CN107988142A - 一种定向epc样细胞、制备方法及其应用 - Google Patents

一种定向epc样细胞、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种定向EPC样细胞的制备方法，包括如下步骤：S1.采集脂肪并分离出脂肪细胞；S2.脂肪细胞经ADSCs培养基培养得到P2代的ADSCs；S3.P2代的ADSCs经EPCs培养基培养得到定向EPC样细胞。本发明的有益效果：本发明采用内皮祖细胞培养基预诱导脂肪干细胞3天，获得CD133表达率为47.63±12.50%、vWF表达率为31.10±5.32%的异质性的CEL，CEL能提高损伤部位血供，缓解缺血症状，不仅对于损伤区域的结构性修复是有益的且对于减轻神经功能损伤是有益的，CEL通过重建损伤区域的组织结构，恢复血液供应，抑制感染环境，减少神经元凋亡，促进轴突再生和突触连接，也能恢复部分感觉和运动功能。

Description

一种定向EPC样细胞、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体来说，涉及一种定向EPC样细胞、制备方法及其应用。
背景技术
神经系统退行性改变和损伤后的再生修复与功能重建一直是神经科学领域的重大课题。结构重建包括神经元新生和再生、轴突生长和突触连接。近年来，几种干细胞类型已经用于脑损伤的再生医学研究，包括胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，IPSs）、神经干细胞（neural stem cells，NSCs）、神经胶质细胞、间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）等。早期的研究多通过ESCs、iPCs来源的神经前体细胞或成体NSCs移植治疗神经损伤，修复神经元，虽然能改善神经功能，但没有任何证据表明外源NSCs及其衍生细胞的植入活性，以及长期的神经元修复和突触连接，更引起诸如癫痫等异常神经活动。就目前的研究进展，以现有的技术实现体内神经元新生和再生是很困难的，但修复脑损伤区域微环境、减少炎症、恢复病灶血供，以及构建轴突生长和突触连接niche是可行的。对于绝大多数外伤、中风等脑损伤，神经元、神经胶质细胞、周细胞、内皮细胞等细胞损失或功能失调，是导致神经功能丧失的根本原因，有效重建神经组织结构和功能需要多种细胞的共同作用。其中因血管栓塞或破裂引起的出血导致病灶缺乏血供、诱发炎症，是导致病灶区神经胶质细胞、神经元损失或功能异常的重要原因之一。
近来对MSCs的神经损伤修复效应的研究取得了很大进展，MSCs能通过旁分泌作用和免疫调节功能抑制炎症、减少纤维化和疤痕形成、诱导内源神经修复的作用看起来更值得期待。但MSCs移植疗效一直存在争议：1）异质性的MSCs细胞群体，其中效应细胞是什么2）MSCs的免疫调节功能存在双面性；3）极少的植入潜力，依靠短期的旁分泌作用诱导固有的组织修复，其再生医学作用不明确；4）体内存活期短；5）体内发育行为与体外分化能力之间存在巨大差异。因此MSCs更像一种多种生长因子、细胞因子、激素等的载体在体内起作用。在没有充分鉴定MSCs的不同细胞亚群特征及其标准化制备体系之前，研究MSCs的体内效应的个体化差异得到了很多争议的结果。总之，在脑损伤医学领域，是先治疗微环境损伤还是先治疗神经损伤是存在争议的。
因此，提出能够促进神经功能恢复的新方案来替代现有技术是十分必要的。
针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种定向EPC样细胞（committedEPC-like，以下简称为CEL），它能够有效参与微血管形成、减少星星胶质细胞增生和炎症反应、抑制了神经损伤、缩小病灶面积，促进神经功能恢复。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种定向EPC样细胞的制备方法，包括如下步骤：
S1.采集脂肪并分离出脂肪细胞；
S2.脂肪细胞经ADSCs培养基培养得到P2代的ADSCs；
S3.P2代的ADSCs经EPCs培养基培养得到定向EPC样细胞。
进一步地，所述ADSCs培养基为含有Ultroser G serum substitute的UltraCULTURE。
进一步地，所述EPCs培养基为含有以下成分的DMEM/F12：
无动物源成分血清替代品；
地塞米松；
重组人血管内皮生长因子；
重组人碱性成纤维细胞生长因子；
胰岛素样生长因子-1。
进一步地，所述步骤S1进一步包括如下步骤，采用腹部皮下抽脂，剔除小血管和结缔组织，剪碎呈流体状，以含硫酸庆大霉素的医用生理盐水重悬，离心取脂肪层和沉淀层，以消化液消化，经水浴和充分振荡后去悬浮絮状物，经筛网过滤，收集滤液，滤液离心弃上清，以PBS重悬，静置后吸弃悬浮物，再次离心弃上清。
进一步地，所述步骤S2进一步包括如下步骤，以ADSCs培养基重悬细胞，调整细胞密度后接种至培养器皿中，于37 ℃，5%CO2培养箱内培养至70-80%汇合时收获；收获时加入胰蛋白酶溶液室温消化5分钟，加入抑肽酶溶液终止消化；离心弃上清，收获沉淀物；沉淀物经洗涤和细胞筛过滤，收集滤液；滤液离心弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代ADSCs；P0代ADSCs传代培养至P2代收获。
进一步地，所述于37 ℃，5%CO2培养箱内培养至70-80%汇合时收获的具体操作方法为，24小时半量换液，36小时半量换液，48小时全换液，以后隔天换液，至70-80%汇合。
进一步地，所述步骤S3进一步包括如下步骤，以ADSCs培养基重悬P2代ADSCs，接种至培养器皿中，培养24小时，换EPCs培养基培养3天收获定向EPC样细胞。
本发明的另一方面，提供一种定向EPC样细胞，其根据上述的方法制备而成。
本发明的另一方面，提供上述定向EPC样细胞的应用，其在治疗由创伤引起的脑组织损害药物中的应用。
本发明的有益效果：本发明采用内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，简称EPCs）培养基预诱导脂肪干细胞（adipose derived stem cells，简称ADSCs）3天，获得CD133表达率为47.63±12.50%、vWF表达率为31.10± 5.32%的异质性的CEL，CEL被证实能够有效参与微血管形成、减少星星胶质细胞增生和炎症反应、抑制了神经损伤、缩小病灶面积，促进神经功能恢复。
使用本发明所述的定向EPC样细胞的制备方法制备得到的CEL，能提高损伤部位血供，缓解缺血症状，不仅对于损伤区域的结构性修复是有益的且对于减轻神经功能损伤是有益的，CEL通过重建损伤区域的组织结构，恢复血液供应，抑制感染环境，减少神经元凋亡，促进轴突再生和突触连接，也能恢复部分感觉和运动功能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是P2代的ADSCs形态图；
图2是ADSCs成骨分化的形态图；
图3是ADSCs成脂肪分化的形态图；
图4是ADSCs成软骨分化的形态图；
图5是CEL诱导分化第3天的形态图
图6是CEL诱导分化第18天的形态图；
图7显示CEL接种到matrigel包被的24孔板中7天呈条索状类血管结构；
图8是CEL吞噬DiI-Ac-LDL显示红色荧光；
图9是P2代的ADSCs和CEL多个分子的表达率统计图；
图10显示TBI后4周时皮质损伤区GFAP+星形胶质细胞（绿色）增生，NeuN+神经元（细胞核染色：红色）减少；
图11显示 DiL-CEL（红色）移植后，集中在撞击形成的凹陷部位，并向皮质内部迁移；
图12显示DiL-CEL（红色）迁移到皮质内部，参与血管内皮构成；
图13是图12方框内放大图；
图14是显示迁移到皮质内的Dil-CEL（红色）不表达GFAP，表明没有发生星形胶质细胞分化；
图15显示迁移到皮质内的Dil-CEL（红色）不表达CD68，表明没有发生巨噬细胞分化；
图16和图17显示迁移到皮质内的Dil-CEL（红色）不表达NeuN和NF200，表明没有发生神经元分化；
图18是TBI后左脑皮质损伤部位GFAP+星形胶质细胞百分比变化统计图；
图19是大鼠左脑皮质CD68+巨噬细胞百分比变化统计图；
图20是TBI后左脑皮质损伤面积变化统计图；
图21是大鼠Bederson评分；
图22是大鼠前肢放置试验结果。
具体实施方式
下面将结合具体实施例及附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员经过能够想要的常规技术调整所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中所使用的各种试剂及实验器材均可以从商业途径获得。
首先，对本发明实施例中出现的英文词汇及涉及的试剂材料作出说明：
DMEM/F12：是一种细胞培养基，生产厂商为GIBCO，货号为12400-024；
硫酸庆大霉素：生产厂商为Sigma，货号为E003632；
肝素钠抗凝剂：生产厂商为鼎国生物，货号为AC-0031；
PBS:磷酸盐缓冲液；
Collagenase NB 1：胶原酶NB 1，生产厂商为SERVA，货号为17455.03；
rh DNase-I：重组人脱氧核糖核酸酶I，生产厂商为ProSpec，货号为ENZ-319；
UltraCULTURE：无血清培养基，生产厂商为LONZA，货号为12-725F；
Ultroser G serum substitute：血清替代物，生产厂商为PALL，货号为15950-017；
胰蛋白酶溶液：生产厂商为Biological industries，货号为T6424-1VL；
抑肽酶溶液：生产厂商为Sigma，货号为A1250000；
无动物源成分血清替代品：生产厂商为Stemboscience，货号为C08003C；
地塞米松：生产厂商为Sigma，货号为D4902；
重组人血管内皮生长因子：生产厂商为PeproTech，货号为AF-100-20；
重组人碱性成纤维细胞生长因子：生产厂商为PeproTech，货号为AF100-18B；
胰岛素样生长因子-1：生产厂商为Prospec-Tany，货号为cyt-216；
DiI-Ac-LDL：DiI标记乙酰化低密度脂蛋白，生产厂商为Yeasen，货号为20606ES76；
Peptide Hydrogel：多肽水凝胶；
染色缓冲液：生产厂商为Invitrogen，货号为00-4222-26；
多聚甲醛溶液：生产厂商为PanEra，货号为AAPR12-250；
Triton™ X-100：聚乙二醇辛基苯基醚，生产厂商为Sigma，货号为T9284；
鼠抗人CD11b -FITC：生产厂商为Invitrogen，货号为11-0113-42；
鼠抗人CD19-FITC：生产厂商为Invitrogen，货号为11-0199-42；
鼠抗人CD34-FITC：生产厂商为Invitrogen，货号为11-0349-42；
鼠抗人CD45-FITC：生产厂商为Invitrogen，货号为11-0459-42；
鼠抗人CD73-FITC：生产厂商为Invitrogen，货号为11-0739-42；
鼠抗人CD90-FITC：生产厂商为Invitrogen，货号为11-0909-42；
鼠抗人CD105-PE：生产厂商为Invitrogen，货号为12-1057-42；
鼠抗人HLA-DR-FITC：生产厂商为Invitrogen，货号为11-9956-42；
鼠抗人CD133-FITC：生产厂商为Invitrogen，货号为12-13389-42；
鼠抗人vWF-F8/86：生产厂商为Invitrogen，货号为MA5-14029；
兔抗人UEA-1：生产厂商为Sigma，货号为U4754；
Alexa Fluor® 488标记兔抗鼠二抗：生产厂商为Invitrogen，货号为A11059；
Alexa Fluor® 488标记羊抗兔二抗：生产厂商为Invitrogen，货号为A11034）；
FBS：胎牛血清；
Isobutylmethylxanthine：IBMX，异丁基甲基黄嘌呤；
Indomethacin：吲哚美辛，消炎痛；
Matrigel：基质胶，生产厂商为BD，货号为354234；
Hamilton® syringe ：汉密尔顿氏注射器，生产厂商为Sigma，货号为HAM80075；
mouse anti-GFAP：鼠抗GFAP，生产厂商为Abcam，货号为ab10062；
mouse anti-CD68：鼠抗CD68，生产厂商为Abcam，货号为ab955；
mouse anti-NeuN：鼠抗NeuN，生产厂商为Abcam，货号为ab104224；
mouse anti-NF200：鼠抗NF200，生产厂商为Abcam，货号为ab7795；
Alexa Fluor® 488标记兔抗鼠二抗：生产厂商为Invitrogen，货号为A11059，Invitrogen）；
Alexa Fluor®647标记羊抗鼠二抗：生产厂商为Abcam，货号为ab150115。
实施例一：自体ADSCs制备
1.1脂肪采集
采集前供者体检，应无肿瘤史、无病毒感染、无支原体感染。脂肪采集在专业医疗采集机构采集。具体方法为腹部皮下抽脂50mL。采集后立即置于125mL冰浴无菌瓶（型号2019-0250，生产厂商Nalgene）中，无菌瓶中含50mL 保存液。
保存液为添加了如下成分的DMEM/F12：
50ug/mL硫酸庆大霉素；
10%肝素钠抗凝剂。
1.2脂肪细胞分离
剔除小血管和结缔组织，剪碎呈流体状，少见颗粒；以2倍体积的医用生理盐水（含50ug/mL硫酸庆大霉素）重悬，500g离心，10分钟，取脂肪层和沉淀层；重复洗涤2次，收集脂肪层和沉淀层，以二倍体积的消化液消化，37度水浴，30分钟，每5分钟充分振荡；去悬浮絮状物；200目筛网过滤，收集滤液；1000rpm离心10分钟，弃上清，以PBS重悬，静置10分钟，吸弃悬浮物，300g离心，10分钟，弃上清。
消化液含有如下成分：
0.15mg/mL Collagenase NB 1；
50IU/mL rh DNase-I。
1.3ADSCs培养
以ADSCs培养基重悬细胞，调整细胞密度为5×105/mL，接种至175cm2组织培养瓶（型号EasyFlask，生产厂家NUNC）中，于37 ℃，5%CO2培养箱内培养，24小时半量换液，36小时半量换液，48小时全换液，以后隔天换液，至70-80%汇合时收获；收获时吸弃培养上清，生理盐水洗涤培养表面1次，加入0.25%胰蛋白酶溶液，室温消化5分钟，加入1mL抑肽酶溶液终止消化；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀物；以生理盐水洗涤2次，以100um尼龙细胞筛过滤，收集滤液；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代ADSCs；P0代ADSCs传代培养至P2代收获，接种密度为6000/cm2。
所述ADSCs培养基为含有2% Ultroser G serum substitute的UltraCULTURE。
实施例二：CEL制备
以ADSCs培养基重悬P2代ADSCs，调整细胞密度至10000/cm2，接种至175cm2组织培养瓶中，培养24小时，换EPCs培养基，培养3天；在培养基中加入终浓度10μg/ml DiI-Ac-LDL，37℃ 孵育4小时后以DMEM/F12清洗3次，收获DIL标记的CEL（即DIL-CEL）。以0.5%PuraMatrix™ Peptide Hydrogel重悬DIL-CEL，调整细胞密度至1×108/mL，即为CIL制剂。
所述EPCs培养基为含有以下成分的DMEM/F12：
5%无动物源成分血清替代品；
10−8 mol/L地塞米松；
20 ng/mL重组人血管内皮生长因子；
5ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子；
5ng/mL胰岛素样生长因子-1。
实施例三：流式细胞学检测
细胞表面直接染色，即以染色缓冲液洗涤细胞，加入荧光标记抗体，4℃孵育30分钟，冷生理盐水洗涤2次，以500uL冷生理盐水重悬细胞，上机检测；细胞内间接染色，即以染色缓冲液洗涤细胞，以4%多聚甲醛溶液4℃固定30分钟，冷生理盐水洗涤1次，以0.25% Triton™X-100透化处理20分钟，冷生理盐水洗涤1次，加入一抗，4℃孵育2小时，冷生理盐水洗涤1次，加入二抗，4℃孵育30分钟，冷生理盐水洗涤2次，以500uL冷生理盐水重悬细胞，上机检测。
使用的抗体包括：
鼠抗人CD11b -FITC；
鼠抗人CD19-FITC；
鼠抗人CD34-FITC；
鼠抗人CD45-FITC；
鼠抗人CD73-FITC；
鼠抗人CD90-FITC；
鼠抗人CD105-PE；
鼠抗人HLA-DR-FITC；
鼠抗人CD133-FITC；
鼠抗人vWF-F8/86；
兔抗人UEA-1；
Alexa Fluor® 488标记兔抗鼠二抗；
Alexa Fluor® 488标记羊抗兔二抗。
实施例四：分化潜能检测
4.1 成骨诱导分化
取P2代细胞，按10000/mL接种至24孔板（货号142475，生产厂商NUNC），第12天时，换成骨诱导培养基，隔天换液，第28天时行茜素红染色。
所述成骨诱导培养基为添加了以下成分的基础培养基：
10%FBS；
10-7mol/L地塞米松；
50μg/ml抗坏血酸；
10mmol/L β-甘油磷酸钠。
4.2 成脂肪诱导分化
取P2代细胞，按10000/mL接种至24孔板，第12天时，换成脂诱导培养基，隔天换液，培养至第24天时行油红O染色。
所述成脂诱导培养基为添加了以下成分的基础培养基：
10%FBS；
10-6 mmol/L 地塞米松；
0.5 mmol/L isobutylmethylxanthine；
60μmol/L indomethacin；
10μg/ml胰岛素。
4.3 成软骨诱导分化
取P2代细胞，以软骨诱导培养基重悬，调整细胞密度至2×105/mL，以悬滴培养5天，小心收集悬液，重新接种至6孔板（货号174901，生产厂商NUNC），补充培养基至3mL/孔，每隔3天换液，继续培养23天，行Alcian Blue染色。
4.4 诱导CEL成血管样结构转化
以EPCs培养基重悬CEL，调整细胞密度至10000/cm2，接种至matrigel包被的24孔板中，培养7天。
实施例五：控制性大鼠脑皮质撞击损伤模型的建立及细胞治疗
5.1建立颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI）模型
30只雌性Wistar大鼠，手术前禁食12小时，5%水合氯醛腹腔注射麻醉。立体定位后行左脑开颅手术，骨孔中心位于前卤人字缝尖连线中点前2mm、外侧2mm处，直径6mm，暴露硬脑膜，待出现夹尾反射时，以直径4.5mm打击帽打击左脑皮质，力度为20g×30cm，打击深度2mm。受创后即刻给予呼吸机通气、心外按压等抢救措施，待自主呼吸恢复后缝合创口。TBI大鼠苏醒后以Bederson评分法评价神经功能缺损程度，评分1以上为造模成功。
5.2 CEL移植治疗
术后3天，随机选取15只Wistar大鼠，以10uLHamilton® syringe 注射10uLDIL-CEL制剂至撞击损伤引起的皮质凹处，此为CEL治疗组；另外15只注射10uL生理盐水，此为对照组。所有动物术后4周以Bederson评分法和肢体对称试验评分法评价神经功能缺损程度。所有动物术后4周猝死后手术取出脑损伤组织， 制备5um厚石蜡切片，行HE染色，计算脑损伤面积（mm2）；在荧光显微镜下观察DiL标记CEL的存活和分布。
5.3 Bederson评分
轻抓大鼠尾巴，提起高于桌面10cm，将大鼠放在一张大、软、有弹性、光滑的记录纸上。然后提起尾部，用手轻推大鼠肩部，指导前肢滑动几厘米。在不同方向重复数次。
0分：两各前爪伸向桌面，无神经功能缺损；
1分：前肢出现任何屈曲成分（即提尾悬空实验阳性），不伴其他不正常；
2分：侧推抵抗力下降（即侧向推力实验阳性），伴前肢屈曲，无转圈行为；
3分：同2分行为，伴自发旋转（自由活动时向瘫痪侧划圈）。
5.4 前肢放置试验
手持大鼠背部皮肤，使得四肢悬空，将大鼠胡须刷触桌面边角，测试前肢触及桌面角边缘次数的百分率。
实施例六：免疫组织学检测
病理切片常规脱蜡入水，0.3％H202阻断内源性过氧化物酶，10％小牛血清封闭切片，滴加一抗，4℃过夜；PBS水洗后滴加二抗，PBS漂洗2次，滴加1μg/ ml 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），孵育5分钟，PBS漂洗2次，以细胞成像系统（Cytell Cell Imaging System，生产厂商GE Healthcare）检测。
使用的抗体包括：
mouse anti-GFAP；
mouse anti-CD68；
mouse anti-NeuN；
mouse anti-NF200；
Alexa Fluor® 488标记兔抗鼠二抗；
Alexa Fluor®647标记羊抗鼠二抗。
实施例七：结果分析
统计学分析采用SPSS17.0进行统计学处理。数据以±S表示，均值比较采用独立样本t-test，P<0.05有统计学意义。
7.1ADSCs特征
图1~4显示了ADSCs培养和分化特征。
脂肪组织采集后经分离培养制备P2代ADSCs，P2代ADSCs细胞呈纺锤状、多角形贴壁生长（参见图1）。CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105、CD133、UEA-1、vWF的表达率（%）分别为1.04±0.16、1.07± 0.10、11.36± 3.73、2.21± 1.56、1.73±1.05、95.58±2.60、96.91± 1.73、92.57± 5.75、2.82±1.80、0.93±0.42、2.83±1.44（参见图9）。
7.2CEL特征
P2代ADSCs经EPCs培养基诱导培养3天，细胞逐渐变形（参见图5），CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105、CD133、UEA-1、vWF的表达率（%）分别为0.39±0.11、0.31±0.08、18.97± 2.86、5.93± 2.67、25.91± 13.52、70.03±13.05、46.45±10.07、99.31±0.85、47.63±12.50、53.01±8.75、31.10± 5.32（参见图3），与P2代ADSCs相比，CD11b、CD19、CD73、CD90的表达率显著降低（P＜0.05），CD34、CD45、HLA-DR、CD105、CD133、UEA-1、vWF的表达率显著提高（P＜0.05）；培养至第18天，自发形成血管状结构（参见图6）；接种至matrigel包被的24孔板中，培养7天时，细胞聚集成条索状，形成类血管样网络（参见图7）；部分CEL能吞噬DiI-Ac-LDL，吞噬率为43.18%（参见图8）。
7.3CEL移植治疗诱导大鼠TBI
诱导TBI 4周时，大鼠左脑皮质损伤部位GFAP+神经胶质细胞显著增生（参见图10），而对照组增生程度明显高于于对照组（P＜0.05）（参见图18），说明CEL移植能抑制星形胶质细胞增生和神经损伤胶质疤痕的形成；移植的DiL标记的CEL集中在撞击所形成的皮质凹陷处，周围包围着GFAP+神经胶质细胞（参见图11），并且CEL逐渐迁移到皮质内部（参见图12），参与毛细血管内皮组织构成（参见图13），说明CEL有利于神经血管重建；没有证据表明，移植的DiL-CEL在体内发生典型的分化，包括GFAP+DiL+神经胶质细胞（参见图14）、CD68+DiL+巨噬细胞（参见图15）、Neun+（参见图16）或NF200+DiL+（参见图17）神经元，暗示CEL移植虽然有植入活性，但缺乏分化活性；诱导TBI导致皮质凹陷和皮质损伤，诱发巨噬细胞聚集引起炎症反应，4周时，实验组TBI凹陷边缘皮质CD68+单核巨噬细胞明显低于于对照组（P＜0.05）和TBI后24小时（P＜0.05）（参见图19），说明CEL移植降低了TBI引起的炎症反应。诱导TBI之后，实验大鼠左脑损伤体积逐渐增加，至4周时，对照组损伤体积远大于对照组（P＜0.05）和TBI前（P＜0.05）（参见图20），说明CEL移植以对炎症反应、星形胶质细胞增生的控制以及对神经血管重建的促进作用能延缓组织损伤发展。
大鼠左脑皮层受到控制性撞击后形成TBI，神经功能受损，表现为不能沿直线行走，平衡功能障碍。TBI导致大鼠左脑皮质损伤， Bederson评分提高，4周时，实验组远低于对照组（P＜0.05）（参见图21）。而前肢放置试验评价实验组远高于对照组（P＜0.05），与TBI前相比有所降低，但没有统计学差异（P＞0.05）（参见图22）。神经功能缺损检测结果表明，CEL移植对于恢复TBI神经功能是有一定疗效的。
实施例八：结果讨论
TBI是由创伤引起的脑组织损害，死亡和致残率极高，是威胁人类健康的重要问题，除了姑息治疗或手术治疗以及神经康复治疗在某些情况下能够缓解病情外，还没有有效的策略治疗TBI后遗症引起的功能性障碍。TBI引起的神经损伤和功能障碍经常是继发性的，源于脑血管出血、栓塞、等引起的神经元变性和坏死。目前的研究表明，在成年人体内仍然存在能够产生神经元的细胞，但这种有限的自体修复能力不足以进行神经再生。因此，为了恢复受损的神经系统，基于干细胞的替代治疗策略受到广泛关注。在很多情况下，基于ESCs、iPS，的NS/PCs、神经胶质细胞移植的治疗效果取决于神经组织的结构重建继而恢复神经功能。但更多的研究表明供者细胞植入到宿主组织中通过分泌生物活性因子，抑制神经变性或促进神经再生。但是，外源NS/PCs迁移到损伤部位后持续凋亡增加了内源细胞凋亡从而加剧了炎症反应。而且外源NS/PCs在体内非定向诱导内源性修复活性，导致神经突触与组织细胞异常连接，引起额外的疼痛和星形胶质细胞增生导致的神经胶质疤痕形成。
MSCs是近年来研究比较多的成体干细胞。至今，有超过28个MSCs移植治疗TBI的临床前研究，结果表明，MSCs具有神经保护潜能，能改善感觉和运动神经功能，对TBI后遗症治疗是有益的。但也有足够的证据证明，MSCs能归巢到TBI损伤区域，调节免疫细胞活性、抑制炎症，分泌多种生长和细胞因子、促进血管新生、恢复血液供应，有利于重建适于神经修复的组织环境，对于缓解TBI症状，抑制损伤发展，提高神经修复能力，促进功能重建有重要意义。但MSCs移植到TBI动物脑损伤部位后，存在植入率低、存活期短，短期改善症状后长期疗效有限的缺陷。因此本发明采用EPCs培养基预诱导脂肪来源的MSCs，制备CEL，移植治疗TBI。
MSCs是体外培养的异质性的细胞群体，包含成脂、成软骨、成骨、成神经等不同分化潜能的细胞亚群，经VEGF、b-FGF、IGF-1等细胞因子诱导能产生EPCs。但完全的EPCs分化需要长期诱导，我们的研究发现，MSCs体外经EPCs培养基持续诱导18天，能形成类似血管的结构。而诱导3天时，CD133、UEA-1、vWF的表达率分别由2.82±1.80%、0.93±0.42%、2.83±1.44%升高到47.63±12.50%、53.01±8.75%、31.10± 5.32%，CD73、CD90分别由95.58±2.60%、96.91± 1.73%降低至70.03±13.05%、46.45±10.07%，CEL即具有EPCs的特征，也具有MSCs的特征。
控制性皮质撞击诱导TBI，大鼠皮质出现凹陷，24小时时损伤面积约5.70±1.18mm2，然后出现星形胶质细胞增生、神经元萎缩凋亡、巨噬细胞聚集现象，输入生理盐水安慰治疗不能延缓损伤发展。申请人研究发现，CEL移植后，CD68+巨噬细胞数量远少于安慰剂对照组（P＜0.05），与MSCs抑制炎症反应有关。星形胶质细胞在皮质损伤后增生是脑损伤的保护作用，同时形成神经胶质疤痕防止损伤持续扩大，但胶质疤痕也是神经损伤修复和神经再生的主要障碍。TBI4周时安慰剂对照组GFAP+星形胶质细胞是TBI前的1.8倍，而实验组虽然比TBI前略高，但没有统计学差异，说明CEL移植能抑制星形胶质细胞增生，减少纤维化和角质疤痕形成。而考察移植CEL后的迁移、归巢效应，申请人发现，CEL移植后，首先聚集在皮质凹陷处，然后向皮质内部迁移，并参与血管形成，说明CEL能提高损伤部位血供，缓解缺血症状。因此，申请人推测，CEL通过抑制炎症反应、星形胶质细胞增生，诱导和参与损伤部位血管新生，从而抑制了损伤的持续发展，有效减少损伤面积。
既往的研究表明，MSCs移植通过分泌多种生长和细胞因子提供神经保护活性，但多个临床前研究的meta分析结果表明，MSCs具有的神经保护活性与他丁类药物、红细胞生成素相近，在没有系统研究和统计的情况下，应更多考察MSCs通过旁分泌作用所具有的调节免疫、抑制炎症、促进血管新生的功能。申请人的研究已经证明了CEL移植能减少损伤面积，说明CEL移植对于损伤区域的结构性修复是有益的。而且移植的CEL，在TBI4周后仍旧没有GFAP、CD68、NeuN、NF200表达，说明CEL并没有发生神经胶质细胞、巨噬细胞和神经元分化，申请人推测，CEL的作用途径依旧是旁分泌途径。
本发明通过Bederson评分和前肢放置试验考察神经损伤症状和神经功能受损程度。Bederson评分可以评价TBI后脑神经损伤症状。评分越高神经损伤症状越严重。申请人的研究发现，TBI后24小时，受创大鼠Bederson评分达到2.13±0.74分，4周时，安慰剂对照组略有降低，但没有显著性差异，而46.67%的CEL实验组大鼠无任何神经损伤症状；前肢放置试验也表明CEL移植后感觉和运动神经功能损伤恢复到接近TBI前的水平，说明CEL移植对于减轻神经功能损伤是有益的。既往的研究证明MSCs移植后能减轻TBI后感觉和运动神经功能损失，但目前的研究结果不足以支持MSCs移植后诱导了神经元结构性重建，申请人的研究也没有发现新生神经元的证据，说明在神经组织修复过程中，神经元再生是十分困难的。而另外的研究表明，截瘫大鼠5%的残留神经纤维即可使瘫痪后肢恢复部分或全部关节运动；当残留达到10%时，截瘫动物甚至可以恢复部分行走功能；当残留比例超过40%时，大鼠后肢运动功能可达到正常。因此，CEL移植即使不能诱导神经元再生，但通过重建损伤区域的组织结构，恢复血液供应，抑制感染环境，减少神经元凋亡，促进轴突再生和突触连接，也能恢复部分感觉和运动功能。由此，申请人认为，通过诱导ADSCs定向内皮分化，产生部分分化的CEL，移植到TBI大鼠皮质损伤部位，能抑制炎症反应、诱导血管新生和再生、重建脑组织结构，促进神经功能性恢复。

Claims (9)

1.一种定向EPC样细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.采集脂肪并分离出脂肪细胞；
S2.脂肪细胞经ADSCs培养基培养得到P2代的ADSCs；
S3.P2代的ADSCs经EPCs培养基培养得到定向EPC样细胞。
2.根据权利要求1所述的一种预诱导ADSCs的制备方法，其特征在于，所述ADSCs培养基为含有Ultroser G serum substitute的UltraCULTURE。
3.根据权利要求1所述的一种定向EPC样细胞的制备方法，其特征在于，所述EPCs培养基为含有以下成分的DMEM/F12：
无动物源成分血清替代品；
地塞米松；
重组人血管内皮生长因子；
重组人碱性成纤维细胞生长因子；
胰岛素样生长因子-1。
4.根据权利要求1所述的一种定向EPC样细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤S1进一步包括如下步骤，采用腹部皮下抽脂，剔除小血管和结缔组织，剪碎呈流体状，以含硫酸庆大霉素的医用生理盐水重悬，离心取脂肪层和沉淀层，以消化液消化，经水浴和充分振荡后去悬浮絮状物，经筛网过滤，收集滤液，滤液离心弃上清，以PBS重悬，静置后吸弃悬浮物，再次离心弃上清。
5. 根据权利要求1所述的一种定向EPC样细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤S2进一步包括如下步骤，以ADSCs培养基重悬细胞，调整细胞密度后接种至培养器皿中，于37℃，5%CO2培养箱内培养至70-80%汇合时收获；收获时加入胰蛋白酶溶液室温消化5分钟，加入抑肽酶溶液终止消化；离心弃上清，收获沉淀物；沉淀物经洗涤和细胞筛过滤，收集滤液；滤液离心弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代ADSCs；P0代ADSCs传代培养至P2代收获。
6. 根据权利要求5所述的一种定向EPC样细胞的制备方法，其特征在于，所述于37 ℃，5%CO2培养箱内培养至70-80%汇合时收获的具体操作方法为，24小时半量换液，36小时半量换液，48小时全换液，以后隔天换液，至70-80%汇合。
7.根据权利要求1所述的一种定向EPC样细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤S3进一步包括如下步骤，以ADSCs培养基重悬P2代ADSCs，接种至培养器皿中，培养24小时，换EPCs培养基培养3天收获定向EPC样细胞。
8.一种定向EPC样细胞，其特征在于，其根据权利要求1~7任一所述的方法制备而成。
9.权利要求8所述的一种定向EPC样细胞在治疗由创伤引起的脑组织损害药物中的应用。
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