明质酸溶液能够形成水凝胶,粘弹性良好,且具有一定的机械应力强度,hVE-cad-Fc改性后水凝胶的流变性质没有发生改变(图31-C)。
水凝胶表面形貌表征,准备两组水凝胶样品各200μL,冷冻真空干燥处理,将干燥的多孔水凝胶切割成立方体结构,用双面胶将样品观察面向上黏贴在扫描电镜铜板之上。SEM(QUANTA 200,FEI)扫描结果表明,水凝胶内部具有比较均匀的孔隙率结构,改性前后水凝胶的形貌特征没有发生明显变化(图31-D),其中左1为对照组水凝胶,左2为其局部放大图,左3为 hVE-cad-Fc融合蛋白改性水凝胶,左4为其局部放大图。
实施例23融合蛋白功能化改性水凝胶对HUVEC生存影响研究
实验样品制备,具体如下:实验分为3个组,(1)对照(Control)组, G5-Ac-DVS树枝状大分子25mg于500μL无氧PBS中完全溶解待用,取50μL 上述溶液,之后加入50μL巯基化透明质酸,形成单独水凝胶体系;(2) RGD组,G5-Ac-DVS-RGD树枝状大分子25mg于500μL无氧PBS中完全溶解待用,取50μL上述溶液,之后加入50μL巯基化透明质酸,形成RGD改性水凝胶体系;(3)hVE-cad-Fc组,G5-Ac-DVS-Fc-bp树枝状大分子25mg 于500μL无氧PBS中完全溶解待用,取50μL上述溶液,加入10μL初始浓度 200μg/mL的hVE-cad-Fc,室温孵育1h之后,加入50μL巯基化透明质酸,形成hVE-cad-Fc改性水凝胶体系;
细胞光镜观察实验:将事先准备好的3组不同水凝胶前液样品100μL 均匀加入到96孔板中,37℃孵育10分钟,待形成稳定的水凝胶。每孔种植细胞1×104,细胞培养箱(37℃,5%CO2)培养,待细胞培养72小时,倒置相差显微镜(奥林巴斯,CKX41)观察细胞形貌特征,结果表明,hVE-cad-Fc 改性水凝胶组中,HUVECs形貌出现了类似毛细血管样结构。(图32-A)
细胞死活染色实验,具体如下:待细胞培养72小时,吸出细胞培养基, PBS清洗干净,配置细胞死活染色液:2μL 2mM EthD-III原液+0.5μL 4mM Calcein Am原液+1mLPBS。每孔加入100μL死活染色液,放置于细胞培养箱30min,PBS清洗3遍。荧光显微镜之下进行观察。结果表明hVE-cad-Fc 改性水凝胶相较于对照组显著增强细胞存活能力。(如图32-B)
细胞增殖实验。将事先准备好的3组不同水凝胶前液样品100μL均匀加入到96孔板中,37℃孵育10分钟,待形成稳定的水凝胶。每孔种植细胞 1×104,细胞培养箱(37℃,5%CO2)培养,分别在4、24、48、72小时CCK-8 实验检测细胞活力,具体如下:首先吸出细胞培养基,PBS清洗干净,加入事先配置好的CCK-8溶液(每100μL含10μL CCK-8原液(CA1210,Solarbio) 与90μL ECM培养基(ScienCell公司)),每孔100μL,37℃孵育4小时,将上述孵育之后的CCK-8溶液转移至新的96孔板,酶标仪测定在450nm处的吸光值。结果表明,hVE-cad-Fc改性水凝胶能够促进细胞的黏附及增殖(图 32-C)。
细胞骨架染色实验,具体如下:将3种不同的水凝胶前液均匀加入到激光共聚焦小皿中,待形成稳定的水凝胶。每皿种植HUVEC 3×104个,细胞培养72小时。轻轻吸掉细胞培养基上清液,37℃预热的PBS清洗细胞,4%多聚甲醛固定细胞10min,0.1%Triton x-100细胞透膜处理10min,1%牛血清白蛋白室温封闭40min,FITC-鬼笔环肽(Sigma)染色细胞骨架微丝,最后DAPI(Sigma)染色细胞核。结果表明,hVE-cad-Fc功能化改性的水凝胶能够显著促进细胞骨架的伸展(图32-D)。
水凝胶对HUVEC三维生长影响研究。取3种不同分组的水凝胶前液各 100μL,每组各加入105个HUVECs轻轻吹打混匀后,加入到96孔板,等待形成水凝胶之后,加入ECM培养基,分别在1、3、5、7天CCK-8检测细胞活力,实验方法同上,结果表明,hVE-cad-Fc改性水凝胶相较于对照组能够显著促进细胞增殖(图32-E)。此外,在第7天,对细胞进行死活染色实验,实验方法同上。结果表明,hVE-cad-Fc功能化改性水凝胶相较于对照组显著增强HUVECs的存活能力(图32-F)。
实施例24融合蛋白功能化改性的水凝胶对HUVEC血管功能化的影响
准备实施例23中所述的3种不同改性水凝胶前液各200μL,均匀加入到 6孔板中待形成稳定水凝胶,每孔种植HUVECs 1×105,分别在24、48、72 小时提取细胞蛋白。具体如下:倒掉培养基,PBS清洗细胞。RIPA(Sigma) 冰上裂解细胞,收集裂解液13000rpm,离心10min,收集上清液之加入上样缓冲液煮沸5min,-20℃储存备用。用8%-10%凝胶电泳,分离不同分子量的蛋白,然后通过湿转法将凝胶上的蛋白质电转到PVDF膜上,膜封闭,加入抗vWF,抗eNOS一抗(Abcam),4℃过夜,PBST清洗膜,加入IgG-HRP 二抗(Santa Cruz),室温孵育2小时,PBST清洗膜,ECL发光检测蛋白表达。结果表明,相较于对照组及RGD组,hVE-cad-Fc改性的水凝胶能够显著促进HUVECs中vWF及eNOS蛋白的表达(图33-A,B)。
将不同改性水凝胶前液均匀加入到96孔板中,待形成稳定水凝胶,每孔种植HUVECs细胞1×104,分别在4h、24h、48h、72h检测细胞NO释放量。具体如下:收集HUVECs培养基上清液,按照NO试剂盒(碧云天,中国) 指导说明进行检测,OD540测吸光度值。结果表明,相较于对照组与RGD 水凝胶组,hVE-cad-Fc融合蛋白功能化改性的水凝胶能够显著促进NO的释放(图33-C)。
不同改性水凝胶前液各100μL均匀加入到共聚焦小皿中,待形成稳定水凝胶,每皿种植HUVECs 2×104,72小时检测细胞对低密度脂蛋白(Ac-LDL) 的吞噬情况。具体如下:待细胞培养至72小时,去除原来细胞培养基,PBS 清洗,然后加入带有荧光标签的低密度脂蛋白(Invirogen,USA)至新的细胞培养基中,培养5小时左右,去除培养基,PBS清洗干净,预热4%多聚甲醛固定细胞10min,PBS清洗,DAPI染色细胞核10min,PBS清洗,激光共聚焦显微镜观察。结果表明,相较于对照组与RGD水凝胶组,hVE-cad-Fc 功能化改性水凝胶显著增强了HUVECs对Ac-LDL的吞噬能力(图33-D)。
实施例25.丙烯酰肼化透明质酸的设计与合成
通过ADH(己二酸二酰肼)、NHS-AC(N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺)对透明质酸链的两步修饰,为透明质酸链修饰上丙烯酰肼基团。具体如下。
准确称取1g分子量为91KD的透明质酸(HA,山东福瑞达生物科技有限公司)粉末,核磁共振氢谱如图34-A所示。加入200mL ddH2O,搅拌充分溶解。向溶液中加入18g的ADH粉末搅拌至充分溶解,再向其中加入2g的 EDAC(催化剂)粉末搅拌至充分溶解,调pH至4.75,分别在反应10分钟, 30分钟,1小时,2小时后调溶液pH至4.75,反应过夜。第二天,调溶液pH至7后,开始透析步骤:透析液分别为100mM氯化钠溶液(48小时), 1/5的乙醇溶液(48小时),ddH2O(48小时)。透析完成后,冻干粉末,称取粉末质量,并进行核磁共振氢谱检测ADH的取代度,如图34-B中的A,B 所示。获得HA-ADH产物。
称取0.5g的HA-ADH产物,加入100ml ddH2O溶解,向其中加入质量比: mHA-ADH∶mNHS-AC=4∶3的NHS-AC至充分溶解,调pH至7.20,反应开始进行,分别在反应10分钟,30分钟,1小时,2小时各个时间点调整溶液pH至4.75,反应过夜。第二天,开始透析步骤:透析液为100mM氯化钠溶液透析48小时,ddH2O透析48小时。透析完成后,冻干,称取粉末质量,并进行核磁共振氢谱检测Ac基团(图34C中C、D两峰)的取代度。此步骤中各反应步骤温度均控制在室温环境。获得HA-AC。
实施例26.丙烯酰肼化透明质酸的hVE-cad-Fc融合蛋白改性修饰
hVE-cad/Fc-结合(-)前液配置:每100μL 5%溶液添加5μL的10mg/mL hVE-cad-Fc融合蛋白,充分混匀,37℃反应30min。
hVE-cad/Fc-结合(+)前液配置:每100μL 5%溶液添加2μL的浓度为 4mg/mL Fc-结合多肽、5uL的10mg/mL hVE-cad-Fc融合蛋白,充分混匀,37℃反应30分钟。用ELISA的方法检测hVE-cad-Fc融合蛋白的固定量。具体方法如下:分别取50μL前液并加入交联剂二硫苏糖醇(DTT)(购自索莱宝生物科技有限公司)充分混匀,置于96孔板中成胶。成胶完成后,利用hVE- 钙粘素ELISA检测试剂盒(索莱宝生物科技有限公司)来完成,分别向 hVE-cad-Fc修饰丙烯酰肼化透明质酸水凝胶、hVE-cad-Fc联合Fc-bp修饰丙烯酰肼化透明质酸水凝胶中加入200μL PBS溶液孵育,在不同的时间点 1,3,5,7天以及不同溶液里收集上清,用试剂盒确定上清中残存的hVE-cad-Fc 融合蛋白,检测其长期稳定性。如图35所示,相较于未添加Fc-bp水凝胶组, hVE-cad-Fc联合Fc-bp修饰水凝胶组中hVE-cad-Fc在第7天时仍有90%存留,而未添加Fc-bp水凝胶组中hVE-cad-Fc在第7天时存留量降至50%,说明 Fc-bp的加入可以明显提升hVE-cad-Fc在水凝胶中的长期负载稳定性。
实施例27.丙烯酰肼化透明质酸水凝胶理化性质表征
设计含有MMPs响应性断裂多肽的双端巯基化的交联剂,考察水凝胶浓度、交联密度、修饰因子对水凝胶理化性质影响。
将MMP-2响应性多肽(CRGDPQGIWGQDRC,SEQ ID NO:97)及DTT 两种交联剂分别用无氧无菌PBS稀释至所需浓度(最终浓度分别为160mM 以及292mM)。
每100uL实施例25制备的丙烯酰肼化透明质酸溶液分别加入0.45g/mL DTT溶液3uL和6uL,交联度分别达到50%和100%,充分混匀,置于37度反应30分钟,制成不同交联度水凝胶。
对DDT和MMP-2交联的水凝胶成胶前后的凝胶状态进行宏观拍照观察,其中图36-A左为DTT交联下的水凝胶;图36-A右为MMP-2响应性多肽交联下的水凝胶。
取MMP-2响应性多肽交联剂(每100μL丙烯酰肼化透明质酸溶液加入浓度0.25g/mL溶液5μL)以及DTT交联剂(每100uL丙烯酰肼化透明质酸加入0.45g/mL溶液6μL),加入水凝胶前液(含有Fc-bp)中37℃反应30分钟,生成DTT,DTT+hVE-cad-Fc,MMP,MMP+hVE-cad-Fc四种水凝胶,分别向水凝胶加入1mL PBS溶液至凝胶充分溶胀,在凝胶溶胀过程中取不同时间点进行凝胶质量称量进行溶胀性实验。同时按照以上实验步骤进行低、高两种交联密度(分别是50%和100%交联度)水凝胶溶胀性实验,观察交联密度对凝胶稳定性的影响。分别合成了DTT交联及MMP-2响应性多肽交联水凝胶体系,两种水凝胶均可以在PBS溶液中长期稳定存在(图36-B左);并且丙烯酰肼化透明质酸溶液在添加DTT或MMP交联剂后均可以在30分钟成胶(图36-B右)。DTT与MMP响应性多肽两种交联的水凝胶均具有良好的溶胀性,且hVE-cad-Fc的添加并不会影响水凝胶本身的溶胀性(图 36-C)。
Claims (46)
1.上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白在激活细胞中存在的EGFR中的应用。
2.上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白在促进干细胞向肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞分化中的应用。
3.权利要求2的应用,其中所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白用于替代EGF。
4.权利要求1-3任一项所述的应用,其中所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白固定在基质上。
5.血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白在促进干细胞向内皮样细胞(优选血管内皮细胞)、肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞分化中的应用。
6.权利要求5所述的应用,其中所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白固定在基质上。
7.权利要求5所述的应用,其中所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白与VEGF-Fc融合蛋白组合使用。
8.权利要求7所述的应用,其中所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和所述VEGF-Fc融合蛋白固定在基质上,优选固定在同一个基质上或不同的基质上。
9.上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白在促进细胞向内皮样细胞、肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞分化中的应用。
10.权利要求9的应用,其中所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白与所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白的比例为3∶1至1∶3,优选1∶3,3∶1或1∶1。
11.权利要求9所述的应用,其中所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白固定在基质上,优选固定在同一个基质上或不同的基质上。
12.权利要求9所述的应用,其中所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白与VEGF-Fc融合蛋白组合使用。
13.权利要求12所述的应用,其中所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和所述VEGF-Fc融合蛋白固定在基质上,优选固定在同一个基质上或不同的基质上。
14.权利要求4,6,8,11或13任一项所述的应用,其中所述基质选自细胞培养板,细胞培养皿,水凝胶(优选透明质酸水凝胶,优选丙稀酰肼化的透明质酸水凝胶或PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶),多孔支架,薄膜(优选纳米纤维薄膜),或者微球,优选所述微球粒径大小为10-50微米(优选15-30,15-20微米),优选所述微球是PLGA微球,更优选粒径大小为10-50微米(优选15-30,15-20微米)的PLGA微球;或者所述微球为聚苯乙烯球,优选聚苯乙烯球的粒径大小为10-50微米(优选15-30,15-20微米)。
15.权利要求14所述的应用,其中所述多孔支架、薄膜或微球为亲水性的或疏水性的。
16.权利要求15所述的应用,其中当所述多孔支架、薄膜或微球为亲水性的多孔支架,薄膜或微球时,所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白或所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白或VEGF-Fc融合蛋白通过接头(优选Fc-结合肽)连接于所述多孔支架、薄膜或微球上。
17.权利要求16所述的应用,其中所述Fc结合肽选自CHWRGWV(SEQ ID NO:93),HYFKFD(SEQ ID NO:94),HFRRHL(SEQ ID NO:95),FYWHCLDE(SEQ ID NO:96)或SpA(staphylococcal蛋白A)。
18.制备肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞的方法,其特征在于,在存在上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和/或血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白的情况下培养干细胞。
19.制备内皮样细胞的方法,其特征在于,在存在血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白的情况下培养干细胞。
20.权利要求18或19所述的方法,在另外存在VEGF-Fc融合蛋白的情况下培养干细胞。
21.权利要求18或19所述的方法,其中所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白/VEGF-Fc融合蛋白(优选所述VEGF-Fc融合蛋白与所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白固定在同一个基质上或不同的基质上)固定在基质上,优选固定在同一个基质上或不同的基质上。
22.权利要求21所述的方法,其中所述基质选自细胞培养板,细胞培养皿,水凝胶(优选透明质酸水凝胶,更优选丙稀酰肼化的透明质酸水凝胶或PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶),多孔支架,薄膜(优选纳米纤维薄膜),或者微球,优选所述微球粒径大小为10-50微米(优选15-30,15-20微米),优选所述微球是PLGA微球,更优选粒径大小为10-50微米(优选15-30,15-20微米)的PLGA微球;或者所述微球为聚苯乙烯球,优选聚苯乙烯球的粒径大小为10-50微米(优选15-30,15-20微米)。
23.权利要求22所述的方法,其中所述多孔支架、薄膜或微球为亲水性的或疏水性的。
24.权利要求23所述的方法,其中当所述多孔支架、薄膜或微球为亲水性的多孔支架、薄膜或微球时,所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白或所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白或VEGF-Fc融合蛋白通过接头(优选Fc-结合肽)连接于所述多孔支架、薄膜或微球。
25.权利要求24所述的方法,其中所述Fc结合肽选自CHWRGWV(SEQ ID NO:93),HYFKFD(SEQ ID NO:94),HFRRHL(SEQ ID NO:95),FYWHCLDE(SEQ ID NO:96)或SpA(staphylococcal蛋白A)。
26.权利要求1-13任一项所述的应用或权利要求18-25任一项所述的方法,其中所述干细胞为间充质干细胞,iPS细胞或胚胎干细胞。
27.权利要求1-13任一项所述的应用或权利要求18-25任一项所述的方法,其中所述干细胞来源于哺乳动物,优选人、鼠、猪。
28.权利要求1-4,和9-11任一项所述的应用或权利要求18或21任一项所述的方法,其中上皮细胞钙粘素为人上皮细胞钙粘素,优选为SEQ ID NO:9所示的序列。
29.权利要求5-13任一项所述的应用或权利要求19-21任一项所述的方法,其中血管内皮细胞钙粘素为人血管内皮细胞钙粘素,优选序列为SEQ ID NO:5所示的序列。
30.权利要求7,12或13任一项所述的应用,或权利要求20所述方法,其中血管内皮细胞生长因子为人VEGF165,优选VEGF的序列为SEQ ID NO:81。
31.权利要求1-13任一项所述的应用或权利要求18-25任一项所述的方法,其中Fc为人IgG(优选IgG1)的Fc,优选为SEQ ID NO:4所示的序列。
32.用于培养细胞的改性基质,其包含上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和/或血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白,其中优选地,所述上皮细胞钙粘素为人上皮细胞钙粘素,优选为SEQID NO:9所示的序列,所述血管内皮细胞钙粘素为人血管内皮细胞钙粘素,优选序列为SEQID NO:5所示的序列。
33.权利要求32所述的改性基质,其用于促进细胞向内皮样细胞、肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞分化,优选地,所述干细胞为间充质干细胞,iPS细胞或胚胎干细胞,更优选地,所述干细胞来源于哺乳动物,优选人、鼠、猪。
34.权利要求32或33所述的改性基质,当改性基质包含血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白时,还进一步包含VEGF-Fc融合蛋白,优选地,所述VEGF为人VEGF165,更优选VEGF的序列为SEQ ID NO:81。
35.权利要求32或33所述的改性基质,其中所述基质选自细胞培养板,细胞培养皿,水凝胶(优选透明质酸水凝胶,更优选丙稀酰肼化的透明质酸水凝胶或PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶),多孔支架,薄膜(优选纳米纤维薄膜),或者微球,优选所述微球是PLGA微球,更优选粒径大小为10-50微米(优选15-30,15-20微米)的PLGA微球;或者所述微球为聚苯乙烯球,优选聚苯乙烯球的粒径大小为10-50微米(优选15-30,15-20微米)。
36.权利要求35所述的改性基质,其中所述多孔支架、薄膜或微球为亲水性的或疏水性的。
37.权利要求36所述的改性基质,其中当所述多孔支架、薄膜或微球为亲水性的多孔支架、薄膜或微球时,所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白或所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白通过接头(优选Fc-结合肽)连接于所述多孔支架、薄膜或微球。
38.权利要求37所述的改性基质,其中所述Fc结合肽选自CHWRGWV(SEQ ID NO:93),HYFKFD(SEQ ID NO:94),HFRRHL(SEQ ID NO:95),FYWHCLDE(SEQ ID NO:96)或SpA(staphylococcal蛋白A)。
39.权利要求32-38任一项所述的改性基质在促进细胞(优选干细胞,更优选间充质干细胞,iPS细胞或胚胎干细胞)分化(优选促进干细胞向内皮样细胞、肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞分化)中的应用。
40.制备改性基质的方法,包含通过将上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白和/或血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白与基质混合来改性所述基质。
41.权利要求40所述的方法,其中所述基质是用于促进细胞向内皮样细胞、肝样细胞、胰样细胞或胆管上皮样细胞分化的基质,优选地,所述干细胞为间充质干细胞,iPS细胞或胚胎干细胞,更优选地,所述干细胞来源于哺乳动物,优选人、鼠、猪。
42.权利要求40或41所述的方法,其中当使用血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白改性基质时,还进一步混合使用VEGF-Fc融合蛋白,优选地,所述VEGF为人VEGF165,更优选VEGF的序列为SEQ ID NO:81。
43.权利要求40-42任一项所述的方法,其中所述基质选自细胞培养板,细胞培养皿,水凝胶(优选透明质酸水凝胶,更优选丙稀酰肼化的透明质酸水凝胶或PAMAM树枝状大分子/巯基化透明质酸水凝胶),多孔支架,薄膜(优选纳米纤维薄膜),或者微球,优选所述微球粒径大小为10-50微米(优选15-30,15-20微米),优选所述微球是PLGA微球,更优选粒径大小为10-50微米(优选15-30,15-20微米)的PLGA微球;或者所述微球为聚苯乙烯球,优选聚苯乙烯球的粒径大小为10-50微米(优选15-30,15-20微米)。
44.权利要求43所述的方法,其中所述多孔支架,薄膜或微球为亲水性的或疏水性的。
45.权利要求44所述的方法,其中当所述多孔支架,薄膜或微球为亲水性的多孔支架,薄膜或微球时,所述上皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白或所述血管内皮细胞钙粘素-Fc融合蛋白通过接头(优选Fc-结合肽)连接于所述多孔支架、薄膜或微球。
46.权利要求45所述的方法,其中所述Fc结合肽选自CHWRGWV(SEQ ID NO:93),HYFKFD(SEQ ID NO:94),HFRRHL(SEQ ID NO:95),FYWHCLDE(SEQ ID NO:96)或SpA(staphylococcal蛋白A)。
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