CN105792895A - 人间充质基质细胞的上皮细胞分化 - Google Patents

Abstract

本发明涉及以下发现：不同的干细胞类型(例如，骨髓源间充质干细胞(BM?MSC)和脂肪源间充质干细胞(AT?MSC))经历肺上皮标记物5表达的大的变化，这取决于它们在其上培养的基底。本发明包括用于将间充质干细胞——比如，骨髓和脂肪组织间充质干细胞——分化为肺细胞、肺细胞群的方法和组合物，以及减轻或治疗需要其的对象中的肺缺陷的方法。

Description

人间充质基质细胞的上皮细胞分化

相关申请的交叉引用

本申请依照35U.S.C.§119(E)要求于2013年8月16日提交的美国临时专利申请号61/866,570的优先权，其由此通过引用以其全部并入本文。

关于联邦政府资助的研究或研发的声明

本发明利用在由美国国立卫生研究院授予的GM086287、HL111016和HL098220下的政府支持完成。政府享有本发明中的某些权利。

发明技术

多个研究组已经描述了骨髓源细胞助于肺修复和再生的能力(Krause等，2001，Cell105：1-9；Rojas等，2005，Am J Respir Cell Mol Biol 33(2)：145-52；Kotton等，2001，Development 128(24)：5181-8；Wong等，2009，Cytotherapy 11：676-687)。有趣地，这些报道显示了骨髓的造血干细胞组分(HSC)以及间充质基质细胞(MSC)级分助于肺上皮。在许多这些研究中，骨髓源细胞助于肺上皮似乎需要肺损伤(Krause，2008，Proc Am Thorac Soc5：323-327)。特别感兴趣的是，人和啮齿动物骨髓MSC样细胞的亚群可以表达克拉拉细胞分泌蛋白(CCSP)——在肺中与克拉拉细胞相关联的标记物(Wong等，2009，Cytotherapy11：676-687)。这些研究者还发现，将鼠CCSP+骨髓细胞尾静脉施用入CCSP基因敲除小鼠导致在肺损伤后CCSP+细胞并入宿主肺中。

骨髓和脂肪组织源间充质基质细胞也已经显示具有免疫调节作用(DelaRosa等，2012，Stem Cells and Development 21：1333-1343；Rasmusson等，2003，Transplantation76：1208-1213)。这些包括当MSC在动物模型中体内递送时，缺少T细胞的活化，以及活化的淋巴细胞的减少(Rasmusson等，2003，Transplantation 76：1208-1213)。此外，MSC产生也已经表明在肺中具有抗炎作用的旁分泌信号(Lee等，2011，Stem Cells 29：913-919；Ortiz等，2003，PNAS 100：8408-8411)。从治疗的角度来看，支持经由直接助于肺上皮或者通过间接的旁分泌免疫调节机制在肺疾病的潜在治疗中使用MSC的证据是高度感兴趣的。

先前的工作已经将新生啮齿动物细胞用于生物工程大鼠的肺的再生(Petersen等，2010，Science 329：538-541)。这些实验表明使用去细胞肺作为引导供体细胞至解剖学上正确的位置的手段的可行性，以及再生器官所得到的功能性——虽然是短暂的。最近的报道还描述了使用放置入去细胞小鼠肺的鼠骨髓源MSC(Daly等，2012，Tissue Eng Part A 18：1-16)。此研究没有显示接种的鼠MSC对采取肺上皮结局(epithelial fate)的有意义贡献。使用灵长类源MSC和肺支架的另一项研究也没有发现在放置在灵长类去细胞肺上后MSC转化为肺上皮结局(Bonvillain等，2012，Tissue Eng Part A 18(23-24)：2437-52)。

因而，在本领域中存在用于间充质基质细胞的上皮细胞分化的组合物和方法的需要。本发明解决了本领域中未被满足的此需要。

发明内容

如下面所描述，本发明包括用于将间充质干细胞——比如骨髓和脂肪组织间充质干细胞——分化为肺细胞、肺细胞群的方法和组合物，以及减轻或治疗需要其的对象中的肺缺陷的方法。

本发明的一个方面包括将间充质干细胞(MSC)分化为肺细胞的方法，方法包括将MSC接种在基底上；并且使接种MSC的基底暴露于包括视黄酸和人表皮生长因子中的至少一种的生长培养基，从而将MSC分化为表达至少一种上皮细胞(epithelial)的肺细胞。

另一个方面包括调节间充质干细胞(MSC)分化为肺细胞的方法，方法包括在基底上培养MSC从而将MSC分化为肺细胞。

又另一个方面包括由间充质干细胞(MSC)分化的肺上皮细胞群，其中肺上皮细胞表达选自CCSP、前SPC(pro-SPC)和细胞角蛋白-5中的至少一种上皮标记物。

仍又另一个方面包括由将间充质干细胞(MSC)分化为肺细胞的方法产生的肺细胞群，方法包括在基底上培养MSC从而将MSC分化为肺细胞。

在本文描绘的本发明的以上方面和任何其它方面的多种实施方式中，MSC选自骨髓源MSC(BM-MSC)和脂肪组织源MSC(AT-MSC)。在一个实施方式中，肺细胞展示了II型肺泡上皮细胞的至少一种特性。在另一个实施方式中，II型肺泡上皮细胞的至少一种特性是表达选自前SPC和细胞角蛋白-5中的至少一种上皮标记物。在又另一个实施方式中，肺细胞展示了克拉拉细胞的至少一种特性。在还另一个实施方式中，克拉拉细胞的至少一种特性是表达克拉拉细胞分泌蛋白(CCSP)。

在一个实施方式中，肺上皮细胞接种在基底上。在另一个实施方式中，基底是去细胞肺组织。在又另一个实施方式中，基底是包括细胞外基质的包被。在还另一个实施方式中，细胞外基质包括人ECM、层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白IV和胶原蛋白I中的一种或多种。

在一个实施方式中，MSC选自骨髓源MSC(BM-MSC)和脂肪组织源MSC(AT-MSC)。在另一个实施方式中，肺上皮细胞选自I型肺泡上皮细胞、II型肺泡上皮细胞和克拉拉细胞。

在另一个实施方式中，MSC是骨髓源MSC(BM-MSC)，MSC分化为展示II型肺泡上皮细胞的至少一种特性的细胞。在又另一个实施方式中，II型肺泡上皮细胞的至少一种特性是表达选自前SPC和细胞角蛋白-5中的至少一种。

在另一个实施方式中，MSC是脂肪组织源MSC(AT-MSC)，MSC分化为展示克拉拉细胞的至少一种特性的细胞。在又另一个实施方式中，克拉拉细胞的至少一种特性是表达克拉拉细胞分泌蛋白(CCSP)。

在一个实施方式中，肺细胞群包括基因修饰的细胞。在另一个实施方式中，细胞被基因修饰以表达治疗基因。在又另一个实施方式中，基因修饰的细胞是基因修饰以表达治疗基因的肺上皮细胞。

另一个方面包括减轻或治疗哺乳动物中的肺缺陷的方法，方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的由间充质干细胞(MSC)分化的肺上皮细胞群，其中肺上皮细胞表达选自CCSP、前SPC和细胞角蛋白-5中的至少一种上皮标记物。

又另一个方面包括减轻或治疗哺乳动物中的肺缺陷的方法，方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的肺细胞群，所述肺细胞群由将间充质干细胞(MSC)分化为肺细胞的方法产生，其中方法包括在基底上培养MSC从而将MSC分化为肺细胞。

附图说明

当连同附图一起阅读时，将更好地理解下列本发明的优选实施方式的详细描述。出于图解本发明的目的，在附图中显示了当前优选的实施方式。然而，应当理解本发明不限于在附图中显示的实施方式的精确布置和手段。

图1，包括图1A至图1F，描绘了粘附(贴壁)的2次传代的hBM-MSC和hAT-MSC样品的FACS分析的结果，其指示细胞表达间充质基质细胞标记物和上皮的标记物。(图1A)2次传代的hBM-MSC的形态。(图1B)hBM-MSC对包括CD90、CD105和CD73的MSC标记物是阳性的，并且它们是CD45阴性的。(图1C)hBM-MSC的亚群表达上皮标记物——前SPC、CCSP和细胞角蛋白-5。(图1D)2次传代的hAT-MSC的形态。(图1E)hAT-MSC的FACS分析确认这些细胞对包括CD90、CD105和CD73的MSC标记物也是阳性的，并且它们是CD45阴性的。(图1F)hAT-MSC也包含对前SPC、CCSP和细胞角蛋白-5阳性的细胞群。显示了同种型对照和实验样品。

图2，包括图2A至图2F，描绘了调查接种有hBM-MSC的肺生物反应器培养物的实验的结果。(图2A、2B)DAPI染色用于揭示天然肺中的核(图2A)和在去细胞肺(图2B)中不存在核。(图2C)接种有hBM-MSC并在SAGM中培养7天的肺的H&E组织切片。(图2D)前SPC的免疫显色显示对2型肺细胞标记物阳性的许多细胞。(图2E、2F)不存在通过免疫染色对克拉拉细胞标记物——CCSP阳性的细胞(图2E)，而存在稀少的对细胞角蛋白-5阳性的细胞(图2F)。(图2G、2H)作为阳性识别hBM-MSC源细胞为2型肺细胞的另外的方法，进行TEM分析。天然2型细胞的TEM分析(图2E)(箭状物表示片层体；V形物(chevron)表示分泌小泡)。(图2F)重新接种有hBM-MSC的肺包含具有片层体(箭状物)和分泌小泡(箭头状物)二者的细胞，二者均是2型肺细胞的特性。

图3，包括图3A至图3D，描绘了实验的结果，其表明当在肺生物反应器中培养时，人脂肪间充质基质细胞(hAT-MSC)引起2型肺细胞样细胞，并且引起衬(line)在气道内的克拉拉样细胞。(图3A)在无细胞大鼠肺生物反应器中的SAGM中培养七天之后，hAT-MSC稳健地使肺基质重新恢复(repopulate)。H&E染色揭示了细胞栖居(inhabit)于气道的衬里(箭头)的具体亲和力。(图3B)衬在气道(箭头)内的细胞对克拉拉细胞标记物——CCSP是阳性的。(图3C)在基质上生长的细胞对前SPC是阳性的。插图显示了颗粒状的、细胞质染色的细胞，其对前SPC是阳性的。(图3D)没有迹象表明，当在去细胞基质上生长时，hAT-MSC维持细胞角蛋白-5表达。

图4，包括图4A至图4G，描绘了实验的结果，其表明接种有hBM-MSC或hAT-MSC的第3天和第7天的肺生物反应器培养物的RT-PCR分析。(图4A-C)随着时间增加，hBM-MSC已经增加末端上皮基因——包括SPC、水通道蛋白-1和窖蛋白-1——在肺生物反应器培养物中的基因表达水平。(图4D-F)类似地，利用更长的培养期，hAT-MSC增加末端基因的表达。肺生物反应器中细胞的倍数变化都与在组织培养瓶中生长的MSC进行比较。(图4G)用于扩增基因序列的引物。

图5，包括图5A至图5E，描绘了实验的结果，其表明在SAGM中生长的hAT-MSC和hBM-MSC活跃地产生表面活性物质。接种在无细胞大鼠肺上的hAT-MSC(图5A)和hBM-MSC(图5B)的RT-PCR分析表明随着培养时间SPC表达递增。在肺切片中在SAGM中培养7天的hAT-MSC(图5D)和hBM-MSC(图5E)在邻近肺切片的培养基中具有可视的表面活性物质液滴。(图5C)培养基样品的ELISA表明，在第3天时，5.5ng/mL的SPC存在于hAT-MSC肺切片培养物中，并且3.3ng/ml的SPC存在于hBM-MSC培养物中。在第7天时，SPC的浓度对于hAT-MSC较低为1.1ng/mL且对于hBM-MSC为0.26ng/mL。所有的ELISA值都相对于单独SAGM培养基标准化。柱代表S.E.M.。

图6，包括图6A至图6F，是一系列图像，其表明基底包被影响hBM-MSC和hAT-MSC中的上皮标记物表达。hBM-MSC和hAT-MSC在SAGM培养基中的多种ECM包被(人ECM、层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白IV和胶原蛋白I)上培养。培养7天后，通过FACS分析hBM-MSC(图6A)和hAT-MSC(图6B)的CCSP、前SPC和细胞角蛋白-5的表达。当在不同的表面包被上培养时，MSC的两种来源关于上皮标记物表达变化。(图6C、6D)在不同的表面包被上培养后，还进行CCSP、SPC和细胞角蛋白-5的表达的RT-PCR分析。RT-PCR数据与FACS分析良好地一致，并且指示与在其它表面包被上生长的MSC相比，SPC的最高表达见于人ECM中生长的MSC中。而且，根据这些实验，在人ECM上生长的hBM-MSC(图6E)和hAT-MSC(图6F)之间的细胞形态的差异也是明显的。

图7，包括图7A至图7F，描绘了实验的结果，其表明接种有hBM-MSC并在10％FBS/DMEM中生长的大鼠肺生物反应器培养物具有粘附细胞，所述粘附细胞具有成纤维细胞的形态学和蛋白质表达。(图7A)第7天时培养物的H&E组织学表明存在遍及再细胞化器官均匀地扩散的细胞。贴壁细胞在形态学上主要是成纤维细胞的。(图7B)α-sma——用于检测肌成纤维细胞的标记物——的免疫荧光揭示大多数细胞对于肌成纤维细胞标记物是阳性的。(图7C、7D)生长在10％FBS/DMEM或小气道生长培养基(small airway growthmedium)(SAGM)中的hBM-MSC的细胞离心涂片(cytospin)中的CCSP表达的免疫荧光分析。CCSP表达在任一条件中培养的细胞中维持。(图7E、7F)在任一培养基中生长的细胞中的α-sma表达的免疫荧光显示，当细胞在SAGM中生长时，α-sma几乎不存在。

图8，包括图8A至图8D，描绘了实验的结果，其表明在重新接种有hAT-MSC或hBM-MSC并在10％FBS/DMEM中培养的肺切片中不存在可视的表面活性分泌物。在10％FBS/DMEM中的肺切片上培养的(图8A)hAT-MSC和(图8B)hBM-MSC不包含在培养基中可视的表面活性物质。(图8C、8D)作为对照，也分析未接种的样品在培养基中的表面活性物质库(pool)，但是这些不包含任何可视的表面活性物质。

图9是在不同的ECM基底上在SAGM中，在组织培养瓶上生长7天的hBM-MSC的一组FACS图。

图10是在不同的ECM基底上在SAGM中，在组织培养瓶上生长7天的hAT-MSC的一组FACS图。

图11，包括图11A至图11I，描绘了实验的结果，其表明在去细胞肝基质上培养的hBM-MSC在形态学上不同于在肺上培养的那些。(图11A)去细胞肝的全样图像。(图11B)去细胞肝H&E组织学显示在基质上不存在残余的细胞。(图11C、11D)重新接种的肝切片在10％FBS/DMEM(图11C)或在SAGM(图11D)中培养3天。这些细胞和接种在肺上的那些(图3C)之间的形态学比较指示细胞形状的大的区别。在10％FBS/DMEM或在SAGM中生长的细胞对CCSP和细胞角蛋白-5是阴性的(图11E、11G、11H、11J)，而少数细胞对前SPC保持阳性(图11F、11I)。

图12是一组图，其显示完整的、未分级的人骨髓细胞作为肺上皮标记物的阴性染色对照。对未分级的人骨髓单核细胞进行肺上皮标记物——前SPC、CCSP和细胞角蛋白-5的染色。不存在具有阳性标记物表达的未分级细胞的指示。右边的阴影峰指示无抗体对照；左边的峰指示使用抗体培育的细胞。

具体实施方式

本发明基于以下发现：人骨髓和脂肪源间充质基质细胞(分别表示为hBM-MSC和hBM-MSC)经历肺上皮标记物表达的改变，这取决于在其上培养它们的基底(例如，去细胞肺组织或包含不同表面包被的培养平板)。

在一个实施方式中，当在去细胞肺组织上培养时，hBM-MSC附着于去细胞肺基质——特别地附着于远端肺区——并表达与2型肺细胞相关联的标记物(前SPC)，包含片层体，并且活跃地分泌表面活性蛋白C。hBM-MSC也分化为对细胞角蛋白-5阳性但是对其它肺关联标记物比如CCSP阴性的细胞。

在一个实施方式中，当在去细胞肺组织上培养时，hAT-MSC展示了2型肺细胞样细胞特性以及克拉拉样细胞特性。与hBM-MSC相比，hAT-MSC引起以解剖学上正确的位置衬在气道内的克拉拉样细胞(例如，对CCSP阳性)。此外，与hBM-MSC相比，hAT-MSC不引起细胞角蛋白-5阳性细胞。

因此，本发明基于以下发现：MSC向肺上皮表型分化的能力取决于基底、组织来源和培养基。

定义

除非另外限定，本文使用的所有的技术和科学术语通常具有与本发明所属的本领域普通技术人员一般理解的相同的含义。一般而言，本文使用的命名法和细胞培养、分子遗传学、有机化学以及核酸化学和杂交中的实验室程序是在本领域中众所周知和一般采用的那些。

冠词“一个(a)”和“一个(an)”在本文用于指一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例而言，“一个要素”意思是一个要素或多于一个要素。

本领域普通技术人员将理解术语“大约”，并且将基于其使用的语境在一定程度上变化。

术语“成体干细胞”或“ASC”用于指源自非胚胎组织——包括胎儿、幼年和成体组织——的任何多能干细胞。干细胞已经从各种成体组织分离，所述成体组织包括血、骨髓、脑、嗅上皮、皮肤、胰腺、骨骼肌、脂肪、心肌等。这些干细胞中的每一种可以基于培养中的基因表达、因子反应性(factor responsiveness)和形态学进行表征。示例性成体干细胞包括神经干细胞、神经嵴干细胞、间充质干细胞、造血干细胞和胰腺干细胞。如上面指示的，干细胞已经发现驻留在几乎每个组织中。因此，本发明理解可以从几乎任何动物组织分离干细胞群。

如本文使用的，“自体的”指源自相同个体的生物材料，材料稍后将被重新引入该个体。

如本文使用的，“同种异体的”指源自与材料将被引入的个体相同的物种的遗传学上不同的个体的生物材料。

如本文使用的，“减轻”疾病、缺陷、紊乱或病症意思是降低疾病、缺陷、紊乱或病症的一种或多种症状的严重度。

如本文使用的，术语“基础培养基”指氨基酸、维生素、盐和营养物的溶液，其对支持细胞在培养中生长是有效的，但是这些化合物正常地将不支持细胞生长，除非补充额外的化合物。营养物包括可被细胞代谢的碳源(例如，糖比如葡萄糖)，以及对于细胞的生存必需的其它化合物。由于缺少编码合成化合物所必需的蛋白质(一种或多种)(必需氨基酸)的一种或多种基因，这些是细胞自身不能合成的化合物，或者对于细胞可合成的化合物，因为它们特定的发育状态，编码必需生物合成蛋白的基因(一种或多种)没有表达为足够的水平。许多基础(base)培养基在哺乳动物细胞培养的领域中是已知的，比如Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、Knockout-DMEM(KO-DMEM)和DMEM/F12，但是可以采用支持处于基本上未分化状态的灵长类胚胎干细胞生长的任何基础培养基。

如本文使用的，“生物相容的”指当植入哺乳动物中时，不在哺乳动物中引起不良反应的任何材料。当引入个体时，生物相容性材料是无毒的或者对该个体无害的，而且其也不在哺乳动物中诱发材料的免疫排斥。

如本文使用的，术语“生物相容性网格(biocompatible lattice)”意思是指可以促进形成为有利于组织发育的三维结构的基底。因而，例如，细胞可以在这样的生物相容性网格上培养或接种至其上，比如包括细胞外基质材料、合成聚合物、细胞因子、生长因子等的一种生物相容性网格。网格可以被塑造为期望的形状，以促进组织类型的发育。而且，至少在细胞培养期间的早期，培养基和/或基底补充有促进适当的组织类型和结构发育的因子(例如，生长因子、细胞因子、细胞外基质材料等)。

如本文使用的，“生物活性剂”可以包括如下的一种或多种：趋化剂(chemotactic agent)；治疗剂(例如，抗生素、甾族或非甾族镇痛药和抗炎药(包括某些氨基酸比如甘氨酸)、抗排斥剂比如免疫抑制剂、和抗癌药)；多种蛋白质(例如，短肽(short term peptide)、骨形态发生蛋白、胶原蛋白、透明质酸、糖蛋白和脂蛋白)；细胞附着介质(cell attachment mediator)；生物学活性配体；整联蛋白结合序列；配体；多种生长和/或分化剂和其片段(例如，表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(例如，bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素衍生生长因子(例如，IGF-1、IGF-II)和转化生长因子(例如，TGFβI-III)、甲状旁腺素、甲状旁腺素相关肽、骨形态发生蛋白(例如，BMP-2、BMP-4；BMP-6；BMP-7；BMP-12；BMP-13；BMP-14)、音猬因子(sonic hedgehog)、生长分化因子(例如，GDF5、GDF6、GDF8)、重组人生长因子(例如，MP52和MP-52变体rhGDF-5)、软骨源形态发生蛋白(CDMP-1；CDMP-2、CDMP-3))；影响特定生长因子上调的小分子；生腱蛋白C；透明质酸；硫酸软骨素；纤连蛋白；饰胶蛋白聚糖；促凝血酶原激酶(thromboelastin)；凝血酶源肽；肝素结合域；肝素；硫酸乙酰肝素。合适的效应物同样包括上面描述的试剂的激动剂或拮抗剂。生长因子还可包括上面描述的生长因子的组合。此外，生长因子可以是由血中的血小板供应的自体生长因子。在此情况下，来自血小板的生长因子将是多种生长因子的未限定的混合物。如果其它这样的物质在矫形领域具有治疗价值，则预期这些物质中的至少一些将在本发明中具有用途，并且这样的物质应当包括在“一种生物活性剂”和“多种生物活性剂”的含义中，除非另外明确的限定。生物活性剂的优选的实例包括培养基、骨形态发生蛋白、生长因子、生长分化因子、重组人生长因子、软骨源形态发生蛋白、水凝胶、聚合物、抗生素、抗炎药物、免疫抑制药物(mediation)、自体、同种异体或异种异体细胞(比如干细胞、软骨细胞、成纤维细胞)、和蛋白质(比如胶原蛋白)、和透明质酸。生物活性剂可以是自体、同种异体的、异种异体的或重组体。

术语“生物学相容性载体”或“生物学相容性介质”指试剂、细胞、化合物、材料、组合物和/或剂型(dosage formulation)，其适合用于与人和动物的组织接触，而没有过多的毒性、刺激、过敏反应或其它并发症，与合理的效益/风险比相称。

术语“细胞”和“细胞群”可互换地使用，并且指多个细胞，即，多于一个细胞。群可以是包括一种细胞类型的纯种群。可选地，群可以包括多于一种细胞类型。在本发明中，没有对细胞群可以包括的细胞类型的数目进行限制。

如本文使用的，术语“细胞培养基”指用于培养细胞的培养基。细胞培养基的实例是包含DMEM/Ham′s F-12(DMEM/F 12Ham′s)、10％胎牛血清、100U青霉素/100μg链霉素/0.25μg两性霉素的培养基。通常，细胞培养基包括基础培养基、血清和抗生素/抗真菌剂。然而，可以使用不含抗生素/抗真菌剂且补充有至少一种生长因子的基质细胞培养基培养细胞。优选地，生长因子是人表皮生长因子(hEGF)。优选的hEGF的浓度是大约1-50ng/ml，更优选地，浓度是大约5ng/ml。优选的基础培养基是DMEM/F12(1∶1)。优选的血清是胎牛血清(FBS)，但是可以使用包括马血清或人血清的其它血清。优选地，多至20％FBS将添加至上面的培养基，以便支持基质细胞的生长。然而，如果FBS中细胞生长必需的生长因子、细胞因子和激素被确定，并且在生长培养基中以适当的浓度提供，则可以使用限定的培养基。进一步意识到，额外的组分可以添加至培养基。这样的组分包括但不限于抗生素、抗真菌剂、白蛋白、生长因子、氨基酸、和本领域已知用于细胞培养的其它组分。可以添加入培养基的抗生素包括但不限于青霉素和链霉素。培养基中青霉素的浓度是大约10至大约200单位/ml。培养基中链霉素的浓度是大约10至大约200μg/ml。然而，本发明绝不应当解释为限制于用于培养细胞的任何一种培养基。而是，可以使用能够在组织培养中支持细胞的任何培养基。

如本文使用的，术语“去细胞的”或“去细胞化”指生物结构(例如，器官或器官的一部分)，细胞和组织内容物已经从所述生物结构去除，留下完整的无细胞的基本结构。器官比如肾由多种特化组织组成。器官的特化组织结构或实质提供与器官相关联的具体功能。器官的支持性(supporting)纤维网络是基质。大多数器官具有由支持特化组织的未特化结缔组织组成的基质构架。去细胞化过程去除特化组织，留下结缔组织的复杂三维网络。结缔组织基本结构主要由胶原蛋白组成。去细胞结构提供了不同细胞群可以灌注至其上的生物相容性基底。去细胞生物结构可以是刚性的或半刚性的，具有改变它们形状的能力。用于本发明的去细胞器官的实例包括但不限于心、肺、肾、肝、胰腺、脾、膀胱、输尿管和尿道、软骨、骨、脑、脊髓、外周神经。

如本文使用的，术语“去分化”指使细胞返回至较不特化状态。在去分化之后，这样的细胞将具有分化为与重编程之前可能的相比更多的或不同的细胞类型的能力。逆分化(即，去分化)过程可能比分化更复杂并且需要“重编程”细胞以使其更原始。

术语“分化的细胞”意思是处于其天然形式不如本文限定的那个术语一样多能的任何初级细胞。换句话说，术语“分化的细胞”指在细胞分化过程中源自较不特化细胞类型的细胞(例如，干细胞比如诱导多能干细胞)的更特化细胞类型的细胞。不希望受限于理论，正常个体发育过程中的多能干细胞可以首先分化为能够形成肺细胞和其它内胚层细胞类型的内胚层细胞。内胚层细胞也可以分化为内胚层起源——比如，肺、肝、肠、胸腺等——的其它细胞。

“分化培养基”在本文用于指包括添加剂或缺少添加剂的细胞生长培养基，使得当在培养基中培育时，干细胞、胎儿肺细胞或其它这样的祖细胞——即，没有完全分化的——发育为具有分化细胞的一些或全部特性的细胞。

术语“胚胎干细胞”用于指胚胎胚泡的内细胞团的多能干细胞(参见美国专利号5,843,780、6,200,806)。这样的细胞可以类似地获得于源自体细胞核移植的胚泡的内细胞团(参见，例如，美国专利号5,945,577、5,994,619、6,235,970)。胚胎干细胞的区别特性限定了胚胎干细胞表型。因此，如果细胞具备胚胎干细胞的独特的特性中的一种或多种使得该细胞可以区分于其它细胞，则其具有胚胎干细胞的表型。示例性的区别胚胎干细胞特征包括但不限于基因表达概况、增殖能力、分化能力、核型、对特定培养条件的反应性等。

如本文使用的，“上皮细胞”意思是形成身体和线器官(line organ)的外表面、腔和粘膜表面的细胞。

如本文使用的，“内皮细胞”意思是衬在血管和淋巴管以及多种其它体腔内的细胞。

如本文使用的，“内源的”指来自生物体、细胞或系统的任何材料或在生物体、细胞或系统内产生的任何材料。

“外源的”指引入生物体、细胞或系统的任何材料或在生物体、细胞或系统外产生的任何材料。

“编码”指多核苷酸中的特定核苷酸序列——比如基因、cDNA或mRNA——作为模板的固有性质和由其产生的生物学性质，所述模板用于在生物学过程中合成具有限定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列的其它聚合物和大分子。因而，如果与基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物学系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。用作基因或cDNA转录的模板的编码链——其核苷酸序列同一于mRNA序列并且通常在序列表中提供——和非编码链可以被称为编码蛋白质或该基因或cDNA的其它产物。

如本文使用的，术语“内胚层细胞”指来自极早期胚胎中的三种初级生殖细胞层中的一种的细胞(其它两种生殖细胞层是中胚层和外胚层)。内胚层是这三层中的最内层。内胚层细胞分化以首先生成胚胎肠道，并且然后生成呼吸道和消化道(例如，肠)、肝和胰腺的衬里。

“可扩增性(expandability)”在本文用于指细胞增殖的能力，例如，在数目上扩增，或者在细胞群的情况下经历种群倍增。

如本文使用的，“细胞外基质组合物”包括可溶或不可溶级分或其任何部分。不可溶级分包括沉积在支持物或支架上的那些分泌的ECM蛋白和生物学组分。可溶级分包括细胞已经在其中培养且细胞已经向其中分泌活性剂(一种或多种)的培养基，并且包括未沉积在支架上的那些蛋白质和生物学组分。可以收集两种级分，并且任选地进一步处理，并且可以单独地或组合地在如本文描述的多种应用中使用。

与纤维组织形成为器官或组织的正常组成相反，“纤维化”是随着修复或反应过程在器官或组织中形成或发育过多的纤维结缔组织。肺纤维化是严重的慢性病，其特征在于损失弹性，并且肺上皮细胞被间质肌成纤维细胞替代，并且细胞外基质蛋白在肺间质组织中沉积，导致肺结构重构。

如本文使用的，“移植物”指植入个体以通常替代、修正或以其它方式克服缺陷的细胞、组织或器官。移植物可以进一步包括支架。组织或器官可以由源自相同个体的细胞组成；此移植物在本文称为以下可互换的术语：“自体移植物”、“自体移植体”、“自体植入物”和“自体的移植物”。包括来自相同物种的遗传学上不同的个体的细胞的移植物在本文称为以下可互换的术语：“同种异型移植物”、“同种异体移植体”、“同种异体植入物”和“同种异体移植物”。来自其同卵双生的个体的移植物在本文称为“同种移植物”、“同基因移植体”、“同基因植入物”或“同基因移植物”。“异源移植物”、“异基因移植体”或“异基因植入物”指从一个个体到不同物种的另一个个体的移植物。

如本文使用的，术语“生长因子产物”指对细胞具有生长、增殖、分化或营养作用的蛋白质、肽、分裂素或其它分子。生长因子包括但不限于成纤维细胞生长因子(FGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-I(IGF-T)、胰岛素样生长因子-II(IGF-II)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、激活蛋白A、骨形态发生蛋白(BMP)、胰岛素、生长激素、红细胞生成素、血小板生成素、白介素3(IL-3)、白介素6(IL-6)、白介素7(IL-7)、巨噬细胞集落刺激因子、c-kit配体/干细胞因子、护骨蛋白配体、胰岛素、神经生长因子、睫状神经营养因子、细胞因子、趋化因子、形态发生素、中和抗体、其它蛋白和小分子。优选地，FGF选自FGF2、FGF7、FGF10和其任意组合。

如本文使用的，术语“生长培养基”意思是指促进细胞生长的培养基。生长培养基将通常包含动物血清。在一些情况下，生长培养基可以不包含动物血清。

“分离细胞”指已经与在组织或哺乳动物中与该分离细胞天然相伴的其它组分和/或细胞分开的细胞。

“分离核酸”指已经与在天然发生状态中在其侧翼的序列分开的核酸区段或片段，即，DNA片段，其已经从正常地邻近该片段的序列——即，在其中其天然发生的基因组中邻近该片段的序列——移出。该术语也适用于已经从与核酸天然相伴的其它组分——即，RNA或DNA或蛋白质，其在细胞中与核酸天然相伴——基本上纯化的核酸。因此，该术语包括，例如，重组DNA，其已经并入载体、并入自主复制的质粒或病毒、或并入原核生物或真核生物的基因组DNA，或者其作为独立于其它序列的单独的分子(即，作为通过PCR或者限制性酶切产生的cDNA或基因组片段或cDNA片段)存在。它还包括重组DNA，其为编码额外的多肽序列的杂合基因的一部分。

术语“肺特异性的”指与体内其它组织相比在肺中主要地表达的核酸分子或多肽。在优选的实施方式中，“肺特异性”核酸分子或多肽以比体内任何其它组织高5倍的水平表达。在更优选的实施方式中，“肺特异性”核酸分子或多肽以比体内任何其它组织高10倍，更优选地至少15倍、20倍、25倍、50倍、或100倍的水平表达。核酸分子水平可以通过核酸杂交——比如RNA印迹杂交或定量PCR——测量。多肽水平可以通过任何已知精确地测量蛋白质水平的方法比如蛋白质印迹分析进行测量。

“肺组织”可以包括但不限于所有肺组织结构和相关联的组织，其包括但不限于静脉、动脉、脉管、毛细血管，和这样的结构的一部分或与这样的结构相关联的类型的细胞；肺和胸膜组织；和血管平滑肌、周皮细胞、和血管内皮谱系和/或表型。

术语“前体细胞”、“祖细胞”和“干细胞”在本领域中可互换地使用，并且如本文使用的，指多能细胞或谱系未定型(lineage uncommitted)祖细胞，其潜在地具有不限数目的有丝分裂的能力以自我更新或产生将分化为期望的细胞类型的子代细胞。与多能干细胞相比，谱系定型祖细胞通常认为不能够产生表型上彼此不同的众多细胞类型。相反，祖细胞产生一种或可能两种谱系定型的细胞类型。

“增殖”在本文用于指类似形式——尤其是细胞——的繁殖或倍增。即，增殖包含产生更多数目的细胞，并且还可以通过简单地对细胞的数目进行计数、测量并入细胞的³H-胸苷以及其他方面等来测量。

“细胞周期的进展或通过细胞周期的进展”在本文用于指以下过程：通过其细胞为有丝分裂和/或减数分裂做准备、和/或进入有丝分裂和/或减数分裂。通过细胞周期的进展包括通过G1期、S期、G2期和M期的进展。

如本文使用的，“支架”指提供适合于细胞粘附和增殖的表面的结构，其包括生物相容性材料。支架可以进一步提供机械稳定性和支持。支架可以为具体的形状或形式，从而影响或界定由增殖细胞的种群呈现的三维形状或形式。这样的形状或形式包括但不限于膜(例如，二维明显大于第三维的形式)、带、索、片、平盘、圆柱、球、三维无定形形状等。

如本文使用的，短语“小气道生长培养基”或“SAGM”指包括一种或多种以下组分的生长培养基：皮质醇、表皮生长因子、肾上腺素、运铁蛋白(transferring)、胰岛素、视黄酸、三碘甲腺原氨酸和无脂肪酸牛血清白蛋白。

如本文使用的，短语“干细胞”均指在组织中或体内负责生成细胞团的最早的可再生的细胞群和极早期的祖细胞，其是稍微较多分化的，但未定型并可以容易地恢复以变为最早的可再生的细胞群的一部分。

如本文使用的，“基本上纯化的”细胞是实质上不含其它细胞类型的细胞。因此，基本上纯化的细胞指已经从其它细胞类型——该细胞在其天然发生状态正常地与其相关联——纯化的细胞。

如本文使用的，术语“对象”和“患者”可互换地使用。如本文使用的，对象优选地是哺乳动物比如非灵长类(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)和灵长类(例如，猴和人)，最优选地是人。

如本文使用的，“治疗”意思是降低患者经历的疾病、缺陷、紊乱或不利状况等的频率。

如本文使用的，“治疗有效量”是足以向施用组合物的个体提供有益效果的本发明的组合物的量。

如本文使用的，“组织工程”指离体生成组织用于组织置换或重建的过程。组织工程是“再生医学”的实例，其包含通过将基因或其它生物学构件并入细胞，连同生物工程材料和技术来修复或置换组织和器官的途径。

如本文使用的，术语“组织移植”和“组织重建”均指将移植物注入个体以治疗或减轻组织缺陷，比如肺缺陷或软组织缺陷。

“移植体”指待移植的生物相容性网格或供体组织、器官或细胞。移植体的实例可包括但不限于皮肤细胞或组织、骨髓、和实体器官比如心、胰腺、肾、肺和肝。

一般而言，“营养因子”限定为促进细胞的生存、生长、增殖和/或成熟，或刺激细胞增加的活性的物质。

范围：遍及本公开内容，本发明的多个方面可以以范围格式呈现。应当理解的是，范围格式的描述仅仅是为了便利和简洁，并且不应当解释为对本发明的范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应当认为已经具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，范围比如从1至6的描述应当认为已经具体地公开了子范围比如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，其都适用。

描述

本发明涉及以下发现：不同的干细胞类型(例如，骨髓源间充质干细胞(BM-MSC)和脂肪源间充质干细胞(AT-MSC))经历肺上皮标记物表达的大的变化，这取决于在它们在其上培养的基底。基底的实例包括但不限于去细胞肺组织和包含不同表面包被的培养平板。去细胞肺组织的教导可见于美国专利申请公开号20120064050，其内容由此通过引用并入。

在一个实施方式中，当放置在去细胞肺上时，BM-MSC能够表达2型肺细胞标记物前SPC以及近端气道标记物细胞角蛋白-5。在一个实施方式中，当在合适的条件下扩增和培养时，BM-MSC可以呈现II型肺泡上皮细胞(也称为2型肺细胞)的表型。在另一个实施方式中，当在合适的条件下扩增和培养时，BM-MSC展示了与在天然2型细胞内包含的功能类似的功能相关联的细胞质结构。

在另一个实施方式中，AT-MSC产生前SPC阳性细胞。在另一个实施方式中，当在合适的条件下扩增和培养时，AT-MSC产生衬在气道的解剖学上正确的位置的克拉拉样细胞(例如，对CCSP阳性)。这与BM-MSC形成对比，BM-MSC不维持CCSP的表达也不粘附至气道。在另一个实施方式中，与BM-MSC相比，AT-MSC不产生细胞角蛋白-5阳性细胞。

因此，本发明提供了生成期望细胞类型的组合物和方法。因此，本发明的细胞充当有希望的细胞来源，以在治疗上用于治疗末端肺疾病(distal lung disease)、肺损伤和影响肺的遗传疾病。

本发明提供了将BM-MSC分化为展示2型肺细胞标记物前SPC以及近端气道标记物细胞角蛋白-5的细胞的方法。在一个实施方式中，本发明提供了分化BM-MSC以展示II型肺泡上皮细胞的至少一种表型的方法。在另一个实施方式中，本发明提供了分化BM-MSC以展示与在天然2型细胞内包含的功能类似的功能相关联的细胞质结构的方法。

因此，本发明提供了用于引导BM-MSC分化为与II型肺泡上皮细胞相关联的细胞类型和组织的方法。

本发明提供了将AT-MSC分化为展示2型肺细胞标记物前SPC但不产生细胞角蛋白-5阳性细胞的细胞的方法。在一个实施方式中，本发明提供了将AT-MSC分化为对CCSP——克拉拉细胞的标记物阳性的细胞的方法。在另一个实施方式中，本发明提供了分化AT-MSC以产生衬在气道的解剖学上正确的位置的克拉拉细胞(例如，对CCSP阳性)的方法。

因此，本发明提供了引导AT-MSC分化为与克拉拉细胞相关联的细胞类型和组织的方法。

培养条件

本发明涉及使用任何细胞分化为肺细胞类型(例如，II型肺泡上皮细胞或克拉拉细胞)。优选地，合适的一种或多种细胞是再生的。再生细胞的实例包括但不限于干细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、脐带血细胞、组织源干细胞或祖细胞、骨髓源干细胞或祖细胞、血源干细胞或祖细胞、脂肪源干细胞或祖细胞、间充质干细胞(MSC)、骨骼肌源细胞、多能成体祖细胞(MAPC)、胎儿肺细胞、分化的肺上皮细胞、肺祖细胞、血管祖细胞、分化的血管细胞等。可以使用的其它再生细胞包括骨髓源干细胞比如骨髓单核细胞(BM-MNC)、内皮或血管干细胞或祖细胞、和外周血源干细胞比如内皮祖细胞(EPC)。

优选地，从哺乳动物分离，更优选地从灵长类，并且还更优选地从人分离合适的细胞。使用本文讨论的方法——例如，在实施例部分中——或者通过本领域中已知的任何方法分离用于本发明的方法的细胞。分离之后，在培养基中培养合适的细胞。

培养基组合物通常包括必需氨基酸、盐、维生素、矿物质、微量金属、糖、脂质和核苷。细胞培养基试图供应必需的组分以满足细胞在受控的、人造的和体外环境中生长需要的营养需求。营养物配方、pH和摩尔渗透压浓度根据参数——比如所采用的细胞类型、细胞密度和培养系统——改变。许多细胞培养基配方记录在文献中，并且许多培养基是商业可得的。

一旦培养基培育有细胞，其被本领域技术人员已知为“条件培养基”。条件培养基包含培养基的许多原始组分，以及许多细胞代谢物和分泌蛋白，例如，其包括生物学活性的生长因子、炎症介质和其它细胞外蛋白。

本领域技术人员将认识到，可以为合适的细胞改良培养条件。支持MSC生长的培养基配方包括但不限于Eagle极限必需培养基、ADC-1、LPM(不含牛血清白蛋白)、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI 1640、BGJ培养基(进行或不进行Fitton-Jackson改良)、Eagle基础培养基(BME-添加Earle盐基)、Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM-不含血清)、Yamane、IMEM-20、Glasgow改良Eagle培养基(GMEM)、LeibovitzL-15培养基、McCoy 5A培养基、M199培养基(M199E-含有Earle盐基)、Medium培养基(M199H-含有Hank盐基)、Eagle极限必需培养基(MEM-E-含有Earle盐基)、Eagle极限必需培养基(MEM-H-含有Hank盐基)和Eagle极限必需培养基(含有非必需氨基酸的MEM-NAA)等。

用于本发明的方法的培养基的额外的非限制性实例可以包含至少1％至大约30％，优选地至少5％至15％，更优选地大约10％的浓度的牛或其它物种的胎儿血清。牛或其它物种的胚胎提取物可以以大约1％至30％，优选地至少大约5％至15％，更优选地大约10％的浓度存在。

通常，培养基包括基础培养基、血清和抗生素/抗真菌剂。一种优选的基础培养基是DMEM/F12(1∶1)。优选的血清是胎牛血清(FBS)，但是可以使用其它血清，包括马血清或人血清。优选地，多至20％FBS将添加至上面的培养基，以便支持MSC的生长。然而，如果FBS中的用于MSC生长的必需生长因子、细胞因子和激素被确定并且在生长培养基中以适当的浓度提供，则可以使用限定的培养基。进一步认识到，额外的组分可以添加至培养基。这样的组分包括但不限于抗生素、抗真菌剂、白蛋白、生长因子、氨基酸、和本领域已知用于细胞培养的其它组分。可以添加入培养基的抗生素包括但不限于青霉素和链霉素。培养基中青霉素的浓度是大约10至大约200单位/ml。培养基中链霉素的浓度是大约10至大约200μg/ml。然而，本发明绝不应当解释为限制于用于培养NPC的任何一种培养基。而是，可以使用在组织培养中能够支持肺细胞的任何培养基。

经常用于培养基配方的其它成分包括脂溶性维生素(包括A、D、E和K)、类固醇与其衍生物、胆固醇、脂肪酸和脂质吐温80、2-巯基乙醇嘧啶(pyramidine)以及多种补充物，包括血清(胎儿、马、牛等)、蛋白质(胰岛素、运铁蛋白、生长因子、激素等)、抗生素(庆大霉素、青霉素、链霉素、两性霉素B等)、全卵超滤液(whole egg ultra filtrate)、和附着因子(纤连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、腱糖蛋白等)。

培养基可以需要或可以不需要补充有生长因子和其它蛋白质比如附着因子，因为许多细胞构建体，尤其是在本申请中描述的三维细胞和组织培养构建体自身合成这样的生长与附着因子和其它产物进入培养基。

可溶因子指在干细胞的培养基中释放和存在的因子。可溶因子的实例包括但不限于血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素生长因子(IGF)、肝细胞生长因子(HGF)、角质细胞生长因子(KGF)和成纤维细胞生长因子家族的其它成员。

分离之后，在将细胞传代至另一个培养装置前，MSC可以在培养装置中的培养基中培育一段时间或直到细胞达到汇合。在最初的平板接种之后，细胞可以在培养基中维持大约6天的时期以得到0传代(P0)种群。细胞可以传代无限数目次数，每一次传代包括培养细胞6-7天，在该时间期间细胞倍增时间可以在大约3天到大约5天之间的范围内。培养装置可以是在体外培养细胞中常用的任何培养装置。

本文描述的MSC可以根据常规程序冷冻保存。优选地，大约一百万至一千万个细胞在包含10％DMSO的培养基中在气相的液N₂中冷冻保存。冷冻细胞可以通过在37℃浴中涡旋解冻，重新悬浮在新鲜生长培养基中，并且如上面描述的进行扩增。

本发明还提供了“接种”支架的细胞。MSC可以在支架上培养。细胞还可以通过在分化培养基中培养细胞而体外分化。可选地，当细胞与哺乳动物内的组织建立接触或当细胞足够接近由从组织释放的物质(例如，生长因子、酶或激素)影响的组织时，细胞可以在体内分化。换句话说，基质的MSC可以凭借从组织接收信号与组织比如肺建立接触。例如，当MSC的表面上的受体或起源于MSC的细胞的表面上的受体结合并转导来自分子——比如由哺乳动物内的组织释放的生长因子、酶或激素——的信号时，这样的信号传导(signaling)将发生。这些试剂引导分化，使得MSC开始表达一些和可能大部分(如果不是全部)的正常地由分化细胞表达的相同的蛋白质，所述分化细胞已经放置在所述组织中。

可选地或此外地，可以通过将物质(例如，生长因子、酶、激素或其它信号传导分子)添加至细胞环境来诱导基质的MSC分化。例如，物质可以添加至本发明的生物学支架。

在另一个实施方式中，本发明提供了在表面上(例如，二维的或三维的)存在ECM蛋白的情况下，在合适的生长培养基中培养本发明的细胞的方法。在一个实施方式中，ECM被包被在培养装置的表面上。

在另一个实施方式中，本发明包括组织培养系统。在多个方面，培养系统由本文描述的ECM组合物——比如包括在二维或三维支持材料中——组成。在另一个方面，本文描述的ECM组合物充当用于多种细胞类型的生长的支持物或二维或三维支持物。例如，培养系统可用于支持本发明的细胞的生长。在一个方面，培养系统可用于支持细胞的分化。

ECM已知由某些细胞分泌，并且主要由纤维状蛋白质、多糖和其它微量成分组成。其组成包括结构单元比如胶原蛋白和弹性蛋白，粘附蛋白比如糖蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、血小板反应蛋白I和腱糖蛋白、以及蛋白聚糖比如饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、硫酸软骨素和硫酸肝素，和粘多糖(GAG)比如透明质酸(HA)。

在一个实施方式中，ECM组合物可以包括以下任何或全部：纤连蛋白、原纤蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白家族的成员(例如，胶原蛋白I、III、和IV)、粘多糖、基质、网状纤维和血小板反应蛋白。优选地，人ECM用于培养定形内胚层。在一个实施方式中，人ECM包括胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、腱生蛋白、弹性蛋白和许多蛋白聚糖与粘多糖。

在另一个实施方式中，在固相支持物上培养细胞是期望的，所述固相支持物包括再构造的基膜，其中该膜可以通过自合适的细胞组织提取或制备来获得，所述细胞组织包含在体内细胞层下方存在的薄膜状细胞外基质中，并且包含蛋白质和糖蛋白比如层粘连蛋白、胶原蛋白IV和肝素硫酸盐蛋白聚糖以及多种细胞生长因子和活化因子等。

在一个实施方式中，占优势的主要细胞外基质组分是纤维状胶原蛋白，具体地是I型胶原蛋白。但是，其它纤维状和非纤维状胶原蛋白包括II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII、XIX型胶原蛋白等。

本发明的ECM组合物可以以许多方式加工。因此，在一个实施方式中，本发明包括组织培养系统。在多个方面，培养系统由本文描述的ECM组合物组成。本发明的ECM组合物可以以多种方式并入组织培养系统。例如，组合物可以通过浸渍如本文描述的三维支架材料而作为包被并入，或者作为培养基中的添加剂用于培养细胞。因此，在一个方面，培养系统可以包括浸渍有本文描述的ECM组合物中的任何——比如生长因子或胚胎蛋白——的三维支持材料。

虽然MSC和相关联的细胞基质最终可以变得完全分化，并且虽然其在一些情况下(例如，在细胞用于再造组织学上成熟和完整的组织的情况下)是期望的，但是不是所有施用的细胞需要完全分化以实现成功的治疗；细胞基质的MSC仅需要分化至足以治疗哺乳动物的点。该点可以在向患者施用基质之前或之后达到。

当基质的细胞表达与植入位点处的成熟细胞实质上相同的表型时，分化发生。例如，出于限定本发明的目的，当已经植入肺的细胞基质的MSC表达与由肺——例如，肺泡上皮细胞——表达的实质上相同的蛋白质时，其是分化的。肺标记物的抗体是商业可得的或者以其它方式容易得到的。

分化细胞也可以通过它们的大体形态和通过它们与其它细胞形成的连接来识别。例如，分化为肺细胞的细胞可以发育出复杂的形态学相似的细支气管。例如，本发明基于以下新的发现：不同的MSC类型(例如，骨髓源间充质干细胞(BM-MSC)和脂肪源间充质干细胞(AT-MSC))经历肺上皮标记物表达的大的变化，这取决于它们在其上培养的培养条件，包括基底或支架。例如，BM-MSC分化为与II型肺泡上皮细胞相关联的细胞类型和组织。而AT-MSC分化为与克拉拉细胞相关联的细胞类型和组织。

为了生成器官或组织，引入脱分化器官内和其上的细胞的数目取决于器官(例如，哪个器官、器官的大小和重量)或组织和再生细胞的类型与发育阶段。不同类型的细胞可以关于那些细胞将达到的种群密度具有不同趋势。类似地，不同的器官或组织可以在不同的密度下细胞化。举例而言，去细胞器官或组织可以接种至少大约1,000(例如，至少10,000、100,000、1,000,000、10,000,000或100,000,000)个再生细胞；或者可以具有附着至其的大约1,000个细胞/mg组织(湿重，即，去细胞化之前)至大约10,000,000个细胞/mg组织(湿重)。

可以通过注入一个或多个位置将细胞引入去细胞器官或组织。此外，多于一种细胞类型(即，细胞的混合物)可以引入去细胞器官或组织。例如，细胞的混合物可以在去细胞器官或组织中的多个位置处注入，或者不同的细胞类型可以注入去细胞器官或组织的不同部分。可选地或除注入外，再生细胞或细胞的混合物还可以通过灌注入插管的去细胞器官或组织来引入。例如，可以使用灌流介质将细胞灌注入去细胞组织，所述灌流介质然后可以变化为扩增和/或分化培养基以诱导再生细胞的生长和/或分化。在肺组织的情况下，细胞可以经由气管引入气道腔隙(airway compartment)，或者经由肺动脉或静脉引入血管腔隙，或者引入二者。

在再细胞化期间，器官或组织在一些条件下维持，在所述条件下至少一些再生细胞可以在去细胞组织或器官内或上倍增和/或分化。那些条件包括但不限于合适的温度和/或压力、电和/或机械活动、力、适当量的O₂和/或CO₂、适当量的湿度、和无菌或接近无菌的条件。在再细胞化期间，去细胞器官或组织和附着至其的细胞在合适的环境中维持。例如，细胞可以需要营养补充物(例如，营养物和/或碳源比如葡萄糖)、外源激素或生长因子、和/或特定的pH。

细胞可以是与去细胞器官或组织同种异体的(例如，接种人细胞的人去细胞组织或器官)，或者再生细胞可以是与去细胞器官或组织异基因的(例如，接种人细胞的猪去细胞器官或组织)。

在一些情况下，通过本文描述的方法生成的器官或组织将移植入患者。在那些情况下，用于使去细胞器官或组织再细胞化的细胞可以自患者获取，以便再生细胞是与患者自体的。例如，来自患者的细胞可以使用本领域中已知的方法从生命的不同阶段(例如，产前、新生或临产、青春期或作为成年)的血、骨髓、组织或器官获取。可选地，用于使去细胞器官或组织再细胞化的细胞可以是与患者同基因的(即，来自同卵双生)，细胞可以是来自例如患者的亲属或者与患者不相关的HLA匹配的个体的人淋巴细胞抗原(HLA)匹配细胞，或者细胞可以是与患者同种异体的，来自例如非HLA匹配供体。

不考虑细胞的来源(例如，自体的或非自体的)，去细胞实体器官可以是与患者自体的、同种异体的或异基因的。

在某些情况下，去细胞组织可以利用细胞在体内再细胞化(例如，在组织已经移植入个体后)。体内再细胞化可以利用例如本文描述的任何细胞如上面描述的进行(例如，注射和/或灌注)。可选地或额外地，利用内源细胞体内接种去细胞器官或组织可以天然地发生或者通过递送至再细胞化组织的因子介导。

治疗

本发明提供了使用本发明的细胞治疗多种肺疾病和病症的组合物和方法。在一些情况下，细胞包括基因修饰的细胞。

本发明还可以包括通过施用本发明的细胞治疗一种或多种肺疾病或病症。在本发明的优选的实施方式中，组合物可以气管内施用。在本发明的最优选的实施方式中，气管内施用包括使肺组织——例如肺泡——接触或暴露于本发明的细胞。

本发明的组合物和方法可以用于治疗或抑制任何肺疾病或病症，其中使一个或多个肺组织与包括本发明的细胞的组合物接触可以是期望的。如本文使用的，疾病或病症指导致肺功能或构造的病理性变化的任何疾病或病症。示例性疾病或病症包括但不限于支气管肺发育异常(BPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺气肿、囊泡性纤维症(CF)、肺发育不良、肺动脉高血压和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。

本发明的组合物和方法可以用于治疗由任何疾病或病症引起的肺泡损伤。示例性疾病或病症包括但不限于支气管肺发育异常(BPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肺气肿和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。

本发明的组合物和方法可以用于治疗或预防任何氧诱发的肺损伤、疾病或病症。示例性疾病或病症包括但不限于支气管肺发育异常(BPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、囊泡性纤维症(CF)、肺发育不良、肺动脉高血压和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。

在基因治疗的背景下，细胞可以利用感兴趣的基因治疗，然后将细胞递送至受体。在一些情况下，这样的基于细胞的基因递送与基因递送至肺的其它方式——比如吸入腺病毒基因递送载体——相比可以存在显著的优势。基于细胞的基因递送至宿主的这种优越性来自以下观察：吸入的基因递送载体通常导致低效率的细胞转导，这是由于由粘液层和宿主免疫系统施加的屏障。递送已经预插入细胞的治疗基因避免了与将基因治疗载体穿透入受体肺细胞相关联的问题。

因此，本发明提供了已经根据本发明的方法培养的基因修饰细胞的用途。例如，基因修饰可以导致外源基因(转基因)的表达或者外源基因表达的改变。这样的基因修饰可以具有治疗益处。可选地，基因修饰可以例如在将本发明的组合物植入个体后，提供追踪或识别如此修饰的细胞的手段。追踪细胞可以包括追踪移植的基因修饰细胞的迁移、同化和生存。基因修饰还可以包括至少第二基因。例如，第二基因可以编码可选择的抗生素-抗性基因或另一种可选择的标记物。

用于追踪细胞的蛋白质包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、任何其它荧光蛋白(例如，增强绿色、青色、黄色、蓝色和红色荧光蛋白；Clontech，Palo Alto，CA)、或其它标签蛋白(例如，LacZ、FLAG-标签、Myc、His₆等)。

当细胞的基因修饰的目的是为了产生生物学活性物质时，该物质将通常是用于治疗给定紊乱的一种物质。例如，基因修饰细胞使得它们分泌与骨或软组织形成相关联的某一生长因子产物可以是期望的。诱导与组织修复相关的其它内源细胞类型的生长的生长因子产物也是有用的。例如，刺激内源毛细血管和/或微血管内皮细胞的生长因子可以用于修复软组织缺陷尤其是较大体积的缺陷。

本发明的细胞可以通过将外源基因材料引入细胞而被基因修饰以产生分子比如营养因子、生长因子、细胞因子等，其对于培养细胞是有益的。此外，通过使细胞基因修饰以产生这样的分子，当植入需要其的哺乳动物中时，细胞可以向哺乳动物提供额外的治疗效果。例如，基因修饰细胞可以分泌对邻近哺乳动物中的移植体位点的细胞有益的分子。

肺细胞可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行基因修饰。参见，例如，Sambrook等(2012，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York)和Ausubel等编辑(1997，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，NY)。例如，肺细胞可以暴露于包括含有转基因的核酸的表达载体，使得核酸在转基因适合于在细胞内表达的条件下引入细胞。转基因通常是表达盒，包括可操作地连接至合适的启动子的多核苷酸。多核苷酸可以编码蛋白质，或者其可以编码生物学活性RNA(例如，反义RNA或核酶)。因而，例如，多核苷酸可以编码赋予对毒素、激素(比如，肽生长激素、激素释放因子、性激素、促肾上腺皮质激素、细胞因子(例如，干扰素、白介素、淋巴因子)等)、细胞-表面-结合细胞内信号传导部分(例如，细胞粘附分子、激素受体等)、促进给定谱系的分化的因子(例如，骨形态发生蛋白(BMP))等的抗性的基因。

在表达盒内，编码多肽可操作地连接至合适的启动子。合适的启动子的实例包括原核启动子和病毒启动子(例如，逆转录病毒ITR、LTR、即时早期病毒启动子(IEp)比如孢疹病毒Iep(例如，ICP4-Iep和ICP0-IEEp)、巨细胞病毒(CMV)Iep、和其它病毒启动子比如劳斯氏肉瘤病毒(RSV)启动子、和鼠白血病病毒(MLV)启动子)。其它合适的启动子是真核启动子，比如增强子(例如，兔子β-球蛋白调控元件)、组成型活性启动子(例如，β-肌动蛋白启动子等)、信号特异性启动子(例如，诱导型启动子比如响应于RU486的启动子等)和组织特异性启动子。选择适合于在预定的细胞环境中驱动基因表达的启动子对于本领域技术人员而言是熟知的。表达盒可以包括多于一种编码多核苷酸，并且其可以根据需要包括其它元件(例如，聚腺苷酸化序列、编码膜插入信号的序列或分泌前导序列、核糖体进入序列、转录调控元件(例如，增强子、沉默子等)等)。

包含转基因的表达盒应当并入适合于将转基因递送至细胞的基因载体。根据期望的最终应用，可以如此采用任何这样的载体以基因修饰细胞(例如，质粒、裸DNA、病毒——比如腺病毒、腺相关病毒、孢疹病毒、慢病毒、乳头状瘤病毒、逆转录病毒等)。可以采用在这样的载体内构建期望的表达盒的任何方法，其中许多在本领域中是熟知的(例如，直接克隆、同源重组等)。载体的选择将大大地决定用于将载体引入细胞的方法(例如，通过原生质体融合、磷酸钙沉淀、基因枪、电穿孔、DEAE葡聚糖或脂质载体介导的转染、病毒载体感染等)，其是本领域中公知的。

足以通过体外扩增方法指导本领域技术人员的技术的实例——包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、和其它DNA或RNA聚合酶介导的技术——见于Sambrook等(2012，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York)中。

一旦蛋白质的核酸被克隆，本领域技术人员可以在多个肺细胞中表达重组基因(一种或多种)。预计本领域技术人员在可用于表达期望的转基因的许多表达系统中是有见识的。

肺细胞

可以使用一种或多种分化剂诱导分化，所述分化剂包括但不限于Ca²⁺、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、转化生长因子(TGF)、细胞因子(比如白介素、干扰素或肿瘤坏死因子)、视黄酸、运铁蛋白、激素(例如，雄激素、雌激素、胰岛素、催乳素、三碘甲状腺氨酸、皮质醇或地塞米松)、丁酸钠、TPA、DMSO、NMF(N-甲基甲酰胺)、DMF(二甲基甲酰胺)、或基质元件(比如，胶原蛋白、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素)。

在一个实施方式中，可以诱导MSC分化为具有肺表型的细胞。例如，可以诱导MSC分化为II型肺泡细胞，其也已知为II型肺细胞。在另一个实施方式中，可以诱导MSC分化为克拉拉细胞。

可以使用包含以下物质的培养基：一种或多种垂体提取物(例如，牛垂体提取物)、类固醇激素(例如，皮质醇或其盐比如醋酸盐)、生长因子(例如，表皮生长因子，优选地是人表皮生长因子)、儿茶酚胺(例如，外消旋或对映体形式的肾上腺素)、铁结合蛋白(例如，运铁蛋白)、胰岛素、维生素(例如，视黄酸)、甲状腺激素(例如，三碘甲状腺氨酸)、血清白蛋白(例如，包括重组制剂的牛或人血清白蛋白)、抗生素(例如，氨基苷类抗生素，比如庆大霉素)、和/或抗真菌剂(例如两性霉素B)。例如，培养基可以包含皮质醇、表皮生长因子、胰岛素、三碘甲状腺氨酸、运铁蛋白和牛血清白蛋白，并且在一些实施方式中，可以进一步包含视黄酸、垂体提取物和肾上腺素。来自Cambrex的SAGM^TM培养基(目录CC-3118)具体有用于使MSC分化为期望的肺细胞。

本发明人通过使用适当的分化因子和培养条件已经能够获得纯的肺细胞群。在一个实施方式中，肺细胞是末端肺细胞类型，优选地是肺泡类型细胞，更优选地是I型或II型肺泡类型细胞。在一个实施方式中，肺细胞是克拉拉细胞。

在一些实施方式中，本发明的方法有效地诱导MSC直接分化为肺泡II型细胞。在一些实施方式中，方法产生足够纯的肺泡II型细胞群(例如，至少95％的肺泡II型表型)。

在一些实施方式中，本发明的方法有效地诱导MSC直接分化为克拉拉细胞。在一些实施方式中，该方法产生足够纯的克拉拉细胞群(例如，至少95％克拉拉细胞表型)。

分化为肺细胞(例如，肺泡II型细胞)可以，例如，通过由光学显微镜评估的肺形态和由透射电子显微镜评估的片层体和微多孔状体的存在确定。片层体是充当肺表面活性物质——表面活性蛋白C(SPC)的储存形式的分泌溶酶体，其是仅在肺泡II型细胞中表达的膜内在蛋白。SPC mRNA的存在可以通过逆转录酶PCR检测，并且SPC蛋白的存在可以通过免疫荧光染色检测。克拉拉细胞分化可以通过检测CCSP的存在评估。

实验实施例

参照下面的实验实施例进一步详细描述本发明。这些实施例仅出于说明的目的提供，并且不意欲是限制性的，除非另外说明。因而，本发明绝不应当解释为限制于以下实施例，而是应当解释为包含由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化。

无需进一步的描述，使用在前的描述和下面的说明性实施例，相信本领域普通技术人员可以制造并利用本发明的化合物，并且实践要求保护的方法。因此，以下操作实施例具体地指出了本发明的优选的实施方式，并且不解释为以任何方式限制本公开内容的其余方面。

实施例1：当在去细胞肺支架中培养时，人间充质基质细胞的上皮细胞分化根据组织的起 源变化

在本文呈现的实验中，在大鼠去细胞肺基质上培养之后，评估人源BM-MSC以及AT-MSC促进肺上皮细胞的潜能。已经发现hBM-MSC和hAT-MSC在接种至肺支架上之后能够附着和生长。在小气道生长培养基(SAGM)中的去细胞大鼠肺支架中培养7天之后，hBM-MSC在RNA和蛋白水平下表达2型肺细胞标记物——前SPC，分泌表面活性物质进入培养基，并且包含如由投射电子显微镜(TEM)显示的片层体。额外地，在大鼠生物反应器中培养后，hBM-MSC细胞引起对近端气道标记物——细胞角蛋白-5阳性的细胞。相反，hAT-MSC引起衬在气道的解剖学上正确位置的前SPC阳性细胞以及克拉拉样细胞。然而，与hBM-MSC不同，在肺生物反应器中培养之后，hAT-MSC不引起细胞角蛋白-5阳性细胞。

间充质基质细胞的分化中的基底基质组合物的影响也通过将hBM-MSC和hAT-MSC接种至包被有人ECM、基质胶(Matrigel)、层粘连蛋白、胶原蛋白1、胶原蛋白4和纤连蛋白的组织培养皿上进行探索。本文证明了当在标准组织培养瓶中生长时，基质表面包被影响表达肺上皮标记物的MSC的百分比。额外地，hBM-MSC在去细胞肝上培养，并且显示接种至肝切片上的MSC不维持当这些在肺基质上培养时存在的相同系列(suite)的上皮标记物。这些数据表明去细胞肺支架保持“邮政编码(zip-code)”以引导细胞分化。当前的数据表明，当放置在去细胞肺上时，人源hBM-MSC和hAT-MSC可以引起多种肺上皮细胞类型。

现在描述在这些研究中采用的材料和方法。

人骨髓和脂肪组织间充质基质细胞的分离和表征

新鲜的、未处理的人骨髓样品获得自Lonza，Allendale，NJ，USA(分类号1M-125)。获得总计三个供体样品——年龄在22-29之间的两名女性和一名男性。将骨髓细胞以5×10⁵个细胞/cm²的密度平板接种在包含10％FBS的高糖DMEM中。每二至三天更换培养基。在实验中仅使用低传代(≤5)细胞。每7-10天以1∶3的比率传代细胞。细胞通过流式细胞仪(BDLSR II)表征CD90、CD105、CD73、CD45的表达(所有抗体获得自eBiosciences)。

AT-MSC获得自年龄在44-63的范围内的三名供体。脂肪抽吸物(lipoaspirate)用DPBS洗涤2次，然后用0.15％的1型胶原蛋白酶(Gibco，Grand Island，NY，USA，分类号17100-017)在DMEM中在37℃下消化60分钟。通过添加10％FBS/DMEM停止消化，然后在10％FBS/DMEM中离心和重悬，并且通过100μm过滤器过滤。每2-3天对细胞补料。

FACS

单细胞用2％多聚甲醛溶液固定10分钟，并且在PBS中洗涤2次每次5分钟。细胞用包含感兴趣的稀释抗体的10％FBS、0.2％Triton X-100培育。利用以下抗体(所有都来自eBiosciences，San Diego，CA，USA)在冰上黑暗中培育细胞25分钟：CD45-PE(12-9459-41)、CD90-FITC(11-0909-41)、CD73-PE(12-0739-41)、CD105-APC(17-1057-41)。使用的额外的抗体是：前SPC 1/100(Millipore，Billerica，MA，USA：ab 3786)和CCSP 1/100(Millipore07-623)。这些抗体的二次抗体(secondary)是全物种适合的以1/500稀释的Invitrogen AlexaFluors。使用的同种型对照包括抗小鼠IgG-PE(eBiosciences 12-4714)、抗小鼠IgG-FITC(ebiosciences 11-4724)、抗小鼠IgGAPC(ebiosciences 17-4015-80)、兔IgG-FITC(ebiosciences11-4614-80)和纯化的兔IgG(Invitrogen 02-6102)。除了同种型对照之外，仅二次抗体对照平行试验。

大鼠肺样品的去细胞化和重新接种

如先前描述的，去细胞化成年Sprague Dawley大鼠肺(3和5月龄之间)(Petersen等，2010，Science 329：538-541)。简略地，IP注射戊巴比妥钠(Euthasol)将大鼠安乐死。切除大鼠肺，并且对气管和肺动脉进行插管。通过重力灌注肝素(50U/ml)和硝普酸钠(1μg/ml)的10ml混合物通过肺动脉。使用500ml的pH 12的去细胞化溶液在37℃下在20mmHg的恒压下滴注肺动脉，所述去细胞化溶液由PBS中的8mM CHAPS、25mM EDTA、1M NaCl组成。然后经由气道使用10ml的核酸酶灌注肺并且在37℃下培育1小时。细胞残留物用2.5L的PBS洗去。在抗生素和抗真菌剂(1％庆大霉素，4mg/ml两性霉素，10％青霉素/链霉素)的混合物中培育肺至少16小时，然后接种细胞。在此培育期间，溶液通过肺动脉以1mL/min灌注。在接种细胞之前，抗生素/抗真菌剂溶液从肺中去除并替换为PBS。在细胞接种前，用PBS灌注肺持续另外的30分钟。细胞接种为2.5×10⁶至10×10⁶个细胞之间的团块，通过气管进入单个去细胞大鼠右上肺叶。经由肺动脉以1ml/min灌注培养基，培养物在SAGM(Lonza，Allendale，NJ；分类号CC-3118)中维持7天。每2-3天更换培养基。

免疫组织化学

利用10％福尔马林溶液通过气道滴注肺，并且在恒定振动的情况下在室温下置于10％福尔马林中4小时。将肺包埋在石蜡中，并以5微米切片。切片在标准的再水化乙醇/二甲苯系列之后去石蜡。通过在75℃下利用Tris-EDTA缓冲液(10mM Tris碱，1mM EDTA，pH 9.0的0.05％吐温-20)培育再水化的组织切片20分钟来进行抗原修复。然后使组织切片在室温下冷却另外的20分钟。在PBS中洗涤切片一次，然后进行免疫染色。切片在封闭试剂(PBS中10％NGS或FBS，0.2％Triton X-100)培育45分钟。一次抗体(CCSP 1/50：Millipore分类号07-623；前SPC 1/100：Millipore：#ab 3786；窖蛋白-1 1/100：Abcam，Cambridge，UK#39541；α平滑肌肌动蛋白1/100：Dako，Glostrup，Denmark分类号M0851)在室温下培育2小时，或在4℃下过夜。切片在PBS中洗涤3次，每次3分钟，然后利用二级抗体(以1/500稀释的来自Invitrogen Alexa Fluor系列的全物种特异性二次抗体)在室温下培育45分钟。组织切片封固在包含DAPI的Vector labs Vectashield封固剂(Vector cat.，Olean，NY#H1200)中。

利用Zeiss荧光显微镜对处理的切片成像，并且用Volocity软件获取图像。利用LeicaTCS SP5获取共聚焦显微镜图像。

实时定量RT-PCR

使用来自Qiagen的RNeasy Mini Kit根据制造商的说明从细胞提取总RNA。利用随机六聚体作为引物，使用SuperScript First-Strand Synthesis System根据制造商的方案(Invitrogen)合成第一链互补DNA(cDNA)。产物的等体积混合物用作用于PCR扩增的模板。反应在具有iQ^TM SYBR Green Supermix(Bio-Rad，Hercules，NY)和使用iCyler和iQ软件(Bio-Rad)显示的每个200nM的正向和反应引物的25μl体积中进行。每个样品一式三份进行。PCR条件包括95℃下4min的预变性步骤，接着是由95℃下15s、60℃下30s和72℃下30s组成的40个PCR循环。来自感兴趣基因(GOI)的三次PCR反应的平均阈值循环(Ct)值相对来自相同cDNA样品的GAPDH的平均Ct值标准化。样品A和样品B之间的GOI转录水平的倍数变化等于2^-ΔΔCt，其中ΔCt＝Ct_(GOI)-Ct_(GAPDH)，并且ΔΔCt＝ΔCt_(A)-ΔCt_(B)。使用的引物列举在本文的其它地方。

统计分析

利用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)进行所有统计分析。数据表达为平均值±s.e.m.(测量的标准误差)。进行T检验以评估两组是否彼此显著地不同，并且p≤0.05视为统计学上显著的。

TEM

依据来自Schmiedl等2005的改进方案(Schmiedl等，2005，Histochem Cell Biol 124(6)：465-76)。天然大鼠肺和再细胞化肺在37℃下利用2.5％戊二醛/2.0％多聚甲醛的0.2M二甲胂酸钠溶液膨胀固定30分钟，然后在4℃培育2小时。固定的组织用0.1M二甲胂酸钠漂洗。组织在1％OsO₄中进行2小时的后固定(post-fix)，然后在整体(en-block)乙酸双氧铀中染色。组织在标准的乙醇系列中脱水并且包埋在EPON中。获得切片(70nm)并利用乙酸双氧铀和柠檬酸铅后染色(post-stain)。利用Philips Tecnai透射电子显微镜获得图像。

用于细胞培养的基质蛋白的包被

hBM-MSC和hAT-MSC在不同的细胞外蛋白质上培养7天，所述细胞外蛋白质包括纤连蛋白(50μg/ml)、胶原蛋白I(100μg/ml)、胶原蛋白IV(50μg/ml)、基质胶(1∶80)和人ECM蛋白质(1∶100)的混合物(由胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、腱生蛋白、弹性蛋白、和许多蛋白聚糖与粘多糖；Sigma)。纤连蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV和层粘连蛋白是肺基质的主要组分。

SPC的酶联免疫吸附测定(ELISA)分析

根据制造商(Life Science Advanced Technology)的说明，在细胞培养基——收集自在大鼠无细胞肺支架上培养的hBM-MSC和hAT-MSC的上清液——上进行ELISA以定量分泌的SPC。SPC值相对细胞的总数目标准化，并且仅实验样品的值从新鲜SAGM培养基减去。

现在描述实验的结果。

从骨髓和脂肪组织分离的MSC的表征

hBM-MSC获得自新鲜分离的骨髓样品(图1A-1C)。将未分级骨髓放置在组织培养瓶上，并且针对典型的MSC的分化标记物的簇，对得到的贴壁细胞进行免疫分型。早期传代hBM-MSC——2至4次传代之间——对CD90、CD105和CD73是大于93％阳性的，而对于CD45是主要地阴性的(图1B)。由于先前的工作已经显示了培养的MSC样细胞的子级分可以表达上皮标记物(Wong等，2009，J Clin Invest 119(2)：336-48)，因此也测定细胞的上皮标记物——包括CCSP、前SPC和细胞角蛋白-5(图1C)——的表达。FACS分析揭示了在10％FBS/DMEM中标准培养之后，hBM-MSC表达上皮标记物。通过FACS分析(图1C)，本文呈现的数据表明hBM-MSC是对于CCSP(80％)、前SPC(63％)和细胞角蛋白-5(77％)阳性的。作为这些实验的阴性对照，通过FACS分析全部未分级骨髓单核细胞，并且这些一致地是对于肺上皮标记物评估阴性的(图12)。

hAT-MSC分离自新鲜获得的脂肪抽吸物(图1D-1F)。细胞经由胶原酶1组织消化分离，并且放置在组织培养瓶上。这些细胞维持在10％FBS/DMEM培养基中用于扩增。hAT-MSC的免疫分型确认它们的身份为CD90+/CD105+/CD73+和CD45-(图1E)。与hBM-MSC类似，hAT-MSC通过FACS对不同的上皮标记物是免疫阳性的(图1F)。有趣地，在hAT-MSC和hBM-MSC之间，表达的上皮标记物的细胞的总量存在区别。与hBM-MSC种群相比，大约一半种群的hAT-MSC对CCSP是阳性的(44％)；hAT-MSC也对前SPC(51％)和细胞角蛋白-5(91％)是阳性的(图1F)。

在肺生物反应器中利用MSC再生大鼠无细胞基质

重新接种至大鼠肺无细胞基质上的hBM-MSC

为了了解脂肪或骨髓源MSC是否能够再细胞化大鼠无细胞基质，和这些细胞是否能够在放置于无细胞基质上后呈现上皮表型，在先前描述的生物模拟的大鼠肺生物反应器系统(Petersen等，2010，Science 329：538-541)中培养MSC。在将MSC接种至去细胞肺支架之前，观察到天然和去细胞肺基质的H&E组织学和DAPI染色。这些分析确认去细胞肺缺乏残余的天然肺细胞(图2A-B)。

将在2至4次传代之间培养的hBM-MSC经由气道以2.5-10×10⁶个细胞之间的密度接种入去细胞大鼠肺的单个右上叶。将这些细胞作为团块注射入气管。并且在小气道生长培养基(SAGM)中在肺生物反应器中培养7天。在中试实验后，选择SAGM为潜在地合适的培养基用于培养再细胞化肺，所述中试实验利用10％FBS/DMEM，其产生在形态学上一致地成纤维细胞状的细胞，而且在培养一周之后，几乎所有细胞表达α-sma——成纤维细胞的标记物(图7)。选择SAGM作为促进肺上皮分化的优良候选，这是因为其包含的视黄酸和人表皮生长因子已经显示促进多能细胞的增殖和上皮分化(Rackley&Stripp，2012，JClin Invest 122：2724-2730；Lenssen&Stolk，2007Int J Chron Obstruct Pulmon Dis.2(2)：131-139)。进行体外中试实验，其中MSC在含有SAGM培养基的组织培养瓶中或在10％FBS/DMEM中生长。这些实验表明，在SAGM中生长的MSC缺乏对α-sma阳性的细胞，而该细胞维持CCSP表达至相似的水平(图7C-7F)。

作为体外实验的结果，SAGM用于试图控制表达α-sma的细胞的量，并且转而促进肺上皮分化。然而，在将hBM-MSC接种入无细胞肺之前，细胞维持在10％FBS/DMEM培养基中以促进稳健的生长。

当与在肺生物反应器中的10％FBS/DMEM中生长的细胞相比时，在SAGM中培养7天的重新接种hBM-MSC的肺的H&E染色表明了贴壁细胞的更加立方形的外观(图2C和图7)。与体外培养一致，α-sma的免疫染色在hBM-MSC再细胞化的啮齿动物肺中几乎完全不存在。肺上皮标记物的另外的染色确定了65-70％之间的贴壁细胞表达前SPC、2型肺细胞标记物(图2D)。由气道的基础上皮细胞表达的标记物——细胞角蛋白-5也存在于贴壁细胞的亚群中(图2F)。有趣地，在肺生物反应器中培养后，不存在对CCSP阳性的细胞，即使通过免疫染色和FACS，hBM-MSC的起始种群表达CCSP(图2E；图1C)。贴壁细胞对基细胞的标记物P63和窖蛋白-1——1型肺细胞的标记物——也是阴性的。

为了赢得对源自hBM-MSC的前SPC阳性细胞的可能的功能和完全分化状态的深刻理解，寻求利用透射电子显微镜鉴定2型肺细胞片层体以及由这些细胞分泌的表面活性小泡(图2H)。经由透射电子显微镜鉴定天然肺2型肺细胞的片层体是阳性鉴定2型细胞的时常使用的方法(Schmiedl等，2005，Histochem Cell Biol 124(6)：465-76)。片层体的存在也可以是这些细胞内的功能的指示(Kassmer&Krause，2010，Experimental Hematology38：564-573)。片层体充当在2型细胞内包含的分泌性表面活性物质和脂质的贮藏室。人和大鼠2型肺细胞二者的特征在于存在片层体。作为阳性对照，研究天然大鼠肺的2型肺细胞内的片层体的存在(图2B，蓝色箭头)。这些片层体长大约500nm，并且其特征在于在由同轴螺环形成的结构中的电子致密地(electron-dense)沉积物。额外地，天然2型肺细胞的另一个特性是存在分泌小泡(图2G，白色箭头)。

也对仅接种有hBM-MSC——无其它细胞类型——并培养7天的肺去细胞支架测定粘附细胞中片层体以及分泌血管的存在(图2H)。这些hBM-MSC源细胞具有充足的电子致密的片层体，以及许多分泌小炮(在图2H中分别为箭状物和V形物)。形态学上地，天然的大鼠2型肺细胞非常类似于已经在肺基质上在生物反应器内且在SAGM的存在下培养7天的hBM-MSC。共同地，这些数据表明hBM-MSC不仅表达在蛋白质水平下与2型肺细胞相关联的标记物，而且具有与某一功能相关联的细胞质结构，所述功能与天然2型细胞内包含的功能相似。因此，当前的数据表明，当在合适的条件下扩增并培养时，hBM-MSC可以呈现II型肺泡上皮细胞的表型。

重新接种至大鼠肺无细胞基质上的hAT-MSC

为了测定hAT-MSC植入至去细胞肺上的能力，将2.5-10×10⁶个细胞作为团块接种入去细胞啮齿动物右上肺叶，并且在与hBM-MSC相同的条件下在SAGM培养基中培养7天。接种的肺的H&E组织学制备表明与不在气道中附着的hBM-MSC不同，hAT-MSC能够遍及基质附着，但是具有附着和重新恢复气道的特定亲和力(图3A-B)。免疫染色揭示附着至气道的细胞对CCSP——克拉拉细胞的标记物是阳性的。这与hBM-MSC形成对比，hBM-MSC在肺基质上培养之后不维持CCSP的表达，同时这些细胞也不粘附至气道。

在肺生物反应器中培养的hAT-MSC对2型肺细胞标记物前SPC也是阳性的。前SPC的免疫荧光揭示了细胞具有该标记物的清晰地、点状的细胞质染色(插图3C)。培养之后的hAT-MSC和hBM-MSC之间的另一区别是，通过免疫荧光hAT-MSC不产生细胞角蛋白-5阳性的细胞，而hBM-MSC产生(图3D和2H)。这些数据表明，就它们使肺无细胞基质重新恢复的能力而言，源自不同的组织来源的MSC之间存在本质的区别。

肺生物反应器培养之后的肺泡上皮基因表达

多种末端肺上皮标记物的基因表达也在hBM-MSC和hAT-MSC再细胞化的肺中评估。实时qRT-PCR用于测定表面活性蛋白C(II型)、窖蛋白-1和水通道蛋白5(AQP5，I型)的表达(图4)。

表面活性蛋白C(SPC)广泛地用作II型肺细胞以及早期肺组细胞的标记物。RT-PCR揭示了当比较第3天和第7天时的生物反应器培养时，hBM-MSC再细胞化的肺中的SPC表达增加，以使MSC在瓶中生长(图4A)。这些结果表明，第3天和第7天时存在的SPC转录本的量分别递增23和93倍(图4A)。

在接种hAT-MSC的肺支架中观察到类似的SPC表达模式。当与在瓶中生长的hAT-MSC相比时，SPC的表达从第3天(36×)至第7天(137×)增加。当与hBM-MSC再细胞化的肺相比时，hAT-MSC再细胞化的肺的SPC基因表达的增加更多。

额外地，在接种hBM-MSC和AT-MSC的大鼠肺支架中评估包括窖蛋白-1和AQP5的两种特异性肺泡I型标记物的表达。当与在组织培养瓶上生长的MSC相比时，如在第3天和第7天时评估的，窖蛋白-1和AQP5二者的基因表达在肺生物反应器培养中随时间增加(图4B-F)。虽然这两种1型细胞标记物的表达在培养中随时间增加，但是无法检测到基于1型标记物——窖蛋白-1或水通道蛋白5的免疫染色的蛋白质表达。

总的来说，qRT-PCR揭示了SPC、窖蛋白-1和AQP5的基因表达水平在具有接种hBM-MSC和hAT-MSC的肺细胞支架的生物反应器中随时间增加。然而，如通过免疫染色显示的蛋白质表达表明了在这些基因中，在肺支架上7天之后，在hBM-MSC和AT-MSC中仅可以检测到前SPC，而不可检测到1型标记物的表达。虽然不希望受限于任何具体理论，但是此明显矛盾很可能由蛋白质水平对使用免疫染色可检测的信号不够强来解释，而qRT-PCR的灵敏度使我们有能力从接种在肺支架上的细胞中检测到少量的mRNA表达。

源自hBM-MSC和hAT-MSC的2型肺细胞的功能

为了测定接种在去细胞肺支架上的MSC是否提供对器官的功能性改善，评估了是否存在由在去细胞支架上生长的细胞分泌入培养基的活性表面活性物质(图5)。hBM-MSC以2×10⁶个细胞的密度接种入右上去细胞肺叶，并使其附着至基质2小时，然后将肺叶切成两半，并且将碎片放置在包含SAGM的6孔培养平板中。将如此接种的肺切片培养3或7天，并且在这些时间点处收集培养基。RT-PCR表明单独与去细胞肺支架相比时，第3天和第7天之间的SPC基因表达增加(图5A、5B)。活性培养物的亮场显微镜检查揭示了大多数靠近肺碎片集中的可视层的油状液滴(图5D、5E)。作为这些实验的对照，将不接种MSC的支架放置在相同的培养条件中。这些对照不包含油状液滴(图8)。因为可视的液滴是由接种的细胞活跃地产生的表面活性物质的可能性，进行ELISA以检验表面活性蛋白C的存在(图5C)。在第3天和第7天二者时，表面活性蛋白C分别以3.3ng/mL和0.26/mL存在于hBM-MSC切片培养物中(图5C)。接种有hAT-MSC的肺培养物具有存在于培养基中的更大量的表面活性蛋白。来自这些培养物的条件SAGM分别包含5.55ng/mL和1.16ng/mL(图5C)。这些数据表明接种的MSC起类似于2型肺细胞的功能，其中当在去细胞肺支架上培养时，MSC活跃地产生和分泌表面活性物质。

基底基质对MSC的分化的影响

为了进一步了解培养基底对MSC的分化的影响，将hAT-MSC或hBM-MSC在已经包被有不同细胞外基质(ECM)蛋白的组织培养瓶上培养，所述细胞外基质蛋白包括胶原蛋白1、胶原蛋白IV、层粘连蛋白、纤连蛋白、人ECM和基质胶(图6)。选择胶原蛋白1、胶原蛋白IV、层粘连蛋白和纤连蛋白，因为每一个都是肺ECM的代表性组分(Petersen等，2012，Cells Tissues Organs 195：222-231；Cortiella等，2010，Tissue Eng Part A 16：2565-2580)；为了提供具有混合的ECM组合物的细胞，选择人ECM和基质胶包被。在SAGM中经历7天的培养期后，通过FACS和通过RT-PCR表征细胞群的上皮标记物表达。

从在不同基底上培养的hBM-MSC的FACS分析实验获得的数据揭示了表达细胞角蛋白-5、CCSP和前SPC的细胞群的大的区别，这取决于细胞在其上培养的ECM组分(图6A、图9和图10)。在胶原蛋白1基底上生长的细胞具有最少量的细胞角蛋白-5阳性的细胞；大约3.0％的种群是阳性的，当与在包被纤连蛋白的塑料瓶中生长的细胞相比时减少大约3倍。hBM-MSC种群中CCSP阳性细胞的量也根据这些在其上生长的基底显著地变化。CCSP阳性细胞的最大种群在包被纤连蛋白的瓶中(44％)，而最小量的CCSP阳性细胞发现在胶原蛋白4上生长的hBM-MSC中(27％)。同样地，表达pro-SPC的hBM-MSC的种群在表面包被之间变化，其中最大量的细胞阳性存在于包被人ECM的瓶中(54％)，而最低的存在于在基质胶上生长的细胞中(34％)。

在不同的ECM基质上生长的hAT-MSC的性状也显示了表达CCSP、前SPC和细胞角蛋白-5的种群的区别。例如，前SPC阳性细胞群在人ECM条件中的高至81％到在胶原蛋白1条件中的低至32％的范围内。当与其它表面包被相比时，CCSP阳性细胞群在包被人ECM的瓶中也是最大的(10％)。虽然在hAT-MSC和hBM-MSC之间，在表达上皮标记物的细胞的量中存在区别，但是在种群之间尤其是在人ECM上培养的那些种群之间存在表型区别也是显而易见的(图6E、6F)。在人ECM上培养的hAT-MSC形成遍及培养皿的网格状网络，而hBM-MSC维持典型的MSC形态。

由于在不同的ECM基底上培养，作为额外的方式进行RT-PCR以定量RNA的变化。通过如由流式细胞仪所见的qPCR在不同的ECM蛋白上培养的hBM-MSC和hAT-MSC中观察到类似的CCSP、细胞角蛋白-5和SPC基因表达模式(图6C、6D)。然而，qPCR数据显示，与在其它ECM蛋白上培养的细胞相比，混合的人ECM蛋白在第7天、在hBM-MSC和hAT-MSC二者中都导致SPC基因的显著较高的表达，CCSP和细胞角蛋白-5基因的较低的表达。

总的来说，hAT-MSC和hBM-MSC种群二者在肺上皮标记物表达中经历大的变化，这取决于它们在其上培养的基底。额外地，这些数据显示基质可以通过间充质基质细胞单独地影响肺上皮标记物的表达。当与在肺生物反应器中培养的hAT-MSC和hBM-MSC相比时，这些数据提供了对上皮标记物表达的区别的深刻理解。

最终，当在肺生物反应器培养之后与hBM-MSC的表型相比时，分析接种至去细胞肝基质上的hBM-MSC的表型(图11)。将hBM-MSC接种至去细胞肝切片上并培养3天，然后进行免疫染色和H&E组织学分析。这些数据显示，通过免疫染色，在10％FBS/DMEM或在SAGM中，在肝切片上培养的hBM-MSC不表达细胞角蛋白-5、CCSP，并且仅很少地表达前SPC(图11)。培养时期限制为仅3天，因为更长的培养期导致较低的MSC生存能力。这些数据进一步显示，肺去细胞化之后的剩余ECM对MSC分化和维持肺上皮标记物的表达的能力起作用。

来自脂肪和骨髓的MSC在去细胞大鼠肺生物反应器系统中培养之后能够呈现2型细胞表 型和功能

先前的工作已经导致研发出成功地去细胞化大鼠肺的方法(Petersen等，2010，Science329：538-541；Petersen等，2012，Cells Tissues Organs 195：222-231)。这些发现可以最终使得去细胞人肺被用作支架，在其上合适的供体细胞可以增殖并分化为肺上皮细胞类型(Badylak等，2011，Annu Rev Biomed Eng 13：27-53)。供体细胞类型必不可少的特性包括：1)分化为肺上皮或其它细胞类型的能力；2)是高度增殖的(必须在接种至去细胞肺支架上之前能够将这些细胞扩增至大数目)；3)是容易从患者(即，自体细胞源，分化细胞或干细胞)获得的；和4)缺少免疫原性或引发免疫应答。全部地，这些特性表明使用间充质基质细胞作为重新接种去细胞肺的来源的可能性。hBM-MSC先前已经显示引起包括肺上皮的多种上皮细胞类型，但是这些发现中的一些还保留有争议(Krause等，2001，Cell 105：1-9；Wong等，2009，Cytotherapy 11：676-687；Ortiz等，2003，PNAS 100：8408-8411；Wong等，2007，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 293：L740-L752；Wang等，2006，Stem Cells 24：482-493)。额外地，MSC与大部分细胞类型相比是低免疫原性的，不表达MHC 2类标记物，并且不引起由T细胞的活化的缺乏所证明的强的免疫应答(Rasmusson等，2003，Transplantation，76：1208-1213)。大鼠肺基质中人骨髓和脂肪源MSC的当前研究表明上皮细胞至少分化为II型肺泡细胞表型以及可能的其它表型的清楚的和无可争议的证据。

本文呈现的数据表明，当放置在去细胞大鼠肺基质上并在SAGM中培养时，人BM-MSC能够表达2型肺细胞标记物——前SPC以及近端气道标记物——细胞角蛋白-5。先前的工作没有表明对来自接种至去细胞肺支架上的BM-MSC的肺上皮细胞的任何实质性促进(Daly等，2012，Tissue Eng Part A 18：1-16；Bonvillain等，2012，Tissue Eng Part A18(23-24)：2437-52)。虽然不希望受限于任何具体理论，但是本数据和其它人的工作之间的此矛盾可以部分地通过肺基质去细胞化过程中的区别元件在本研究中利用的在生物反应器培养中经由肺动脉使用连续灌注培养基来解释。相比之下，这些其它组的工作使用肺切片培养系统，并且使用在保留的ECM组分中很可能不同的肺支架。额外地，本文使用的去细胞化方法利用8mM CHAPS，而其它组在去细胞化方案中使用0.1％Triton-X。比较用于去细胞化的CHAPS和SDS洗涤剂的先前报道发现在肺去细胞化之后保留胶原蛋白和弹性蛋白中的区别(Petersen等，2012，Cells Tissues Organs 195：222-231)。与Triton-X去细胞化相比，可能在CHAPS肺去细胞化之后保留不同的基质组分，并且结果对接种的BM-MSC的分化存在影响。另外，虽然报道之间的矛盾的更大可能性是本研究使用接种至大鼠肺上的人源MSC，而Daly和同事使用小鼠肺和细胞，并且Bonvillain等使用猕猴肺和细胞。

本文还显示了hAT-MSC引起衬在气道内并表达CCSP蛋白的克拉拉细胞，其是在测定的三种人骨髓供体样品中的任一种中未发现的特性。额外地，与hBM-MSC类似，hAT-MSC也引起2型样细胞，但是在再细胞化肺后不引起对细胞角蛋白-5阳性的细胞。考虑到两种MSC来源开始于共同的CD标记物表达，这些区别是特别感兴趣的。然而，如本文所示，MSC种群关于表达上皮标记物——CCSP、前SPC和细胞角蛋白-5的种群变化。最初的上皮标记物表达中的这些区别可以在肺生物反应器中培养后在MSC来源之间导致下游变化。多种报道已经记录关于MSC的分化潜能的区别取决于组织的来源(Vidal等，2008，Veterinary Surgery 37：713-724；Baer&Geiger，2012，Stem Cells International 2012，1-11；Al-Nbaheen等，2013，Stem Cell Rev 9(1)：32-43；Hoffman等，2011，Stem Cells andDevelopment 20：1779-1792；Pevsner-Fischer等，2011，Stem Cell Rev and Rep 7：560-568)。源自骨髓、脂肪和皮肤的MSC之间的基因表达比较已经显示了在表达与成骨和脂肪形成谱系相关联的基因的能力中的显著差别(Al-Nbaheen等，2013，Stem Cell Rev 9(1)：32-43)。当比较hAT-MSC和hBM-MSC来源时，考虑到本结果，虽然不希望受限于任何具体理论，但是当在适当的肺生物模拟的条件下培养时，可能额外的MSC来源可以具有明显的分化潜能。待评估的具体感兴趣的候选是从支气管肺泡灌洗液分离的细胞，所谓的附着至可塑体(plastic)并表达与骨髓MSC相关联的典型的标记物的“肺MSC”(Hoffman等，2011，StemCells and Development 20：1779-1792；Lama等，2007，J Clin Invest 117：989-996；Jarvinen等，2008，J Immunol.181(6)：4389-96)。

虽然先前的研究已经显示了BM-MSC分化为肺上皮细胞的能力，但是这些发现不是无可争议的(Kassmer&Krause，2010，Experimental Hematology 38：564-573)。这些争议似乎很大程度源自研究者之间使用的实验方法，尤其是使用eGFP作为工具来谱系追踪感兴趣的细胞中的不同(Krause，2008，Proc Am Thorac Soc 5：323-327)。本结果进一步证明了hBM-MSC促进肺上皮的能力，因为起始材料是去细胞肺和hBM-MSC或hAT-MSC。本研究中的去细胞肺完全缺乏肺上皮细胞(图2B)。这避免了污染——将非骨髓或脂肪源细胞误认为肺上皮——可能性。

还开始显示，当与无细胞肺支架相比时，再细胞化肺具有功能性改善。肺泡2型细胞的主要功能中的一种是产生表面活性蛋白。虽然hAT-MSC和hBM-MSC种群二者通过免疫荧光、RT-PCR显示表达表面活性蛋白C，并且包含如通过TEM显示的片层体，但是也通过ELISA显示在再细胞化肺中培养的MSC活跃地产生SPC，并且在邻近肺切片的培养基中还包含可视的表面活性物质液滴。本文呈现的数据表明，当与在培养中第3天时由hBM-MSC分泌的3.3ng/mL SPC相比时，hAT-MSC能够分泌多至5.5ng/mL的SPC至培养基。这些数据进一步支持MSC能够呈现2型细胞表型，而且当附着至去细胞肺基质时能够产生表面活性物质。有趣地，不存在来自任一MSC种群的维持在10％FBS的培养物中的表面活性分泌物的可视证据，支持培养基在细胞分化中的重要性(图5和图8)。

为了评估ECM在调节细胞分化中的重要性，MSC也在不同种类的ECM中的SAGM中培养，并且通过RT-PCR评估几种上皮标记物的基因表达水平和通过FACS分析评估种群标记物表达。这些数据表明，当在不同的ECM基底上生长时，MSC种群根据标记物表达显著地变化。在相关实验中，hBM-MSC在在SAGM或10％FBS中在去细胞肝上培养3天(图11)。这些实验旨在解答具体原理，而出人意料地，经常不评估在去细胞器官上培养之后，保留的ECM对细胞分化的重要性和影响的问题。这些实验表明，在无细胞肝上培养之后，hBM-MSC不表达细胞角蛋白-5，并且对前SPC表达主要为阴性的。

共同地，这些实验表明，在去细胞大鼠肺生物反应器系统中培养之后，来自脂肪和骨髓二者的MSC能够呈现2型细胞表型和功能，而仅hAT-MSC能够使CCSP阳性细胞移居于气道。这些数据是重要的，因为将来的肺再细胞化工作可以利用多种MSC来源作为供体细胞用于整个器官重新恢复。为了这个目的，可选的MSC来源——包括源自脐带和肺组织的那些——在分离中或在共培养情景中增强再细胞化过程的能力正在被探索。

本文中引用的所有的专利、专利申请和出版物的公开内容在此以其全部通过引用并入本文。虽然已经参照具体的实施方式对本发明进行了公开，但是显而易见的是，本发明的实施方式和变化可以由本领域技术人员设计，而不背离本发明的真实精神和范围。所附权利要求书意欲被解释为包括所有这样的实施方式和其等价变化。

Claims (28)

1.将间充质干细胞(MSC)分化为肺细胞的方法，所述方法包括：

在基底上接种所述MSC；和

将所述接种MSC的基底暴露于包括视黄酸和人表皮生长因子中的至少一种的生长培养基，从而将所述MSC分化为表达至少一种上皮标记物的肺细胞。

2.权利要求1所述的方法，其中所述MSC选自骨髓源MSC(BM-MSC)和脂肪组织源MSC(AT-MSC)。

3.权利要求1所述的方法，其中所述肺细胞表现出II型肺泡上皮细胞的至少一种特性。

4.权利要求3所述的方法，其中所述II型肺泡上皮细胞的至少一种特性是表达选自前SPC和细胞角蛋白-5中的至少一种上皮标记物。

5.权利要求1所述的方法，其中所述肺细胞表现出克拉拉细胞的至少一种特性。

6.权利要求5所述的方法，其中所述克拉拉细胞的至少一种特性是表达克拉拉细胞分泌蛋白(CCSP)。

7.权利要求1所述的方法，其中所述基底是去细胞肺组织。

8.权利要求1所述的方法，其中所述基底是包括细胞外基质的包被。

9.权利要求8所述的方法，其中所述细胞外基质包括人ECM、层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白IV和胶原蛋白I中的一种或多种。

10.由间充质干细胞(MSC)分化的上皮肺细胞的种群，其中所述上皮肺细胞表达选自CCSP、前SPC和细胞角蛋白-5中的至少一种上皮标记物。

11.权利要求10所述的肺细胞的种群，其中所述MSC选自骨髓源MSC(BM-MSC)和脂肪组织源MSC(AT-MSC)。

12.权利要求10所述的肺细胞的种群，其中所述上皮肺细胞选自I型肺泡上皮细胞、II型肺泡上皮细胞和克拉拉细胞。

13.权利要求10所述的肺细胞的种群，其中所述上皮肺细胞接种在基底上。

14.权利要求13所述的肺细胞的种群，其中所述基底是去细胞肺组织。

15.权利要求13所述的肺细胞的种群，其中所述基底是包含细胞外基质的包被。

16.权利要求15所述的肺细胞的种群，其中所述细胞外基质包括人ECM、层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白IV和胶原蛋白I中的一种或多种。

17.权利要求10所述的肺细胞的种群，其中所述种群包括基因修饰的细胞。

18.权利要求17所述的肺细胞的种群，其中所述基因修饰的细胞是基因修饰以表达治疗基因的上皮肺细胞。

19.减轻或治疗哺乳动物中的肺缺陷的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的由间充质干细胞(MSC)分化的上皮肺细胞的种群，其中所述上皮肺细胞表达选自CCSP、前SPC和细胞角蛋白-5中的至少一种上皮标记物。

20.调节间充质干细胞(MSC)分化为肺细胞的方法，所述方法包括在基底上培养所述MSC，从而将所述MSC分化为肺细胞。

21.权利要求20所述的方法，其中当所述MSC是骨髓源MSC(BM-MSC)时，所述MSC分化为表现出II型肺泡上皮细胞的至少一种特性的细胞。

22.权利要求21所述的方法，其中所述II型肺泡上皮细胞的至少一种特性是表达选自前SPC和细胞角蛋白-5中的至少一种。

23.权利要求20所述的方法，其中当所述MSC是脂肪组织源MSC(AT-MSC)时，所述MSC分化为表现出克拉拉细胞的至少一种特性的细胞。

24.权利要求23所述的方法，其中所述克拉拉细胞的至少一种特性是表达克拉拉细胞分泌蛋白(CCSP)。

25.通过将间充质干细胞(MSC)分化为肺细胞的方法产生的肺细胞的种群，所述方法包括在基底上培养所述MSC，从而将所述MSC分化为肺细胞。

26.权利要求25所述的肺细胞的种群，其中所述MSC选自骨髓源MSC(BM-MSC)和脂肪组织源MSC(AT-MSC)。

27.权利要求25所述的肺细胞的种群，其中所述种群包括基因修饰以表达治疗基因的细胞。

28.减轻或治疗哺乳动物中的肺缺陷的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的通过将间充质干细胞(MSC)分化为肺细胞的方法产生的肺细胞的种群，其中所述方法包括在基底上培养所述MSC，从而将所述MSC分化为肺细胞。