CN116814543A - 一种从间充质干细胞中分离纯化得到的高活性亚群细胞及其方法和应用 - Google Patents
一种从间充质干细胞中分离纯化得到的高活性亚群细胞及其方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及细胞分离纯化技术领域，尤其涉及一种从间充质干细胞中分离纯化得到的高活性亚群细胞及其方法和应用。本发明的方法包括如下步骤：(1)将间充质干细胞与30％Percoll分离液、70％Percoll分离液混合，收集位于30％Percoll分离液和70％Percoll分离液界面的细胞，得到层面细胞；(2)将层面细胞清洗，得到沉淀细胞，将沉淀细胞与培养基混合后，培养，得到中间细胞；(3)将所述的中间细胞按照步骤(1)～(2)的方法重复1～3次后，得到所亚群细胞。按照该方法获得的亚群细胞在损伤修复方面明显优于亲本间充质干细胞。
Description
技术领域
本发明涉及细胞分离纯化技术领域，尤其涉及一种从间充质干细胞中分离纯化得到的高活性亚群细胞及其方法和应用。
背景技术
人类用于临床治疗的多器官组织或细胞源间充质干细胞(Mesenymal stemcells,MSCs)均存在异质性而影响疗效和安全性的问题，如源于骨髓、脐带、脂肪肝脏、胰腺、心脏、肺脏、肾脏、眼、皮肤、肌肉、牙髓、滑膜、胎盘、绒毛膜、经血、母乳、羊水或其它细胞等。2003年美国O’Connor团队首次报道人类骨髓间充质干细胞(BMMSCs)中存在一种表达神经胶质2型抗原(Neuro-glialantigen2,NG2)的高增值活性亚群(NG2+亚群)，对于NG2+亚群存在于上述多器官源MSCs中先后均有报道，但当时不清楚其具备高活性。另外，受成体干细胞分离纯化方法限制无法体外扩增培养和深入研究和临床应用。
基于此，提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从间充质干细胞中分离纯化得到的高活性亚群细胞及其方法和应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种从间充质干细胞中分离纯化高活性亚群细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将间充质干细胞与30％Percoll分离液混合后，加到70％Percoll分离液上部，得到分层混合物；将所述的分层混合物离心，收集位于30％Percoll分离液和70％Percoll分离液界面的细胞，得到层面细胞；
(2)将所述的层面细胞清洗2～4次后，取沉淀，得到沉淀细胞，将所述的沉淀细胞与培养基混合后，置于铺垫有L-赖氨酸的培养容器中，静置25～30min后，再添加培养基培养1～7d，得到中间细胞；
(3)将所述的中间细胞按照步骤(1)～(2)的方法重复1～3次后，得到亚群细胞。
作为优选，所述间充质干细胞的初始浓度为0.5～1.0×106个/mL。
作为优选，所述间充质干细胞与30％Percoll分离液混合的体积比为1:6；
所述间充质干细胞与70％Percoll分离液混合的体积比为1:6～8。
作为优选，步骤(1)所述离心的转速为1500～2000rpm；
所述离心的时间为20～30min。
作为优选，步骤(2)所述清洗为离心清洗；所述离心清洗的方法为：将所述的层面细胞与清洗液混合，离心；
所述清洗液为DMEM/F12培养基；
所述的层面细胞与清洗液混合的体积比为1:4～9；
所述离心的转速为800～1200rpm；
所述离心的时间为5～8min。
作为优选，步骤(2)所述的培养基为含有胎牛血清的DMEM/F12培养基；所述胎牛血清的终浓度为10vt％；
步骤(2)所述培养的温度为36～38℃，
所述培养时CO2的浓度为4～6％。
作为优选，所述间充质干细胞源于骨髓、脐带血、脂肪组织、肝组织、胰腺组织、肺脏组织、皮肤组织、肾脏组织、心脏、皮肤、羊水、牙髓或眼。
本发明还提供了利用所述的方法得到的亚群细胞。
本发明还提供了所述的亚群细胞在制备用于损伤修复的药物中的应用。。
本发明提供了一种从间充质干细胞中分离纯化得到的高活性亚群细胞及其方法和应用。
经过本发明的方法得到的亚群细胞具有跨谱系或胚层分化作用，酷似人类胚胎干细胞。经我们长期研究推断，亚群细胞可能是在胚胎发育过程中停留在多器官组织中用于损伤修复的“类胚胎干细胞样”亚群。动物模型实验显示，亚群细胞损伤修复效率明显优于原亲本间充质干细胞。
本发明的分离方法，不仅可以解决学术界棘手的间充质干细胞异质性的关键科学问题，又可以实现提升原/亲本间充质干细胞临床治疗相应疾病的效果。研究显示，亚群细胞比原/亲本间充质干细胞具有显著优越性。
本发明的方法分离纯化的亚群细胞具有类似胚胎干细胞样生物学功能特性，可用于包括肝纤维化或肝硬化等相应疾病治疗的疗效提升。
附图说明
图1为从间充质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)中获取亚群细胞的方法和工艺流程；
图2为骨髓间充质干细胞和亚群细胞的形态学特征；
图3为骨髓间充质干细胞和亚群细胞生长和增殖活性；
图4为胰腺间充质干细胞和亚群细胞的形态学特征；
图5为胰腺间充质干细胞和亚群细胞生长和增殖活性；
图6为脐带间充质干细胞和亚群细胞的形态学特征；
图7为肝源亚群细胞在肝发育微环境中的功能性肝向分化；
图8为肝脏和骨髓亚群细胞表达阶段性胚胎干细胞特异性标志物优势；
图9为免疫荧光双染色法检测肝源亚群细胞在胚胎发育微环境中nestin(+)干细胞向的分化情况；
图10为肝源亚群细胞在胚胎发育微环境下向成熟(功能)肝细胞分化；
图11为肝源亚群细胞在胚胎发育微环境下向成熟(功能)胆管细胞分化；
图12为多器官亚群细胞向中胚层分化；
图13为肝源亚群细胞向外胚层分化；
图14为骨髓间充质干细胞亚群细胞对比亲本骨髓间充质干细胞改善肝功能优势；
图15为骨髓间充质干细胞亚群细胞对比亲本骨髓间充质干细胞细胞的存活能力优势；
图16为骨髓间充质干细胞亚群细胞向肝细胞和胆管细胞的分化；
图17为脐带间充质干细胞亚群细胞向肝细胞和胆管细胞的分化。
具体实施方式
本发明提供了一种从间充质干细胞中分离纯化高活性亚群细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将间充质干细胞与30％Percoll分离液混合后，加到70％Percoll分离液上部，得到分层混合物；将所述的分层混合物离心，收集位于30％Percoll分离液和70％Percoll分离液界面的细胞，得到层面细胞；
(2)将所述的层面细胞清洗2～4次后，取沉淀，得到沉淀细胞，将所述的沉淀细胞与培养基混合后，置于铺垫有L-赖氨酸的培养容器中，静置25～30min后，再添加培养基培养1～7d，得到中间细胞；
(3)将所述的中间细胞按照步骤(1)～(2)的方法重复1～3次后，得到亚群细胞。
得到的亚群细胞在使用前18～24h移入无血清培养基中进行培养，得到降低动物源级别的亚群细胞。在使用前的这步培养可以提升亚群细胞的安全性。
具体的方法和工艺流程图如图1所示。
在本发明中，所述30％Percoll分离液和70％Percoll分离液是按照专利号为201210426637.8《多器官源性成体NG2阳性干细胞群的分离纯化方法》中公开的30％Percoll分离液和70％Percoll分离液的配方配置的。
在本发明中，所述间充质干细胞的初始浓度为0.5～1.0×106个/mL，优选为0.75×106个/mL。在本发明中，所述间充质干细胞与30％Percoll分离液混合的体积比为1:6；所述间充质干细胞与70％Percoll分离液混合的体积比为1:6～8，优选为1:7。在本发明中，步骤(1)所述离心的转速为1500～2000rpm，优选为1750rpm；所述离心的时间为20～30min，优选为25min。
在本发明中，步骤(2)所述清洗为离心清洗；所述离心清洗的方法为：将所述的层面细胞与清洗液混合，离心；所述清洗液为DMEM/F12培养基；所述的层面细胞与清洗液混合的体积比为1:4～9，优选为1:6.5；所述离心的转速为800～1200rpm，优选为1000rpm；所述离心的时间为5～8min，优选为6.5min。所述清洗的次数优选为3次。
在本发明中，步骤(2)所述的培养基为含有胎牛血清的DMEM/F12培养基；所述胎牛血清的终浓度为10vt％；步骤(2)所述培养的温度为36～38℃，优选为37℃，所述培养时CO2的浓度为4～6％，优选为5％。
在本发明中，所述间充质干细胞源于骨髓、脐带血、脂肪组织、肝组织、胰腺组织、肺脏组织、皮肤组织、肾脏组织、心脏、皮肤、羊水、牙髓或眼。
本发明还提供了利用所述的方法得到的亚群细胞。
本发明还提供了所述的亚群细胞在制备用于损伤修复的药物中的应用。
在本发明中，利用亚群细胞时，需要对其进行预处理；所述预处理的步骤为：将亚群细胞接种于含有植物血凝素PHA的无血清培养基中培养18～24h。
所述植物血凝素与无血清培养基的质量体积比为0.5～1:100mL；
所述无血清培养基有两种：当细胞数不充足时采用申请号为202011211168.9《一种快速提升哺乳类动物间充质干细胞增殖效率的增殖培养基及增殖培养方法》中公开的ZEzh培养基；当细胞数充足时采用申请号为202011212380.7《可增进间充质干细胞干性的植物血凝素及其在间充质干细胞扩增培养中的应用》中公开的培养基。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
从骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)中分离纯化亚群细胞
所述的BMMSCs来源自人类。
(1)取每毫升含有细胞浓度为1×106个/mL的BMMSCs 1mL与6mL30％Percoll分离液混合，再加到7mL70％Percoll分离液上部，得到分层混合物；将所述的混合物置于2000rpm的离心机中离心30min，收集位于7.5mL分层界面的细胞，得到层面细胞。
(2)将层面细胞与DMEM/F12培养基按体积比1:9混合，1000rpm离心5min，弃去上清液，完成第一次清洗，之后再加入层面细胞4倍体积的DMEM/F12培养基，按上述步骤再清洗一次。弃上清液后，混匀于3mL含有10vt％胎牛血清的DMEM/F12培养基中后，置于铺垫有L-赖氨酸培养瓶中静止25min，再添加22mL含有10vt％胎牛血清的DMEM/F12培养基中37℃,5％CO2浓度培养7d，得到中间细胞1。L-赖氨酸的终浓度为1wt％。
重复步骤(1)～(2)2次，第1次重复，将中间细胞1与30％Percoll分离液按体积比1:6混合，再加到70％Percoll分离液上部，得到分层混合物；将所述的混合物置于2000rpm的离心机中离心30min，收集位于30％Percoll分离液与70％Percoll分离液界面的细胞，得到层面细胞。将层面细胞与DMEM/F12培养基按体积比1:9混合，1000rpm离心5min，弃上清后，混匀于含有10vt％胎牛血清的DMEM/F12培养基中后，置于铺垫有L-赖氨酸培养瓶中静止25min，再添加含有10vt％胎牛血清的DMEM/F12培养基中继续培养3d，得到中间细胞2。第2次重复，将中间细胞2与30％Percoll分离液按体积比1:6混合，再加到7mL70％Percoll分离液上部，得到分层混合物；将所述的混合物置于2000rpm的离心机中离心30min，收集位于30％Percoll分离液与70％Percoll分离液界面的细胞，得到层面细胞。将层面细胞与DMEM/F12培养基按体积比1:9混合，1000rpm离心5min，弃上清后，混匀于含有10vt％胎牛血清的DMEM/F12培养基中后，置于铺垫有L-赖氨酸培养瓶中静止20min，再添加含有10vt％胎牛血清的DMEM/F12培养基，继续培养1d，得到亚群细胞。得到的BMMSCs亚群细胞如图2所示。
图2显示，该亚群细胞呈片状形态，亲本细胞呈梭形形态。亚群细胞(NG2+)显著大于亲本细胞。
采用CCK-8和Ki-67免疫荧光双染方法检测亚群细胞和原本BMMSCs的生长和增殖活性，结果如图3所示。A表示CCK-8方法检测亚群细胞和亲本细胞的生长活性；B为Ki-67免疫荧光双染方法检测的亚群细胞和亲本细胞的增殖活性；C为Ki-67表达统计学分析；D为亚群细胞相比亲本细胞的增殖倍数。
图3显示，亚群细胞生长和增殖活性明显优于亲本细胞。B图的放大倍数为400倍。
实施例2
从小鼠胰腺(Pancreas间充质干细胞，pMSCs)中分离纯化亚群细胞
(1)取pMSCs浓度为1×106个/mL，1mL，加入6mL30％Percoll分离液混合，再加入到7mL70％Percoll分离液上层，得到层面混合物；将所述的层面混合物置于2000rpm的离心机中离心30min，收集界面细胞，得到层面细胞。
(2)将层面细胞与DMEM/F12培养基按体积比1:4混合，800rpm离心5min，弃去上清液，完成第一次清洗，之后再加入层面细胞5倍体积的DMEM/F12培养基，按上述步骤再清洗一次。弃上清液后，混匀于3mL含有10vt％胎牛血清的DMEM/F12培养基中后，置于铺垫有L-赖氨酸培养瓶中静止25min，再添加22mL含有10vt％胎牛血清的DMEM/F12培养基37℃,5％CO2浓度培养7d，得到中间细胞1。L-赖氨酸的终浓度为1-2wt％。
重复步骤(1)～(2)2次，第1次重复，将中间细胞1与30％Percoll分离液按体积比1:6混合，再加到70％Percoll分离液上部，得到分层混合物；将所述的混合物置于2000rpm的离心机中离心30min，收集位于30％Percoll分离液与70％Percoll分离液界面的细胞，得到层面细胞。将层面细胞与DMEM/F12培养基按体积比1:9混合，1000rpm离心5min，弃上清后，混匀于含有10vt％胎牛血清的DMEM/F12培养基中后，置于铺垫有L-赖氨酸培养瓶中静止25min，再添加含有10vt％胎牛血清的DMEM/F12培养基中继续培养3d，得到中间细胞2。第2次重复，将中间细胞2与30％Percoll分离液按体积比1:6混合，再加到70％Percoll分离液上部，得到分层混合物；将所述的混合物置于2000rpm的离心机中离心30min，收集位于30％Percoll分离液与70％Percoll分离液界面的细胞，得到层面细胞。将层面细胞与DMEM/F12培养基按体积比1:9混合，1000rpm离心5min，弃上清后，混匀于含有10vt％胎牛血清的DMEM/F12培养基中后，置于铺垫有L-赖氨酸培养瓶中静止20min，再添加含有10vt％胎牛血清的DMEM/F12培养基，继续培养1d，得到亚群细胞。胰腺间充质干细胞分离得到的亚群细胞如图4所示。左图为亲本细胞，右图为亚群细胞。
图4显示，胰腺亚群细胞片状，亚群细胞显著大于亲本细胞。
Ki-67免疫荧光双染方法检测亚群细胞和原本胰腺间充质干细胞的增殖活性，结果如图5所示。A为亲本细胞，B为亚群细胞。
图5显示，亚群细胞增殖活力表达量(B)明显高于亲本细胞(A)。
实施例3
从脐带间充质干细胞(umbilicalcord间充质干细胞，uMSCs)中分离纯化亚群细胞
按照实施例1的方法分离uMSCs中的亚群细胞。结果如图6所示(A为亲本细胞，B为亚群细胞)。
图6所示，脐带亚群细胞呈片状。
实验例1
按照实施例1的方法从小鼠肝脏间充质干细胞、肾脏间充质干细胞、眼睛间充质干细胞、肾脏间充质干细胞、心脏间充质干细胞中分离亚群细胞，进行后续试验。
(1)肝源亚群细胞显示“类胚胎干细胞样”特性：
1)取出新生1d的小鼠肝脏，制成匀浆，将匀浆与无血清培养基按体积比1:5配置制备成肝发育微环境。将小鼠肝脏来源的亚群细胞(类似胚胎干细胞)置于此肝发育的微环境中培养24h，免疫荧光法检测多向(箭头所示)和成熟肝向(干细胞、胆管细胞)分化情况。结果如图7所示。图7显示，亚群细胞向胚胎干细胞分化。A为肝源亚群细胞的肝向发育情况，B为学术界报道的胚胎干细胞的肝向发育过程，绿色箭头表示发育过程类似的情况。图7显示，肝源亚群细胞的发育类似于胚胎干细胞的发育过程，亚群细胞具有与胚胎干细胞相似的形态结构，显示内胚层肝源亚群细胞的多能干性潜力，如大细胞核，有一个或几个核仁；同时也表明其向内胚层分化。
学术界报道的胚胎干细胞的发育过程来源于Aleiandro Soto-Gutierrezet al发表的《Biotechnology and Genetic Engineering Reviews》(Vol.25,149-164(2008))中。
2)免疫荧光双染色法检测肝源和实施例1骨髓源间充质干细胞亚群细胞高表达胚胎干细胞阶段性特异性胚胎抗原SSEA-1和SSEA-3，骨髓来源的亚群细胞表达SSEA-1和SSEA-3对比亲本骨髓间充质干细胞的优势如图8所示(A为小鼠肝源亚群细胞表达SSEA-1和SSEA-3的情况；B为人类骨髓间充质干细胞表达SSEA-1和SSEA-3的情况)。非分化胚胎干细胞高表达此抗原，尤其SSEA-1表面抗原可作为发育全能性的一种标志。
3)免疫荧光双染色法检测肝脏亚群细胞在肝发育微环境下快速分化为nestin(+)细胞(>66％，一种早期干细胞标志物)，表明无需像iPS细胞的复杂转分化过程来获取类胚胎干性，如图9所示。
(2)肝源亚群细胞跨谱系/胚层分化：
1)向本(内)胚层(成熟肝细胞)分化:
(A)肝脏来源的亚群细胞在肝发育微环境下快速(1～4h)分化为Albumin(ALB+)细胞(ALB，一种成熟肝细胞标志物)，如图10所示。
(B)肝脏来源的亚群细胞在胚胎发育微环境下快速(1～4h)分化(内胚层)为CK19(+)细胞(CK19，一种成熟胆管细胞标志物)，如图11所示。
2)向中胚层分化：
多器官源间充质干细胞-亚群细胞在向中胚层分化，可以成骨和成脂(中胚层)如图12所示。
具体检测方法为：
将亚群细胞在成骨培养基中培养3周后，用1％茜素红染色检测成骨分化情况；
成骨培养基以DMEM培养基为基础培养基，还包括以下终浓度的组分10vt％胎牛血清、10mMβ-甘油磷酸酯、0.2mM抗坏血酸和1nM地塞米松。
将亚群细胞在脂肪诱导培养基中培养3周，用0.4％的油红O染色液染色，检测亚群细胞向成脂的分化情况；
脂肪诱导培养基以DMEM培养基为基础培养基，还包括以下终浓度的组分：10wt％牛磺酸、0.5mM吲哚美辛、1mM抗坏血酸，1μM地塞米松。
3)向外胚层分化：
肝脏来源的亚群细胞与脑损伤后的匀浆混合，得到混合物，将混合物与无血清培养基按体积比1:8混合，培养。培养24h后，免疫荧光检测亚群细胞向beta(β)-tubulin+细胞分化情况(β)-tubulin是外胚层成熟神经细胞标志物)。结果如图13所示。
无血清培养基为202011212380.7《可增进间充质干细胞干性的植物血凝素及其在间充质干细胞扩增培养中的应用》中公开的培养基。
图13所示，肝源间充质细胞亚群细胞可被诱导向外胚层神经细胞分化，标志物为β-tublin。
实验例2
动物模型的损伤修复实验：
亚群细胞修复二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)诱导的肝纤维化/肝硬化动物模型
(1)实施例1得到的亚群细胞的损伤修复
转输实施例1得到的亚群细胞(5×105)入DEN肝纤维化/肝硬化小鼠模型改善肝功能优势。DEN肝纤维化/肝硬化小鼠模型的建立方法为：将0.14mL DEN溶于1000mL灭菌水(浓度为133μg/mL),配成DEN溶液连续喂饲C57BL/6小鼠6dDEN，然后喂饲1d蒸馏水，如此循环建立模型。对比亲本间充质干细胞(彩色柱状图)，亚群细胞(条形彩色柱状图)对改善肝功能的作用。结果图如14所示。
图14显示，亚群细胞较亲本细胞在改善肝功能时具有明显的优势作用。可以改善谷丙转氨酶(ALT)，白蛋白(ALB)和血清总胆红素(TBIL)。
实施例1得到的亚群细胞增殖优势：转输亚群细胞入DEN诱导的C57BL/6小鼠肝损伤模型中，研究亚群细胞在肝损伤微环境内的存活能力，观察时的放大倍数为200倍。如图15所示，(A表示亲本细胞的存活能力，B表示亚群细胞的存活能力)。
图15显示，骨髓间充质干细胞亚群细胞较亲本细胞高表达ki-67。说明骨髓间充质干细胞亚群细胞的存活能力(B)明显优于亲本细胞(A)。
促内源肝再生优势：转输实施例1得到的亚群细胞入DEN诱导的C57BL/6小鼠肝损伤模型动物的微环境内，检测亚群细胞向肝细胞和胆管细胞的分化能力。结果如图16所示。
图16显示，接受亚群细胞的宿主促内源成熟肝细胞(ALB+)和胆管细胞(CK9+)分化能力明显强于接受亲本细胞。
(2)脐带血间充质干细胞-亚群细胞损伤修复优势：
按照实施例1的方法从人类脐带血间充质干细胞中分离亚群细胞，得到脐带血间充质干细胞来源的亚群细胞。
转输人类脐带血源间充质干细胞来源的亚群细胞入DEN诱导的C57BL/6小鼠肝损伤动物模型中，检测脐带血来源的间充质干细胞分离得到的亚群细胞向肝细胞和胆管细胞的分化能力。检测结果如图17所示。
图17显示，接受脐带血间充质干细胞来源的亚群细胞的宿主肝细胞和胆管细胞数量明显多于亲本细胞。
由以上实施例可知，本发明提供一种从间充质干细胞中分离纯化得到的高活性亚群细胞及其方法和应用。经过本发明的方法得到的亚群细胞具有跨谱系/胚层分化的“类胚胎干细胞样”生物功能特性作用，酷似人类胚胎干细胞，经多年研究和实验数据推测，间充质干细胞-亚群细胞可能是在胚胎发育过程中停留在多器官组织中用于损伤修复的定向胚胎干细胞亚群。动物模型实验显示，分离纯化的间充质干细胞-亚群细胞损伤修复效率明显优于亲本间充质干细胞。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种从间充质干细胞中分离纯化高活性亚群细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将间充质干细胞与30％Percoll分离液混合后，加到70％Percoll分离液上部，得到分层混合物；将所述的分层混合物离心，收集位于30％Percoll分离液和70％Percoll分离液界面的细胞，得到层面细胞；
(2)将所述的层面细胞清洗2～4次后，取沉淀，得到沉淀细胞，将所述的沉淀细胞与培养基混合后，置于铺垫有L-赖氨酸的培养容器中，静置25～30min后，再添加培养基培养1～7d，得到中间细胞；
(3)将所述的中间细胞按照步骤(1)～(2)的方法重复1～3次后，得到亚群细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞的初始浓度为0.5～1.0×106个/mL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞与30％Percoll分离液混合的体积比为1:6；
所述间充质干细胞与70％Percoll分离液混合的体积比为1:6～8。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述离心的转速为1500～2000rpm；
所述离心的时间为20～30min。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述清洗为离心清洗；所述离心清洗的方法为：将所述的层面细胞与清洗液混合，离心；
所述清洗液为DMEM/F12培养基；
所述的层面细胞与清洗液混合的体积比为1:4～9；
所述离心的转速为800～1200rpm；
所述离心的时间为5～8min。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的培养基为含有胎牛血清的DMEM/F12培养基；所述胎牛血清的终浓度为10vt％；
步骤(2)所述培养的温度为36～38℃，
所述培养时CO2的浓度为4～6％。
7.根据权利要求1～6任意一项所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞源于骨髓、脐带血、脂肪组织、肝组织、胰腺组织、肺脏组织、皮肤组织、肾脏组织、心脏、皮肤、羊水、牙髓或眼。
8.利用权利要求1～7任意一项所述的方法得到的亚群细胞。
9.权利要求8所述的亚群细胞在制备用于损伤修复的药物中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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