CN102899291A

CN102899291A - 多器官源性成体ng2阳性干细胞群的分离纯化方法

Info

Publication number: CN102899291A
Application number: CN2012104266378A
Authority: CN
Inventors: 白莲花; 帅领; 赖洁娟; 曾林立; 张玉君; 李瑶琛; 张宏宇; 别平
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2012-10-31
Filing date: 2012-10-31
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2032-10-31

Abstract

本发明公开了一种从成体多器官中分离纯化NG2阳性干细胞群的有效方法，先从成体中枢神经系统、眼虹膜、骨髓、心脏、肝脏、胰腺、肺脏或肾脏组织中消化分离获得悬浮单个细胞群，再通过30%和70%percoll分离液离心分离获得NG2阳性干细胞群并进行原代培养，所得多器官源性成体NG2阳性干细胞群纯度高，增殖能力强，具有相似的发育学特性和干细胞潜能，对损伤信号反应及时、强烈，在相应器官损伤微环境下能够迅速分化为功能性修复细胞，有望作为新型干细胞群对损伤器官实施有效治疗；本发明不仅为今后深入研究多器官中NG2阳性细胞群的生物学特性及其在再生医学中的作用奠定了基础，而且为干细胞临床治疗和再生医学领域提供了新型干细胞群。

Description

多器官源性成体NG2阳性干细胞群的分离纯化方法

技术领域

本发明属于细胞分离纯化技术领域，涉及一种成体干细胞群的分离纯化方法。

背景技术

NG2（Nerve/Glial 2）阳性细胞是一群主要分布在中枢神经系统（Central Nerve System, CNS）的细胞，被命名为少突胶质细胞祖先细胞（Oligodendrocyte Procursor Cells, OPCs）。传统概念定义，NG2阳性细胞是CNS所特有的具有修复功能的干细胞群。但目前NG2阳性细胞作为干细胞在发育期CNS中的研究较多，而由于缺少从成体CNS中分离纯化NG2阳性细胞的实用方法，关于NG2阳性细胞在成体CNS中是否同样具有干细胞潜能至今尚不清楚。此外，近年研究发现，CNS以外的其它器官也有NG2表达，例如血管窦周细胞（Pericytes, PCs），但目前研究证据还不足以支持PCs与NG2阳性细胞的同源性。最近Berry研究团队也报道，成年小鼠心脏主动脉有NG2表达，且表达NG2的细胞在特定诱导环境下可以分化为少突胶质细胞，提示NG2阳性细胞可能并非CNS所特有的干细胞群。

当今从哺乳类个体成体的各组织器官中寻找具相似生物学特性和修复特性的单一群体细胞是干细胞研究的热点，而上述细胞群的分离纯化恰是其中的难点。该难点的攻破将为损伤器官的干细胞治疗开辟一条新的途径。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从成体多器官中分离纯化具有相似生物学特性和干细胞潜能的NG2阳性细胞群的有效方法，为今后深入研究多器官中NG2阳性细胞群的生物学特性及其在再生医学中的作用奠定基础，并为干细胞临床治疗和再生医学领域提供新型干细胞群。

经研究，本发明提供如下技术方案：

1．多器官源性成体NG2阳性干细胞群的分离纯化方法，包括以下步骤：

a．分离成年哺乳类动物的中枢神经系统、眼虹膜、骨髓、心脏、肝脏、胰腺、肺脏或肾脏组织，去除被膜，用含有抗生素的MEM培养液充分冲洗并破碎组织；

b．将步骤a破碎后的组织用细胞消化液消化，再用含有脱氧核糖核酸酶I、血清和抗生素的DMEM/F12培养液充分吹打分散细胞，用细胞筛过滤除去组织获得单细胞悬液，离心，弃上清；

c．向步骤b离心后的细胞沉淀中加入30% Percoll分离液，混匀，再将混合物加至与30% Percoll分离液等体积的70% Percoll分离液的液面上，1500~3000rpm离心15~30分钟，收集位于两种Percoll分离液界面的细胞层，用含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液洗涤并重悬，制成细胞悬液；所述30%Percoll分离液是将percoll分离液与含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液按体积比为3:7混合制得；所述70%Percoll分离液是将percoll分离液与0.01mol/L PBS按体积比为7:3混合制得；

d．将步骤c所得细胞悬液接种至预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶中，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养，每隔3~7天补加新鲜培养液1次，待NG2阳性干细胞初次出现时全量更换新鲜培养液，之后每隔3~4天全量更换新鲜培养液1次，当培养瓶铺满单层细胞时，即得原代NG2阳性干细胞群；所述新鲜培养液为新制的含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液，

e．将步骤e所得原代NG2阳性干细胞群用细胞消化液消化后进行传代培养。

优选的，步骤a中所述含有抗生素的MEM培养液是含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的MEM培养液；步骤b和e中所述细胞消化液是胰酶/EDTA消化液，由质量分数为0.25%的胰酶溶液与质量分数为 0.02%的EDTA溶液按体积比为1: 1混合而成；步骤b中所述含有脱氧核糖核酸酶I、血清和抗生素的DMEM/F12培养液是含有质量分数为0.04%的脱氧核糖核酸酶I、质量分数为10%的胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液；步骤c和d中所述含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液是含有质量分数为10%的胎牛血清、100U/mL 青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液。

优选的，步骤b是向步骤a破碎后的组织中加入细胞消化液，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下孵育30分钟，再加入含有脱氧核糖核酸酶I、血清和抗生素的DMEM/F12培养液，充分吹打分散细胞，用孔径为70μm的细胞筛过滤除去组织获得单细胞悬液，2000rpm离心5分钟，弃上清。

优选的，步骤c是向步骤b离心后的细胞沉淀中加入30% Percoll分离液，混匀，再将混合物加至与30% Percoll分离液等体积的70% Percoll分离液的液面上，2000rpm离心30分钟，收集位于两种Percoll分离液界面的细胞层，用含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液洗涤并重悬，制成细胞悬液。

优选的，步骤d是将步骤c所得细胞悬液接种至预先用0.1mg/mL 多聚赖氨酸溶液过夜包被的培养瓶中，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养，每隔7天补加新鲜培养液1次，待NG2阳性干细胞初次出现时全量更换新鲜培养液，之后每隔4天全量更换新鲜培养液1次，当培养瓶铺满单层细胞时，即得原代NG2阳性干细胞群。

进一步，所述哺乳类动物为小鼠。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种从成体多器官中分离纯化NG2阳性干细胞群的通用方法，不仅从成体CNS中分离纯化出了具有干细胞潜能的NG2阳性细胞群，而且从其它成体多器官包括眼虹膜、骨髓、心脏、肝脏、胰腺、肺脏和肾脏中都分离纯化出了与成体CNS-NG2细胞具有相似发育学特性和干细胞潜能的NG2阳性细胞群。该方法通过Percoll不连续密度梯度离心分离纯化NG2阳性干细胞群，方法简单；采用常规细胞培养基进行细胞培养，不需要加入昂贵的细胞因子，经济实用；所得NG2阳性干细胞群纯度高，增殖能力强，具有显著的干细胞特性（自我更新和定向分化能力强），对损伤信号反应及时、强烈，在相应器官损伤微环境下能迅速分化为修复细胞，有望作为新型干细胞群对损伤器官如脑、脊髓、眼虹膜、骨髓、心脏、肝脏、胰腺、肺脏或肾脏等实施有效治疗。因此，本发明不仅为今后深入研究多器官中NG2阳性细胞群的生物学特性及其在再生医学中的作用奠定了基础，而且为干细胞临床治疗和再生医学领域提供了新型干细胞群。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的描述。

图1为从成年小鼠脊髓中分离纯化的NG2阳性干细胞群（简称为CNS-NG2），图中a为采用本发明方法从成年小鼠脊髓中分离纯化的NG2阳性细胞群；b为所得NG2阳性细胞群约95%以上表达NG2抗原（发红色荧光）；c为在溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine, LPC）作用下，成体CNS-NG2细胞（发红色荧光）表达神经干细胞标志物nestin（发绿色荧光）；d为在LPC作用下，成体CNS-NG2细胞（发红色荧光）表达窦周细胞标志物血小板源性生长因子受体β（PDGFR-β）（发绿色荧光）；e为在LPC作用下，成体CNS-NG2细胞（发红色荧光）不表达内皮细胞标志物血管性血友病因子（von Willebrand Factor, vWF）（发绿色荧光）；f为在LPC作用下，成体CNS-NG2细胞（发红色荧光）不表达疤痕细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP）（发绿色荧光）；b-f中细胞核均用DAPI标记，发蓝色荧光。

图2为成体CNS-NG2细胞治疗促进实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental Allergic Encephalomyelitis, EAE）功能修复，图中a为临床评分证明成体CNS-NG2细胞治疗组功能恢复；b为Black gold 染色证明成体CNS-NG2细胞治疗组髓鞘再生；c为成体CNS-NG2细胞治疗组降低炎性CD3阳性T淋巴细胞群；d为成体CNS-NG2细胞在体外损伤微环境（EAE匀浆）中分化为少突胶质细胞（O1+，发绿色荧光）；e为成体CNS-NG2细胞在体外损伤微环境（EAE匀浆）中分化为神经细胞（beta-tubulinIII+，发绿色荧光）；c-e中NG2均用TRITC标记，发红色荧光；细胞核均用DAPI标记，发蓝色荧光。

图3为成体CNS-NG2细胞促进脊髓损伤（Spinal Cord Injury, SCI）功能修复，图中a为成体CNS-NG2细胞在体内SCI微环境中协助beta-tubulinIII+ 神经细胞进行损伤修复作用；b为成体CNS-NG2细胞在体外SCI微环境（SCI匀浆）中分化为功能性少突胶质细胞（髓鞘碱性蛋白(Myelin Basic Protein, MBP)+，发红色荧光）；c为成体CNS-NG2细胞在体外SCI微环境（SCI匀浆）中分化为神经细胞（beta-tubulinIII+，发红色荧光），细胞核用DAPI标记，发蓝色荧光；a-c中NG2均发绿色荧光。

图4为从成年小鼠多实质器官中分离纯化的NG2阳性干细胞群，图中A第1行和第3行分别为采用本发明方法从脊髓（CNS）、肝脏（liver）、胰腺（pancreas）、心脏（heart）、眼虹膜（Iris）、肺脏（lung）、肾脏（kidney）、骨髓（BM）中分离纯化的NG2阳性细胞群，第2行和第4行显示从上述器官中分离纯化出的NG2阳性细胞群都约95%以上表达NG2抗原（发红色荧光），细胞核用DAPI标记，发蓝色荧光；B为溴脱氧尿苷（5-溴代-2'-脱氧尿苷, BrdU）标记法检测成体CNS-NG2细胞在四代后仍然具有明显的增殖能力。

图5为从成年小鼠肝脏中分离纯化的NG2阳性干细胞群（简称为liver-NG2）在损伤微环境（肝硬化匀浆）中分化为功能性细胞，图中a为二代生长中的liver-NG2细胞；b为二代liver-NG2细胞与肝硬化匀浆共育24小时的细胞形态变化；c为二代liver-NG2细胞与肝硬化匀浆共育72小时的细胞形态变化；d为二代liver-NG2细胞（发绿色荧光）与肝硬化匀浆共育72小时，分化为表达白蛋白（Albumin+，发红色荧光）的功能性肝细胞；e为二代liver-NG2细胞与肝硬化匀浆共育一周的细胞形态变化；f为二代liver-NG2细胞（发红色荧光）与肝硬化匀浆共育一周，约60%的细胞分化为表达白蛋白（Albumin+，发绿色荧光）的功能性肝细胞；d和f中细胞核均用DAPI标记，发蓝色荧光。

图6为从成年小鼠眼虹膜中分离纯化的NG2阳性干细胞群（简称为Iris-NG2）在损伤微环境（先天视盲小鼠虹膜匀浆）中分化为功能性细胞，图中a为二代生长中的Iris-NG2细胞；b为二代生长中的Iris-NG2细胞表达NG2抗原（发绿色荧光）；c为二代Iris-NG2细胞与先天视盲小鼠虹膜匀浆共育7小时分化为表达视锥（Opsin）功能性的修复细胞（发红色荧光）；d为二代Iris-NG2细胞与先天视盲小鼠虹膜匀浆共育7小时分化为表达视杆（Rhodopsin）功能性的修复细胞（发红色荧光）。

具体实施方式

下面将参照附图，对本发明的实施例及其效果进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商建议的条件。

实施例中使用的主要试剂如下：α-MEM（Hyclone，cat. no. Sh30265.01B），青霉素-链霉素溶液（Cellgro，cat. no. 30-001-CI，5000U/mL青霉素，5000μg/mL链霉素），DMEM:F12 1:1（Gibco-BRL，cat. no. 11330），胎牛血清（FBS，Sigma，cat. no. A-7906），脱氧核糖核酸酶I（DNase I，Sigma，cat. no. AMPD1），胰酶/EDTA消化液（0.25%胰酶: 0.02%EDTA=1: 1，Hyclone，cat. no. J110831)，多聚赖氨酸溶液（P-L-L，Sigma，cat. No. P1399），磷酸盐缓冲液（0.01M PBS，北京中杉金桥生物技术公司，cat. no. ZLI-9062），percoll分离液（Biosharp，cat. no. 301944/10055500），30%Percoll分离液（将percoll分离液与含有10%(w/w)FBS、100U/mL 青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液以体积比为3:7混合制得），70%Percoll分离液（将percoll分离液与0.01mol/L PBS以体积比为7:3混合制得），抗原MOG35-55（上海楚肽生物科技有限公司），结核杆菌H37Ra（BD DIFCO，cat. no. 231141），正常羊血清（北京中杉金桥生物技术公司，cat. no. ZLI-9021），兔抗鼠NG2抗体（Millipore，cat. no. AB5320），鼠抗鼠NG2抗体（Millipore，cat. no. MAB5384），鼠抗鼠nestin抗体（DSHB，cat. no. RAT-401），兔抗鼠PDGFR-β抗体（Abcam，cat. no. ab32570），鼠抗鼠vWF（Santa，cat. no. sc-365712），鼠抗鼠GFAP抗体（Millipore，cat. no. IF03L-100UG），鼠抗鼠O1抗体（Millipore，cat. no. MAB344），鼠抗鼠beta-tubulinIII抗体（Sigma，cat. no. T8660），兔抗鼠MBP抗体（Epitomics，1982-1），山羊抗鼠Albumin抗体（Abcam，cat. no. ab19194），鼠抗鼠Albumin抗体（Abcam，cat. no. ab41589），兔抗鼠视锥抗体（Millipore，cat. no. AB5405），鼠抗鼠视杆抗体（Millipore，cat. no. MABN15），TRITC标记羊抗兔IgG二抗（Proteintech Group，cat. no. SA00007-2），FITC标记羊抗鼠IgG二抗（Proteintech Group，cat. no. SA00003-1），FITC标记羊抗兔IgG二抗（Proteintech Group，cat. no. SA00003-2），CY3标记羊抗鼠IgG二抗（Proteintech Group，cat. no. SA00009-1），4,6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI，beyotime，cat. no. C1005），抗荧光淬灭PVP封片液（beyotime，cat. no. P0123）。

实施例一、从成年小鼠脊髓中分离纯化NG2阳性干细胞群（CNS-NG2）

具体步骤如下：

a．分离体重约20g、6-9周龄C57BL/6成年小鼠的脊髓，去除被膜，用含有100U/mL 青霉素和100μg/mL链霉素的MEM培养液充分冲洗并破碎组织；

b．向步骤a破碎后的组织中加入胰酶/EDTA消化液3mL，在37℃、5%CO₂的条件下孵育30分钟，再加入含有0.04%(w/w) DNase I、10%(w/w)FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液6mL，充分吹打分散细胞，再用孔径为70μm的细胞筛过滤除去组织获得单细胞悬液，2000rpm离心5分钟，弃上清；

c．向步骤b离心后的细胞沉淀中加入30% Percoll分离液5mL，混匀，再将混合物缓慢加至5mL 70% Percoll分离液的液面上，2000rpm离心30分钟，用滴管小心吸取位于两种Percoll分离液界面的灰白细胞层；

d．将步骤c收集的细胞转入离心管中，用含有10%(w/w)FBS、100U/mL 青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液离心洗涤1次，再加入含有10%(w/w)FBS、100U/mL 青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液，制成细胞悬液；

e．将步骤d制得的细胞悬液接种至预先用3mL 0.1mg/mL 多聚赖氨酸溶液过夜包被的75cm²培养瓶中（包被后的培养瓶用灭菌去离子水洗涤3~4次，干燥后使用），在37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，每隔7天补加1mL新鲜培养液，待NG2阳性干细胞初次露面时全量更换新鲜培养液，之后每隔4天全量更换新鲜培养液1次，当培养瓶铺满单层细胞时，即得原代NG2阳性干细胞群；

f．将步骤e所得原代NG2阳性干细胞群用胰酶/EDTA消化液消化，待全部细胞脱壁后进行传代培养。

观察显示，原代培养中的CNS-NG2细胞生长缓慢，22天左右方可露面，细胞呈片状形态，体积较大，首次传代后，生长迅速（图1a），NG2抗原表达高达98%（图1b）。同时，该细胞还表达神经干细胞标志物nestin（图1c）和窦周细胞标志物PDGFR-β（图1d），但不表达内皮细胞标志物vWF（图1e）和疤痕细胞标志物GFAP（图1f）。

实施例二、成体CNS-NG2细胞促进EAE功能修复

将20只体重18-20g、8~10周龄的雌性C57BL/6小鼠随机分为成体CNS-NG2细胞治疗组（EAE+CNS-NG2组）和对照组（EAE+PBS组），每组10只。将抗原MOG35-55用生理盐水稀释制成6mg/mL的溶液，再与完全弗氏佐剂（其中结核杆菌H37Ra终浓度为4mg/mL）等体积混合，乳化，按每只0.1mL于小鼠脊柱两侧分四点皮下注射，免疫后立即（0小时）及第48小时分别给小鼠腹腔注射0.5mL百日咳毒素（PTX），构建EAE小鼠模型。采用双盲法每日一次对EAE小鼠进行评分，评分标准如下，0分：无任何临床症状；1分：尾部张力消失，可见轻度步态笨拙；2分：双后肢无力，被动翻身后可以恢复；3分：双后肢瘫痪，被动翻身后不能恢复，但给予刺激后可以挪动；4分：双后肢瘫痪，前肢瘫痪或肌力减弱伴尿便失禁；5分：濒死状态或死亡；症状介于两档分值之间者以±0.5分计；“每日评分均值”由当日组内所有动物评分总和除以该组动物数量而得。于EAE小鼠病发高峰期（本实验中为免疫第15天），成体CNS-NG2细胞治疗组按1×10⁶/只静脉注射实施例一所得成体CNS-NG2细胞进行治疗，对照组静脉注射等体积PBS进行治疗，之后继续每日一次对小鼠进行评分，连续评估30天以上。结果显示，将成体CNS-NG2细胞转输到多发性硬化症脱髓鞘动物模型EAE中，可以促使瘫痪小鼠功能恢复（图2a）。

评估结束后，分别制作两组小鼠的脊髓切片。取脊髓切片，用0.2% Black-Gold试剂染色，镜下观察成体CNS-NG2细胞治疗对髓鞘再生的影响。结果显示，成体CNS-NG2细胞治疗对瘫痪小鼠脊髓髓鞘具有修复作用（图2b）。另取脊髓切片，先与抗CD3 T淋巴细胞抗体（稀释度1:100）在室温下孵育30分钟，再与二抗（稀释度1:200）孵育，镜下观察成体CNS-NG2细胞治疗对炎性反应的影响。结果显示，成体CNS-NG2细胞治疗具有降低炎性反应的作用（图2c）。

另取EAE小鼠脊髓制成匀浆；将实施例一所得成体CNS-NG2细胞接种到预先用多聚赖氨酸包被的圆形载玻片上，静置20分钟，待细胞稳定后加入EAE小鼠脊髓匀浆，共育7小时后取出载玻片，用预热至37℃的DMEM/F12培养液清洗1次，置含有NG2抗体（稀释度1:100）、O1或beta-tubulinIII抗体（稀释度1:100）和5%(v/v)正常羊血清的DMEM/F12培养液中，室温下孵育20分钟，用DMEM/F12培养液清洗6次，再置含有FITC标记二抗（稀释度1:500）、TRITC标记二抗（稀释度1:500）和5%(v/v)正常羊血清的DMEM/F12培养液中，温度37℃孵育20分钟，用DMEM/F12培养液清洗6次，再置5%(v/v)冰甲醇中，-20℃固定15分钟，用DMEM/F12培养液清洗6次，PBS清洗3次，DAPI染色1分钟，去离子水清洗1次，抗荧光淬灭PVP封片液封片，避光，镜下观察成体CNS-NG2细胞在损伤微环境诱导下的分化情况。结果显示，在损伤微环境（EAE匀浆）诱导下，成体CNS-NG2细胞可以分化为表达O1的功能性少突胶质细胞（图2d）和表达beta-tubulinIII的神经细胞（图2e），表明其具有干细胞潜能。

实施例三、成体CNS-NG2细胞促进SCI功能修复

参照文献方法（Horn et al., 2008）构建背柱嵌压性脊髓损伤模型：使用相距1.5mm宽的镊子尖头直插入小鼠第八胸椎1.0mm，将镊子尖头收拢，保持压力10秒钟；将上述破碎过程重复两次，用凝胶膜覆盖伤口，再用4-0尼龙缝线缝合肌层，手术缝合钉钉合全部伤口。

（1）隔天注射实施例一所得成体CNS-NG2细胞，十天后观察发现，成体CNS-NG2细胞与SCI损伤神经元相互作用后，可以稳定和促进营养不良的神经轴突生长，并使其免受炎性巨噬细胞的攻击（该部分研究结果已发表文章：Busch SA, etc al. Adult NG2+ cells are permissive to neurite outgrowth and stabilize sensory axons during macrophage-induced axonal dieback after spinal cord injury. J Neurosci. 2010, 30(1): 255-265）。同时，研究结果还表明，成体CNS-NG2细胞可以延伸跨过SCI损伤区为神经细胞的修复提供桥梁作用（图3a）。

（2）损伤三天后取出脊髓，制成匀浆。将实施例一所得成体CNS-NG2细胞接种到预先用多聚赖氨酸包被的圆形载玻片上，静置20分钟，待细胞稳定后加入SCI小鼠脊髓匀浆，共育7小时后取出载玻片，用预热至37℃的DMEM/F12培养液清洗1次，置含有NG2抗体（稀释度1:100）、MBP抗体（稀释度1:350）或beta-tubulinIII抗体（稀释度1:50）、以及5%(v/v)正常羊血清的DMEM/F12培养液中，室温下孵育20分钟，用DMEM/F12培养液清洗6次，再置含有FITC标记二抗（稀释度1:500）、TRITC标记二抗（稀释度1:500）和5%(v/v)正常羊血清的DMEM/F12培养液中，温度37℃孵育20分钟，用DMEM/F12培养液清洗6次，再置5%(v/v)冰甲醇中，-20℃固定15分钟，用DMEM/F12培养液清洗6次，PBS清洗3次，DAPI染色1分钟，去离子水清洗1次，抗荧光淬灭PVP封片液封片，避光，镜下观察成体CNS-NG2细胞在损伤微环境诱导下的分化情况。结果显示，在损伤微环境（SCI匀浆）诱导下，成体CNS-NG2细胞可以分化为表达MBP的功能性少突胶质细胞（图3b）和表达beta-tubulinIII的神经细胞（图3c），表明其具有干细胞潜能。

实施例四、从成年小鼠多实质器官中分离纯化NG2阳性细胞群

按照实施例一所述分离纯化方法，本发明从成年小鼠其它离体器官包括肝脏（liver）、胰腺（pancreas）、心脏（heart）、眼虹膜（Iris）、肺脏（lung）、肾脏（kidney）和骨髓（BM）中也分离纯化得到了相应的NG2阳性细胞群。观察发现，从成年小鼠上述器官中分离纯化得到的NG2阳性细胞群liver-NG2、pancreas- NG2、heart-NG2、Iris-NG2、lung-NG2、kidney-NG2和BM-NG2与实施例一从成年小鼠脊髓中分离纯化得到的NG2阳性细胞群CNS-NG2具有相同的生长特性和表面标志，如原代生长缓慢，形态酷似CNS-NG2，首次传代后NG2抗原表达高达95%（图4A）。随后用BrdU标记法进行细胞增殖检测，结果显示，四代后的NG2阳性细胞群仍然具有明显的增殖能力（图4B给出了成体CNS-NG2细胞的BrdU染色结果，其它器官成体NG2细胞的BrdU染色结果类同成体CNS-NG2细胞，省略）。

实施例五、成体liver-NG2细胞在损伤微环境中分化为功能性细胞

将实施例四所得二代liver-NG2细胞接种到预先用多聚赖氨酸包被的圆形载玻片上，静置20分钟，待细胞稳定后加入小鼠肝硬化匀浆（采用四氯化碳诱导的小鼠肝硬化模型），共育一定时间后取出载玻片，用预热至37℃的DMEM/F12培养液清洗1次，置含有NG2抗体（稀释度1:100）、白蛋白（Albumin）抗体（稀释度1:100）和5%(v/v)正常羊血清的DMEM/F12培养液中，室温下孵育20分钟，用DMEM/F12培养液清洗6次，再置含有FITC标记二抗（稀释度1:500）、TRITC标记二抗（稀释度1:500）和5%(v/v)正常羊血清的DMEM/F12培养液中，温度37℃孵育20分钟，用DMEM/F12培养液清洗6次，再置5%(v/v)冰甲醇中，-20℃固定15分钟，用DMEM/F12培养液清洗6次，PBS清洗3次，DAPI染色1分钟，去离子水清洗1次，抗荧光淬灭PVP封片液封片，避光，镜下观察成体liver-NG2细胞在损伤微环境诱导下的分化情况。结果显示，肝硬化匀浆可促使二代liver-NG2细胞（图5a）迅速分化为肝细胞样细胞（图5b, c）并表达功能性蛋白标志物白蛋白（图5d）。将liver-NG2与肝硬化匀浆共同培养1周，可见约60%的liver-NG2分化为功能性肝细胞（图5e, f）。

实施例六、成体Iris-NG2细胞在损伤微环境中分化为功能性细胞

将实施例四所得二代Iris-NG2细胞接种到预先用多聚赖氨酸包被的圆形载玻片上，静置20分钟，待细胞稳定后加入先天视盲小鼠虹膜匀浆，共育7小时后取出载玻片，用预热至37℃的DMEM/F12培养液清洗1次，置含有NG2抗体（稀释度1:100）、视锥或视杆抗体（稀释度1:100）、以及5%(v/v)正常羊血清的DMEM/F12培养液中，室温下孵育20分钟，用DMEM/F12培养液清洗6次，再置含有FITC标记二抗（稀释度1:500）、TRITC标记二抗（稀释度1:500）和5%(v/v)正常羊血清的DMEM/F12培养液中，温度37℃孵育20分钟，用DMEM/F12培养液清洗6次，再置5%(v/v)冰甲醇中，-20℃固定15分钟，用DMEM/F12培养液清洗6次，PBS清洗3次，DAPI染色1分钟，去离子水清洗1次，抗荧光淬灭PVP封片液封片，避光，镜下观察成体Iris-NG2细胞在损伤微环境诱导下的分化情况。结果显示，将二代Iris-NG2细胞（图6a,b）与先天视盲小鼠虹膜匀浆共同培养，3小时后该细胞即可对损伤信号作出反应，分化为具有视椎功能性的修复细胞（图6c）和具有视杆功能性的修复细胞（图6d）。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims

1.多器官源性成体NG2阳性干细胞群的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

d．将步骤c所得细胞悬液接种至预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶中，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养，每隔3~7天补加新鲜培养液1次，待NG2阳性细胞初次出现时全量更换新鲜培养液，之后每隔3~4天全量更换新鲜培养液1次，当培养瓶铺满单层细胞时，即得原代NG2阳性干细胞群；所述新鲜培养液为新制的含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液，

2.根据权利要求1所述的多器官源性成体NG2阳性干细胞群的分离纯化方法，其特征在于，步骤a中所述含有抗生素的MEM培养液是含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的MEM培养液；步骤b和e中所述细胞消化液是胰酶/EDTA消化液，由质量分数为0.25%的胰酶溶液与质量分数为 0.02%的EDTA溶液按体积比为1: 1混合而成；步骤b中所述含有脱氧核糖核酸酶I、血清和抗生素的DMEM/F12培养液是含有质量分数为0.04%的脱氧核糖核酸酶I、质量分数为10%的胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液；步骤c和d中所述含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液是含有质量分数为10%的胎牛血清、100U/mL 青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液。

3.根据权利要求2所述的多器官源性成体NG2阳性干细胞群的分离纯化方法，其特征在于，步骤b是向步骤a破碎后的组织中加入细胞消化液，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下孵育30分钟，再加入含有脱氧核糖核酸酶I、血清和抗生素的DMEM/F12培养液，充分吹打分散细胞，用孔径为70μm的细胞筛过滤除去组织获得单细胞悬液，2000rpm离心5分钟，弃上清；

步骤c是向步骤b离心后的细胞沉淀中加入30% Percoll分离液，混匀，再将混合物加至与30% Percoll分离液等体积的70% Percoll分离液的液面上，2000rpm离心30分钟，收集位于两种Percoll分离液界面的细胞层，用含有血清和抗生素的DMEM/F12培养液洗涤并重悬，制成细胞悬液；

步骤d是将步骤c所得细胞悬液接种至预先用0.1mg/mL 多聚赖氨酸溶液过夜包被的培养瓶中，在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养，每隔7天补加新鲜培养液1次，待NG2阳性干细胞初次出现时全量更换新鲜培养液，之后每隔4天全量更换新鲜培养液1次，当培养瓶铺满单层细胞时，即得原代NG2阳性干细胞群。

4.根据权利要求1所述的多器官源性成体NG2阳性干细胞群的分离纯化方法，其特征在于，所述哺乳类动物为小鼠。