CN107541492A - 一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，包括如下步骤：S1.以新生儿脐带华通氏胶经MSCs培养基培养得到P2代脐带MSCs；S2.以MSCs培养基悬浮P2代脐带MSCs，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的细胞培养板中培养至60‑70%汇合，换神经分化培养基制备得到神经上皮预诱导细胞；S3.以神经上皮预诱导细胞经SCs培养基培养得到P0代SCs，并传代培养至P1代；S4.以P1代SCs制备SCs滋养层;S5.制备DRG感觉神经元细胞，以SCs滋养层与DRG感觉神经元细胞进行共培养。本发明提出的MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，为中枢神经系统神经损伤修复的细胞治疗提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体来说，涉及一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法。
背景技术
神经损伤发生时，神经元的再生是非常困难的，但残留神经元的轴突再生、生长和突触再连接是神经功能恢复的关键。神经损伤修复经轴突芽生、再生轴突生长和延伸、神经功能恢复三个阶段。既往的研究发现细胞外基质粘附分子、NGF、BDGF、NT-3、FGF、神经递质、生物活性磷脂等细胞外基质分子，可调节神经元轴突的形成、引导、延伸、分支、转向、暂停、回缩等，影响神经元的形态结构。但在体内局部注射这些成分对损伤修复有较好的作用，但对轴突再生以及神经功能修复的作用并不显著，推测与神经轴突生长基质细胞微环境有关。神经发育生物学的研究发现，在发育阶段，SCs由一种前体细胞发育成形态学和功能上完全不同的两类，即髓鞘形成细胞和非髓鞘形成细胞。以上两类细胞的分化是可逆的，如果神经离断后，这两类细胞都可回复到发育早期的“活跃细胞”阶段，这种活跃细胞也覆盖神经-肌肉接口处。有学者发现肌肉神经切断后，很快就有终末Sc伸出突起长入肌肉，长度达几百毫米。另外的研究发现，神经横断后，远端植入SCs细胞，轴突很快长入移植物中，能建立与远端实质的天然联系。因此雪旺细胞可能具有构建轴突复建细胞微环境的作用，引导和促进轴突生长。
既往用于实验研究和移植研究的SCs一般取自自体神经周围组织，会造成额外的损伤，且体外分离、培养困难。随着干细胞研究的发展，科学家发现采用胚胎干细胞、诱导多能干细胞也能大量制备SCs，但广泛的移植成瘤性等严重不良反应限制了其临床研究发展。近些年对间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）多潜能性的研究取得长足的进步，发现类似于胚胎干细胞诱导SCs的方法经多步诱导可以体外制备SCs。但其诱导体系比较复杂，操作繁琐。
针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，为中枢神经系统神经损伤修复的细胞治疗提供了新的思路。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，包括如下步骤：
S1.以新生儿脐带华通氏胶经MSCs培养基培养得到P2代脐带MSCs；
S2.以MSCs培养基悬浮P2代脐带MSCs，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的细胞培养板中培养至60-70%汇合，换神经分化培养基制备得到神经上皮预诱导细胞；
S3.以神经上皮预诱导细胞经SCs培养基培养得到P0代SCs，并传代培养至P1代；
S4.以P1代SCs制备SCs滋养层;
S5.制备DRG感觉神经元细胞，以SCs滋养层与DRG感觉神经元细胞进行共培养。
进一步地，所述MSCs培养基为含2% 血清替代物的无血清培养基。
进一步地，所述神经分化培养基为包含以下成分的DMEM/F12：
1×B27，
10%无动物源成分血清替代品，
5nM人二氢睾丸酮，
20ng /mL重组人碱性成纤维细胞生长因子，
20ng /mL重组人表皮生长因子，
40ng/ml 全反式维甲酸。
进一步地，所述SCs培养基为包含以下成分的DMEM/F12：
1×B27，
10%无动物源成分血清替代品，
5nM人二氢睾丸酮，
10ng/mL rh b-FGF，
10uM毛喉素，
5 ng/mL重组人血小板来源生长因子AA，
50ng/mL重组人神经胶质细胞来源的生长因子-2。
进一步地，所述步骤S1进一步包括如下步骤：足月健康新生儿脐带经洗涤，无菌解剖剥离华通氏胶，剪碎，以MSCs培养基悬浮后，转移至培养瓶置于CO2培养箱内培养，培养至第14天时，加入消化液室温消化5分钟后终止，离心弃上清，收获沉淀物以尼龙细胞筛过滤，收集滤液，离心弃上清，收获沉淀物，记为P0代脐带MSCs；以MSCs培养基重悬细胞，调整细胞密度，接种至新的组织培养瓶中培养至第4天，收获，记为P1代脐带MSCs，将P1代继续培养至P2代。
进一步地，所述步骤S2进一步包括如下步骤：以MSCs培养基悬浮P2代脐带MSCs，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的培养板中，培养至60-70%汇合，换神经分化培养基，37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养4天，吸弃培养上清，PBS洗涤培养表面1次，加入胰蛋白酶溶液，室温消化5分钟后终止，离心弃上清，收获沉淀细胞，即为神经上皮预诱导细胞。
进一步地，所述步骤S3进一步包括如下步骤：以SCs培养基重悬神经上皮预诱导细胞，接种至重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白、重组人调蛋白-β1包被的培养板中，隔天换液，60-80%汇合时，吸弃培养上清，PBS洗涤培养表面，加入AccutaseTM消化液，室温消化5分钟后终止，离心弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代SCs，P0代SCs传代培养至P1代时收获。
进一步地，所述步骤S4进一步包括如下步骤：以SCs培养基重悬P1代SCs，接种至重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白、重组人调蛋白-β包被的培养板中，培养至24小时，换含3%FBS的DMEM/F12培养48小时备用，此为SCs滋养层。
进一步地，所述步骤5进一步包括如下步骤：断颈处死成年雄性Wistar大鼠，手术取DRG，以含0.1mg/mLNB4的DMEM/F12消化DRG，600g离心10分钟，弃上清；以胰蛋白酶溶液重悬沉淀，37℃消化15分钟后终止，离心弃上清；沉淀以生理盐水洗涤，以移液管抽吸吹打，离心弃上清，沉淀为DRG感觉神经元细胞；以含3%FBS的DMEM/F12重悬DRG感觉神经元细胞，调整细胞密度；吸弃SCs滋养层培养基，再接种DRG感觉神经元细胞悬液，37℃，5%CO2条件下共培养48小时。
本发明的有益效果：本发明所述的MSCs来源的SCs滋养感觉神经元轴突生长的方法，采用MSCs来源的SCs与成年大鼠背根神经节（Dorsal root ganglia，DRG）感觉神经元共培养48小时，86.42 +/-11.72%的DRG感觉神经元轴突生长，平均生长长度为426.23 +/-114.01 um，远超过脐带MSCs（99.46 +/-3.87 um）和少突胶质前体细胞（oligodendrocyteprecursor cells，OPCs）（190.22 +/-20.51 um），为中枢神经系统神经损伤修复的细胞治疗提供了新的思路。
附图说明
图1是华通氏胶组织块接种时的形态图；
图2是华通氏胶组织块培养第14天时的形态图；
图3是P2代脐带MSCs的形态图；
图4是脐带P2代MSCs在重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的6孔板上生长的形态图；
图5是神经上皮预诱导细胞形态的改变；
图6是神经上皮预诱导细胞高表达nestin的形态图；
图7是脐带MSCs来源的SCs高表达GFAP的形态图；
图8是脐带MSCs和MSCs来源的SCs培养48小时分泌多种生物活性分子浓度比较图；
图9是对照组DRG感觉神经元形态图；
图10是脐带MSCs共培养组DRG感觉神经元形态图；
图11是SCs共培养组DRG感觉神经元形态图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，实施例中所涉及的各种试剂和实验器械未经特殊说明均可从商业途径获得。
首先，对本发明具体实施例中涉及的试剂、出现的英文及缩写进行简单的说明。
Ultra CULTURE：无血清培养基，生产厂商为LONZA，货号为12-725F；
Ultroser G serum substitute：血清替代物，生产厂商为PALL，货号为15950-017；
0.25%重组人胰蛋白酶：生产厂商为上海雅心生物技术有限公司，货号为RHT0301；
0.08%EDTA：生产厂商为SIGMA-ALDRICH，货号为1233508；
抑肽酶溶液：生产厂商为Sigma，货号为A1250000；
重组人层黏连蛋白：生产厂商为BioLamina，货号为Laminin-221；
重组人玻连蛋白：生产厂商为Enzo，货号为ENZ-PRT179-0500；
重组人纤黏连蛋白：生产厂商为ProSpec，货号为PRO-448；
重组人调蛋白-β1：生产厂商为GenScript，货号为Z03051-10；
FBS：胎牛血清，生产厂商为BI，货号为 04-400-1A；
DMEM/F12：是一种细胞培养基，生产厂商为invitrogen，货号为12800017；
B27：人体白细胞抗原，生产厂商为GIBCO，货号为17504-044；
无动物源成分血清替代品：生产厂商为Stemboscience，货号为C08003C；
人二氢睾丸酮：生产厂商为Sigma，货号为T6147；
重组人碱性成纤维细胞生长因子：生产厂商为Sigma，货号为SRP2092，Sigma；
重组人表皮生长因子：生产厂商为Sigma，货号为E9644；
全反式维甲酸：生产厂商为Sigma，货号为R2625；
AccutaseTM消化液：生产厂商为Innovative Cell Technologies, Inc，货号为40506ES60；
毛喉素：生产厂商为Sigma，货号为F6886；
重组人血小板来源生长因子AA：生产厂商为Sigma，货号为SPR-3268；
重组人神经胶质细胞来源的生长因子-2：生产厂商为BPS Biosciensice，货号为BPS-90255-A；
NB4：胶原酶NB4，生产厂商为Serva，货号为17454；
胰蛋白酶溶液：生产厂商为Biological industries，货号为03-053-1A；
mouse anti-nestin：小鼠抗巢蛋白，生产厂商为Millipore，货号为MAB5326；
mouse anti-GFAP：小鼠抗神经胶质酸性蛋白，生产厂商为Abcam，货号为ab10062；
mouse anti-integrin β1：小鼠抗整合素β1，生产厂商为Abcam，货号为ab183666；
Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC)：羊抗鼠免疫球蛋白GH&L（FITC标记），生产厂商为Abcam，货号为ab6785；
NGF：神经生长因子；
BDNF：脑源性神经营养因子；
NT-3：NT-3神经营养因子；
GDNF：胶质细胞源性神经营养因子；
VEGF:血管内皮生长因子;
TGF- β1：重组人转化生长因子-β1；
TGF- β2：重组人转化生长因子-β2；
bFGF：碱性纤维母细胞生长因子；
PDGF-AA：重组人血小板衍生生长因子-AA ；
Angiogenin：血管生成素。
HGF：肝细胞生长因子。
实施例一：MSCs的培养及MSCs滋养层的建立
足月健康新生儿脐带以生理盐水洗涤3次，去除残血，无菌解剖剥离华通氏胶，剪碎至2-3mm3的小块，以10mLMSCs培养基悬浮，所述MSCs培养基为含2% Ultroser G serumsubstitute的Ultra CULTURE。
转移至25cm2组织培养瓶（型号：EasyFlask，生产厂商：NUNC）中，置于37 ℃，5% CO2培养箱内培养。
培养至第14天时，吸弃培养上清，以生理盐水洗涤表面2次，加入5mL胰蛋白酶消化液，室温消化5分钟，以1mL抑肽酶溶液终止消化，400g离心，5min，弃上清，收获沉淀物。所述胰蛋白酶消化液含有0.25%重组人胰蛋白酶和0.08%EDTA。
沉淀物以生理盐水洗涤2次，100um尼龙细胞筛过滤，收集滤液，400g离心，5min，弃上清，收获沉淀物，即为P0代脐带MSCs。
以MSCs培养基重悬细胞，调整细胞密度至6000个/cm2，接种至新的25cm2组织培养瓶中培养至第4天，收获，即为P1代脐带MSCs。
继续培养至P2代。以MSCs培养基悬浮P2代脐带MSCs，按6000个/cm2接种至重组重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白、重组人调蛋白-β1包被的96孔板（型号：167008，生产厂商：NUNC）中，培养至24小时，换含3%FBS的DMEM/F12培养48小时备用，此为MSCs滋养层。
实施例二：神经上皮预诱导细胞的制备
以MSCs培养基悬浮P2代脐带MSCs，按6000个/cm2接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的6孔板（型号：174901，生产厂商：NUNC）中，培养至60-70%汇合，换神经分化培养基，37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养4天。
吸弃培养上清，PBS洗涤培养表面1次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶溶液，室温消化5分钟，加入100uL抑肽酶溶液终止消化。
400g离心，5min，弃上清，收获沉淀细胞，即为神经上皮预诱导细胞。
其中，神经分化培养基为包含以下成分的DMEM/F12：
1×B27，
10%无动物源成分血清替代品，
5nM人二氢睾丸酮，
20ng /mL重组人碱性成纤维细胞生长因子，
20ng /mL重组人表皮生长因子，
40ng/ml 全反式维甲酸。
实施例三：SCs的培养及SCs滋养层的建立
以SCs培养基重悬神经上皮预诱导细胞，按2×104/cm2接种至重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白、重组人调蛋白-β1包被的6孔板中，隔天换液，8-12天60-80%汇合时，吸弃培养上清，PBS洗涤培养表面1次，加入AccutaseTM消化液1mL，室温消化5分钟，加入200uL抑肽酶溶液终止消化；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代SCs。
P0代SCs传代培养1次。以SCs培养基重悬P1代SCs，按2×104/cm2接种至重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白、重组人调蛋白-β1包被的96孔板中，培养至24小时，换含3%FBS的DMEM/F12培养48小时备用，此为P1代SCs滋养层。
其中，SCs培养基为包含以下成分的DMEM/F12：
1×B27，
10%无动物源成分血清替代品，
5nM人二氢睾丸酮，
10ng/mL rh b-FGF，
10uM毛喉素，
5 ng/mL重组人血小板来源生长因子AA，
50ng/mL重组人神经胶质细胞来源的生长因子-2。
实施例四：DRG感觉神经元分离和共培养
断颈处死成年雄性Wistar大鼠（型号：SPF，生产厂商：维通利华），手术取DRG。以含0.1mg/mLNB4的DMEM/F12消化DRG，37℃，90分钟，600g离心10分钟，弃上清。
以0.05%胰蛋白酶溶液重悬沉淀，37℃消化15分钟，加入10%体积的抑肽酶溶液终止消化，400g离心10分钟，弃上清。
沉淀以生理盐水洗涤2次，以5mL移液管抽吸吹打15次，400g离心10分钟，弃上清，沉淀为DRG感觉神经元细胞。
以含3%FBS的DMEM/F12重悬DRG感觉神经元细胞，调整细胞密度至3×104/mL。
对照组直接接种DRG感觉神经元细胞悬液于重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白、重组人调蛋白-β1包被的96孔板中。
MSCs共培养组和SCs共培养组，首先吸弃MSCs滋养层和SCs滋养层培养基，再接种DRG感觉神经元细胞悬液，每孔100uL，37℃ 5%CO2，共培养48小时。
实施例五：多种生物活性分子表达检测及DRG神经元轴突检测
5.1 多种生物活性分子表达检测
ELISA法检测培养48小时的P2代脐带MSCs和培养48小时的MSCs来源的P1代SCs培养上清中以下生物活性分子的表达：NGF、BDNF、NT-3、GDNF、TGF-β1、TGF-β2、HGF、bFGF、PDGF-AA、Angiogenin。
5.2 免疫荧光检测
贴壁细胞免疫组织学检测时，吸弃培养基，以PBS漂洗2次，以4％多聚甲醛（PFA）固定细胞10分钟，以PBS漂洗2次，滴加一抗，4℃过夜；PBS洗涤2次，滴加FITC标记二抗，室温孵育1小时；PBS漂洗2次，滴加1μg/ ml 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），孵育5分钟，PBS漂洗2次，以细胞成像系统（Cytell Cell Imaging System，生产厂商：GE Healthcare）检测。
使用的抗体包括：mouse anti-nestin；mouse anti-GFAP；mouse anti-integrinβ1；Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC)。
5.3统计学分析
统计学分析采用SPSS17.0进行统计学处理。数据以±S表示，均值比较采用独立样本t-test，频数比较采用卡方检测，P<0.05有统计学意义。
实施例六：实验结果
6.1滋养层制备和分析
脐带MSCs来源的SCs培养的不同阶段参见图1~7。
脐带组织块采用无血清培养体系培养，参见图1，至第7天时部分组织块有大量细胞爬出，至第14天收获时，大约45%的组织块周围形成多克隆的典型MSCs培养形态，参见图2。
随着传代次数的增加，细胞形态逐渐均一化，参见图3。
P2代脐带MSCs高表达CD73、CD90、CD105，低表达或不表达造血免疫系定向表型。
P2代MSCs在重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的6孔板上更易于贴壁，且具有更好的迁移特征，培养72小时具有典型的MSCs形态特征，参见图4。
以神经诱导培养基诱导MSCs向神经分化，MSCs细胞体逐渐拉长，平行生长，参见图5，高表达nestin，参见图6。
以SCs培养基诱导MSCs来源的神经上皮预诱导细胞分化成SCs，8-12天以后，细胞形态发生明显的双极性、三极性改变，传代培养至第1代时87.19±9.33%表达nestin的细胞表达GFAP，参见图7。
脐带源MSCs和MSCs来源的SCs培养48小时，分泌的与神经修复相关的生物活性因子分泌有较大差别。结果参见图8，左侧为MSCs表达多种生物活性分子的结果，右侧为SCs表达多种生物活性分子的结果，结果表明，MSCs分化成SCs后，与MSCs相比，NGF、BDNF、NT-3、GDNF、VEGF、HGF的分泌量有显著增长，的分泌量有显著增长，分别增长至8.28、27.75、4.02、66.89、1.13、1.27倍；而TGF-β1、TGF-β2、bFGF、PDGF-AA、Angiogenin分泌有不同程度降低，分别降低至MSCs分泌量的4.42%、26.76%、78.97%、54.65%、0.02%。
6.2 滋养层细胞促进DRG感觉神经元细胞轴突增加和生长
DRG感觉神经元细胞接种至重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白、重组人调蛋白-β1包被的96孔板、MSCs滋养层或SCs滋养层上共培养48小时，对照组、MSCs共培养组、SCs共培养组的神经元轴突都有不同程度的增加和生长，分别参见图9、图10和图11。
其中对照组带有神经纤维的神经元为22.52±9.11%， MSCs共培养组为51.85±20.06%、SCs共培养组为93.66±31.65%。SCs共培养组神经元轴突生长最长（426.23±114.01 um），显著长于MSCs共培养组（99.46 ±3.87 um）和对照组（25.12±3.28 um）。
实施例七：结果分析
外周神经系统损伤时，机体的生理性反应是保护损伤区域剩余的神经组织，重建轴突，SCs在其中起到关键作用。既往的研究表明，脊髓损伤发生后，SCs移植能促进轴突生长和突触连接，恢复神经功能。早期的以SCs为基础的细胞治疗，SCs的来源经常是受者自体神经组织，或者是流产、引产胎儿的神经组织，受到样本资源限制很大。近年来，干细胞及再生医学研究取得很大进展，特别是MSCs转分化研究为SCs移植带来了一线曙光。MSCs是存在于成体多种组织的，具有高度增殖潜能和分化潜能的干细胞。MSCs具有成神经分化潜能，体外能分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、雪旺细胞等细胞类型。但MSCs移植治疗神经损伤的动物研究发现，MSCs在体内几乎没有发生神经分化，其神经营养和保护功能目前仅限于旁分泌作用。因此，MSCs体外分化产生神经细胞是否具有神经修复能力成为研究的重点。既往我们研究了MSCs来源的神经元、少突胶质细胞体内神经修复能力，发现MSCs来源的神经元没有桥接损伤神经的能力，植入能力极其有限，与胚胎、ESCs来源的NSCs移植有很大区别，但MSCs来源的OPCs的神经保护作用和髓鞘再生能力与胚胎、ESCs来源的额OPCs移植非常接近，我们一度认为OPCs移植是治疗周围神经损伤的最有前景的手段。但随后的研究发现，神经损伤后，其功能恢复很少依赖于神经元新生桥接损伤的轴突，内源性轴突再生、突触连接更多的依赖于SCs形成的髓鞘通道。因此，支持轴突生长可能是多种细胞共同作用的结果。
既往我们对轴突生长的研究发现，生长因子、神经营养因子的作用很小，而滋养细胞的促进作用很大。我们研究了MSCs、OPCs的促轴突生长作用，发现脐带MSCs来源的OPCs滋养DRG感觉神经元，神经元的生长锥数量相比于无滋养层的对照组和MSCs滋养层增加了3.9倍和1.32倍，而神经纤维长度，经共培养48小时，提高了7.57倍和1.91倍。进一步本研究采用SCs作为滋养层滋养DRG感觉神经元，发现神经元的生长锥数量相比于无滋养层的对照组和MSCs滋养层增加了4.16倍和1.81倍，而神经纤维长度，经共培养48小时，提高了16.97倍和4.28倍。因此，我们发现了一种通过脐带MSCs来源的SCs有效培养DRG感觉神经元轴突增长和生长的方法。
Claims (9)
1.一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.以新生儿脐带华通氏胶经MSCs培养基培养得到P2代脐带MSCs；
S2.以MSCs培养基悬浮P2代脐带MSCs，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的细胞培养板中培养至60-70%汇合，换神经分化培养基制备得到神经上皮预诱导细胞；
S3.以神经上皮预诱导细胞经SCs培养基培养得到P0代SCs，并传代培养至P1代；
S4.以P1代SCs制备SCs滋养层;
S5.制备DRG感觉神经元细胞，以SCs滋养层与DRG感觉神经元细胞进行共培养。
2.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述MSCs培养基为含2% 血清替代物的无血清培养基。
3.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述神经分化培养基为包含以下成分的DMEM/F12：
1×B27，
10%无动物源成分血清替代品，
5nM人二氢睾丸酮，
20ng /mL重组人碱性成纤维细胞生长因子，
20ng /mL重组人表皮生长因子，
40ng/ml 全反式维甲酸。
4.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述SCs培养基为包含以下成分的DMEM/F12：
1×B27，
10%无动物源成分血清替代品，
5nM人二氢睾丸酮，
10ng/mL rh b-FGF，
10uM毛喉素，
5 ng/mL重组人血小板来源生长因子AA，
50ng/mL重组人神经胶质细胞来源的生长因子-2。
5.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述步骤S1进一步包括如下步骤：足月健康新生儿脐带经洗涤，无菌解剖剥离华通氏胶，剪碎，以MSCs培养基悬浮后，转移至培养瓶置于CO2培养箱内培养，培养至第14天时，加入消化液室温消化5分钟后终止，离心弃上清，收获沉淀物以尼龙细胞筛过滤，收集滤液，离心弃上清，收获沉淀物，记为P0代脐带MSCs；以MSCs培养基重悬细胞，调整细胞密度，接种至新的组织培养瓶中培养至第4天，收获，记为P1代脐带MSCs，将P1代继续培养至P2代。
6.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述步骤S2进一步包括如下步骤：以MSCs培养基悬浮P2代脐带MSCs，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的培养板中，培养至60-70%汇合，换神经分化培养基，37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养4天，吸弃培养上清，PBS洗涤培养表面1次，加入胰蛋白酶溶液，室温消化5分钟后终止，离心弃上清，收获沉淀细胞，即为神经上皮预诱导细胞。
7.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述步骤S3进一步包括如下步骤：以SCs培养基重悬神经上皮预诱导细胞，接种至重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白、重组人调蛋白-β1包被的培养板中，隔天换液，60-80%汇合时，吸弃培养上清，PBS洗涤培养表面，加入AccutaseTM消化液，室温消化5分钟后终止，离心弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代SCs，P0代SCs传代培养至P1代时收获。
8.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述步骤S4进一步包括如下步骤：以SCs培养基重悬P1代SCs，接种至重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白、重组人调蛋白-β包被的培养板中，培养至24小时，换含3%FBS的DMEM/F12培养48小时备用，此为SCs滋养层。
9.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述步骤5进一步包括如下步骤：断颈处死成年雄性Wistar大鼠，手术取DRG，以含0.1mg/mLNB4的DMEM/F12消化DRG，600g离心10分钟，弃上清；以胰蛋白酶溶液重悬沉淀，37℃消化15分钟后终止，离心弃上清；沉淀以生理盐水洗涤，以移液管抽吸吹打，离心弃上清，沉淀为DRG感觉神经元细胞；以含3%FBS的DMEM/F12重悬DRG感觉神经元细胞，调整细胞密度；吸弃SCs滋养层培养基，再接种DRG感觉神经元细胞悬液，37℃，5%CO2条件下共培养48小时。
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