CN101353640A - 小鼠间充质干细胞的分离培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及小鼠间充质干细胞的分离和培养方法，不必另外增加促增殖因子的条件下，解决了当前干细胞治疗研究中的主要动物模型的间充质干细胞培养的难题，为干细胞的基础和临床研究提供了条件。

Description

小鼠间充质干细胞的分离培养方法

技术领域

本发明涉及间充质干细胞的分离培养方法。尤其是涉及小鼠的间充质干细胞培养方法。

背景技术

间充质干细胞除具有长期自我更新和多向分化的潜能，还有免疫原性低，被认为是细胞治疗和基因治疗的合适的细胞源。由于小鼠维持费用低及它的基因分析很清楚，故当前用于细胞治疗和基因治疗的动物模型一般是小鼠。

因间充质干细胞的贴壁的特性，在人、狒狒、兔、大鼠等其它动物的骨髓中都能成功分离出间充质干细胞，而小鼠间充质干细胞在分离培养中因非间充质细胞的污染使其远比人和其它物种难以分离，代传困难。在国内，暂无人系统详实的陈述小鼠间充质干细胞的分离方法。最近几年，虽有几篇文献介绍小鼠间充质干细胞的培养方法，但国内的研究机构并未成功的分离培养出来。

发明内容及具体实施方案

材料和推荐试剂：

·DMEM-LG                            ·有盖培养皿或小瓶子

·HEPES                              ·6-孔培养板

·FBS                                ·15ml离心管

·外科材料(适当大小的剪子，镊子等)   ·血细胞计数器

·带有22G针头的5ml注射器             ·0.3％台盼蓝(溶于PBS)

培养基

基础培养基是DMEM-LG含3.7g/l的碳酸氢钠各种0-15mM HEPES。完全培养基含10％FBS的基础培养基。

原代培养

步骤：

1.用颈椎脱臼法杀死小鼠

2.放入70％的酒精中3分钟左右，再转到操净台上

3.移去附着在股骨、胫骨上的连接组织(用无菌的剪刀和镊子)

4.用含有完全培养基的注射器将针头插入骨的一端并将另一头的骨端剪去，也可将两端剪去，冲洗骨髓到皿中

5.来回冲洗最多五次后，将骨弃去

6.转移细胞悬液到15ml的离心管中，离心300-400g，10分钟

7.在6ml的完全培养基中重悬细胞。

8.取少量与台盼蓝1∶1混合，用计数板计算细胞数

9.再离心收集细胞，以适当的完全培养基重悬细胞，使细胞的浓度为5×10⁶/ml

10.每孔加入3.5ml的细胞悬液并放入37℃，5％CO2的孵箱

11.种板72小时后，吸出全部旧培养液，加入3.5ml的新鲜培养液

12.在上述条件下，当细胞在第1周至第2周内有70-80％的汇合时，就可进行传代。

MSC的传代培养

材料和推荐试剂：

·含10mM HEPES(钠盐)且无Ca2+和Mg2+的PBS液

·胰蛋白酶-EDTA液(0.25％胰蛋白酶和0.01％EDTA).

1.为取得最好的效果，在37℃下，预热PBS

2.移去培养液，至少用1ml的PBS洗单(细胞)层两次

3.加50μl/cm²胰蛋白酶-EDTA，37℃孵育5-10分钟(第一到三传代)。从第四代起，消化时间约2分钟

4.用两倍体积的完全培养液再悬浮细胞，分装到两个新的培养瓶中(1:2传代)

5.当细胞汇合时，重复步骤1-4。到达汇合时，首次传代可能需要半个月

MSCs培养和传代的建议

·每3或4天更换培养液

·要避免因过多的基质造成细胞无效的分离，避免细胞汇合过度

·注意消化时间的掌握，不需要一定要将所有的细胞都消化下来

·这个实验步骤至少可应用于C57BL和mdx小鼠

附图说明：

1.图1第九代小鼠间充质干细胞的流式细胞结果；

2.图2小鼠间充质干细胞光镜图片(40×)；

3.图3小鼠间充质干细胞成骨图片(100×)；

4.图4小鼠间充质干细胞成脂图片(100×)。

第九代小鼠间充质干细胞的流式细胞结果(图1)、普通光镜(图2)及成骨(图3)及成脂(图4)。

Claims (1)

1. 一种分离培养小鼠间充质干细胞的方法，其特征是利用间充质干细胞的贴壁的特性，经过下述条件分离而成

   (1)骨髓有核细胞种板量约为2×10⁵cm²

   (2)原代胰蛋白酶消化时间需较长(10分钟)，第一代至四代约5分钟，此后消化时间1-2分钟

   (3)前四代细胞的汇合度约80％左右时就可消化，按1∶2来传代。四代后一般按1∶3来传代。

   (4)培养过程中，不必另外增加各种促增殖因子如bFGF等。

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