CN108624560A - 一种分化培养基及少突胶质前体细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于将神经干细胞分化为少突胶质前体细胞的培养基，该培养基不包含外源因子，避免外源因子的污染并且能够高效分化少突胶质前体细胞；本发明同时还提供一种利用该培养基制备少突胶质前体细胞的方法，利用本发明提供的方法能够在提高少突胶质前体细胞产率的前提下提高少突胶质前体细胞的分化效率。

Description

一种分化培养基及少突胶质前体细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及细胞分化技术领域，尤其涉及一种培养基及少突胶质前体细胞的制备方法。
背景技术
髓鞘是神经系统中重要的组成结构，脱髓鞘疾病会导致认知、记忆、运动等功能障碍，严重影响患者的生活质量。
髓鞘是由少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs)在脊椎动物中枢神经系统(central nervous system,CNS)中缠绕神经元的轴突而成，在神经发育早期，神经前体细胞先产生神经元，之后开始产生少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursors,OPs)少突胶质前体细胞向神经系统其他部位迁移、增殖，最后分化为成熟的少突胶质细胞(OLs)并形成髓鞘。
目前，体外和体内实验都已经证实少突胶质前体细胞具有增殖、迁移和分化后的成髓鞘能力，因此少突胶质前体细胞移植是治疗髓鞘损伤疾病的一种有效的手段；进来有研究表明，少突胶质前体细胞移植应用研究的的热点在于和髓鞘损伤有关的脊髓损伤的修复。
随着多能干细胞研究的深入，少突胶质前体细胞来源的问题得到解决。目前多能干细胞向少突胶质前体细胞的分化主要借鉴和模拟少突胶质细胞在体内的自然发生过程，首先将多能干细胞诱导分化为神经上皮细胞，再进一步分化为少突胶质前体细胞。然而，目前多能干细胞向少突胶质前体细胞分化的步骤复杂冗长，整个培养过程需要4个月左右，长者甚至需要6个月，严重限制了OPs在细胞治疗或构建疾病模型中的应用；目前由神经上皮细胞分化至OPs的培养方法中，培养基中多添加胎牛血清、非人源白蛋白或非人源生长因子等异源物，增加了OPs在临床应用的风险。目前很多学者致力于研究一种能缩短分化时间，提高分化效率的培养基和培养方法。
发明内容
为了提高在无外源因子条件下制备少突胶质前体细胞的效率，本发明实施例一方面提供一种用于将神经干细胞分化为少突胶质前体细胞的培养基，所述培养基包括由Advanced DMEM/F12和Neurobasal medium混合而成的基础培养基，还包括终浓度为0.5～2.5％的GlutaMAX、1～5％的B27、0.5～2.5％的N2、2～25ng/ml的bFGF、2～25ng/ml的PDGF-AA、25～250ng/ml的β-HRG1、1～20μM的2-巯基乙醇以及1％的P/S。
本发明提供的用于将神经干细胞分化为少突胶质前体细胞的培养基，缩短由神经干细胞分化成少突胶质前体细胞的时间，提高神经干细胞分化为少突胶质前体细胞的分化效率，其中所述培养基中添加2-巯基乙醇不仅能够提高细胞的抗氧化能力，增强细胞活力，并且所述2-巯基乙醇和培养基中的PDGF-AA以及β-HRG1共同作用能显著提高少突胶质前体细胞的分化效率。
为了进一步提高少突胶质前体细胞的分化效率及最终成品纯度，优选的是，所述用于将神经干细胞分化为少突胶质前体细胞的培养基中，所述培养基包括由AdvancedDMEM/F12和Neurobasal medium以体积比为1:1混合而成的基础培养基，还包括终浓度为1％的GlutaMAX、2％的B27、1％的N2、10ng/ml的bFGF、10ng/ml的PDGF-AA、100ng/ml的β-HRG1、10μM的2-巯基乙醇、1％的P/S。
进一步优选的是，所述培养基包括由Advanced DMEM/F12和Neurobasal medium混合而成的基础培养基，还包括终浓度为0.5～2.5％的GlutaMAX、1～5％的B27、0.5～2.5％的N2、2～25ng/ml的bFGF、2～25ng/ml的PDGF-AA、IGF-1、Wnt3A、25～250ng/ml的β-HRG1、1～20μM的2-巯基乙醇以及1％的P/S。
所述培养基中添加IGF-1和Wnt3A能够进一步提高细胞活性，增加少突胶质前体细胞的产量，促进神经干细胞向胶质细胞分化，进一步提高分化效率，其中IGF-1和Wnt3A在培养基中的浓度优选分别为2～25ng/ml和1～10ng/ml。
为了进一步提高少突胶质前体细胞的分化效率，增加其产量，所述用于将神经干细胞分化为少突胶质前体细胞的培养基中，所述培养基包括由Advanced DMEM/F12和Neurobasal medium以体积比为1:1混合而成的基础培养基，还包括终浓度为1％的GlutaMAX、2％的B27、1％的N2、10ng/ml的bFGF、10ng/ml的PDGF-AA、10ng/ml的IGF-1、5ng/ml的Wnt3A、100ng/ml的β-HRG1、10μM的2-巯基乙醇和1％的P/S。
本发明实施例另一方面提供了一种制备少突胶质前体细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
配置包括由Advanced DMEM/F12和Neurobasal medium混合而成的基础培养基，并且还包括终浓度为0.5～2.5％的GlutaMAX、1～5％的B27、0.5～2.5％的N2、2～25ng/ml的bFGF、2～25ng/ml的PDGF-AA、25～250ng/ml的β-HRG1、1～20μM的2-巯基乙醇以及1％的P/S培养基的步骤；
用浓度为2.5～25μg/ml的PLO和2.5～25μg/ml的层粘连蛋白包被细胞培养容器后加入以上步骤所述的培养基，并以1×104～5×104个细胞/cm2的密度将神经干细胞接种至所述细胞培养容器的步骤；
在保证细胞有足够的生长因子和养分的条件下定期更换所述的培养基至所述培养基中出现少突胶质前体细胞，也可每隔48h定期更换所述培养基。
在少突胶质前体细胞分化过程中，细胞之间的相互作用影响分化效率，以1×104～5×104个细胞/cm2的接种密度在保证少突胶质前体细胞数量的基础上提高分化效率，当接种密度高于5×104个细胞/cm2或密度低于1×104个细胞/cm2时，制备同样数量的少突胶质前体细胞需要更长的分化时间。
其中为了使分化的少突胶质前体细胞更接近或满足临床应用标准，包被细胞培养容器的层粘连蛋白(laminin)可优选为人源层粘连蛋白。
进一步优选的是，所述的制备少突胶质前体细胞的方法中，神经干细胞以4×104个细胞/cm2的密度接种至所述细胞培养容器，在该条件下，自接种之日起5～10天可观察到少突胶质前体细胞，培养至纯度高于90％的少突胶质前体细胞，可进一步用于临床研究或作为细胞制剂的活性成分用来治疗髓鞘损伤相关的疾病。
优选的是，所述制备少突胶质前体细胞的方法中，所述细胞培养容器为6孔板。在保证细胞密度的前提下，不排除其他细胞培养板或培养皿，如12孔板、24孔板或者根据实际需要分化的少突胶质细胞的量选择细胞培养皿进行分化。
本发明实施例提供的制备少突胶质前体细胞的方法中用到的神经干细胞可根据本领域技术人员所熟知的各种方法制备得到的神经干细胞，优选的是，所述神经干细胞来源于骨髓间充质干细胞，由骨髓间充质干细胞根据本发明提供的方法制备的少突胶质前体细胞能够在无明显排斥反应情况下跨种属应用于髓鞘损伤治疗或其他研究。
本发明实施例另一目的是提供一种能稳定控制由骨髓间充质干细胞制备少突胶质前体细胞过程并提高少突胶质前体细胞质量的方法。
优选的是，所述制备少突胶质前体细胞的方法中，所述神经干细胞的制备方法包括以下步骤：
配置包括含有终浓度为0.5％～2.5％的GlutaMAX、1％～5％的B27、10～60ng/ml的bFGF、10～60ng/ml的EGF、5～40ng/ml的GMP IGF-1和1％的P/S的Advanced DMEM/F12培养基作为神经干细胞培养基；
用所述神经干细胞培养基非贴壁培养骨髓间充质干细胞，并以7500～20000个细胞/cm2的密度接种至非贴壁细胞培养容器中；
根据细胞的生长情况定期更换所述非贴壁细胞培养容器中的神经干细胞培养基，所述神经干细胞以神经球的形式存在于所述神经干细胞培养基中
进一步优选的是，在所述制备少突胶质前体细胞的方法中，配置包括含有终浓度为1％的GlutaMAX、2％的B27、40ng/ml的bFGF、40ng/ml的EGF、20ng/ml的IGF-1和1％的P/S的Advanced DMEM/F12培养基作为神经干细胞培养基；用所述神经干细胞培养基非贴壁培养骨髓间充质干细胞，并以10000个细胞/cm2的密度接种至非贴壁细胞培养容器中，其中，较高浓度的bFGF及EGF配合IGF-1可有效提高神经球产量。
所述神经球在培养容器中应当以非贴壁方式进行培养，非贴壁方式培养能够抑制神经球的自主分化，有利于控制分化过程；采用非贴壁培养收集所述神经球时不需要对细胞进行消化，可直接将培养液进行离心处理，减少消化步骤对细胞的损伤，因此通过非贴壁方式培养骨髓间充质干细胞能够提高由骨髓间充质细胞制备少突胶质前体细胞的产率。
优选的是，所述制备少突胶质前体细胞的方法中，所述神经干细胞以神经球的形式存在于所述神经干细胞培养基中，所述神经球在100g～300g条件下离心约5min的条件下与所述神经干细胞培养基分离。
优选的是，所述制备少突胶质前体细胞的方法中，所述骨髓间充质干细胞由骨髓通过以下步骤制备而成：
以Stem Pro Medium培养所述骨髓，48h后移除培养基及未贴壁的细胞并加入新培养基继续培养；
培养基中出现骨髓间充质干细胞克隆时，以40000个细胞/cm2的接种密度接种至Stem Pro Medium进行传代培养，直至培养基中表达CD45阳性细胞的含量小于1％。
骨髓中含有很多骨髓间充质干细胞之外的杂细胞，骨髓贴壁培养48h后移除培养基能大量减少未贴壁的杂细胞，提高骨髓间充质干细胞的纯度。
发明人通过实验发现骨髓中的造血干细胞会影响骨髓间充质干细胞制备神经干细胞的效率，骨髓经48h培养后，对贴壁的细胞进行传代培养可大量减少骨髓中的造血干细胞，通常情况下传代3～4次可使表达CD45阳性细胞的含量小于1％。
并且以40000个细胞/cm2的接种密度进行传代有助于维持骨髓间充质干细胞的干性，抑制骨髓间充质干细胞随机分化，从而提高了由骨髓制备少突胶质前体细胞的产率。
进一步优选的是，所述制备少突胶质前体细胞的方法中，用于制备神经干细胞的骨髓间充质干细胞STRO-1,CD90和CD73阳性表达量大于90％，Nestin阳性表达量大于5％，并且CD45阳性表达量小于1％。培养基中细胞标记物阳性表达的量可通过骨髓间充质杆细胞传代培养的次数进行控制，当培养基中CD45阳性表达量小于1％时，造血干细胞对骨髓间充质干细胞制备神经干细胞的影响可忽略不计。
本发明提供一种具有高效分化少突胶质前体细胞的培养基，利用该培养基制备少突胶质前体细胞的方法，包括由骨髓制备少突胶质前体细胞的方法。本发明提供的培养基及制备少突胶质前体细胞的过程中不使用外源因子，避免外源因子的污染，为临床研究提供可能；另外本发明提供的制备方法还具有制备少突胶质前体细胞的产率高，分化效率高，分化过程可控的有益效果。
附图说明
图1是流式细胞术检测实施例1中骨髓间充质干细胞标志物CD90、CD73、STRO-1、CD45和Nestin的表达；
图2是以骨髓间充质干细胞中Nestin和GFAP阳性表达率做为对照，神经球中Nestin和GFAP阳性表达的细胞占神经球中细胞总数的比例的柱状图；
图3是根据实施例4制备的少突胶质前体细胞Olig2(A图)、PDGFRα(B图)、NG2和Sox10(C图)免疫荧光染色图；
图4是通过流式细胞技术检测实施例4中少突胶质前体细胞标记蛋白Olig2、PDGFRα、NG2和Sox10；
图5是以不含有少突胶质细胞前体的CIB作为对照(A图)，shiverer模型鼠注射OPs(B图)12周后髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达；
图6是分别注射含有人源OPs和鼠源OPs后shiverer模型鼠寿命延长情况。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明进行进一步描述，实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法，实验所用的仪器和试剂皆可通过商业途径获得。
本发明实施例采用的培养基主要成分来源信息如下：
CTS Stem Pro Medium：Thermo Fisher，Cat.No.:A1033201
Advanced DMEM/F12：Thermo Fisher，Cat.No.:12634028
Neurobasal medium：Thermo Fisher，Cat.No.:21103049
本发明实施例采用临床标准的生长因子，如CTS N2(Thermo Fisher，Cat.No.:1370701)、CTS B27(Thermo Fisher，Cat.No.:1486701)、GMP bFGF(Peprotech,Cat.No.:GMP100-18B)和GMP PDGF-AA(Peprotech,Cat.No.:GMP100-13A)。并不排除非临床标准的化学试剂应用于本发明实施例制备少突胶质前体细胞。
实施例1：骨髓间充质干细胞(BMSC)预处理
1、材料来源：
骨髓来源包括但不限于30日龄的斯普拉格-杜勒鼠(Sprague-Dawley rats)，或年龄在18～40岁之间的成年人。
2、用9ml的CTS Stem Pro Medium稀释1ml斯普拉格-杜勒鼠或成年人骨髓，将稀释后的骨髓加入经过改性处理为适合细胞贴壁培养的10cm细胞培养皿中培养，将骨髓进行贴壁培养之日定义为少突胶质前体细胞分化过程的首日(D0)。
3、48h后移除细胞培养皿中的培养基，用DPBS洗除未贴壁的细胞后，加入10ml CTSStem Pro Medium，此后每隔72h更换一次CTS Stem Pro Medium继续培养。
4、培养至D6～D7时，可在培养皿中观察到骨髓间充质干细胞(BMSC)克隆；培养至D8～D10时，吸除培养基并用3ml的DPBS冲洗培养皿中未贴壁的细胞，移除上述DPBS并向培养皿中加入1ml的CTS Tryple Select，在37℃环境下孵育5min，收集消化后的细胞溶液并于室温条件下200g离心5min得到沉淀，用CTS Stem Pro Medium重悬上述离心沉淀。
5、将上述细胞以4×104个细胞/cm2的密度接种至6cm或10cm的细胞培养皿。
6、当培养皿中的BMSC达80％～90％融合时，传代培养，其中BMSC传代培养不能超过10代。
7、BMSC的鉴定
BMSC传代至P3时，收集细胞，常规消化，用DPBS重悬细胞后，加入4％的PFA固定10min后离心，用DPBS清洗2～3次细胞沉淀以清除PFA；分别用含有CD90、CD73、CD45、Nestin和STRO-1的一抗的封闭液孵育细胞2h，离心后再用含有荧光染料(Alexa488)标记过的二抗的封闭液孵育细胞30min，离心并用DPBS重悬细胞后用流式细胞仪对细胞表面抗原进行检测。阴性对照采用和一抗的来源，Ig分型和标记一致的非特异性抗体作为同型对照。图1的结果表明本发明实施例培养的细胞具备BMSC表型特征且几乎不含造血干细胞，BMSC的纯度较高。
其中封闭液为：含有2％的BSA和0.1％的Triton X-100的DPBS。
利用流式细胞技术检测如下三组标记物：
A：BMSC标记物：STRO-1、CD90和CD73；
B：神经干细胞标记物：Nestin；
C：造血干细胞标记物：CD45。
当培养皿中的细胞的A组标记物呈现高于90％阳性，B组标记物高于5％阳性且C组标记物低于1％时，培养皿中的细胞可用于进一步操作。
实施例2：BMSC分化为神经干细胞
1、神经干细胞培养基的制备
配置含有终浓度为1％的CTS GlutaMAX、2％的CTS B27、40ng/ml的GMP bFGF、40ng/ml的GMP EGF、20ng/ml的GMP IGF-1和1％的P/S的Advanced DMEM/F12培养基。
2、在BMSC传至第3～10代之间时(优选D15)，用CTS Tryple Select消化BMSC，离心后用神经干细胞培养基重悬BMSC，并以1×104个细胞/cm2的密度接种于Ultra非贴壁培养6孔板中。
3、每隔48h更换一次神经干细胞培养基，随着培养时间的增加，神经干细胞形成神经球悬浮于神经干细胞培养基中，非贴壁培养第5～7天时，将培养基于200g离心5min得到以神经球形式存在的神经干细胞。
实施例3：神经干细胞的鉴定
以骨髓间充质干细胞作为对照，将实施例2所述的非贴壁培养第5天的神经球打散后，用免疫荧光技术检测神经球中阳性表达Nestin和GFAP的细胞含量并计数，从图2可以看出，实施例2神经球中阳性表达Nestin和GFAP的细胞量超过85％。
实验证明，当实施例2所述的神经球中的细胞阳性表达Nestin和GFAP的细胞量高于75％时，利用该神经球进一步分化的少突胶质前体细胞纯度和分化效率较高。
实施例4：神经干细胞分化为少突胶质前体细胞
1、制备少突胶质前体细胞分化培养基
分别配置如下三组少突胶质前体细胞分化培养基用于分化实施例2制备的神经干细胞：
(1)第一组分化培养基包括以Advanced DMEM/F12和CTS Neurobasal medium以体积比为1:1均匀混合而成基础培养基，以及终浓度为1％的CTS GlutaMAX、2％的CTS B27、1％的CTS N2、10ng/ml的GMP bFGF、GMP PDGF-AA、100ng/ml的GMPβ-HRG1、10μM的2-巯基乙醇和1％的P/S。
(2)第二组分化培养基包括Advanced DMEM/F12和Neurobasal medium以体积比为9:2混合均匀而成的基础培养基，以及终浓度分别为0.5％的GlutaMAX、1％的B27、0.5％的N2、2ng/ml的bFGF、2ng/ml的PDGF-AA、25ng/ml的β-HRG1、1μM的2-巯基乙醇和1％的P/S。
(3)第三组分化培养基包括Advanced DMEM/F12和Neurobasal medium以体积比为1.5:7.5混合均匀而成的基础培养基，以及终浓度分别为2.5％的GlutaMAX、5％的B27、2.5％的N2、25ng/ml的bFGF、25ng/ml的PDGF-AA、250ng/ml的β-HRG1、20μM的2-巯基乙醇和1％的P/S。
2、用浓度均为10μg/ml的多聚-L-鸟氨酸(PLO)和人源层粘连蛋白包被6孔板，向6孔板中加入少突胶质前体细胞分化培养基后接种实施例2制备的神经干细胞，其中，接种密度为4×104个细胞/cm2。
3、接种后每隔48h更新少突胶质前体细胞分化培养基，自神经干细胞接种至含有第一组少突胶质前体细胞分化培养基之日第8天起，用CTS Tryple Select消化并收集少突胶质前体细胞，由实施例1中1ml的骨髓通过本发明提供的少突胶质前体细胞的制备方法可获得2×107个少突胶质前体细胞，因此根据本发明提供的分化培养基及培养方法制备少突胶质前体细胞的时间相比于对比文件明显缩短，提高了少突胶质前体细胞的制备效率，并且根据少突胶质前体细胞计数结果，本发明制备少突胶质前体细胞的产率较高。
4、通过流式细胞技术检测少突胶质前体细胞表达Olig2、PDGFRα、NG2、和SOX10的情况，图4为第一组分化培养基制备的少突胶质前体细胞的Olig2、PDGFRα、NG2、和SOX10阳性细胞率。神经干细胞在第二组分化培养基培养第19天，Olig2、PDGFRα、NG2、和SOX10的阳性细胞率分别为72.5％、69.36％、75.91％和74.75％；神经干细胞在第三组分化培养基条件下培养第17天，Olig2、PDGFRα、NG2、和SOX10的阳性细胞率分别为83.41％、79.67％、78.5％和81.74％。第三组培养基中物质浓度较高，会使少突胶质前体细胞向少突胶质细胞转化，在一定程度上降低Olig2、PDGFRα、NG2、和SOX10的阳性细胞率。如图4所示，当细胞以上四种标记物的阳性率均高于90％时，该细胞具有较好的少突胶质前体细胞的生物活性，可进一步用作细胞制剂的活性成分或用于临床研究。
实施例5：少突胶质前体细胞的体外实验
1、Myelin Forming Medium(MFM)制备
配置含有终浓度为1％的CTS GlutaMAX，2％的CTS B27，10μM的2-巯基乙醇，1％的P/S以及终浓度为10μM的T3的CTS Neurobasal Medium。
2、将通过上述方法由斯普拉格-杜勒鼠或成年人骨髓制备的BMSC分化的少突胶质前体细胞和神经元在MFM中共培养15天时可检测到髓鞘碱性蛋白表达量明显增加。
实施例6：少突胶质前体细胞的体内实验
1、细胞注射缓冲液的制备(Cell Injection Buffer，CIB)
配置含有终浓度为20mM的D-葡萄糖，1％的P/S的无Ca2+苯酚溶液或无Mg2+的汉克平衡盐溶液(HBSS)溶液。
2、用CTS Tryple Select消化实施例4制备的少突胶质前体细胞，加入CIB终止消化，于200g条件下离心5min后用CIB重悬沉淀作为少突胶质前体细胞注射液。
3、动物实验
分别向shiverer模型鼠的中枢神经注射由人源骨髓分化的少突胶质前体细胞注射液和由斯普拉格-杜勒鼠骨髓分化的少突胶质前体细胞注射液，其中注射液浓度为4×104个细胞/ul；并且用不含有少突胶质前体细胞的CIB作为对照。
其中，shiverer模型鼠是中枢神经的髓鞘受损且寿命仅约90天的实验鼠，目前被广泛应用在髓鞘损伤研究中。
图5表明Shiverer模型鼠注射含少突胶质前体细胞注射液之日起12周，可在该模型鼠脑组织检测到大量髓鞘碱性蛋白(MBP)的阳性表达，说明少突胶质前体细胞有助于受损髓鞘的恢复，其中，少突胶质前体细胞由鼠源骨髓分化制备。
另外，图6表明少突胶质前体细胞将shiverer模型鼠的寿命平均延长至125天(最长达138天)，并且人源骨髓制备的少突胶质前体细胞和鼠源骨髓制备的少突胶质前体细胞一样，都可以延长模型鼠寿命，人源骨髓制备的少突胶质前体细胞注射至shiverer模型鼠后未发现明显的排斥反应。
以上实验结果证明，利用本发明的分化条件由骨髓间充质干细胞分化的少突胶质前体细胞具备治疗髓鞘损伤或其他和少突胶质细胞有关的神经系统的疾病的潜能；本发明提供的方法明显缩短了由骨髓间充质干细胞分化为少突胶质前体细胞的时间，且由于本发明所使用的培养基均采用无动物源成分配方，进一步促进了少突胶质前体细胞在临床的应用。
本发明实施例中细胞的鉴定和检测方法所使用的免疫荧光染色和流式细胞技术的实验方法和采用的相关试剂均为本领域技术人员在检测或鉴定相应细胞的采用的常规方法。
本发明实施例中披露的各种实验参数为发明人通过多次实验筛选出的可有效提高少突胶质前体细胞分化效率的实验参数，并不限定本发明的保护范围。在本发明的基础上对培养基成分、含量或实验条件诸如培养时间、离心力、离心时间、培养温度等所做的显而易见地改变、替换或者修改，均在本发明要求保护的范围之内。

Claims (10)

1.一种用于将神经干细胞分化为少突胶质前体细胞的培养基，其特征在于，所述培养基包括由Advanced DMEM/F12和Neurobasal medium混合而成的基础培养基，还包括终浓度为0.5～2.5％的GlutaMAX、1～5％的B27、0.5～2.5％的N2、2～25ng/ml的bFGF、2～25ng/ml的PDGF-AA、25～250ng/ml的β-HRG1、1～20μM的2-巯基乙醇以及1％的P/S。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基包括由Advanced DMEM/F12和Neurobasal medium以体积比为1:1混合而成的基础培养基，还包括终浓度为1％的GlutaMAX、2％的B27、1％N2、10ng/ml的bFGF、10ng/ml的PDGF-AA、100ng/ml的β-HRG1、10μM的2-巯基乙醇以及1％的P/S。
3.根据权利要求1～2任一项所述的培养基制备少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
配置如权利要求1所述的培养基；
用浓度为2.5～25μg/ml的PLO和2.5～25μg/ml的层粘连蛋白包被细胞培养容器后加入如权利要求1所述的培养基，并以1×104～5×104个细胞/cm2的密度将神经干细胞接种至所述细胞培养容器；
定期更换如权利要求1所述的培养基至所述培养基中出现少突胶质前体细胞。
4.根据权利要求3所述的制备少突胶质前体细胞的方法，其特征在于所述细胞培养容器为6孔板。
5.根据权利要求3所述的制备少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，神经干细胞以4×104个细胞/cm2的密度接种至所述细胞培养容器。
6.根据权利要求3所述的制备少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，所述神经干细胞的制备方法包括以下步骤：
配置包括含有终浓度为0.5％～2.5％的GlutaMAX、1％～5％的B27、10～60ng/ml的bFGF、10～60ng/ml的EGF、5～40ng/ml的IGF-1和1％的P/S的Advanced DMEM/F12培养基作为神经干细胞培养基；
用所述神经干细胞培养基非贴壁培养骨髓间充质干细胞，并以7500～20000个细胞/cm2的密度接种至非贴壁细胞培养容器中；
定期更换所述神经干细胞培养基，所述神经干细胞以神经球的形式存在于所述神经干细胞培养基中。
7.根据权利要求6所述的制备少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，所述神经干细胞的制备方法包括以下步骤：
配置包括含有终浓度为1％的GlutaMAX、2％的B27、40ng/ml的bFGF、40ng/ml的EGF、20ng/ml的IGF-1和1％的P/S的Advanced DMEM/F12培养基作为神经干细胞培养基；
用所述神经干细胞培养基非贴壁培养骨髓间充质干细胞，并以10000个细胞/cm2的密度接种至非贴壁细胞培养容器进行培养。
8.根据权利要求6所述的制备少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，所述神经球在100g～300g条件下离心5min与所述神经干细胞培养基分离。
9.根据权利要求6～8任一项所述的制备少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞由骨髓通过以下步骤制备而成：
以Stem Pro Medium培养所述骨髓，48h后移除培养基及未贴壁的细胞后继续培养；
培养基中出现骨髓间充质干细胞克隆时，以40000个细胞/cm2的接种密度接种至StemPro Medium进行传代培养，直至培养基中阳性表达CD45的细胞量小于1％。
10.根据权利要求9所述的制备少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，用于制备神经干细胞的骨髓间充质干细胞STRO-1,CD90和CD73阳性表达量大于90％，Nestin阳性表达量大于5％，并且CD45阳性表达量小于1％。
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US17/043,229 US20210355439A1 (en) 2018-06-01 2019-05-31 Differentiation medium and method for preparing oligodendrocyte precursor
KR1020207030627A KR102573180B1 (ko) 2018-06-01 2019-05-31 분화 배지 및 희소돌기아교세포 전구체를 제조하는 방법
EP19810230.3A EP3805374A4 (en) 2018-06-01 2019-05-31 DIFFERENTIATION MEDIUM AND OLIGODENDROCYTE PRECURSOR PREPARATION METHOD
PCT/CN2019/089625 WO2019228518A1 (zh) 2018-06-01 2019-05-31 一种分化培养基及少突胶质前体细胞的制备方法
JP2021517093A JP7114134B2 (ja) 2018-06-01 2019-05-31 分化用培地及びオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法

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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019228518A1 (zh) * 2018-06-01 2019-12-05 南京艾尔普再生医学科技有限公司 一种分化培养基及少突胶质前体细胞的制备方法
CN112725276A (zh) * 2021-01-14 2021-04-30 香港再生医学有限公司 提高msc分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法
CN113481161A (zh) * 2021-07-30 2021-10-08 四川省医学科学院·四川省人民医院 一种培养基及少突胶质祖细胞的诱导培养方法以及应用
CN113564122A (zh) * 2021-08-05 2021-10-29 呈诺再生医学科技(珠海横琴新区)有限公司 人诱导性多能干细胞向少突胶质细胞分化的方法，试剂盒以及应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115612667B (zh) * 2022-11-02 2023-09-08 广州瑞臻再生医学科技有限公司 一种诱导多能干细胞来源的前脑少突胶质细胞的制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080293056A1 (en) * 2007-04-18 2008-11-27 Riken Method for preparing cancer stem cells
CN101451123A (zh) * 2007-11-30 2009-06-10 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种诱导人骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化的方法
US20100159595A1 (en) * 2007-12-20 2010-06-24 Su-Chun Zhang Method of generating myelinating oligodendrocytes
CN102325878A (zh) * 2008-12-23 2012-01-18 斯特姆塞尔思加利福尼亚有限公司 少突胶质前体细胞的靶向细胞群及制备与使用方法
CN103484432A (zh) * 2013-09-30 2014-01-01 栾佐 一种诱导神经干/祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基及其诱导方法和用途
CN104774807A (zh) * 2015-04-28 2015-07-15 安沂华 将脐带间充质干细胞诱导分化成少突胶质细胞的方法
CN105925528A (zh) * 2016-05-20 2016-09-07 南通大学 源于骨髓神经嵴细胞的施旺氏祖细胞及其在促进神经再生中的应用

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR046076A1 (es) * 2003-07-18 2005-11-23 Otsuka Pharma Co Ltd Procedimiento para obtener una poblacion homogenea de celulas precursoras de oligodendrocitos y poblacion obtenida
US20100021434A1 (en) * 2005-12-08 2010-01-28 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Isolated Oligodendrocyte-Like Cells and Populations Comprising Same for the Treatment of CNS Diseases
US20080152630A1 (en) * 2006-12-07 2008-06-26 Irene Ginis Method of generation and expansion of tissue-progenitor cells and mature tissue cells from intact bone marrow or intact umbilical cord tissue
CN101245336A (zh) 2008-03-20 2008-08-20 万美蓉 脑脊液诱导自体骨髓干细胞分化为神经干细胞的方法
US20090304647A1 (en) 2008-05-30 2009-12-10 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Production of Neural Stem Cells from Bone Marrow Tissue and Use Thereof
KR101102483B1 (ko) 2008-08-12 2012-01-05 연세대학교 산학협력단 인간 신경줄기세포 및 이를 이용한 중추 또는 말초 신경계 질환 및 손상 치료용 약학적 조성물
WO2010030199A1 (en) * 2008-09-15 2010-03-18 Neurotrophincell Pty Limited Stem cell culture
ES2649396T3 (es) 2009-11-12 2018-01-11 Q Therapeutics, Inc. Métodos y composiciones para expandir, identificar, caracterizar y mejorar la potencia de células progenitoras restringidas gliales derivadas de mamíferos
JP2011121949A (ja) 2009-12-14 2011-06-23 Kyoto Univ 筋萎縮性側索硬化症の予防および治療用医薬組成物
EP2539440A4 (en) 2010-02-27 2014-01-15 Reza Izadpanah DERIVATION OF HEMATOPOIETIC CELLS FROM ADULT MESENCHYMAL STEM CELLS
JP5608927B2 (ja) 2010-04-13 2014-10-22 国立大学法人名古屋大学 歯髄幹細胞を用いた神経疾患治療用組成物
DK2663638T3 (da) * 2011-01-12 2019-07-08 Oligogen Inc Dyrkningsfremgangsmåde til opnåelse og opretholdelse af en ren eller beriget population af neurale pattedyrstamceller og/eller neurale progenitorceller, der in vitro er tilbøjelige til at differentiere ind i celler af oligodendrocytcellelinjen
EP2675893B1 (en) 2011-02-18 2019-01-09 The Scripps Research Institute Directed differentiation of oligodendrocyte precursor cells to a myelinating cell fate
JP2013017434A (ja) 2011-07-12 2013-01-31 Kanazawa Univ 神経細胞とグリア細胞を共培養する方法
KR101330649B1 (ko) * 2011-07-20 2013-11-15 연세대학교 산학협력단 전능성 줄기세포로부터 희소돌기아교전구세포의 제조 방법
JP6243675B2 (ja) 2012-09-20 2017-12-06 諭一郎 大西 オルファクトリースフィア細胞の生成・単離方法及び製造方法並びに該オルファクトリースフィア細胞を用いた脱随疾患治療剤及び末梢神経軸索再生増強剤の製造方法
JP6541577B2 (ja) 2013-02-06 2019-07-10 ユニバーシティー オブ ロチェスター ミエリン障害の治療のための誘導多能性細胞由来オリゴデンドロサイト前駆細胞
US20140271584A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Research Foundation For The State University Of New York Methods and Compositions for Direct Reprogramming of Somatic Cells to Stem Cells, and Uses of these Cells
JP6416206B2 (ja) 2013-04-10 2018-10-31 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 幹細胞培養のためのポリカプロラクトン・マイクロキャリアーおよびその製造
JP2015047140A (ja) 2013-09-03 2015-03-16 国立大学法人京都大学 移植後の生着能を有する神経細胞と固体３次元マトリックスとの複合体
KR101604436B1 (ko) * 2014-03-31 2016-03-18 한양대학교 산학협력단 인간 줄기세포 배양을 위한 인슐린 농도가 조절된 배지 및 이를 이용한 인간 줄기세포 배양 방법
CN104450618B (zh) 2014-05-12 2015-11-04 南通大学 一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法
DK3145517T3 (da) * 2014-05-22 2020-11-30 New York Stem Cell Found Inc Funktionelle oligodendrocytter afledt fra pluripotente stamceller og fremgangsmåder til fremstilling og anvendelse deraf
EP3149155B1 (en) * 2014-06-02 2020-09-23 Kadimastem Ltd. Methods of inducing myelination and maturation of oligodendrocytes
CN104073468B (zh) 2014-07-16 2016-04-27 栾佐 获得人源OPCs的方法和OPCs培养基
JP6844953B2 (ja) 2015-04-22 2021-03-17 公益財団法人東京都医学総合研究所 アルツハイマー病研究を標的にしたグリア細胞システム
WO2017187680A1 (ja) 2016-04-27 2017-11-02 株式会社ジェイテックコーポレーション 大量細胞培養システム及びそれに用いるベッセル間細胞液移送装置並びに回転細胞培養装置
CN107164325B (zh) * 2017-06-28 2019-09-17 北京再生生物科技研究院有限公司 MSCs来源的少突胶质细胞的制备方法及试剂盒
CN107365743B (zh) * 2017-08-23 2020-06-02 北京再生生物科技研究院有限公司 一种少突胶质前体细胞的培养方法
CN108624560B (zh) * 2018-06-01 2022-04-08 南京艾尔普再生医学科技有限公司 一种分化培养基及少突胶质前体细胞的制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080293056A1 (en) * 2007-04-18 2008-11-27 Riken Method for preparing cancer stem cells
CN101451123A (zh) * 2007-11-30 2009-06-10 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种诱导人骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化的方法
US20100159595A1 (en) * 2007-12-20 2010-06-24 Su-Chun Zhang Method of generating myelinating oligodendrocytes
CN102325878A (zh) * 2008-12-23 2012-01-18 斯特姆塞尔思加利福尼亚有限公司 少突胶质前体细胞的靶向细胞群及制备与使用方法
CN103484432A (zh) * 2013-09-30 2014-01-01 栾佐 一种诱导神经干/祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基及其诱导方法和用途
CN104774807A (zh) * 2015-04-28 2015-07-15 安沂华 将脐带间充质干细胞诱导分化成少突胶质细胞的方法
CN105925528A (zh) * 2016-05-20 2016-09-07 南通大学 源于骨髓神经嵴细胞的施旺氏祖细胞及其在促进神经再生中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIN YANG等: "Oligodendrocyte precursor cell transplantation promotes functional recovery following contusive spinal cord injury in rats and is associated with altered microRNA expression", 《MOLECULAR MEDICINE REPORTS》 *
SHUM, DKY等: "Towards remyelination therapy with oligodendrocyte precursor and Schwann cells derived from bone marrow stromal cells", 《THE 43RD ANNUAL MEETING OF THE SOCIETY FOR NEUROSCIENCE (SFN) – NEUROSCIENCE》 *
丁坦等: "不同浓度ＢＭＥ对大鼠胚胎脊髓神经干细胞增殖和分化的影响", 《第四军医大学学报》 *
陈婧等: "改良传代法获取大量高纯度大鼠少突胶质前体细胞", 《神经解剖学杂志》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019228518A1 (zh) * 2018-06-01 2019-12-05 南京艾尔普再生医学科技有限公司 一种分化培养基及少突胶质前体细胞的制备方法
CN112725276A (zh) * 2021-01-14 2021-04-30 香港再生医学有限公司 提高msc分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法
CN113481161A (zh) * 2021-07-30 2021-10-08 四川省医学科学院·四川省人民医院 一种培养基及少突胶质祖细胞的诱导培养方法以及应用
CN113564122A (zh) * 2021-08-05 2021-10-29 呈诺再生医学科技(珠海横琴新区)有限公司 人诱导性多能干细胞向少突胶质细胞分化的方法，试剂盒以及应用
CN113564122B (zh) * 2021-08-05 2022-04-08 呈诺再生医学科技(珠海横琴新区)有限公司 人诱导性多能干细胞向少突胶质细胞分化的方法，试剂盒以及应用

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