KR102605562B1 - 인간 중간엽 기질 세포의 상피 세포 분화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 상이한 줄기 세포 유형 (예컨대, 골수 유래 중간엽 줄기 세포 (BM-MSC) 및 지방 유래 중간엽 줄기 세포 (AT-MSC))은 그의 배양이 이루어진 기재에 따라 폐 상피 마커 발현에 있어 큰 변화를 겪게 된다는 발견에 관한 것이다.

Description

인간 중간엽 기질 세포의 상피 세포 분화 {EPITHELIAL CELL DIFFERENTIATION OF HUMAN MESENCHYMAL STROMAL CELLS}
[관련 출원에 대한 상호 참조]
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)하에 2013년 8월 16일 출원된 미국 가특허 출원 번호 제61/866,570호에 대한 우선권을 주장할 자격이 있으며, 상기 가특허 출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
[연방 정부 지원 연구 또는 개발에 관한 진술]
본 발명은 미국 국립보건원(National Institute of Health)에 의해 지급된 GM086287, HL111016 및 HL098220 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대하여 일정 권리를 가진다.
다양한 그룹들이 폐 수복 및 재생에 기여할 수 있는 골수 유래 세포의 능력에 대해 기술하였다 (문헌 [Krause et al., 2001, Cell 105:1-9]; [Rojas, et al., 2005, Am J Respir Cell Mol Biol 33(2):145-52]; [Kotton, et al., 2001, Development 128(24):5181-8]; [Wong et al., 2009, Cytotherapy 11:676-687]). 흥미롭게도, 상기 보고에는 골수의 조혈 줄기 세포 성분 (HSC) 뿐만 아니라, 중간엽 기질 세포 (MSC) 분획에 의해 폐 상피에 기여하는 것으로 제시되어 있다. 상기 연구 중 다수에서, 골수 유래 세포에 의한 폐 상피에의 기여는 폐 손상을 필요로 하는 것으로 보인다 (문헌 [Krause, 2008, Proc Am Thorac Soc 5:323-327]). 인간 및 설치류 골수 MSC 유사 세포의 서브집단은 폐에서 클라라(Clara) 세포와 관련된 마커인 클라라 세포의 분비 단백질 (CCSP)을 발현할 수 있다는 것이 특히 관심의 대상이 된다 (문헌 [Wong et al., 2009, Cytotherapy 11:676-687]). 상기 연구원들은 또한 뮤린 CCSP+ 골수 세포를 CCSP 넉아웃 마우스 내로 꼬리 정맥을 통해 투여하였을 때 폐 손상 이후의 숙주의 폐에서 CCSP+ 세포가 도입되었다고 밝혔다.
골수 및 지방 조직 유래 중간엽 기질 세포는 또한 면역조정 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [DelaRosa, et al., 2012, Stem Cells and Development 21:1333-1343]; [Rasmusson et al., 2003, Transplantation 76:1208-1213]). 이는, MSC가 동물 모델에서 생체내로 전달되었을 때에, T 세포 활성화 부족 뿐만 아니라, 활성화된 림프구 감소를 포함한다 (문헌 [Rasmusson et al., 2003, Transplantation 76:1208-1213]). 추가로, MSC는 폐에서 항염증성 역할을 하는 것으로도 또한 입증된 측분비 신호를 생산한다 (문헌 [Lee et al., 2011, Stem Cells 29:913-919]; [Ortiz et al., 2003, PNAS 100:8408-8411]). 치료학적 관점에서 볼 때, MSC가 폐 상피에의 직접적인 기여를 통해, 또는 간접적인 측분비 면역조정 기전을 통하여 폐 질환의 잠재적 치료에 사용될 수 있다는 것을 뒷받침하는 증거가 가장 큰 관심의 대상이 되고 있다.
이전 연구에서는 생체조작된 래트 폐의 재증식을 위해 신생아 설치류 세포를 이용하였다 (문헌 [Petersen et al., 2010, Science 329:538-541]). 이 연구에서는 도너 세포를 해부학상 올바른 위치로 유도하는 수단으로서 세포제거된(decellularized) 폐가 사용될 수 있다는 가능성 뿐만 아니라, 비록 일시적이기는 하지만, 재증식된 장기의 생성된 기능이 입증되었다. 최근 보고에서는 또한 뮤린 골수 유래 MSC를 사용하여 세포제거된 마우스 폐 내로 배치하였다는 것이 기술되었다 (문헌 [Daly et al., 2012, Tissue Eng Part A 18:1-16]). 이 연구에서는 시딩된 뮤린 MSC가 폐 상피 운명을 채택하는 데 중요한 기여를 한다는 것을 보이는 데 실패하였다. 영장류 유래 MSC 및 폐 스캐폴드를 이용하여 수행된 또 다른 연구 또한 영장류의 세포제거된 폐 상의 배치 이후의 MSC의 폐 상피 운명으로의 전환을 밝혀내지 못하였다 (문헌 [Bonvillain et al., 2012, Tissue Eng Part A 18(23-24):2437-52]).
따라서, 당업계에서는 중간엽 기질 세포의 상피 세포 분화를 위한 조성물 및 방법이 요구되고 있다. 본 발명은 당업계에서 상기와 같이 충족되지 못한 요구를 다룬다.
하기 기술되는 바와 같이, 본 발명은 중간엽 줄기 세포, 예컨대, 골수 및 지방 조직 중간엽 줄기 세포를 폐 세포, 폐 세포 집단으로 분화시키기 위한 방법 및 조성물, 및 폐 결함 완화 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 폐 결함을 완화 또는 치료하기 위한 방법을 포함한다.
본 발명의 한 측면은 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 기재(substrate) 상에 시딩하는 단계; 및 레티노산 및 인간 표피 성장 인자 중 적어도 하나를 포함하는 성장 배지에 MSC가 시딩된 기재를 노출시켜 MSC를, 1개 이상의 상피 마커를 발현하는 폐 세포로 분화시키는 단계를 포함하는, MSC를 폐 세포로 분화시키는 방법을 포함한다.
또 다른 측면은 기재 상에서 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 배양하여 MSC를 폐 세포로 분화시키는 단계를 포함하는, MSC의 폐 세포로의 분화를 조정하는 방법을 포함한다.
추가의 또 다른 측면은 중간엽 줄기 세포 (MSC)로부터 분화된 상피 폐 세포 집단으로서, 여기서 상피 폐 세포는 CCSP, 프로-SPC(pro-SPC) 및 시토케라틴-5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 상피 마커를 발현하는 것인, 상피 폐 세포 집단을 포함한다.
또한 추가의 또 다른 측면은 MSC를 기재 상에서 배양함으로써 MSC를 폐 세포로 분화시키는 단계를 포함하는 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 폐 세포로 분화시키는 방법에 의해 생산된 폐 세포 집단을 포함한다.
본원에 설명된 본 발명의 상기 측면 또는 임의의 다른 측면의 다양한 실시양태에서, MSC는 골수 유래 MSC (BM-MSC) 및 지방 조직 유래 MSC (AT-MSC)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 폐 세포는 II형 폐포 상피 세포의 1개 이상의 특징을 보인다. 또 다른 실시양태에서, II형 폐포 상피 세포의 1개 이상의 특징은 프로-SPC 및 시토케라틴-5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 상피 마커의 발현이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 폐 세포는 클라라 세포의 1개 이상의 특징을 보인다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 클라라 세포의 1개 이상의 특징은 클라라 세포의 분비 단백질 (CCSP)의 발현이다.
한 실시양태에서, 상피 폐 세포를 기재 상에 시딩한다. 또 다른 실시양태에서, 기재는 세포제거된 폐 조직이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 기재는 세포외 기질을 포함하는 코팅물이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 세포외 기질은 인간 ECM, 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐 IV, 및 콜라겐 I 중 하나 이상의 것을 포함한다.
한 실시양태에서, MSC는 골수 유래 MSC (BM-MSC) 및 지방 조직 유래 MSC (AT-MSC)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 상피 폐 세포는 I형 폐포 상피 세포, II형 폐포 상피 세포 및 클라라 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, MSC는 골수 유래 MSC (BM-MSC)이고, MSC는 II형 폐포 상피 세포의 1개 이상의 특징을 보이는 세포로 분화된다. 추가의 또 다른 실시양태에서, II형 폐포 상피 세포의 1개 이상의 특징은 프로-SPC 및 시토케라틴-5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 것의 발현이다.
또 다른 실시양태에서, MSC는 지방 조직 유래 MSC (AT-MSC)이고, MSC는 클라라 세포의 1개 이상의 특징을 보이는 세포로 분화된다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 클라라 세포의 1개 이상의 특징은 클라라 세포의 분비 단백질 (CCSP)의 발현이다.
한 실시양태에서, 폐 세포 집단은 유전적으로 변형된 세포를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 치료학적 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 유전적으로 변형된 세포는 치료학적 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형된 상피 폐 세포이다.
또 다른 측면은 포유동물에게 치료학상 유효량의, 중간엽 줄기 세포 (MSC)로부터 분화된 상피 폐 세포 집단을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 상피 폐 세포는 CCSP, 프로-SPC 및 시토케라틴-5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 상피 마커를 발현하는 것인, 포유동물에서 폐 결함을 완화 또는 치료하는 방법을 포함한다.
추가의 또 다른 측면은 포유동물에게 치료학상 유효량의, 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 분화시키는 방법에 의해 생산된 폐 세포 집단을 폐 세포 내로 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, MSC를 분화시키는 방법은 MSC를 기재 상에서 배양하여 MSC를 폐 세포 내로 분화시키는 단계를 포함하는 것인, 포유동물에서 폐 결함을 완화 또는 치료하는 방법을 포함한다.
본 발명은 인간 골수 및 지방 유래 중간엽 기질 세포 (각각 hBM-MSC, 및 hAT-MSC)는 배양되었을 때, 기재 (예컨대, 세포제거된 폐 조직 또는 상이한 표면 코팅물을 함유하는 배양 플레이트)에 따라 폐 상피 마커 발현에 있어 변화가 일어난다는 발견에 기초한다.
한 실시양태에서, hBM-MSC는 세포제거된 폐 조직 상에서 배양되었을 때, 세포제거된 폐 기질에, 특히, 원위 폐 영역에 부착되고, 2형 폐포세포와 관련된 마커 (프로-SPC)를 발현하고, 층판소체를 함유하고, 계면활성제 단백질 C를 활발하게 분비한다. hBM-MSC는 또한 시토케라틴-5에 대해 양성이지만, 다른 폐 관련 마커, 예컨대, CCSP에 대해서는 음성인 세포로 분화된다.
한 실시양태에서, hAT-MSC는 세포제거된 폐 조직 상에서 배양되었을 때, 2형 폐포세포 유사 세포 특징 뿐만 아니라, 클라라 유사 세포 특징을 보였다. hBM-MSC와 대조적으로, hAT-MSC는 해부학상 정확한 위치에서 기도에서 막을 형성하는 클라라 유사 세포 (예컨대, CCSP에 대하여 양성)를 생성한다. 추가로, hBM-MSC와 달리 hAT-MSC는 시토케라틴-5 양성인 세포를 생성하지 않는다.
따라서, 본 발명은 폐 상피 표현형으로 분화될 수 있는 MSC의 능력은 기재, 기원 조직, 및 배양 배지에 의존한다는 발견에 기초한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 당업계의 숙련가가 통상적으로 이해하는 것과 같은 의미를 가진다. 일반적으로, 본원에서 사용된 명명법 및 세포 배양, 분자 유전학, 유기 화학, 및 핵산 화학 및 하이브리드화에서의 실험실 방법은 당업계에 주지되어 있고, 통상적으로 사용되는 것이다.
본원에서 사용되는 바, "하나"("a" 및 "an")라는 관사는 하나 또는 1개 초과의 (즉, 1개 이상의) 관사의 문법상의 대상을 지칭한다. 일례로, "한 요소"는 하나의 요소 또는 1개 초과의 요소를 의미한다.
"약"이라는 용어는 당업계의 숙련가에 의해 이해될 것이며, 이는 사용되는 문맥에 기초하여 어느 정도까지 달라질 것이다.
"성인 줄기 세포" 또는 "ASC"라는 용어는 태아, 청소년, 및 성인 조직을 비롯한, 비-배아 조직으로부터 유래된 임의의 다능성 줄기 세포를 의미하는 것으로 사용된다. 줄기 세포는 혈액, 골수, 뇌, 후각 상피, 피부, 췌장, 골격근, 지방, 심근 등을 비롯한, 매우 다양한 성인 조직으로부터 단리되었다. 이들 줄기 세포는 각각 유전자 발현, 인자 반응성, 및 배양물 중 형태에 기초하여 특징 규명될 수 있다. 예시적인 성인 줄기 세포로는 신경 줄기 세포, 신경능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 및 췌장 줄기 세포를 포함한다. 상기 명시된 바와 같이, 줄기 세포는 실제로 모든 조직에 상주하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 줄기 세포 집단이 사실상 임의의 동물 조직으로부터 단리될 수 있다는 것을 인정한다.
본원에서 사용되는 바, "자가"란 생물학적 물질이 추후에 다시 재도입되는 동일의 개체로부터 유래되는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "동종이계"란 생물학적 물질이 도입되는 개체와 동일한 종의 유전적으로 상이한 개체로부터 유래되는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 질환, 결함, 장애 또는 병태를 "완화시키다"라는 것은 질환, 결함, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "기초 배지"라는 용어는, 비록 보통은 하기 화합물이 추가의 화합물로 보충되지 않았을 때에는 세포 성장을 지지하지 않기는 하지만, 배양물 중에서 세포의 성장을 지지하는 데 효과적인, 아미노산, 비타민, 염, 및 영양소로 이루어진 용액을 의미한다. 영양소로는 세포에 의해 대사될 수 있는 탄소원 (예컨대, 당, 예컨대, 글루코스) 뿐만 아니라, 세포의 생존에 필요한 다른 화합물을 포함한다. 이는 화합물 (예컨대, 필수 아미노산)을 합성하는 데 필요한 단백질(들)을 코딩하는 유전자(들) 중 하나 이상이 부재하는 것에 기인하여 세포 스스로가 합성할 수 없는 화합물이거나, 또는 세포가 합성할 수 있는 화합물과 관련해서는 그의 특정 발생 상태에 기인하여, 필요한 생합성 단백질을 코딩하는 유전자(들)가 충분한 수준으로 발현되지 않는 것이다. 비록 실질적으로 미분화 상태의 영장류 배아 줄기 세포의 성장을 지지하는 임의의 기초 배지가 사용될 수 있지만, 포유동물 세포 배양 분야에 다수의 기초 배지가 공지되어 있으며, 그 예로는 예컨대, 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 넉아웃-DMEM (KO-DMEM), 및 DMEM/F12가 있다.
본원에서 사용되는 바, "생체적합성"이란 임의의 물질이 포유동물 내로 이식되었을 때, 포유동물에서 유해한 반응을 일으키지 않는다는 것을 의미한다. 생체적합성 물질은 개체 내로 도입되었을 때 그 개체에 대하여 독성을 띠지 않거나, 유해하지 않으며, 포유동물에 그 물질에 대한 면역 거부를 유도하지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "생체적합성 격자"라는 용어는 조직 발생에 도움이 되는 3차원 구조로의 형성을 촉진시킬 수 있는 기재를 의미하는 것으로 한다. 따라서, 예를 들어, 세포는 상기와 같은 생체적합성 격자, 예컨대, 세포외 기질 물질, 합성 중합체, 시토카인, 성장 인자 등을 포함하는 것 상에서 배양되거나, 또는 시딩될 수 있다. 격자는 조직 유형의 발생을 촉진시키기 위하여 원하는 형상으로 몰딩될 수 있다. 또한, 세포 배양 동안 적어도 조기 단계에 배지 및/또는 기재는 적절한 조직 유형 및 구조의 발생을 촉진시키는 인자 (예컨대, 성장 인자, 시토카인, 세포외 기질 물질 등)로 보충된다.
본원에서 사용되는 바, "생체활성제"로는 하기: 주화제; 치료제 (예컨대, 항생제, 스테로이드성 및 비-스테로이드성 진통제 및 항-염증제 (특정 아미노산, 예컨대, 글리신 포함), 거부반응 억제제(anti-rejection agent), 예컨대, 면역억제제 및 항암 약물); 각종 단백질 (예컨대, 단기 펩티드, 골 형성 단백질, 콜라겐, 히알루론산, 당단백질, 및 지단백질); 세포 부착 매개인자; 생물학적으로 활성인 리간드; 인테그린 결합 서열; 리간드; 각종 성장 및/또는 분화 작용제 및 그의 단편(예컨대, 표피 성장 인자 (EGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 섬유아세포 성장 인자 (예컨대, bFGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 인슐린 유래 성장 인자 (예컨대, IGF-1, IGF-II) 및 형질전환 성장 인자 (예컨대, TGFβ I-III), 부갑상선 호르몬, 부갑상선 호르몬 관련 펩티드, 골 형성 단백질 (예컨대, BMP-2, BMP-4; BMP-6; BMP-7; BMP-12; BMP-13; BMP-14), 소닉 헤지호그, 성장 분화 인자 (예컨대, GDF5, GDF6, GDF8), 재조합 인간 성장 인자 (예컨대, MP52, 및 MP-52 변이체인 rhGDF-5), 연골 유래 형태 발생 단백질 (CDMP-1; CDMP-2, CDMP-3)); 특이 성장 인자의 상향조절에 영향을 미치는 소형 분자; 테나신-C; 히알루론산; 콘드로이틴 술페이트; 피브로넥틴; 데코린; 트롬보엘라스틴; 트롬빈 유래 펩티드; 헤파린-결합 도메인; 헤파린; 헤파란 술페이트 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다. 적합한 이펙터로는 또한 상기 기술된 작용제들의 효능제 및 길항제를 포함한다. 성장 인자는 또한 상기 기술된 성장 인자의 조합도 포함할 수 있다. 추가로, 성장 인자는 혈액 중 혈소판이 공급하는 자가 성장 인자일 수 있다. 이러한 경우, 혈소판으로부터의 성장 인자는 각종 성장 인자로 이루어진 미정의 칵테일이 될 것이다. 상기와 같은 다른 물질이 정형외과 분야에서 치료학적 가치를 가지는 경우, 상기 물질 중 적어도 일부가 본 발명에서 사용될 수 있을 것으로 기대되며, 상기 물질은 달리 명백하게 제한되지 않는 한, "생체활성제" 및 "생체활성제들"이라는 의미에 포함되어야 한다. 생체활성제의 바람직한 예는 배양 배지, 골 형성 단백질, 성장 인자, 성장 분화 인자, 재조합 인간 성장 인자, 연골 유래 형태 발생 단백질, 히드로겔, 중합체, 항생제, 항-염증성 약물, 면역억제성 조정제, 자가, 동종이계 또는 이종 세포, 예컨대, 줄기 세포, 연골세포, 섬유아세포 및 단백질, 예컨대, 콜라겐 및 히알루론산을 포함한다. 생체활성제는 자가, 동종이계, 이종성 또는 재조합성일 수 있다.
"생물학상 적합한 담체" 또는 "생물학상 적합한 배지"라는 용어는 적당한 유익/위험 비에 비례하여 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉시켜 사용하는 데 적합한 시약, 세포, 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 제제를 의미한다.
"세포" 및 "세포 집단"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되고, 복수 개의 세포, 즉, 1개 초과의 세포를 의미한다. 집단은 한 세포 유형을 포함하는 순수한 집단일 수 있다. 별법으로, 집단은 1개 초과의 세포 유형을 포함할 수 있다. 본 발명에서, 세포 집단이 포함할 수 있는 세포 유형의 개수에는 제한을 두지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "세포 배지"라는 용어는 세포를 배양하는 데 유용한 배지를 의미한다. 세포 배지의 예로는 DMEM/F 12 Ham's, 10% 우태아 혈청, 100 U 페니실린/100 ㎍ 스트렙토마이신/0.25 ㎍ 훈기존(Fungizone)을 포함하는 배지이다. 전형적으로, 세포 배지는 기초 배지, 혈청 및 항생제/항곰팡이제를 포함한다. 그러나, 세포는 항생제/항곰팡이제 없이, 및 1종 이상의 성장 인자로 보충된 기질 세포 배지로 배양될 수 있다. 바람직하게, 성장 인자는 인간 표피 성장 인자 (hEGF)이다. hEGF의 바람직한 농도는 약 1-50 ng/ml이고, 더욱 바람직하게, 농도는 약 5 ng/ml이다. 바람직한 기초 배지는 DMEM/F12 (1:1)이다. 바람직한 혈청은 우태아 혈청 (FBS)이지만, 말 혈청 또는 인간 혈청을 비롯한 다른 혈청도 사용될 수 있다. 바람직하게는 최대 20%의 FBS가 기질 세포의 성장을 지지하기 위하여 상기 배지에 첨가될 것이다. 그러나, 세포 성장을 위해 FBS 중 필요한 성장 인자, 시토카인 및 호르몬이 확인되고, 성장 배지 중에 적절한 농도로 제공될 경우, 규정 배지가 사용될 수 있다. 추가의 성분이 배양 배지에 첨가될 수 있다는 것이 추가로 인식된다. 그러한 성분은 항생제, 항곰팡이제, 알부민, 성장 인자, 아미노산 및 세포 배양용으로 당업계에 공지된 다른 성분들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 배지 내에 첨가될 수 있는 항생제로는 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 배양 배지 중 페니실린의 농도는 1 ml당 약 10 내지 약 200 단위이다. 배양 배지 중 스트렙토마이신의 농도는 약 10 내지 약 200 ㎍/ml이다. 그러나, 본 발명은 세포 배양을 위한 임의의 한 배지로 한정되는 것으로 해석되지 않아야 한다. 오히려, 조직 배양물에서 세포를 지지할 수 있는 임의의 배지가 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "세포제거된" 또는 "세포제거"라는 용어는 그로부터 세포 및 조직 성분이 제거되어 무손상 무세포성 하부 구조만이 남은 생체구조 (예컨대, 장기, 또는 장기의 일부)를 의미한다. 장기, 예컨대, 신장은 각종의 특수화된 조직으로 구성된다. 장기의 특수화된 조직 구조, 또는 실질은 장기와 관련된 특이적인 기능을 제공한다. 장기의 지지 섬유성 네트워크는 기질이다. 대부분의 장기는 특수화된 조직을 지지하는 비특수 결합 조직으로 구성된 기질 골격을 가진다. 세포제거 프로세스는 특수화된 조직을 제거하고, 이로써, 결합 조직의 복잡한 3차원 네트워크가 남게 된다. 결합 조직 하부 구조는 주로 콜라겐으로 구성된다. 세포제거된 구조는 그 위에 상이한 세포 집단이 주입될 수 있는 생체적합성 기재를 제공한다. 세포제거된 생체구조는 그의 형상을 변경시킬 수 있는 능력을 가지며, 강성, 또는 반강성일 수 있다. 본 발명에 유용한 세포제거된 장기의 예로는 심장, 폐, 신장, 간, 췌장, 비장, 방광, 요관 및 요도, 연골, 골, 뇌, 척수, 말초 신경을 포함하나, 이에 한정되지 않는다,
본원에서 사용되는 바, "탈분화"라는 용어는 세포가 덜 특수화된 상태로 되돌아가는 것을 의미한다. 탈분화 후, 상기 세포는 재-프로그래밍 이전에 가능한 것보다 더 많은 또는 그와 상이한 세포 유형으로 분화되는 능력을 가질 것이다. 역 분화 과정 (즉, 탈분화)은 분화보다 더 복잡할 가능성이 있으며, 세포가 더욱 원시적으로 되도록 세포를 "재-프로그래밍"하는 것을 필요로 한다.
"분화된 세포"라는 용어는 그의 천연 형태에서 만능성(상기 용어는 본원에서 정의된 바와 같다)인 아닌 임의의 1차 세포를 의미한다. 또 다른 방식으로 언급하면, "분화된 세포"라는 용어는 세포 분화 과정에서 덜 특수화된 세포 유형의 세포 (예컨대, 줄기 세포, 예컨대, 유도 만능성 줄기 세포)로부터 유래된 더욱 특수화된 세포 유형의 세포를 의미한다. 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 정상적인 개체 발생 과정에서 만능성 줄기 세포는 먼저 폐 세포 및 다른 내배엽 세포 유형을 형성할 수 있는 내배엽 세포로 분화될 수 있다. 내배엽 세포는 또한 내배엽 기원의 다른 세포, 예컨대, 폐, 간, 장, 흉선 등으로 분화될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "분화 배지"란 충분히 분화되지 않은 줄기 세포, 태아 폐 세포 또는 상기와 같은 다른 전구 세포가 배지 중에서 인큐베이션되었을 때 분화된 세포의 특징들 중 일부 또는 상기 특징 모두를 가지는 세포로 발생되도록 하는, 첨가제를 포함하거나, 첨가제가 결여된 세포 성장 배지를 의미한다.
"배아 줄기 세포"라는 용어는 배아 포배의 내부 세포 매스의 만능성 줄기 세포를 의미하는 것으로 사용된다 (미국 특허 번호 제5,843,780호, 제6,200,806호 참조). 상기 세포는 유사하게 체세포 핵 전달로부터 유도된 포매의 내부 세포 매스로부터 수득될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 제5,945,577호, 제5,994,619호, 제6,235,970호 참조). 배아 줄기 세포의 다른 것과 구별되는 특징이 배아 줄기 세포 표현형을 정의한다. 따라서, 세포가 다른 세포와 구별될 수 있도록 배아 줄기 세포의 독특한 특징들 중 하나 이상을 가진다면, 세포는 배아 줄기 세포의 표현형을 가지는 것이다. 예시적인 다른 것과 구별되는 배아 줄기 세포 특징으로는 제한 없이, 유전자 발현 프로파일, 증식 능력, 분화 능력, 핵형, 특정 반응 조건에 대한 반응성 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "상피 세포"란 신체의 외부 표면을 형성하며 장기, 공동 및 점막 표면에서 막을 형성하는 세포를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "내피 세포"란 혈관 및 림프관 및 각종의 다른 신체 공동에서 막을 형성하는 세포를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "내인성"은 유기체, 세포 또는 시스템 유래의 또는 그 내부에서 생성되는 임의의 물질을 의미한다.
"외인성"은 유기체, 세포 또는 시스템 내로 도입되거나, 그 외부에서 생성되는 임의의 물질을 의미한다.
"코딩하는"은 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서의 역할을 하여 규정된 뉴클레오티드 서열 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 규정된 아미노산 서열 및 그로부터 생성된 생물학적 특성을 갖게 되는, 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드의 특정 서열의 내재적 특성을 나타낸다. 따라서, 유전자는 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성할 경우 단백질을 코딩한다. 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고, 일반적으로 서열 목록에 제공된 코딩 가닥과, 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비-코딩 가닥, 둘 모두는 그 유전자 또는 cDNA의 다른 생성물 또는 그 단백질을 코딩하는 것으로 언급될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "내배엽 세포"라는 용어는 매우 이른 시점의 배아에서 3개의 1차 생식 세포층 중 하나로부터 유래된 세포를 의미한다 (나머지 다른 두 생식 세포층은 중배엽 및 외배엽이다). 내배엽은 3개의 층 중 가장 안쪽에 있는 것이다. 내배엽 세포는 분화되어 처음에는 배아 창자로, 및 이어서, 기도 및 소화관(예컨대, 장), 간 및 췌장의 내막으로 생성된다.
본원에서 "확장성"이란 세포가 증식할 수 있는 능력, 예를 들어, 수적인 면에서 확장하거나, 세포 집단의 경우, 집단 배가를 겪는 능력을 의미하는 것으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바, "세포외 기질 조성물"은 가용성 및 비-가용성 분획, 둘 모두, 또는 그의 임의의 일부를 포함한다. 비-가용성 분획은 지지체 또는 스캐폴드 상에 침착된 생물학적 성분 및 분비된 ECM 단백질을 포함한다. 가용성 분획은 세포의 배양이 이루어지고, 세포가 그 안으로 활성 작용 물질(들)을 분비하는 배양 배지를 포함(의미)하고, 스캐폴드 상에 침착되지 않은 단백질 및 생물학적 성분을 포함한다. 상기 두 분획 모두를 수집하고, 임의적으로 추가로 프로세싱하고, 본원에 기술된 바와 같이 다양한 적용에서 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
"섬유증"은 장기 또는 조직의 일반 구성 요소로서 섬유성 조직을 형성하는 것과 대조적으로, 수복성 또는 반응성 과정으로서 장기 또는 조직에서 과도한 섬유성 결합 조직의 형성 또는 발생이다. 폐 섬유증은 탄력성 상실 및 간질 근섬유아세포에 의해 대체된 폐 상피 세포의 상실, 및 폐 간질에서 세포외 기질 단백질의 침착 (이는 폐 구조적 리모델링을 유도한다)을 특징으로 하는 중증 만성 질환이다.
본원에서 사용되는 바, "이식편"이란 개체 내로 이식되어 전형적으로 결함을 대체하거나, 그를 보정하거나 또는 다르게는 그를 극복하는 세포, 조직 또는 장기를 의미한다. 이식편은 스캐폴드를 추가로 포함할 수 있다. 조직 또는 장기는 동일한 개체로부터 기원하여 발생된 세포로 이루어질 수 있으며; 이 이식편은 본원에서 하기의 상호교환가능한 용어로 언급된다: "자가이식편," "자가 이식 트랜스플란트," "자가 이식 임플란트" 및 "자가 이식편." 동일한 종의 유전적으로 상이한 개체 유래의 세포를 포함하는 이식편은 본원에서 하기의 상호교환가능한 용어로 언급된다: "동종이식편," "동종이계 트랜스플란트," "동종이계 임플란트" 및 "동종이계 이식편". 한 개체로부터 그의 일란성 쌍둥이로의 이식편은 본원에서 "동계이식편," "동계 트랜스플란트," "동계 임플란트" 또는 "동계 이식편"으로 언급된다. "이종이식편," "이종성 트랜스플란트" 또는 "이종성 임플란트"는 하나의 개체로부터 상이한 종의 또 다른 것으로의 이식편을 언급한다.
본원에서 사용되는 바, "성장 인자 생성물"이라는 용어는 세포에 대하여 성장, 증식, 분화 또는 영양적 영향을 미치는 단백질, 펩티드, 미토겐 또는 다른 분자를 의미한다. 성장 인자로는 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 산성 섬유아세포 성장 인자 (aFGF), 표피 성장 인자 (EGF), 인슐린 유사 성장 인자-I (IGF-T), 인슐린 유사 성장 인자-II (IGF-II), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), 액티빈-A, 골 형성 단백질 (BMP), 인슐린, 성장 호르몬, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 인터루킨 3 (IL-3), 인터루킨 6 (IL-6), 인터루킨 7 (IL-7), 대식세포 콜로니 자극 인자, c-kit 리간드/줄기 세포 인자, 오스테오프로테게린 리간드, 인슐린, 신경 성장 인자, 섬모체 신경영양 인자, 시토카인, 케모카인, 모르포겐, 중화 항체, 다른 단백질, 및 소분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, FGF는 FGF2, FGF7, FGF10, 및 임의의 그의 조합으로부터 선택된 군으로부터 선택된다.
본원에서 사용되는 바, "성장 배지"라는 용어는 세포의 성장을 촉진하는 배양 배지를 의미하는 것으로 한다. 성장 배지는 일반적으로 동물 혈청을 함유할 것이다. 일부 예에서, 성장 배지는 동물 혈청을 함유하지 않을 수도 있다.
"단리된 세포"란 조직 또는 포유동물에서 천연적으로 단리된 세포를 동반하는 다른 성분 및/또는 세포로부터 분리된 세포를 의미한다.
"단리된 핵산"이란 자연 발생적 상태에서 측면에 위치하는 서열로부터 분리된 핵산 절편 또는 단편, 즉, 보통 DNA 단편에 인접한 서열, 즉, 게놈 내의 상기 단편에 인접한 서열 (게놈 내에서 상기 단편이 자연적으로 발생됨)로부터 제거된 DNA 단편을 의미한다. 상기 용어는 또한 핵산, 즉, RNA 또는 DNA 또는 단백질을 자연적으로 동반하는 다른 성분으로부터 실질적으로 정제된 핵산에 적용되는데, 상기 핵산 또는 단백질은 세포 내에서 상기 다른 성분을 자연적으로 동반한다. 따라서, 상기 용어는 예를 들어 벡터 내로, 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스 내로, 또는 원핵 또는 진핵 생물의 게놈 DNA 내로 혼입된, 또는 다른 서열과는 관계없이 별도의 분자로서 (즉, cDNA 또는 게놈 또는 PCR에 의해 생성된 cDNA 단편 또는 제한 효소 분해물로서) 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 또한 상기 용어는 추가의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.
"폐 특이적"이라는 용어는 신체 내의 다른 조직과 비교할 때 폐에서 주로 발현되는 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 의미한다. 바람직한 실시양태에서, "폐 특이적" 핵산 분자 또는 폴리펩티드는 신체 내의 임의의 다른 조직보다 5배 더 높은 수준으로 발현된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, "폐 특이적" 핵산 분자 또는 폴리펩티드는 신체 내의 임의의 다른 조직보다 10배 더 높은 수준으로, 더욱 바람직하게는 신체 내의 임의의 다른 조직보다 적어도 15배, 20배, 25배, 50배 또는 100배 더 높은 수준으로 발현된다. 핵산 분자 수준은 핵산 하이브리드화, 예컨대, 노던 블롯 하이브리드화, 또는 정량적 PCR에 의해 측정될 수 있다. 폴리펩티드 수준은 웨스턴 블롯 분석과 같이, 단백질 수준을 정확하게 측정하기 위한 임의의 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다.
"폐 조직"은 모든 폐 조직 구조, 및 정맥, 동맥, 혈관, 모세관, 및 상기 구조의 일부이거나, 또는 그와 관련된 유형의 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 관련된 조직; 폐 및 흉막 조직; 및 혈관 평활근, 혈관주위세포, 및 혈관 내피 계통 및/또는 표현형을 포함할 수 있지만, 그에 한정되지 않는다.
"전구체 세포," "전구 세포," 및 "줄기 세포"라는 용어는 당업계에서 상호교환적으로 사용되며, 본원에서 사용되는 바, 만능성 또는 계통-미결정 전구 세포 중 어느 하나를 의미하며, 이는 무제한의 유사 분열을 잠재적으로 할 수 있으며, 이로써, 그 자신을 새로 교체하거나, 원하는 세포 유형으로 분화될 자손 세포를 생성한다. 만능 줄기 세포와는 대조적으로, 계통 결정 전구 세포는 일반적으로 표현형이 서로와 상이한 다수의 세포 유형을 생성할 수 없는 것으로 간주된다. 대신, 전구 세포는 하나 또는 가능하게는 2개의 계통 결정 세포 유형을 생성한다.
본원에서 "증식"은 유사한 형태의, 특히, 세포의 번식 또는 증가를 의미하는 것으로 사용된다. 즉, 증식은 더 많은 개수의 세포 생성을 포함하며, 특히 단순히 세포 개수를 계수하는 것, 3H-티미딘의 세포 내로의 혼입을 측정하는 것 등에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "세포 주기의 진행 또는 세포 주기를 거치는 진행"이란 유사 분열 및/또는 감수 분열을 준비하고/거나, 그에 진입하는 과정을 의미한다. 세포 주기를 거치는 진행은 G1 기, S 기, G2 기, 및 M 기를 거치는 진행을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "스캐폴드"란 세포의 부착 및 증식에 적합한 표면을 제공하는, 생체적합성 물질을 포함하는 구조체를 의미한다. 스캐폴드는 기계적 안정성 및 지지성을 추가로 제공할 수 있다. 스캐폴드는 증식 중인 세포의 집단이 지니는 3차원 형상 또는 형태에 영향을 주거나, 그의 범위를 정하기 위해 특정한 형상 또는 형태로 존재할 수 있다. 그러한 형상 또는 형태로는 필름 (예컨대, 실질적으로 3차원보다 큰 2차원을 가지는 형태), 리본, 코드, 시트, 평평한 디스크, 원통, 구체, 3차원 무정형 형상 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "소기도 성장 배지" 또는 "SAGM"이라는 어구는 하기 성분, 히드로코르티손, 표피 성장 인자, 에피네프린, 트랜스페린, 인슐린, 레티노산, 트리아이오도티로닌, 및 소 혈청 알부민-지방산 무함유 중 하나 이상의 것을 포함하는 성장 배지를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "줄기 세포"라는 어구는 조직 또는 신체에서 세포 매스를 생성하는 것을 담당하는 최초의 재생가능한 세포 집단, 및 다소 좀더 분화된 것이지만, 아직 수임된 것은 아니고, 최초의 재생가능한 세포 집단의 일부가 되도록 쉽게 복귀될 수 있는 매우 이른 시점의 전구 세포, 둘 모두를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "실질적으로 정제된" 세포란 본질적으로 다른 세포 유형이 없는 세포이다. 따라서, 실질적으로 정제된 세포란 보통 그의 천연적으로 발생된 상태에서 그와 회합되어 있는 다른 세포 유형으로부터 정제된 세포를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "대상체" 및 "환자"라는 용어는 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 사용되는 바, 대상체는 바람직하게는 포유동물, 예컨대, 비-영장류 (예컨대, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 및 영장류 (예컨대, 원숭이 및 인간), 가장 바람직하게는 인간이다.
본원에서 사용되는 바, "치료하다"라는 것은 환자가 질환, 결함, 장애, 또는 유해 병태 등의 증상을 경험하는 빈도를 감소시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "치료학상 유효량"이란 조성물을 투여받는 개체에게 유익한 효과를 제공하는 데 충분한 본 발명의 조성물의 양이다.
본원에서 사용되는 바, "조직 공학"이란 조직 대체 또는 재건에서 사용하기 위해 생체외에서 조직을 생성하는 공정을 의미한다. 조직 공학은 재생 의학의 한 예로서, 이는 생체공학적 물질 및 기술과 함께 세포, 유전자 또는 다른 생물학적 빌딩 블록을 혼입시킴으로써 조직 및 장기를 수복 또는 대체하는 접근법을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "조직 이식" 및 "조직 재건"이라는 용어는 둘 모두가 조직 결함, 예컨대, 폐 결함 또는 연조직 결함을 치료 또는 완화시키기 위해 이식편을 개체 내로 이식하는 것을 의미한다.
"이식 조직"이란 이식시키고자 하는 생체적합성 격자 또는 도너 조직, 장기 또는 세포를 의미한다. 이식 조직의 예로는 피부 세포 또는 조직, 골수, 및 고형 장기, 예컨대, 심장, 췌장, 신장, 폐 및 간을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
일반적으로, "영양 인자"란 세포의 생존, 성장, 증식 및/또는 성숙을 촉진시키거나, 세포의 활성 증가를 자극하는 물질로서 정의된다.
범위: 본 개시내용 전역에 걸쳐 본 발명의 다양한 측면은 범위 포맷으로 제공될 수 있다. 범위 포맷으로 기술된 것은 단지 편의성 및 간결성을 위한 것이며, 본 발명의 범주에 있어 변경할 수 없는 제한인 것으로 해석되지 않아야 한다. 따라서, 범위 기술은 구체적으로 개시된 모든 가능한 서브범위 뿐만 아니라, 상기 범위 내의 개별 수치 값을 가지는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 예컨대, 1 내지 6과 같은 범위로 기술된 것은 구체적으로 개시된 서브범위, 예컨대, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 뿐만 아니라, 상기 범위 내의 개별 수치, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 가지는 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위 폭에 상관 없이 적용된다.
설명
본 발명은 상이한 줄기 세포 유형 (예컨대, 골수 유래 중간엽 줄기 세포 (BM-MSC) 및 지방 유래 중간엽 줄기 세포 (AT-MSC))은 그의 배양이 이루어진 기재에 따라 폐 상피 마커 발현에 있어 큰 변화를 겪게 된다는 발견에 관한 것이다. 기재의 예로는 세포제거된 폐 조직 및 상이한 표면 코팅물을 함유하는 배양 플레이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 세포제거된 폐 조직에 관한 교시는 미국 특허 출원 공개 번호 20120064050에서 살펴볼 수 있으며, 상기 특허 출원은 본원에서 참조로 포함된다.
한 실시양태에서, BM-MSC는 세포제거된 폐 상에 배치되었을 때, 2형 폐포세포 마커인 프로-SPC 뿐만 아니라, 근위 기도 마커인 시토케라틴-5를 발현할 수 있다. 한 실시양태에서, BM-MSC는 적합한 조건하에서 확장되고 배양되었을 때, II형 폐포 상피 세포 (이는 2형 폐포세포로도 지칭된다)의 표현형을 취할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, BM-MSC는 적합한 조건하에서 확장되고 배양되었을 때, 천연 2형 세포 내에 함유되어 있는 것과 유사한 기능과 관련된 세포질 구조를 보인다.
또 다른 실시양태에서, AT-MSC는 프로-SPC 양성인 세포를 생성한다. 또 다른 실시양태에서, AT-MSC는 적합한 조건하에서 확장되고 배양되었을 때, 해부학상 정확한 위치에서 기도에서 막을 형성하는 클라라 유사 세포 (예컨대, CCSP에 대하여 양성)를 생성한다. 이는 CCSP의 발현을 유지하지도 않으며, 기도에 부착되지도 않는 BM-MSC와 대조를 이룬다. 또 다른 실시양태에서, BM-MSC와 대조적으로, AT-MSC는 시토케라틴-5 양성인 세포를 생성하지 않는다.
따라서, 본 발명은 원하는 세포 유형을 생성하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 그러므로, 본 발명의 세포는 원위 폐 질환, 폐 손상, 및 폐를 이환시키는 유전병을 치료하기 위해 치료학적으로 사용하기 위한 유망한 세포 공급원으로서의 역할을 한다.
본 발명은 BM-MSC를, 2형 폐포세포 마커인 프로-SPC 뿐만 아니라, 근위 기도 마커인 시토케라틴-5를 보이는 세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 1개 이상의 II형 폐포 상피 세포의 표현형을 보이도록 BM-MSC를 분화시키는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 천연 2형 세포 내에 함유되어 있는 것과 유사한 기능과 관련된 세포질 구조를 보이도록 BM-MSC를 분화시키는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 BM-MSC를 II형 폐포 상피 세포와 관련된 세포 유형 및 조직으로 직접 분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 AT-MSC를, 2형 폐포세포 마커인 프로-SPC를 보이지만, 시토케라틴-5 양성인 세포를 생성하지 않는 세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 AT-MSC를, 클라라 세포의 마커인 CCSP에 대하여 양성인 세포로 분화시키는 방법을 제공한다. 또 다르게, 본 발명은 hAT-MSC는 해부학상 정확한 위치에서 기도에서 막을 형성하는 클라라 유사 세포 (예컨대, CCSP에 대하여 양성)를 생성하도록 AT-MSC를 분화시키는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 AT-MSC를 클라라 세포와 관련된 세포 유형 및 조직으로 직접 분화시키는 방법을 제공한다.
배양 조건
본 발명은 한 유형의 폐 세포 (예컨대, II형 폐포 상피 세포 또는 클라라 세포)로 분화시키기 위한 임의 세포의 용도에 관한 것이다. 바람직하게, 적합한 세포 또는 세포들은 재생성인 것이다. 재생 세포의 예로는 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 성인 줄기 세포, 제대 혈액 세포, 조직 유래 줄기 세포 또는 전구 세포, 골수 유래 줄기 세포 또는 전구 세포, 혈액 유래 줄기 세포 또는 전구 세포, 지방 유래 줄기 세포 또는 전구 세포, 중간엽 줄기 세포 (MSC), 골격근 유래 세포, 다능성 성인 전구 세포 (MAPC), 태아 폐 세포, 분화된 폐 상피 세포, 폐 전구 세포, 혈관 전구 세포, 분화된 혈관 세포 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 추가의 재생 세포로는 골수 유래 줄기 세포, 예컨대, 골수 단핵구 세포 (BM-MNC), 내피 또는 혈관 줄기 세포 또는 전구 세포, 및 말초 혈액 유래 줄기 세포 예컨대, 내피 전구 세포 (EPC)를 포함한다.
바람직하게, 적합한 세포는 포유동물, 더욱 바람직하게, 영장류 및 더욱더 바람직하게 인간으로부터 단리된 것이다. 본 발명의 방법에서 유용한 세포는 예를 들어, 실시예 섹션에서 본원에서 논의된 방법을 사용하여, 또는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 단리된다. 단리 후, 적합한 세포는 배양 배지에서 배양된다.
배양 배지 조성물은 전형적으로 필수 아미노산, 염, 비타민, 미네랄, 미량 금속, 당, 지질 및 뉴클레오시드를 포함한다. 세포 배양 배지는 조절, 인공 및 시험관내 환경에서 세포를 성장시키는 데 필요한 영양학적 요구를 충족시키는 데 필요한 성분을 공급하려고 시도한다. 영양 제제, pH, 및 오스몰 농도는 파라미터, 예컨대, 세포 유형, 세포 밀도, 및 사용되는 배양 시스템에 따라 달라진다. 다수의 세포 배양 배지 제제가 문헌으로 작성되어 있고, 다수의 배지가 상업적으로 이용가능하다.
일단 배양 배지를 세포와 함께 인큐베이션시키고 나면, 이는 당업자에게 "조절 배지"로 공지된다. 조절 배지는 배지의 원래의 성분들 다수 뿐만 아니라, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 성장 인자, 염증성 매개인자 및 다른 세포외 단백질을 비롯한, 다양한 세포 대사산물 및 분비된 단백질을 함유한다.
당업자는 배양 조건은 적합한 세포에 맞게 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다. MSC의 성장을 지지하는 배지 제제로는 최소 필수 배지 이글(Minimum Essential Medium Eagle), ADC-1, LPM (소 혈청 알부민 무함유), F10 (HAM), F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ 배지 (피톤-잭슨 변형(Fitton-Jackson Modification) 포함 및 비포함), 기초 배지 이글 (Basal Medium Eagle) (얼 염 (Earle's salt) 베이스가 첨가된 BME), 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium) (혈청을 포함하지 않는 DMEM), 야만 (Yamane), IMEM-20, 글래스고 변형 이글 배지(Glasgow Modification Eagle Medium: GMEM), 레이보비츠(Leibovitz) L-15 배지, 맥코이 5A 배지(McCoy's 5A Medium), 배지 M199(얼 염 베이스를 포함하는 M199E), 배지 M199(행크스 염(Hank's salt) 베이스를 포함하는 M199H), 최소 필수 배지 이글 (얼 염 베이스를 포함하는 MEM-E), 최소 필수 배지 이글 (행크스 염 베이스를 포함하는 MEM-H) 및 최소 필수 배지 이글 (비필수 아미노산을 포함하는 MEM-NAA) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에서 유용한 배지의 추가의 비제한적인 예는 적어도 1% 내지 약 30%, 바람직하게는 적어도 약 5% 내지 15%, 가장 바람직하게는 약 10% 농도의 소 또는 다른 종의 태아 혈청을 함유할 수 있다. 소 또는 다른 종의 배아 추출물은 약 1% 내지 30%, 바람직하게는 적어도 약 5% 내지 15%, 가장 바람직하게는 약 10%의 농도로 존재할 수 있다.
전형적으로, 배양 배지는 기초 배지, 혈청 및 항생제/항곰팡이제를 포함한다. 한 바람직한 기초 배지는 DMEM/F12 (1:1)이다. 바람직한 혈청은 우태아 혈청 (FBS)이지만, 말 혈청 또는 인간 혈청을 비롯한 다른 혈청도 사용될 수 있다. 바람직하게는 최대 20%의 FBS가 MSC의 성장을 지지하기 위하여 상기 배지에 첨가될 것이다. 그러나, MSC 성장을 위해 FBS 중 필요한 성장 인자, 시토카인 및 호르몬이 확인되고, 성장 배지 중에 적절한 농도로 제공될 경우, 규정 배지가 사용될 수 있다. 추가의 성분이 배양 배지에 첨가될 수 있다는 것이 추가로 인식된다. 그러한 성분은 항생제, 항곰팡이제, 알부민, 성장 인자, 아미노산 및 세포 배양용으로 당업계에 공지된 다른 성분들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 배지 내에 첨가될 수 있는 항생제로는 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 배양 배지 중 페니실린의 농도는 1 ml당 약 10 내지 약 200 단위이다. 배양 배지 중 스트렙토마이신의 농도는 약 10 내지 약 200 ㎍/ml이다. 그러나, 본 발명은 NPC의 배양을 위한 임의의 한 배지로 한정되는 것으로 해석되지 않아야 한다. 오히려, 조직 배양물에서 폐 세포를 지지할 수 있는 임의의 배지가 사용될 수 있다.
배지 제제에서 주로 사용되는 다른 성분으로는 지용성 비타민 (A, D, E 및 K 포함) 스테로이드 및 그의 유도체, 콜레스테롤, 지방산 및 지질 트윈 80, 2-메르캅토에탄올 피라미딘 뿐만 아니라, 혈청 (소, 말, 송아지 등), 단백질 (인슐린, 트랜스페린, 성장 인자, 호르몬 등) 항생제 (겐타마이신, 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신 B 등) 전란 한외 여과액, 및 부착 인자 (피브로넥틴, 비트로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 테나신 등)를 비롯한 다양한 보충제를 포함한다.
배지는 성장 이자 및 다른 단백질, 예컨대, 부착 인자로 보충되어야 할 필요가 있을 수 있거나, 또는 그렇지 않을 수 있는데, 그 이유는 본 출원에 기술된 다수의 세포 구축물, 특히, 3차원 세포 및 조직 배양 구축물은 그 자체가 상기 성장 및 부착 인자 및 다른 생성물을 배지 내로 만들어 내기 때문이다.
가용성 인자란 줄기 세포의 배양 배지 중에 방출되고, 존재하는 인자를 의미한다. 가용성 인자의 예로는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인슐린 성장 인자 (IGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 각질세포 성장 인자 (KGF) 및 섬유아세포 성장 인자 패밀리의 다른 구성원을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
단리 후, MSC를 세포가 또 다른 배양 장치로 전해지기 전에 세포가 융합성에 도달될 때까지 또는 일정 기간 동안 배양 장치 중 배양 배지에서 인큐베이션시킬 수 있다. 첫 플레이팅 후, 세포를 약 6일의 기간 동안 배양물 중에 유지시켜 계대 0 (P0)의 집단을 수득할 수 있다. 세포를 무한 횟수 동안 계대할 수 있으며, 각각의 계대는 세포를 약 6-7일 동안 배양하는 것을 포함하는데, 그 시간 동안 세포 배가 시간은 약 3 내지 약 5일의 범위일 수 있다. 배양 장치는 보통 시험관내에서 세포를 배양하는 데 사용되는 임의의 배양 장치의 것일 수 있다.
본원에 기술된 MSC는 통상적인 절차에 따라 냉동보존될 수 있다. 바람직하게, 약 백만개 내지 천만개의 세포가 액체 N2의 증기상에서 10% DMSO를 함유하는 배양 배지 중에 냉동보존된다. 냉동된 세포를 37℃ 배쓰에서 선회시킴으로써 해동시키고, 신선한 성장 배지에 재현탁시키고, 상기에 기술된 바와 같이 확장시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 스캐폴드에 "시딩되는" 세포를 제공한다. MSC는 스캐폴드 상에서 배양될 수 있다. 세포는 또한 세포를 분화 배지에서 배양함으로써 시험관내에서 분화될 수 있다. 별법으로, 세포는 세포가 포유동물 내에서 조직과의 접촉을 확립할 때, 또는 세포가 조직으로부터 방출되는 물질 (예컨대, 성장 인자, 효소 또는 호르몬)에 의해 영향을 받도록 조직에 충분히 가깝게 있을 때, 생체내에서 분화될 수 있다. 다시 말하면, 기질의 MSC는 조직으로부터 신호을 받음으로써 조직, 예컨대, 폐와의 접촉을 확립할 수 있다. 그러한 신호전달은 예를 들어, MSC의 표면 상의, 또는 MSC의 자손인 세포의 표면 상의 수용체가 포유동물 내에서 조직에 의해 방출된 분자, 예컨대, 성장 인자, 효소 또는 호르몬에 결합하여 그로부터 신호를 전달할 때 일어나게 된다. 이들 작용제는 분화를 유도하여 MSC가 분화된 세포가 내부에 위치한 조직에서 분화된 세포에 의해 통상적으로 발현되는 상기 단백질 중 일부, 및 (전부는 아니라도) 가능하게는 대부분을 발현하게 된다.
별법으로, 또는 추가로, 기질의 MSC는 세포의 환경에 물질 (예컨대, 성장 인자, 효소, 호르몬 또는 다른 신호전달 분자)을 첨가함으로써 분화되도록 유도될 수 있다. 예를 들어, 물질은 본 발명의 생물학적 스캐폴딩에 첨가될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 적합한 성장 배지 중 표면 (예컨대, 2차원 또는 3차원) 상에서 ECM 단백질의 존재하에 본 발명의 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, ECM은 배양 장치의 표면 상에 코팅된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 조직 배양 시스템을 포함한다. 다양한 측면에서, 배양 시스템은 본원에 기술된 ECM 조성물, 예컨대, 2차원 또는 3차원 지지체 물질에 포함되는 것으로 구성된다. 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 ECM 조성물은 다양한 세포 유형의 성장을 위한 지지체 또는 2차원 또는 3차원 지지체로서의 역할을 한다. 예를 들어, 배양 시스템은 본 발명의 세포의 성장을 지지하는 데 사용될 수 있다. 한 측면에서, 배양 시스템은 세포의 분화를 지지하는 데 사용될 수 있다.
ECM은 특정 세포에 의해 분비되는 것으로 공지되어 있고, 주로 섬유성 단백질, 다당류, 및 다른 부성분으로 구성된다. 그의 성분으로는 구조 요소, 예컨대, 콜라겐 및 엘라스틴, 부착성 단백질, 예컨대, 당단백질 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 트롬보스폰딘 I 및 테나신, 뿐만 아니라, 프로테오글리칸, 예컨대, 데코린, 비글리칸, 콘드로이틴 술페이트 및 헤파린 술페이트 및 글리코사미노글리칸 (GAG) 예컨대, 히알루론산 (Ha)을 포함한다.
한 실시양태에서, ECM 조성물은 하기: 피브로넥틴, 피브릴린, 라미닌, 엘라스틴, 콜라겐 패밀리의 구성원 (예컨대, 콜라겐 I, III, 및 IV), 글리코사미노글리칸, 기저 물질, 망상 섬유 및 트롬보스폰딘 중 임의의 것 또는 그 모두를 포함할 수 있다. 바람직하게, 인간 ECM은 완성 내배엽을 배양하는 데 사용된다. 한 실시양태에서, 인간 ECM은 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 테나신, 엘라스틴, 및 다수의 프로테오글리칸 및 글리코사미노글리칸을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 막이, 생체내에서 세포층 아래 존재하는 얇은 막성 세포외 기질에 함유되어 있으며, 단백질 및 당단백질, 예컨대, 라미닌, 콜라겐 IV 및 헤파린 술페이트 프로테오글리칸 뿐만 아니라, 각종 세포 성장 인자 및 활성화 인자 등을 함유하는 적합한 세포 조직으로 추출되고, 제조됨으로써 수득될 수 있는 것인, 재구성된 기저막을 포함하는 고체 지지체 상에서 세포를 배양하는 것이 바람직할 수 있다.
한 실시양태에서, 우세한 주요 세포외 기질 성분은 원섬유 콜라겐, 특히, 콜라겐 I형이다. 그러나, 다른 원섬유 및 비-원섬유 콜라겐 (콜라겐 II형, III형, IV형, V형, VI형, VII형, VIII형, IX형, X형, XI형, XII형, XIII형, XIV형, XV형, XVI형, XVII형, XVIII형, XIX형 등 포함)도 있다.
본 발명의 ECM 조성물은 다양한 방식으로 프로세싱될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 조직 배양 시스템을 포함한다. 다양한 측면에서, 배양 시스템은 본원에 기술된 ECM 조성물로 구성된다. 본 발명의 ECM 조성물은 다양한 방식으로 조직 배양 시스템 내로 혼입될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 코팅제로서, 본원에 기술된 바와 같이 3차원 스캐폴드 물질을 함침시킴으로써, 또는 세포 배양물을 위한 배지에의 첨가제로서 혼입될 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 배양 시스템은 본원에 기술된 ECM 조성물 중 임의의 것, 예컨대, 성장 인자 또는 배아 단백질이 함침된 3차원 지지체 물질을 포함할 수 있다.
MSC 및 관련 세포 기질은 최종적으로는 완전하게 분화될 수 있고, 이러한 것이 일부 환경에서는 바람직할 수 있지만 (예컨대, 세포가 조직학상 성숙하고 완전한 조직을 되살리는 데 사용되는 경우), 투여된 모든 세포가 성공적인 치료를 달성하기 위해 완전하게 분화될 필요는 없으며; 세포 기질의 MSC는 단지 포유동물을 치료하는 데 충분한 시점까지는 분화되어야 한다. 이 시점에는 기질이 환자에게 투여되기 이전 또는 이후에 도달될 수 있다.
분화는 기질의 세포가 이식 부위의 성숙 세포와 본질적으로 동일한 표현형을 발현할 때 일어난다. 예를 들어, 본 발명을 정의하기 위한 목적으로, 폐 내로 이식된 세포 기질의 MSC는 그가 폐, 예컨대, 폐포 상피 세포에 의해 발현되는 본질적으로 동일한 단백질을 발현할 때 분화된다. 폐 마커에 대한 항체는 상업적으로 이용가능하거나, 또는 다르게는 쉽게 획득가능하다.
분화된 세포는 또한 그의 육안적 형태에 의해 및 그가 다른 세포와 함께 형성하는 연결부에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 폐 세포로 분화되는 세포는 세기관지와 유사한 복잡한 형태를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본 발명은, 상이한 MSC 유형 (예컨대, 골수 유래 중간엽 줄기 세포 (BM-MSC) 및 지방 유래 중간엽 줄기 세포 (AT-MSC))은 그의 배양이 이루어지는 기재 또는 스캐폴드를 비롯한 배양 조건에 따라 폐 상피 마커 발현에 있어 큰 변화를 겪게 된다는 신규한 발견에 기초한다. 예를 들어, BM-MSC는 II형 폐포 상피 세포와 관련된 세포 유형 및 조직으로 분화된다. 반면, AT-MSC는 클라라 세포와 관련된 세포 유형 및 조직으로 분화된다.
장기 또는 조직을 생성하기 위하여 세포제거된 장기 내에 또는 그 위에 도입되는 세포의 개수는 장기 (예컨대, 장기의 종류, 장기의 크기 및 중량) 또는 조직과, 재생 세포의 유형 및 발달 단계, 둘 모두에 의존한다. 상이한 유형의 세포는 그 세포가 도달하게 되는 집단의 밀도에 관하여 상이한 경향을 가질 수 있다. 유사하게, 상이한 장기 또는 조직은 상이한 밀도로 세포화될 수 있다. 예로서, 세포제거된 장기 또는 조직에 약 1,000개 이상 (예컨대, 10,000, 100,000, 1,000,000, 10,000,000, 또는 100,000,000개 이상)의 재생 세포가 시딩될 수 있거나; 조직 1 mg (습식 중량, 즉, 세포제거 이전의 중량)당 약 1,000개의 세포 내지 조직 1 mg (습식 중량)당 약 10,000,000개의 세포가 그에 부착될 수 있다.
세포는 하나 이상의 위치 내로의 주입에 의해 세포제거된 장기 또는 조직으로 도입될 수 있다. 추가로, 1 초과의 세포 유형 (즉, 세포의 칵테일)이 세포제거된 장기 또는 조직 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 세포의 칵테일은 세포제거된 장기 또는 조직 내의 다수의 위치에서 주입될 수 있거나, 상이한 세포 유형들은 세포제거된 장기 또는 조직의 상이한 부분들 내로 주입될 수 있다. 주입에 대한 별법으로, 또는 추가로, 재생 세포 또는 세포의 칵테일은 캐뉼러 삽입된 세포제거된 장기 또는 조직 내로 관류에 의해 도입될 수 있다. 예를 들어, 세포는 관류 배지를 사용하여 세포제거된 장기 내로 관류될 수 있고, 이어서, 상기 관류 배지는 재생 세포의 성장 및/또는 분화를 유도하기 위하여 확장 및/또는 분화 배지로 교환될 수 있다. 폐 조직의 경우, 세포는 기관을 통하여 기도 구획 내로 또는 폐 동맥 또는 정맥을 통하여 혈관 구획 내로, 또는 상기 둘 모두의 내부로 도입될 수 있다.
재세포화 동안, 장기 또는 조직은 재생 세포 중 적어도 일부가 세포제거된 장기 또는 조직 내에서 및 그 위에서 증식 및/또는 분화될 수 있는 조건하에 유지된다. 상기 조건으로는 제한 없이 적절한 온도 및/또는 압력, 전기적 및/또는 기계적 활성, 힘, 적절한 양의 O2 및/또는 CO2, 적절한 양의 습도, 및 살균 조건 또는 살균에 가까운 조건을 포함한다. 재세포화 동안, 세포제거된 장기 또는 조직 및 그에 부착된 세포는 적합한 환경에서 유지된다. 예를 들어, 세포는 영양 보충 (예컨대, 영양소 및/또는 탄소원, 예컨대, 글루코스), 외인성 호르몬 또는 성장 인자 및/또는 특정 pH를 필요로 할 수 있다.
세포는 세포제거된 장기 또는 조직 (예컨대, 인간 세포가 시딩된 인간 세포제거된 장기 또는 조직)에 대하여 동종이계일 수 있거나, 또는 재생 세포는 세포제거된 장기 또는 조직 (예컨대, 인간 세포가 시딩된 돼지 세포제거된 장기 또는 조직)에 대하여 이종성일 수 있다.
일부 경우에서, 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 장기 또는 조직은 환자 내로 이식되어야 한다. 상기 경우에서, 세포제거된 장기 또는 조직을 재세포화하는 데 사용되는 세포는 재생 세포가 환자에게 자가성이 되도록 환자로부터 수득될 수 있다. 환자 유래의 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생의 다른 단계에서 (예컨대, 출생 이전에, 신생아로 또는 주산기로, 청소년기 동안 또는 성인으로서) 예를 들어, 혈액, 골수, 조직 또는 장기로부터 수득될 수 있다. 별법으로, 세포제거된 장기 또는 조직을 재세포화하는 데 사용되는 세포는 환자에 대하여 동계일 수 있거나 (즉, 일란성 쌍둥이로부터 유래), 세포는 예를 들어, 환자의 친척 또는 환자와 관련이 없는 인간 림프구 항원 (HLA)-매칭된 개체 유래의 HLA-매칭된 세포일 수 있거나, 세포는 환자에 대하여 동종이계일 수 있으며, 즉, 예를 들어, 비-HLA-매칭된 도너 유래의 것일 수 있다.
세포 (예컨대, 자가 또는 비자가 세포) 공급원에 관계 없이, 세포제거된 실질 장기는 환자에 대하여 자가, 동종이계 또는 이종성일 수 있다.
특정한 예에서, 세포제거된 조직은 생체내에서 (예컨대, 조직이 개체 내로 이식된 후) 세포로 재세포화될 수 있다. 생체내 재세포화는 예를 들어, 본원에 기술된 세포 중 임의의 것을 이용하여 상기 기술된 바와 같이 (예컨대, 주입 및/또는 관류) 수행될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 내인성 세포를 세포제거된 장기 또는 조직에 생체내에서 시딩하는 것은 천연적으로 일어날 수 있거나, 재세포화된 조직에 전달된 인자에 의해 매개될 수 있다.
치료
본 발명은 본 발명의 세포를 사용하여 각종 폐 질환 및 병태를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 예에서, 세포는 유전적으로 변형된 세포를 포함하였다.
본 발명은 또한 본 발명의 세포를 투여함으로써 하나 이상의 폐 질환 또는 병태를 치료하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 조성물은 기관내로 투여될 수 있다. 본 발명의 가장 바람직한 실시양태에서, 기관내 투여는 폐 조직, 예컨대, 폐포를 본 발명의 세포에 접촉 또는 노출시키는 것을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법은 하나 이상의 폐 조직을 본 발명의 세포를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것이 바람직할 수 있는 임의의 폐 질환 또는 병태를 치료 또는 억제시키는 데 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 질환 또는 병태란 폐 기능 또는 구조에 병적 변경을 일으키는 임의의 질환 또는 병태를 의미한다. 예시적인 질환 또는 병태로는 기관지폐 형성이상 (BPD), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 폐기종, 낭성 섬유증 (CF), 폐 형성 저하증, 및 폐 고혈압, 및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물 및 방법은 임의의 질환 또는 병태에 의해 유발된 폐포 손상을 치료하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 질환 또는 병태로는 기관지 폐 형성이상 (BPD), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 폐기종, 및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물 및 방법은 임의의 산소 유도성 폐 손상, 질환, 또는 병태를 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 질환 또는 병태로는 기관지 폐 형성이상 (BPD), 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 폐기종, 낭성 섬유증 (CF), 폐형성 저하증, 폐 고혈압, 및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
유전자 요법과 관련하여, 세포를 수혜자 내로 전달하기 이전에 관심 유전자로 처리할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 세포 기반 유전자 전달은 예컨대, 아데노바이러스 유전자 전달 벡터의 흡입과 같이 폐에 유전자를 전달하는 다른 수단의 상당한 이점을 제공할 수 있다. 세포 기반 유전자의 숙주로의 전달이 가지는 상기와 같은 우수성은 흡입된 유전자 전달 벡터가 전형적으로는 점막층 및 숙주 면역계에 의해 가해지는 장벽으로 인하여 세포 형질도입의 효율성을 불량하게 만든다는 관찰 결과로부터 비롯된 것이다. 세포 내로 사전 삽입된 치료학적 유전자의 전달은 수용 폐 세포 내로의 유전자 요법 벡터의 투과와 결부된 문제를 회피한다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 배양된 유전적으로 변형된 세포의 용도를 제공한다. 유전자 변형은 예를 들어, 외인성 유전자 ("트랜스진") 를 발현시키거나, 내인성 유전자의 발현을 변화시킬 수 있다. 그러한 유전자 변형은 치료학상 유익할 수 있다. 별법으로, 유전자 변형은 상기와 같이 변형된 세포를, 예를 들어, 본 발명의 조성물을 개체 내로 삽입한 이후에 추적 또는 확인하는 수단을 제공할 수 있다. 세포 추적은 이식된 유전적으로 변형된 세포의 이동, 동화 및 생존을 추적하는 것을 포함할 수 있다. 유전자 변형은 또한 적어도 제2 유전자를 포함할 수 있다. 제2 유전자는 예를 들어, 선별가능한 항생제 저항성 유전자 또는 또 다른 선별가능한 마커를 코딩할 수 있다.
세포 추적에 유용한 단백질로는 녹색 형광 단백질 (GFP), 다른 형광성 단백질 중 임의의 것 (예컨대, 증강된 녹색, 청록색, 황색, 청색 및 적색 형광성 단백질; 클론테크(Clontech, 미국 캘리포니아주 팔로 알토)) 또는 다른 태그 단백질 (예컨대, LacZ, FLAG-tag, Myc, His6 등)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
세포의 유전자 변형 목적이 생물학적으로 활성인 물질을 제조하는 것인 경우, 상기 물질은 일반적으로 주어진 장애의 치료에 유용한 것이 될 것이다. 예를 들어, 세포가 뼈 또는 연조직 형성과 관련된 특정한 성장 인자 생성물을 분비하도록 세포를 유전적으로 변형시키는 것이 요망될 수 있다. 조직 수복과 관련된 다른 내인성 세포 유형의 성장을 유도하는 성장 인자 생성물 또한 유용하다. 예를 들어, 내인성 모세관 및/또는 미세혈관 내피 세포를 자극하는 성장 인자가 연조직 결함의 수복에서, 특히, 더욱 큰 부피의 결함에 유용할 수 있다.
본 발명의 세포는 세포 내로의 외인성 유전 물질의 도입에 의해 유전적으로 변형되어 세포의 배양에 유익한 분자, 예컨대, 영양 인자, 성장 인자, 시토카인 등을 생산할 수 있다. 추가로, 세포는 상기 분자를 생산하도록 유전적으로 변형됨으로써 그를 필요로 하는 포유동물 내로 이식되었을 때, 포유동물에게 추가의 치료학적 효과를 제공할 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 세포는 포유동물에서 이식 부위에 이웃하는 세포에 유익한 분자를 분비할 수 있다.
폐 세포는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 유전적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)], [Ausubel et al.,. Eds, (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY)]를 참조할 수 있다. 예를 들어, 트랜스진을 포함하는 핵산이 세포 내에서 트랜스진이 발현되기에 적절한 조건하에 세포 내로 도입되도록 트랜스진을 포함하는 핵산을 포함하는 발현 벡터에 폐 세포를 노출시킬 수 있다. 트랜스진은 일반적으로 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트이다. 폴리뉴클레오티드는 단백질을 코딩할 수 있거나, 또는 생물학적으로 활성인 RNA (예컨대, 안티센스 RNA 또는 리보자임)를 코딩할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 독소에 대한 저항성을 부여하는 유전자, 호르몬 (예컨대, 펩티드 성장 호르몬, 호르몬 방출 인자, 성 호르몬, 부신피질 자극 호르몬, 시토카인 (예컨대, 인터페린, 인터루킨, 림포카인) 등), 세포 표면 결합 세포내 신호전달 모이어티 (예컨대, 세포 부착 분자, 호르몬 수용체 등), 주어진 분화 계통을 촉진하는 인자 (예컨대, 예컨대, 골 형성 단백질 (BMP)) 등을 코딩할 수 있다.
발현 카세트 내에서, 코딩 폴리뉴클레오티드는 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 적합한 프로모터의 예로는 원핵성 프로모터 및 바이러스 프로모터 (예컨대, 레트로바이러스 ITR, LTR, 즉시 초기 바이러스 프로모터 (IEp), 예컨대, 헤르페스바이러스 IEp (예컨대, ICP4-IEp 및 ICP0-IEEp), 시토메갈로바이러스 (CMV) IEp 및 다른 바이러스 프로모터, 예컨대, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 및 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 프로모터)를 포함한다. 다른 적합한 프로모터로는 진핵성 프로모터, 예컨대, 인핸서 (예컨대, 토끼 .베타.-글로빈 조절 요소), 구성적으로 활성인 프로모터 (예컨대, .베타.-액틴 프로모터 등), 신호 특이적 프로모터 (예컨대, 유도성 프로모터, 예컨대, RU486에 반응성인 프로모터 등) 및 조직 특이적 프로모터가 있다. 미리 정의된 세포 환경에서 유전자 발현을 유도하는 데 적합한 프로모터를 선택하는 것은 충분히 당업계의 기술 범위 내에 포함된다. 필요할 경우, 발현 카세트는 1 초과의 코딩 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 다른 요소 (예컨대, 폴리아데닐화 서열, 막 삽입 신호 또는 분비 리더를 코딩하는 서열, 리보좀 진입 서열, 전사 조절 요소 (예컨대, 인핸서, 사일런서 등) 등)를 포함할 수 있다.
트랜스진을 포함하는 발현 카세트는 트랜스진을 세포에 전달하는 데 적합한 유전적 벡터 내로 혼입되어야 한다. 원하는 최종 적용에 따라, 상기와 같은 임의의 벡터는 세포를 유전적으로 변형시키기 위해 그와 같이 이용될 수 있다 (예컨대, 플라스미드, 네이키드 DNA, 바이러스, 예컨대, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스바이러스, 렌티바이러스, 파필로마바이러스, 레트로바이러스 등). 상기 벡터 내의 원하는 발현 카세트를 구성하는 임의의 방법이 이용될 수 있으며, 이들 중 다수는 당업계에 널리 공지되어 있다 (예컨대, 직접적인 클로닝, 상동 재조합 등). 벡터 선택이 대개는 벡터를 세포 내로 도입하기 위하여 사용되는 방법 (예컨대, 원형질 융합, 인산칼슘 침전법, 유전자 총, 전기천공법, DEAE 덱스트란 또는 지질 캐리어 매개 형질감염, 바이러스 벡터를 이용한 감염 등에 의해)을 결정하며, 이러한 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.
중합효소 연쇄 반응 (PCR), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 및 다른 DNA 또는 RNA 중합효소 매개 기법을 비롯한, 시험관내 증폭 방법을 통해 당업자를 지도하는 데 충분한 기법의 예는 문헌 [Sambrook et al. (2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)]에서 살펴볼 수 있다.
일단 단백질에 대한 핵산을 클로닝하고 나면, 당업자는 다양한 폐 세포에서 재조합 유전자(들)를 발현시킬 수 있다. 당업자는 원하는 트랜스진을 발현시키는 데 이용가능한 다수의 발현 시스템에 대하여 정통할 것으로 기대된다.
폐 세포
분화는 제한 없이, Ca2+, 표피 성장 인자 (EGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 각질세포 성장 인자 (KGF), 형질전환 성장 인자 (TGF), 시토카인 예컨대, 인터루킨, 인터페론, 또는 종양 괴사 인자, 레티노산, 트랜스페린, 호르몬 (예컨대, 안드로겐, 에스트로겐, 인슐린, 프로락틴, 트리아이오도티로닌, 히드로코르티손, 또는 덱사메사손), 부티르산나트륨, TPA, DMSO, NMF (N-메틸 포름아미드), DMF (디메틸포름아미드), 또는 기질 요소, 예컨대, 콜라겐, 라미닌, 헤파란 술페이트)를 비롯한, 하나 이상의 분화제를 사용하여 유도될 수 있다.
한 실시양태에서, MSC는 폐 표현형을 가지는 세포로 분화되도록 유도될 수 있다. 예를 들어, MSC는 II형 폐포세포(pneumocyte)로도 알려져 있는, II형 폐포 세포(alveolar cell)로 분화되도록 유도될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, MSC는 클라라 세포로 분화되도록 유도될 수 있다.
뇌하수체 추출물 (예컨대, 소 뇌하수체 추출물), 스테로이드 호르몬 (예컨대, 히드로코르티손, 또는 그의 염, 예컨대, 아세테이트), 성장 인자 (예컨대, 표피 성장 인자, 바람직하게, 인간 표피 성장 인자), 카테콜아민 (예컨대, 라세믹 형태 또는 거울상이성질체 형태의 에피네프린), 철 결합 단백질 (예컨대, 트랜스페린), 인슐린, 비타민 (예컨대, 레티노산), 갑상샘 호르몬 (예컨대, 트리아이오도티로닌), 혈청 알부민 (예컨대, 소 또는 인간 혈청 알부민, 재조합 제제 포함), 항생제 (예컨대, 아미노글리코시드 항생제, 예컨대, 겐타마이신), 및/또는 항진균제 (예컨대, 암포테리신-B) 중 하나 이상의 것을 함유하는 배지가 사용될 수 있다. 예를 들어, 배지는 히드로코르티손, 표피 성장 인자, 인슐린, 트리아이오도티로닌, 트랜스페린, 및 소 혈청 알부민을 포함할 수 있고, 일부 실시양태에서, 레티노산, 뇌하수체 추출물, 및 에피네프린을 추가로 포함할 수 있다. 캠브렉스(Cambrex)로부터의 SAGM™ 배지 (카탈로그 CC-3118)는 특히 MSC를 원하는 폐 세포로 분화시키는 데 유용하다.
본 발명자들은 적절한 분화 인자 및 배양 조건을 사용함으로써 순수한 폐 세포 집단을 수득할 수 있다. 한 실시양태에서, 폐 세포는 원위 폐 세포 유형, 바람직하게, 폐포-유형 세포, 더욱 바람직하게, I형 또는 II형 폐포-유형 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 폐 세포는 클라라 세포이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 MSC의 폐포 II형 세포로의 직접적인 분화를 효율적으로 유도한다. 일부 실시양태에서, 본 방법을 통해 충분히 순수한 폐포 II형 세포 집단 (95% 이상의 폐포 II형 표현형)을 수득할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 MSC의 클라라 세포로의 직접적인 분화를 효율적으로 유도한다. 일부 실시양태에서, 본 방법을 통해 충분히 순수한 클라라 세포 집단 (95% 이상의 클라라 세포 표현형)을 수득할 수 있다.
폐 세포 (예컨대, 폐포 II형 세포)로의 분화는 예를 들어, 광학 현미경법에 의해 평가되는 바, 폐 형태에 의해, 및 투과 전자 현미경법에 의해 평가되는 바, 층판소체 및 미세소포체의 존재에 의해 확인할 수 있다. 층판소체는 오직 폐포 II형 세포에서만 발현되는 내재 막 단백질인, 폐 계면활성제인 계면활성제 단백질 C (SPC)의 저장 형태로서의 역할을 하는 분비성 리소좀이다. SPC mRNA의 존재는 역전사효소 PCR에 의해 검출될 수 있고, SPC 단백질의 존재는 면역형광 염색법에 의해 검출될 수 있다. 클라라 세포 분화는 CCSP의 존재를 검출함으로써 평가될 수 있다.
본 발명은 중간엽 줄기 세포, 예컨대, 골수 및 지방 조직 중간엽 줄기 세포를 폐 세포, 폐 세포 집단으로 분화시키기 위한 방법 및 조성물, 및 폐 결함 완화 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 폐 결함을 완화 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 관한 하기의 상세한 설명은 첨부된 도면을 함께 판독할 때 더욱 잘 이해될 것이다. 본 발명을 예시하기 위한 목적으로, 현재 바람직한 실시양태를 도면에 제시한다. 그러나, 본 발명은 도면에 제시된 실시양태의 정확한 처리 방식 및 수단으로 제한되지 않음을 이해하여야 한다.
도 1a 내지 도 1f를 포함하는 도 1은 부착성, 계대 2, hBM-MSC 및 hAT-MSC 샘플의 FACS 분석 결과를 도시하는 것으로, 이는 세포가 중간엽 기질 세포 마커 및 상피의 마커를 발현한다는 것을 나타내는 것이다. (도 1a) 계대 2 hBM-MSC의 형태. (도 1b) hBM-MSC는 CD90, CD105 및 CD73을 비롯한 MSC 마커에 대하여 양성이고, CD45에 대해서는 음성이다. (도 1c) hBM-MSC의 서브집단은 상피 마커인 프로-SPC, CCSP 및 시토케라틴-5를 발현한다. (도 1d) 계대 2 hAT-MSC의 형태. (도 1e) hAT-MSC의 FACS 분석을 통해 상기 세포 또한 CD90, CD105 및 CD73을 비롯한 마커에 대하여 양성이고, 이는 CD45 음성이라는 것이 확인된다. (도 1f) hAT-MSC는 또한 프로-SPC, CCSP 및 시토케라틴 5에 대해 양성인 세포 집단을 함유한다. 이소형 대조군 및 실험 샘플이 제시되어 있다.
도 2a 내지 도 2f를 포함하는 도 2는 hBM-MSC로 시딩된 폐 생물반응기 배양물(도 2a, 2b)을 연구한 실험의 결과를 도시한 것이다. DAPI 염색은 천연의 것 중의 핵 (도 2a), 및 세포제거된 폐 중 핵의 부재 (도 b)를 나타내는 데 사용된다. (도 2c) hBM-MSC로 시딩되고, SAGM 중에서 7일 동안 배양된 폐의 H&E 조직 섹션. (도 2d) 프로-SPC에 대한 면역염색은 2형 폐포세포 마커에 대해 양성인 다수의 세포를 보여준다. (도 2e, 2f) 클라라 세포 마커인 CCSP에 대한 면역염색에 의해 양성인 세포는 존재하지 않은 반면 (도 2e), 시토케라틴-5 양성인 세포는 드문드문 존재하였다 (도 2f). (도 2g, 2h) hBM-MSC 유래 세포가 2형 폐포세포인 것으로 명확하게 확인하는 추가의 방법으로서 TEM 분석을 수행하였다. 천연 2형 세포의 TEM 분석 (도 2e) (화살표 표시는 층판소체를 나타내고; V형 무늬는 분비성 소포체를 나타낸다). (도 2f) hBM-MSC가 재시딩된 폐는, 둘 모두가 2형 폐포세포의 특징인 것인, 층판소체 (화살표 표시) 및 분비성 소포체 (화살촉 표시), 둘 모두를 가지는 세포를 함유한다.
도 3a 내지 도 3d를 포함하는 도 3은 인간 지방 중간엽 기질 세포 (hAT-MSC)가 폐 생물반응기에서 배양되었을 때, 2형 폐포세포 유사 세포를, 및 기도에서 막을 형성하는 클라라 유사 세포를 생성한다는 것을 입증하는 실험의 결과를 도시한 것이다. (도 3a) hAT-MSC는 무세포성 래트 폐 생물반응기 중 SAGM에서의 7일간의 배양 후 폐 기질을 강건하게 재증식시킨다. H&E 염색은 세포가 기도의 내막 (화살표 표시)에 존재하고자 하는 특정의 친화성을 나타낸다. (도 3b) 기도에서 막을 형성하는 세포 (화살표 표시)가 클라라 세포 마커인 CCSP에 대하여 양성이다. (도 3c) 기질 상에서 성장하는 세포가 프로-SPC에 대하여 양성이다. 삽입된 도면은 프로-SPC에 대하여 양성인 세포의 과립 세포질 염색을 보여주는 것이다. (도 3d) hAT-MSC는 세포제거된 기질 상에서 성장시켰을 때, 시토케라틴-5 발현을 유지한다는 것을 보여주는 것은 없다.
도 4a 내지 도 4g를 포함하는 도 4는 hBM-MSC 또는 hAT-MSC로 시딩된 3일째 및 7일째의 폐 생물반응기 배양물의 RT-PCR 분석을 나타내는 실험의 결과를 도시한 것이다. (도 4a-c) hBM-MSC는 폐 생물반응기 배양물 중에서 시간이 증가됨에 따라 SPC, 아쿠아포린-1 및 카베올린-1을 비롯한 원위 상피 유전자의 유전자 발현 수준을 증가시켰다. (도 4d-f) 유사하게, hAT-MSC는 배양 기간이 장기화됨에 따라 원위 유전자의 발현을 증가시킨다. 폐 생물반응기 중의 세포의 변화 배수는 모두 조직 배양 플라스크 중에서 성장시킨 MSC와 비교된 것이다. (도 4g) 유전자 서열을 증폭시키기 위하여 사용된 프라이머.
도 5a 내지 도 5e를 포함하는 도 5는 SAGM에서 성장시킨 hAT-MSC 및 hBM-MSC가 계면활성제를 활발하게 생산한다는 것을 입증하는 실험의 결과를 도시한 것이다. 무세포성 래트 폐 상에 시딩된 hBM-MSC (도 5a) 및 hAT-MSC (도 5b)에 관한 RT-PCR 분석은 배양 시간이 증가됨에 따라 SPC 발현이 계속해서 증가한다는 것을 나타낸다. 7일 동안 SAGM에서 배양된 폐 슬라이스 중의 hBM-MSC (도 5d) 및 hAT-MSC (도 5e)는 폐 슬라이스에 인접한 배양 배지 중 육안상 보이는 계면활성제 소적을 가진다. (도 5c) 배지 샘플에 대한 ELISA는 3일째 5.5 ng/mL의 SPC가 hAT-MSC 폐 슬라이스 배양물 중에 존재하고, 3.3 ng/ml가 hBM-MSC 배양물 중에 존재한다는 것을 나타낸다. 7일째, SPC의 농도는 hAT-MSC의 경우, 1.1 ng/mL, 및 hBM-MSC의 경우, 0.26 ng/mL로 더 낮다. ELISA 값은 모두 SAGM 배지 단독인 것으로 정규화된 것이었다. 막대는 S.E.M.을 나타낸다.
도 6a 내지 도 6f를 포함하는 도 6은 기재 코팅물이 hBM-MSC 및 hAT-MSC에서 상피 마커 발현에 영향을 미친다는 것을 입증하는 일련의 영상이다. hBM-MSC 및 hAT-MSC를 SAGM 배지 중 각종 ECM 코팅물 (인간 ECM, 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐 IV, 및 콜라겐 I) 상에서 배양하였다. 7일간 배양한 후, FACS에 의해 CCSP, 프로-SPC, 및 시토케라틴 5의 발현에 대하여 hBM-MSC (도 6a) 및 hAT-MSC (도 6b)를 분석하였다. MSC의 두 공급원 모두 상이한 표면 코팅물 상에서 배양되었을 때, 상피 마커 발현에 있어 달랐다. (도 6c, 6d) 상이한 표면 코팅물 상에서 배양한 후, CCSP, SPC, 및 시토케라틴 5의 발현에 대하여 RT-PCR 분석 또한 수행하였다. RT-PCR 데이터는 FACS 분석과 매우 잘 일치하고, 이는 SPC의 최고 발현은 다른 표면 코팅물 상에서 성장시킨 MSC와 비교하였을 때 인간 ECM에서 성장시킨 MSC에서 관찰되었다는 것을 나타낸다. 인간 ECM 상에서 성장시킨 hBM-MSC (도 6e) 및 hAT-MSC (도 6f) 사이의 세포 형태상의 차이 또한 본 실험으로부터 입증되었다.
도 7a 내지 도 7f를 포함하는 도 7은 hBM-MSC로 시딩되고, 10% FBS/DMEM 중에서 성장시킨 래트 폐 생물반응기 배양물은 섬유아세포 형태 및 단백질 발현을 가지는 부착된 세포를 가진다는 것을 입증하는 실험의 결과를 도시한 것이다. (도 7a) 7일째 배양물의 H&E 조직학적 분석은 세포가 재세포화된 장기 전역에 걸쳐 균일하게 퍼져 존재함을 입증한다. 부착된 세포는 대개 형태상 섬유아세포이다. (도 7b) 근섬유아세포를 검출하는 데 사용되는 마커인 a-sma에 대한 면역형광 결과, 세포 대부분이 근섬유아세포 마커에 대하여 양성인 것으로 나타났다. (도 7c, 7d) 10% FBS/DMEM 또는 소기도 성장 배지 (SAGM) 중에서 성장된 hBM-MSC의 시토스핀에서의 CCSP 발현에 관한 면역형광 분석. CCSP 발현은 어느 조건에서든 배양된 세포에서 유지된다. (도 7e, 7f) 어느 배지에서든 성장시킨 세포 중의 a-sma 발현에 대한 면역형광은 세포를 SAGM 중에서 성장시켰을 때, a-sma은 대개 존재하지 않다는 것을 나타낸다.
도 8a 내지 도 8d를 포함하는 도 8은 hAT-MSC 또는 hBM-MSC 중 어느 하나로 재시딩되고, 10% FBS/DMEM 중에서 배양된 폐 슬라이스 중에는 육안상 보이는 계면활성제 분비가 존재하지 않았음을 입증하는 실험의 결과를 도시한 것이다. 10% FBS/DMEM 중 폐 슬라이스 상에서 배양된 (도 8a) hAT-MSC 및 (도 8b) hBM-MSC는 배지 중 육안상 보이는 계면활성제를 함유하지 않는다. (도 8c, 8d) 대조군으로서, 시딩되지 않은 샘플 또한 배지 중 계면활성제 풀에 대하여 분석하였지만, 이들은 어느 육안상 보이는 계면활성제도 함유하지 않았다.
도 9는 상이한 ECM 기재 상에서 7일 동안 SAGM 중 조직 배양 플라스크 상에서 성장시킨 hBM-MSC의 FACS 플롯 세트이다.
도 10은 상이한 ECM 기재 상에서 7일 동안 SAGM 중 조직 배양 플라스크 상에서 성장시킨 hAT-MSC의 FACS 플롯 세트이다.
도 11a 내지 도 11i를 포함하는 도 11은 세포제거된 간 기질 상에서 배양된 hBM-MSC가 폐에서 배양된 것과 형태상 상이하다는 것을 입증하는 실험의 결과를 도시한 것이다. (도 11a) 세포제거된 간의 전조직 표본 영상. (도 11b) 세포제거된 간의 H&E 조직학적 분석은 기질 상에 어떤 세포도 남아있지 않음을 보여준다. (도 11c, 11d) 재시딩된 간 슬라이스를 3일 동안 10% FBS/DMEM (도 11c) 중에서 또는 SAGM (도 11d) 중에서 배양하였다. 상기 세포와 폐 상에 시딩된 것 사이의 형태상의 비교는 세포 형상이 매우 차이난다는 것으로 나타낸다 (도 3c). 10% FBS/DMEM 중에서, 또는 SAGM 중에서 성장시킨 세포는 CCSP 및 시토케라틴 5에 대하여 음성인 반면 (도 11e, 11g, 11h, 11j), 소수의 세포가 프로-SPC에 대하여 여전히 양성인 상태 그대로였다 (도 11f, 11i).
도 12는 폐 상피 마커에 대하여 음성으로 염색된 대조군으로서의 전체 비분획된 인간 골수 세포를 보여주는 그래프 패널이다. 비분획된 인간 골수 단핵구 세포를 폐 상피 마커인 프로-SPC, CCSP, 및 시토케라틴-5에 대하여 염색하였다. 양성 마커 발현을 가지는 비분획된 세포는 나타나지 않았다. 우측의 음영 표시된 피크는 항체 대조군이 없는 것을 나타내고; 좌측의 피크는 항체와 함께 인큐베이션된 세포를 나타낸다.
본 발명은 하기 실험 실시예를 참조로 하여 상세히 추가로 기술된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 달리 명시되지 않는 한, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 어느 방식으로든 하기 실시예로 제한되는 것으로 해석되지 않아야 하며, 오히려, 본원에서 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 및 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
추가의 설명 없이도, 당업계의 숙련가는 상기 기술 내용 및 하기의 예시적인 실시예를 사용함으로써 본 발명의 화합물을 제조하고, 사용할 수 있고, 청구된 방법을 실시할 수 있을 것으로 여겨진다. 그러므로, 하기의 실험 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 구체적으로 언급하며, 어느 방식으로든 본 개시내용의 나머지 부분을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: 세포제거된 폐 스캐폴드에서 배양될 때, 인간 중간엽 기질 세포의 상피 세포 분화는 조직 기원에 따라 달라진다
본원에 제시된 실험에서, 래트 세포제거된 폐 기질 상에서의 배양 이후, 폐 상피로 기여할 수 있는 인간 유래 BM-MSC 뿐만 아니라, AT-MSC의 잠재능을 평가하였다. hBM-MSC 및 hAT-MSC는 폐 스캐폴드 상에의 시딩 이후에 부착 및 성장할 수 있는 것으로 나타났다. 소기도 성장 배지 (SAGM) 중 세포제거된 래트 폐 스캐폴드에서 7일간의 배양 이후에 hBM-MSC는 2형 폐포세포 마커인 프로-SPC를 RNA 및 단백질 수준으로 발현하고, 계면활성제를 배양 배지로 분비하고, 투과 전자 현미경법 (TEM)으로 보여지는 층판소체를 함유한다. 추가로, hBM-MSC 세포는 래트 생물반응기에서의 배양 이후에 근위 기도 마커인 시토케라틴-5에 대해 양성인 세포를 생성한다. 대조적으로, hAT-MSC는 프로-SPC 양성인 세포 뿐만 아니라, 해부학상 정확한 위치에서 기도에서 막을 형성하는 클라라 유사 세포를 생성한다. 그러나, hAT-MSC는 hBM-MSC와 달리, 폐 생물반응기에서의 배양 이후에 시토케라틴-5 양성인 세포를 생성하지 못한다.
hBM-MSC 및 hAT-MSC를 인간 ECM, 마트리겔(Matrigel), 라미닌, 콜라겐 1, 콜라겐 4, 및 피브로넥틴으로 코팅된 조직 배양 디쉬 상에 시딩함으로써 기재 기질 조성이 중간엽 기질 세포의 분화에 미치는 영향 또한 분석하였다. 표준 조직 배양 플라스크에서 성장되었을 때, 폐 상피 마커를 발현하는 MSC의 비율(%)에 매트릭스 표면 코팅제가 영향을 준다는 것이 본원에서 입증되었다. 추가로, hBM-MSC를 세포제거된 간 상에서 배양하였고, 간 슬라이스 상에 시딩된 MSC는 그가 폐 기질 상에서 배양되었을 때 존재하는 상피 마커와 동일한 모음을 유지하지 않는 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 세포제거된 폐 스캐폴드가 세포 분화를 지시하는 "집 코드"를 유지한다는 것을 시사한다. 본 데이터는 인간 유래 hBM-MSC 및 hAT-MSC는 세포제거된 폐 상에 배치되었을 때 다중의 폐 상피 세포 유형을 생성할 수 있다는 것을 입증하는 것이다.
이제 본 연구에서 사용된 물질 및 방법을 기술한다.
인간 골수 및 지방 조직 중간엽 기질 세포의 단리 및 특징 규명
신선한, 프로세싱되지 않은 인간 골수 샘플을 론자(Lonza: 미국 뉴저지주 앨런데일) (카탈로그 번호 1M-125)로부터 획득하였다. 연령 범위가 22-29세인 여성 2명 및 남성 1명으로부터의 것인 총 3개의 도너 샘플을 획득하였다. 10% FBS를 함유하는 높은 글루코스의 DMEM 중에 골수 세포를 5x105개의 세포/㎠ 밀도로 플레이팅하였다. 배지를 매 2 내지 3일마다 교체하였다. 오직 낮은 계대 (≤ 5) 세포만 본 실험에서 사용하였다. 세포를 매 7-10일마다 1:3 비율로 계대하였다. 유세포 측정법 (BD LSR II)에 의해 세포를 CD90, CD105, CD73, CD45 (모든 항체는 e바이오사이언시즈(eBiosciences)로부터 획득하였다)의 발현에 대하여 특징 규명하였다.
연령 범위가 44-63세인 3명의 도너로부터 AT-MSC를 획득하였다. 지질 흡인물을 DPBS를 이용하여 2x로 세척한 후, 37℃에서 60분 동안 DMEM 중에서 0.15% 콜라게나제 1형 (기브코(Gibco: 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드), 카탈로그 번호 17100-017)으로 분해하였다. 10% FBS/DMEM을 첨가하여 분해를 중단시킨 후, 원심분리하고, 10% FBS/DMEM 중에 재현탁시키고, 100 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 매 2-3일마다 세포를 공급하였다.
FACS
단일 세포를 10분 동안 2% 파라포름알데히드 용액으로 고정시키고, 매회 5분 동안 2회에 걸쳐 PBS 중에서 세척하였다. 세포를 관심 항체 희석액을 함유하는 0.2% 트린톤 X-100, 10% FBS와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 암실에서 25분 동안 얼음 상에서 하기 항체 (이들은 모두 e바이오사이언시즈(미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 입수): CD45-PE (12-9459-41), CD90-FITC (11-0909-41), CD73-PE (12-0739-41), CD105-APC (17-1057-41)와 함께 인큐베이션시켰다. 사용된 추가 항체는 프로-SPC 1/100 (밀리포어(Millipore: 미국 매사추세츠주 빌레리카): ab 3786), 및 CCSP 1/100 (밀리포어 07-623)이었다. 1/500으로 희석된 모든 종의 적절한 인비트로겐(Invitrogen) 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)가 상기 항체에 대해 2차적인 것이었다. 사용된 이소형 대조군으로는 항-마우스 IgG-PE (e바이오사이언시즈 12-4714), 항-마우스 IgG-FITC (e바이오사이언시즈11-4724), 항-마우스 IgG APC (e바이오사이언시즈 17-4015-80), 토끼 IgG-FITC (e바이오사이언시즈 11-4614-80), 및 정제된 토끼 IgG (인비트로겐 02-6102)를 포함하였다. 이소형 대조군 이외에도, 오직 2차 항체 대조군만이 병행하여 수행되었다.
래트 폐 샘플의 세포제거 및 재시딩
앞서 기술된 바와 같이 (문헌 [Petersen et al., 2010, Science 329:538-541]) 성체인 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트의 폐 (3개월 내지 5개월된 래트)에서 세포제거하였다. 간략하면, 펜토바비탈나트륨 (유타솔(Euthasol))을 IP 주사하여 래트를 안락사시켰다. 래트 폐를 절제하고, 기관 및 폐 동맥에 캐뉼러를 삽입하였다. 헤파린 (50 U/ml) 및 니트로프루시드나트륨 (1 ㎍/ml)으로 이루어진 혼합물 10 ml를 폐 동맥을 통해 중력에 의해 주입하였다. 20 mmHg의 일정한 압력하에 37℃에서 PBS 중 8 mM CHAPS, 25 mM EDTA, 1 M NaCl로 구성된 세포제거 용액 (pH 12) 500 ml를 폐 동맥에 서서히 주입하였다. 이어서, 기도를 통해 폐에 10 ml의 벤조나제를 주입하고, 37℃에서 1 hr 동안 인큐베이션시켰다. 2.5 L PBS로 세포 잔류물을 세척하였다. 세포를 시딩하기 전 16시간 이상 동안 항생제 및 항곰팡이제 (1% 겐타마이신, 4 mg/ml 암포테리신, 10% 페니실린/스트렙토마이신) 혼합물 중에서 폐를 인큐베이션시켰다. 상기 인큐베이션 동안, 용액을 1 mL/분으로 폐 동맥을 통해 관류시켰다. 세포를 시딩하기 전, 항생제/항곰팡이제 용액을 폐로부터 제거하고, PBS로 교체하였다. 세포 시딩 전 추가로 30분 동안 폐에 PBS를 관류시켰다. 세포를 2.5X106 내지 10X106 세포의 볼루스로서 기관을 통해 단일 세포제거된 우상 래트 폐엽으로 시딩하였다. 배지를 폐 동맥을 통해 1 ml/분으로 관류시키면서, 배양물을 SAGM (론자 (미국 뉴저지주 앨런데일); 카탈로그 번호 CC-3118) 중에서 7일 동안 유지시켰다. 매지를 매 2-3일마다 교체하였다.
면역조직화학법
10% 포르말린 용액을 기도를 통해 폐에 서서히 주입하고, 일정하게 로킹하면서 실온에서 4시간 동안 10% 포르말린 중에 놓았다. 폐를 파라핀 중에 포매시키고, 5 ㎛로 절단하였다. 표준 재수화 알콜/크실렌 시리즈 후, 섹션에서 파라핀을 제거하였다. 재수화된 조직 섹션을 75℃에서 20분 동안 트리스-EDTA 완충제 (10 mM 트리스 베이스, 1 mM EDTA, 0.05% 트윈-20 (pH 9.0))와 함께 인큐베이션시킴으로써 항원 회수를 수행하였다. 이어서, 조직 섹션을 실온에서 추가의 20분 동안 냉각시켰다. 면역염색 이전에 섹션을 PBS 중에서 1회에 걸쳐 세척하였다. 섹션을 45분 동안 차단 시약 (PBS 중 10% NGS 또는 FBS, 0.2% 트리톤 X-100) 중에서 인큐베이션시켰다. 1차 항체 (CCSP 1/50: 밀리포어 카탈로그 번호 07-623; 프로-SPC 1/100: 밀리포어: # ab 3786; 카베올린-1 1/100: 압캠(Abcam: 영국 케임브리지) # 39541; 알파 평활근 액틴 1/100: 다코(Dako: 덴마크 글로스트럽) 카탈로그 번호 M0851)를 실온에서 2시간 동안, 또는 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 섹션을 매회 세척당 3분 동안 3회에 걸쳐 PBS 중에서 세척한 후, 실온에서 45분 동안 2차 항체 (1/500으로 희석된 인비트로겐 알렉사 플루오르 시리즈로부터의 모든 종 특이 2차 항체)로 함께 인큐베이션시켰다. DAPI를 함유하는 벡터 랩 벡타쉴드(Vector labs Vectashield) 장착 배지 (벡터 캐트.(Vector cat.: 미국 뉴욕주 올리앤) # H1200)에 조직 섹션을 장착하였다.
프로세싱된 섹션을 자이스(Zeiss) 형광 현미경으로 영상화하고, 벨로시티(Volocity) 소프트웨어를 이용하여 영상을 획득하였다. 레이카(Leica) TCS SP5를 이용하여 공초점 현미경 영상을 획득하였다.
실시간 정량적 RT-PCR
퀴아젠(Qiagen)으로부터 입수한 RN이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit)를 이용하여 제조사의 설명서에 의해 전체 RNA를 세포로부터 추출하였다. 슈퍼스크립트 퍼스트 스트랜드 신테시스 시스템(SuperScript First-Strand Synthesis System)을 이용하여 제조사의 프로토콜 (인비트로겐)에 따라 프라이머로서 무작위 육량체를 사용하여 제1 가닥 상보성 DNA (cDNA)를 합성하였다. PCR 증폭을 위해 주형으로서 동량의 생성물 혼합물을 사용하였다. 25 ㎕ 부피로 iQTM SYBR 그린 슈퍼믹스(iQTM SYBR Green Supermix) (바이오-래드(Bio-Rad: 미국 뉴욕주 허큘리스)), 및 각각 200 nM씩의 제시된 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 i사이클러(iCyler) 및 iQ 소프트웨어 (바이오-래드)를 사용함으로써 반응을 수행하였다. 각 샘플에 대해 3중으로 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 4 분 동안의 초기 변성 단계, 이어서, 95℃에서 15 초, 60℃에서 30 초, 및 72℃에서 30 초로 이루어진 40사이클의 PCR을 포함하였다. 관심 유전자 (GOI)에 대해 3중으로 수행된 PCR 반응으로부터의 평균 역시 사이클 (Ct) 값을 같은 cDNA 샘플로부터의 GAPDH에 대한 평균 Ct 값에 대하여 정규화하였다. 샘플 A와 샘플 B 사이의 GOI 전사체 수준의 변화 배수는 2-ΔΔCt, (여기서, ΔCt = Ct(GOI) - Ct(GAPDH), 및 ΔΔCt=Ct(A) - Ct(B))와 같다. 사용된 프라이머는 본원 다른 곳에 열거되어 있다.
통계학적 분석
모든 통계학적 분석을 오리진(Origin) 소프트웨어 (오리진랩(OriginLab: 미국 매사추세츠주 노샘프턴)를 이용하여 수행하였다. 데이터는 평균 ± s.e.m. (측정치의 표준 오차)으로서 표현하였다. T-검정을 수행하여 두 군이 서로 유의적으로 상이한지 여부를 평가하였고, p ≤0.05인 것을 통계학상 유의적인 것으로 간주하였다.
TEM
문헌 [Schmiedl et al. 2005]로부터의 변형된 프로토콜에 따라 수행하였다 (문헌 [Schmiedl, et al., 2005, Histochem Cell Biol 124(6):465-76]). 천연 래트 폐 및 재세포화된 폐를 37℃에서 30분 동안 0.2 M 소듐 카코딜레이트 중 2.5% 글루타르알데히드/2.0% 파라포름알데히드로 팽창 고정시킨 후, 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 고정된 조직을 0.1 M 소듐 카코딜레이트로 세정하였다. 조직을 2시간 동안 1% OsO4 중에서 후속으로 고정시킨 후, 블록에서 우라닐 아세테이트 염색법을 수행하였다. 조직을 표준 에탄올 시리즈에서 탈수시키고, EPON 중에 포매시켰다. 섹션 (70 nm)을 수득하고, 우라닐 아세테이트 및 납 시트레이트를 이용하여 후속으로 염색시켰다. 필립스 텍나이(Philips Tecnai) 투과 전자 현미경으로 영상을 수득하였다.
세포 배양을 위한 기질 단백질의 코팅물
피브로넥틴 (50 ㎍/ml), 콜라겐 I (100 ㎍/ml), 콜라겐 IV (50 ㎍/ml), 마트리겔 (1:80), 및 인간 ECM 단백질의 혼합물 (1:100) (콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 테나신, 엘라스틴, 및 다수의 프로테오글리칸 및 글리코사미노글리칸으로 구성; 시그마)을 비롯한 상이한 세포외 단백질 상에서 hBM-MSC 및 hAT-MSC를 7일 동안 배양하였다. 피브로넥틴, 콜라겐 I, 콜라겐 IV 및 라미닌이 폐 기질의 주요 성분이다.
SPC에 대한 효소 결합 면역흡착 검정 분석법 (ELISA)
제조사의 설명서 (라이프 사이언스 어드밴스드 테크놀러지(Life Science Advanced Technology))에 따라 래트 무세포성 폐 스캐폴드 상에서 배양된 hBM-MSC 및 hAT-MSC의 상청액으로부터 수집된 세포 배양 배지에서 ELISA를 수행하여 분비된 SPC를 정량화하였다. 총 세포 개수에 대해 SPC 값을 정규화하고, 신선한 SAGM 배지 단독인 것의 값으로부터 실험 샘플에 대한 값을 감산하였다.
이제 실험 결과를 기술한다.
골수 및 지방 조직으로부터 단리된 MSC 특징 규명
새로 단리된 골수 샘플로부터 hBM-MSC를 수득하였다 (도 1a-1c). 비분획된 골수를 조직 배양 플라스크에 놓고, 생성된 부착성 세포를 분화 마커의 정규 MSC 클러스터 발현에 대해 면역표현형을 분석하였다. 2 내지 4 계대의 조기 계대 hBM-MSC는 CD90, CD105, 및 CD73에 대해서는 93% 초과로 양성을 띤 반면, CD45에 대해서는 대부분 음성을 띠었다 (도 1b). 이전 연구에서는 배양된 MSC 유사 세포의 서브분획이 상피 마커를 발현할 수 있는 것으로 밝혀졌는 바 (문헌 [Wong, et al., 2009, J Clin Invest 119(2):336-48]), 세포를 또한 CCSP, 프로-SPC 및 시토케라틴 5 (도 1c)를 비롯한 상피 마커의 발현에 대해서도 검정하였다 (도 1c). FACS 분석 결과, hBM-MSC는 10% FBS/DMEM 주에서의 표준 배양 후, 상피 마커를 발현하는 것으로 나타났다. 본원에 제시된 데이터는 FACS 분석에 의하면 hBM-MSC는 CCSP (80%), 프로-SPC (63%), 및 시토케라틴-5 (77%)에 대해 양성임을 나타낸다 (도 1c). 본 실험에 대한 음성 대조군으로서, 전체 비분획된 골수 단핵구 세포를 FACS에 의해 분석하였고, 이는 폐 상피 마커 평가에 대해 균일하게 음성을 띠었다 (도 12).
새로 수거된 지질 흡인물로부터 hAT-MSC를 단리시켰다 (도 1d-1f). 세포를 콜라게나제 1 조직 분해를 통해 단리시키고, 조직 배양 플라스크 상에 놓았다. 상기 세포를 확장을 위해 10% FBS/DMEM 배지 중에서 유지시켰다. hAT-MSC에 대해 면역 표현형을 분석한 결과, CD90+/CD105+/CD73+ 및 CD45-인 것으로서 그의 아이덴티티를 확인할 수 있었다 (도 1e). hBM-MSC와 유사하게, FACS에 의하면 hAT-MSC는 다양한 상피 마커에 대하여 면역양성이었다 (도 1f). 흥미롭게도, hAT-MSC 및 the hBM-MSC 사이에는 상피 마커를 발현하는 세포의 총량에서 차이가 나타났다. hBM-MSC 집단과 달리, hAT-MSC 집단 중 대략 절반이 CCSP에 대해 양성을 띠고 (44%); hAT-MSC는 또한 프로-SPC (51%), 및 시토케라틴 5 (91%)에 대해 양성을 띤다 (도 1f).
폐 생물반응기에서 MSC를 포함하는 래트 무세포성 기질의 재증식
* 래트 폐 무세포성 기질 상에 재시딩된 hBM-MSC
지방 또는 골수 유래 MSC가 래트 무세포성 기질을 재세포화할 수 있는지 여부, 및 상기 세포가 무세포성 기질 상에 배치된 후, 상피 표현형을 띨 수 있는지 여부를 이해하기 위한 노력으로, MSC를 앞서 기술된 생체모방 래트 폐 생물반응기 시스템에서 배양하였다 (문헌 [Petersen et al., 2010, Science 329:538-541]). MSC를 세포제거된 폐 스캐폴드 상에 시딩하기 전, 천연 및 세포제거된 폐 기질의 H&E 조직학적 성질 및 DAPI 염색 결과를 관찰하였다. 본 분석 결과, 세포제거된 폐에는 잔류 천연 폐 세포가 없는 것으로 확인되었다 (도 2a-b).
2 내지 4 계대로부터 배양된 hBM-MSC를 2.5-10 x 106개의 세포인 밀도로 기도를 통해 세포제거된 래트의 폐의 단일 우상 폐엽 내로 시딩하였다. 상기 세포를 볼루스로서 기관 내로 주사하고, 폐 생물반응기 중 소기도 성장 배지 (SAGM) 중에서 7일 동안 배양하였다. 예비 실험 이후에 SAGM을 재세포화된 폐의 배양에 잠재적으로 적합한 배지인 것으로서 선택하였으며, 1주 동안의 배양 후, 10% FBS/DMEM은 근섬유아세포의 마커인 형태상 균일한 섬유아세포인 세포를 생성하였으며, 거의 모든 세포가 α-sma를 발현하였다 (도 7). SAGM이 함유하는 레티노산 및 인간 표피 성장 인자가 만능성 세포의 증식 및 상피 분화를 촉진시키는 것으로 밝혀졌는 바, SAGM을 폐 상피 분화를 촉진시키는 우수한 후보 물질로서 선택하였다 (문헌 [Rackley & Stripp, 2012, J Clin Invest 122:2724-2730]; [Lenssen & Stolk, 2007 Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 2(2):131-139]). 조직 배양 플라스크 중 SAGM 배지를 이용하여 10% FBS/DMEM 중에서 MSC를 성장시킨 시험관내 예비 실험을 수행하였다. 본 실험을 통해 SAGM 중에서 성장시킨 MSC에는 α-sma에 양성을 띠는 세포가 없는 반면, 세포는 CCSP 발현을 유사한 수준으로 유지시켰다는 것인 입증되었다 (도 7c-7f).
시험관내 실험 결과, α-sma를 발현하는 세포의 양을 억제시켜, 결국에는 폐 상피 분화를 촉진시키기 위한 노력으로 SAGM을 사용하였다. 그러나, hBM-MSC를 무세포성 폐로 시딩하기 이전에 강력한 성장을 촉진시키기 위해 세포를 10% FBS/DMEM 배지 중에서 유지시켰다.
SAGM 중에서 7일 동안 배양된 hBM-MSC 재시딩된 폐의 H&E 염색 결과, 폐 생물반응기 중 10% FBS/DMEM에서 성장시킨 세포와 비교하였을 때, 부착된 세포의 외관은 더욱 입방형을 띠는 것으로 나타났다 (도 2c 및 도 7). 시험관내 배양과 일치하여, hBM-MSC 재세포화된 설치류 폐에서 α-sma에 대한 면역염색은 거의 완전하게 존재하지 않았다. 폐 상피 마커에 대한 추가 염색 결과, 부착된 세포 중 65-70%가 2형 폐포세포 마커인 프로-SPC를 발현한 것으로 확립되었다 (도 2d). 기도의 기저 상피 세포에 의해 발현되는 마커인 시토케라틴-5 또한 부착된 세포의 서브세트에 존재하였다 (도 2f). 흥미롭게도, 비록 hBM-MSC의 출발 집단이 면역염색법 및 FACS에 의하면, CCSP를 발현하기는 하였지만, 폐 생물반응기에서의 배양 후, CCSP에 대해 양성을 띤 세포는 없었다 (도 2e; 도 1c). 부착된 세포는 또한 기저 세포의 마커인 P63, 및 1형 폐포세포의 마커인 카베올린-1에 대해서도 음성을 띠었다.
hBM-MSC로부터 유래된 프로-SPC 양성인 세포의 가능한 기능 및 전체 분화 상태에 대한 식견을 얻기 위해, 투과 전자 현미경법을 이용하여 2형 폐포세포 층판소체 뿐만 아니라, 상기 세포에 의해 분비되는 계면활성제 소포체를 확인하고자 하였다 (도 2h). 투과 전자 현미경법을 통해 천연 폐 2형 폐포세포의 층판소체를 확인하는 것은 2형 세포를 확인하는 데 흔히 사용되는 양성 식별 방법이다 (문헌 [Schmiedl, et al., 2005, Histochem Cell Biol 124(6):465-76]). 층판소체가 존재하는 것은 또한 이들 세포 내에서의 기능을 암시하는 것일 수도 있다 (문헌 [Kassmer & Krause, 2010, Experimental Hematology 38:564-573]). 층판소체는 2형 세포 내에 함유되어 있는 분비성 계면활성제 및 지질의 저장소로서의 역할을 한다. 인간 및 래트 2형 폐포세포, 둘 모두 층판소체가 존재하는 것을 특징으로 한다. 양성 대조군으로서, 천연 래트 폐의 2형 폐포세포 내에 층판소체 존재에 대해 조사하였다 (도 2b, 청색 화살표 표시). 상기 층판소체의 길이는 대략 500 nm이고, 동심의 소용돌이 형상으로 형성되는 구조체 중의 고전자 밀도 침착물을 특징으로 한다. 추가로, 천연 2형 폐포세포의 또 다른 특징은 분비성 소포체 (도 2g, 백색 화살표 표시)가 존재하는 것이다
다른 세포 유형 없이, 오직 hBM-MSC만이 시딩되고, 7일 동안 배양된 폐 세포제거된 스캐폴드 또한 부착된 세포 중의 층판소체 뿐만 아니라, 분비성 혈관의 존재에 대해 검정하였다 (도 2h). 상기 hBM-MSC 유래 세포는 풍부한 고전자 밀도 층판소체 뿐만 아니라, 다수의 분비성 소포체 (도 2h에서 각각 화살표 표시 및 V형 무늬)를 가졌다. 형태상 천연 래트 2형 폐포세포는 생물반응기 내의 폐 기질 상에서 및 SAGM의 존재하에 7일 동안 배양된 hBM-MSC와 매우 유사하였다. 종합해 보면, 상기 데이터는 hBM-MSC가 2형 폐포세포와 관련된 마커를 단백질 수준으로 발현할 뿐만 아니라, 천연 2형 세포 내에 함유되어 있는 것과 유사한 기능과 관련된 세포질 구조를 가진다는 것을 나타낸다. 그러므로, 본 데이터는 hBM-MSC가 적합한 조건하에서 확장 및 배양되었을 때, II형 폐포 상피 세포의 표현형을 취할 수 있다는 것을 입증한다.
래트 폐 무세포성 기질 상에 재시딩된 hAT-MSC
hAT-MSC의 세포제거된 폐 상에의 이식 능력을 측정하기 위해, 2.5-10x106개의 세포를 볼루스로서 우상 세포제거된 설치류 폐엽 내로 시딩하고, hBM-MSC와 동일한 조건하에서 7일 동안 SAGM 배지 중에서 배양하였다. 시딩된 폐의 H&E 조직학적 제제를 통해 hAT-MSC는 기질 전역에 걸쳐 부착될 수 있지만, 기도에서 부착되지 않는 hBM-MSC와 달리 (도 3a-b), 기도에 부착되고, 기도를 재증식시키는 특정의 친화성을 가진 것으로 입증되었다. 면역염색 결과, 기도에 부착된 세포는 클라라 세포의 마커인 CCSP에 대해 양성인 것으로 나타났다. 이는 폐 기질 상에서의 배양 후, CCSP의 발현을 유지하지도 않았고, 이들 세포는 기도에 부착되지도 않은 hBM-MSC와 대조를 이룬다.
폐 생물반응기에서 배양된 hAT-MSC 또한 2형 폐포세포 마커인 프로-SPC에 대해 양성이었다. 프로-SPC에 대한 면역형광법을 통해 상기 마커에 대하여 뚜렷한 작은 반점이 있는 세포질을 포함하는 세포가 나타났다 (도 3c에서 삽입된 도면). 배양 후 hAT-MSC와 hBM-MSC의 또 다른 차이는 면역형광법에 따르면, hAT-MSC는 시토케라틴-5 양성인 세포를 생성하지 않는 반면, hBM-MSC는 그를 생성한다는 점이다 (도 3d 및 2h). 상기 데이터는 상이한 조직 공급원으로부터 유래된 MSC 사이에는 폐 무세포성 기질을 재증식시킬 수 있는 그의 능력과 관련하여 본질적인 차이가 존재한다는 것을 나타낸다.
폐 생물반응기에서의 배양 이후의 폐포 상피 유전자 발현
hBM-MSC 및 hAT-MSC 재세포화된 폐에서 다양한 원위 폐 상피 마커에 대한 유전자 발현 또한 평가하였다. 실시간 qRT-PCR을 사용하여 계면활성제 단백질 C (II형), 카베올린-1 및 아쿠아포린 5 (AQP5, I형)의 발현에 대하여 검정하였다 (도 4).
계면활성제 단백질 C (SPC)는 II형 폐포세포 뿐만 아니라, 조기 폐 전구 세포의 마커로서 널리 사용된다. RT-PCR 결과, 3일째 및 7일째 생물반응기 배양물을 플라스크에서 성장된 MSC와 비교하였을 때, hBM-MSC 재세포화된 폐에서의 SPC 발현은 증가된 것으로 나타났다 (도 4a). 이러한 결과는 3일째 및 7일째 SPC 전사체 존재량이 각각 23배 및 93배만큼 점진적으로 증가되었다는 것을 나타낸다 (도 4a).
hAT-MSC 시딩된 폐 스캐폴드에서 유사한 패턴의 SPC 발현이 관찰되었다. 플라스크에서 성장된 hAT-MSC와 비교하였을 때 SPC의 발현은 3일째 (36X)부터 7일째 (137X)까지 증가하였다. hBM-MSC 재세포화된 폐와 비교하였을 때 SPC 유전자 발현 증가는 hAT-MSC 재세포화된 폐에서 더 컸다.
추가로, hBM-MSC 및 hAT-MSC 시딩된 래트 폐 스캐폴드에서 카베올린-1 및 AQP5를 비롯한, 2개의 특이 폐포 I형 마커의 발현에 대해 평가하였다. 3일째 및 7일째 평가한 바, 조직 배양 플라스크 상에서 성장된 MSC와 비교하였을 때, 카베올린-1 및 AQP5, 둘 모두의 유전자 발현은 폐 생물반응기 배양에서 시간이 경과함에 따라 증가하였다 (도 4b-f). 상기 두 1형 세포 마커에 대한 유전자 발현은 1형 마커에 대한 면역염색법에 기초하였을 때 배양물 단백질 발현에 있어 시간에 따라 증가하였지만, 카베올린-1 또는 아쿠아포린 5는 검출되지 못했다.
전반적으로, qRT-PCR 결과, SPC, 카베올린-1 및 AQP5에 대한 유전자 발현 수준은 hBM-MSC 및 hAT-MSC 시딩된 폐 스캐폴드 둘 모두의 경우에, 생물반응기에서 시간에 따라 증가한 것으로 나타났다. 그러나, 면역염색법에 의해 제시된 바, 단백질 발현은 상기 유전자 중 오직 프로-SPC의 것만이 폐 스캐폴드 상에서의 7일 후에 hBM-MSC 및 AT-MSC에서 검출가능한 반면, 1형 마커에 대한 검출가능한 발현은 없다는 것을 나타낸다. 어느 특정 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 이러한 뚜렷한 차이는 가능하게는 면역염색법을 이용하였을 때에는 검출가능한 신호에 대하여 충분히 강력하지 않은 단백질 수준에 의해 설명될 수 있으며, 반면, qRT-PCR의 감도를 통해서 본 발명자들은 폐 스캐폴드 상에 시딩된 세포로부터의 소량의 mRNA 발현도 검출할 수 있는 능력을 얻게 된다.
hBM-MSC 및 hAT-MSC로부터 유래된 2형 폐포세포의 기능
세포제거된 폐 스캐폴드 상에 시딩된 MSC가 장기의 기능을 개선시켰는지 측정하기 위해, 세포제거된 스캐폴드 상에서 성장시킨 세포에 의해 배지 내로의 활성 계면활성제의 분비가 이루어졌는지 여부를 평가하였다 (도 5). hBM-MSC를 2x106개의 세포인 밀도로 우상 세포제거된 폐엽 내로 시딩하고, 2시간 동안 기질에 부착될 수 있도록 한 후, 폐엽을 절반으로 절단하고, 상기 조각을 SAGM을 함유하는 6웰 배양 플레이트 중에 놓았다. 상기와 같이 시딩된 폐 슬라이스를 3일 또는 7일 동안 배양하고, 상기 시점에 배지를 수집하였다. RT-PCR 결과, 세포제거된 스캐폴드 단독인 것과 비교하였을 때, 3일째 내지 7일째 사이에 SPC 유전자 발현이 증가된 것으로 나타났다 (도 5a, 5b). 활성 배양물에 대한 명시야 현미경법 결과, 대개 폐 조각 주변에 농축되어 있는 오일 유사 소적으로 이루어진 층이 육안상 보이는 것으로 나타났다 (도 5d, 5e). 본 실험의 대조군으로서, MSC가 시딩되지 않은 스캐폴드를 동일한 배양 조건에 놓았다. 이 대조군은 오일 유사 소적을 함유하지 않았다 (도 8). 육안상 보이는 소적이 시딩된 세포에 의해서 활발하게 생산된 계면활성제일 가능성이 있기 때문에, 계면활성제 단백질 C의 존재에 대해 시험하는 ELISA를 수행하였다 (도 5c). 계면활성제 단백질 C는 3일째 및 7일째 둘 모두에서 hBM-MSC 슬라이스 배양물 중에 각각 3.3 ng/mL 및 0.26 /mL로 존재하였다 (도 5c). hAT-MSC가 시딩된 폐 배양물은 배양 배지 중에 더 많은 양의 계면활성제 단백질이 존재하였다. 상기 배양물로부터의 조절 SAGM은 각각 5.55 ng/mL 및 1.16 ng/mL를 함유하였다 (도 5c). 본 데이터는 MSC가 세포제거된 폐 스캐폴드 상에서 배양되었을 때, 계면활성제를 활발하게 생산하고, 그를 분비한다는 점에서, 시딩된 MSC는 2형 폐포세포와 유사한 기능을 한다는 것을 나타낸다.
기재 기질이 MSC의 분화에 미치는 영향
배양 기재가 MSC의 분화에 미치는 영향을 추가로 이해하기 위한 노력으로, hAT-MSC 또는 hBM-MSC를 콜라겐 1, 콜라겐 IV, 라미닌, 피브로넥틴, 인간 ECM, 및 마트리겔을 비롯한 다양한 세포외 기질 (ECM) 단백질로 코팅된 조직 배양 플라스크 상에서 배양하였다 (도 6). 콜라겐 1, 콜라겐 IV, 라미닌 및 피브로넥틴 각각이 폐 ECM의 대표 성분이기 때문이기 때문에, 그를 선택하였고 (문헌 [Petersen et al., 2012, Cells Tissues Organs 195:222-231]; [Cortiella et al., 2010, Tissue Eng Part A 16:2565-2580]); 인간 ECM 및 마트리겔 코팅제는 세포에 혼합된 ECM 조성물을 제공하기 위한 노력으로 선택하였다. SAGM 중에서 7일 동안 배양 기간 후, 세포 집단을 FACS에 의해 및 RT-PCR에 의해 상피 마커 발현에 대하여 특징 규명하였다.
여러 가지의 기재 상에서 배양된 hBM-MSC로부터의 FACS 분석 실험으로부터 얻은 데이터에서는 세포가 배양이 이루어진 ECM 성분에 따라 시토케라틴 5, CCSP 및 프로-SPC를 발현한 세포 집단에서는 큰 차이가 있는 것으로 나타났다 (도 6a, 도 9, 및 도 10). 콜라겐 1 기재 상에서 성장된 세포는 시토케라틴 5에 대해 양성인 세포를 최소량으로 가졌으며; 집단 중 대략 3.0%가 양성이었고, 피브로넥틴으로 코팅된 플라스틱 플라스크 상에서 성장된 세포와 비교하였을 때, 대략 3배 정도 감소된 양이었다. hBM-MSC 집단에서 CCSP 양성인 세포의 양 또한 그의 성장이 이루어진 기재에 따라 큰 차이를 보였다. 가장 큰 CCSP 양성인 세포 집단은 피브로넥틴으로 코팅된 플라스크에 존재하였고 (44%), 그에 반해, 최소량의 CCSP 양성인 세포는 콜라겐 4에서 성장된 hBM-MSC에서 발견되었다 (27%). 유사하게, 프로-SPC를 발현하는 hBM-MSC 집단은 표면 코팅제 간에 차이를 보였는데, 여기서, 가장 많은 양의 양성 세포는 인간 ECM으로 코팅된 플라스크에 존재하였고 (54%), 최소량은 마트리겔 상에서 배양된 세포에 존재하였다 (34%).
상이한 ECM 기질 상에서 성장된 hAT-MSC의 거동 또한 CCSP, 프로-SPC 및 시토케라틴-5를 발현하는 집단에서 차이를 보였다. 예를 들어, 프로-SPC 양성인 세포 집단의 범위는 인간 ECM 조건에서는 81%로 높은 범위에서부터 콜라겐 1 조건에서는 32%로 낮은 범위까지였다. CCSP 양성인 세포 집단 또한 다른 표면 코팅제와 비교하였을 때, 인간 ECM으로 코팅된 플라스크에서 가장 컸다 (10%). hAT-MSC 및 hBM-MSC 사이에는 상피 마커를 발현한 세포 양에 있어 차이가 존재하였고, 또한, 집단 사이에도, 특히, 인간 ECM 상에서 배양된 집단 사이에도 표현형상의 차이가 명백하였다 (도 6e, 6f). 인간 ECM 상에서 배양된 hAT-MSC는 배양 디쉬 전역에 걸쳐 격자 유사 네트워크를 형성한 반면, hBM-MSC는 정규 MSC 형태를 유지하였다.
상이한 ECM 기재 상에서의 배양의 결과로서 RNA의 변화를 정량화하기 위한 추가 수단으로서 RT-PCR을 수행하였다. 유세포 측정법에 의해 관찰된 바와 같이 qPCR에 의해서도 상이한 ECM 단백질 상에서 배양된 hBM-MSC 및 hAT-MSC에서 유사한 패턴의 CCSP, 시토케라틴-5 및 SPC 유전자 발현이 관찰되었다 (도 6c, 6d). 그러나, qPCR 데이터 결과, 다른 ECM 단백질 상에서 배양된 세포와 비교하였을 때, 7일째 hBM-MSC 및 hAT-MSC, 둘 모두에서 혼합된 인간 ECM 단백질을 통해 SPC의 발현은 약간 더 증가하였고, CCSP 및 시토케라틴-5 유전자의 발현은 감소된 것으로 나타났다.
전반적으로, hAT-MSC 및 hBM-MSC 집단, 둘 모두에서는 상기 집단의 배양이 이루어진 기재에 따라 폐 상피 마커 발현의 변화가 일어난다. 추가로, 상기 데이터는 기재가 단독으로 중간엽 기질 세포에 의한 폐 상피 마커의 발현에 영향을 줄 수 있다는 것을 나타낸다. 상기 데이터는 폐 생물반응기에서 배양된 hAT-MSC 및 hBM-MSC와 비교하였을 때, 상피 마커 발현의 차이에 관한 식견을 제공한다.
최종적으로, 폐 생물반응기 배양 후 hBM-MSC의 표현형을 비교하였을 때, 세포제거된 간 기질 상에 시딩된 hBM-MSC의 표현형을 분석하였다 (도 11). hBM-MSC를 세포제거된 간 슬라이스 상에 시딩하고, 3일 동안 배양한 후, 면역염색법 및 H&E 조직학적 분석을 수행하였다. 상기 데이터는 면역염색법에 의하면 10% FBS/DMEM 중 또는 SAGM 중 간 슬라이스 상에서 배양된 hBM-MSC는 시토케라틴 5, CCSP는 발현하지 못하였고, 오직 프로-SPC만을 매우 드물게 발현하였다는 것을 나타낸다 (도 11). 배양 기간이 길면, MSC 생존가능성이 더 감소하기 때문에, 배양 기간은 단지 3일로만 제한하였다. 상기 데이터는 폐 세포제거 이후에 남은 ECM이, 분화될 수 있고, 폐 상피 마커의 발현을 유지시킬 수 있는 MSC의 능력에 대해 중요한 역할을 한다는 것을 추가로 나타낸다.
지방 및 골수로부터의 MSC는 세포제거된 래트 폐 생물반응기 시스템에서의 배양 이후에 2형 세포 표현형 및 기능을 취할 수 있다.
이전 연구를 통해 래트 폐를 성공적으로 세포제거할 수 있는 방법을 개발할 수 있게 되었다 (문헌 [Petersen et al., 2010, Science 329:538-541]; [Petersen et al., 2012, Cells Tissues Organs 195:222-231]). 이러한 관찰 결과를 통해 궁극적으로 세포제거된 인간 폐는, 그 위에서 적절한 도너 세포의 증식이 이루어지고, 폐 상피 세포 유형으로의 분화가 이루어질 수 있는 스캐폴드로서 사용될 수 있다 (문헌 [Badylak et al., 2011, Annu Rev Biomed Eng 13:27-53]). 도너 세포 유형에 필수적인 특징으로는 1) 폐 상피 또는 다른 세포 유형으로 분화될 수 있는 능력; 2) 증식성이 고도로 높다는 특징 (세포제거된 폐 스캐폴드 상에 시딩되기 이전에 상기 세포를 다수로 확장시킬 수 있어야 하는 특징); 3) 환자 (즉, 분화된 또는 줄기 세포인, 자가 세포 공급원)로부터 쉽게 접근가능하여야 하는 특징; 및 4) 면역원성 또는 면역 반응을 일으키는 것의 결여를 포함한다. 전체적으로, 상기와 같은 특징은 세포제거된 폐를 재시당하기 위한 공급원으로서 중간엽 기질 세포를 사용할 수 있는 가능성을 시사한다. 비록 연구 결과 중 일부는 여전히 논란의 대상이 되고 있지만, 앞서 hBM-MSC는 폐 상피를 비롯한 각종 상피 세포 유형을 생성하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Krause et al., 2001, Cell 105:1-9]; [Wong et al., 2009, Cytotherapy 11:676-687]; [Ortiz et al., 2003, PNAS 100:8408-8411]; [Wong et al., 2007, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 293:L740-L752]; [Wang et al., 2006, Stem Cells 24:482-493]). 추가로, MSC는 대부분의 세포 유형보다 면역원성이 더 작고, MHC 클래스 2 마커를 발현하지 않으며, T 세포의 활성화 결여에 의해 입증되는 바와 같이, 강한 면역 반응을 유도하지 않는다 (문헌 [Rasmusson et al., 2003, Transplantation, 76: 1208-1213]). 래트 폐 기질 중 인간 골수 및 지방 유래 MSC에 관한 본 연구는 상피 세포가 적어도 II형 폐포 세포 표현형으로, 및 또한 아마도 다른 표현형으로도 분화된다는 명백하고 반론의 여지가 없는 증거를 시사한다.
본원에서 제시된 데이터는 인간 BM-MC가 세포제거된 래트 폐 기질 상에 배치되고, SAGM 중에서 배양되었을 때, 2형 폐포세포 마커인 프로-SPC 뿐만 아니라, 근위 기도 마커 시토케라틴-5를 발현할 수 있다는 것을 입증한다. 이전 연구에서는 세포제거된 폐 스캐폴드 상에서 시딩된 BM-MSC로부터 폐 상피로의 상당한 기여를 밝히는 데 실패하였다 (문헌 [Daly et al., 2012, Tissue Eng Part A 18:1-16]; [Bonvillain et al., 2012, Tissue Eng Part A 18(23-24):2437-52]). 어느 특정 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 본 데이터와 다른 연구 사이의 상기와 같은 차이는 부분적으로는 폐 기질 세포제거 공정의 차이, 및 본 연구에서 사용된 생물반응기 배양에서 폐 동맥을 통한 배지의 연속적 관류 사용에 의해 설명될 수 있다. 그에 반해, 상기 다른 군의 연구에서는 폐 슬라이스 배양 시스템이 사용되고, 가능하게는 보유 ECM 성분이 차이가 나는 폐 스캐폴드가 사용되었다. 추가로, 본원에서 사용된 세포제거 방법은 8 mM CHAPS를 사용한 반면, 다른 군은 세포제거 프로토콜에서 0.1% 트리톤-X를 사용하였다. 세포제거를 위해 CHAPS 및 SDS 계면활성제를 비교한 이전 보고에서는 폐 세포제거 후 콜라겐 및 엘라스틴 보유에 있어 차이가 나는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Petersen et al., 2012, Cells Tissues Organs 195:222-231]). 가능하게는 트리톤-X 세포제거와 비교하였을 때, CHAPS 폐 세포제거 후에도 상이한 기질 성분이 그대로 남아 있으며, 그 결과, 시딩된 BM-MSC의 분화에 영향을 미치게 된다. 비록 보고들 간의 차이에 대한 가능성이 더 희박하기는 하지만, 또 다른 것은 본 연구에서는 래트 폐 상에 시딩된 인간 유래 MSC가 사용된 반면, 달리(Daly)와 동료들은 마우스 폐 및 세포를 사용하였고, 본빌레인(Bonvillain) 등은 마카크 폐 및 세포, 둘 모두를 사용하였다는 점이다.
본원에서는 또한 hAT-MSC가 기도에서 막을 형성하고, 검정된 3개의 인간 골수 도너 샘플 중 어느 것에서도 발견되지 않는 특징인, CCSP 단백질을 발현하는 클라라 유사 세포를 생성하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, hBM-MSC와 유사하게, hAT-MSC는 또한 2형 유사 세포를 생성하지만, 폐의 재세포화 이후에 시토케라틴-5에 대해 양성인 세포를 생성하지 않는다. MSC 공급원 둘 모두 공통 CD 마커 발현으로 시작된다고 가정할 때, 상기와 같은 차이는 특히 흥미롭다. 그러나, 본원에서 제시된 바와 같이, MSC 집단은 상피 마커인 CCSP, 프로-SPC 및 시토케라틴-5를 발현하는 집단에 관하여 차이를 보인다. 초기 상피 마커 발현에서의 상기와 같은 차이는 폐 생물반응기 중에서의 배양 후 MSC 공급원 사이의 하류 변형을 일으킬 수 있다. 다양한 보고에 조직 기원에 따라 다른 MSC의 분화능에 관한 차이가 기록되어 있다 (문헌 [Vidal et al., 2008, Veterinary Surgery 37:713-724]; [Baer & Geiger, 2012, Stem Cells International 2012, 1-11]; [Al-Nbaheen et al., 2013, Stem Cell Rev 9(1):32-43]; [Hoffman et al., 2011, Stem Cells and Development 20:1779-1792]; [Pevsner-Fischer et al., 2011, Stem Cell Rev and Rep 7:560-568]). 골수, 지방 및 피부로부터 유래된 MSC 사이의 유전자 발현 비교 결과, 골생성 계통 및 지방생성 계통과 관련된 유전자를 발현할 수 있는 능력에 있어 뚜렷한 차이가 있는 것으로 나타났다 (문헌 [Al-Nbaheen et al., 2013, Stem Cell Rev 9(1):32-43]). hAT-MSC 및 hBM-MSC 공급원을 비교하였을 때 얻은 본 결과를 고려해 볼 때, 어느 특정 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 가능하게는, 적절한 폐 생체모방 조건하에서 배양되었을 때, 추가의 MSC 공급원이 상이한 분화능을 가질 수 있다고 볼 수 있다. 평가하는 있어 특히 흥미로운 후보 물질은 플라스틱에 부착되고, 골수 MSC와 관련된 정규 마커를 발현하는, 소위 "폐 MSC"로 불리는, 기관지 폐포 세척액으로부터 단리된 세포이다 (문헌 [Hoffman et al., 2011, Stem Cells and Development 20:1779-1792]; [Lama et al., 2007, J Clin Invest 117:989-996]; [Jarvinen et al., 2008, J Immunol. 181(6):4389-96]).
이전 연구에서 폐 상피로 분화될 수 있는 BM-MSC의 능력이 밝혀졌지만, 이러한 연구 결과는 논란의 여지가 없는 것은 아니다 (문헌 [Kassmer & Krause, 2010, Experimental Hematology 38:564-573]). 이러한 논란은 대개 연구원들 사이에 사용된 실험 방법, 특히, 관심의 대상이 되는 미량 세포를 계통하는 수단으로서 eGFP를 사용하는 것에서의 변동으로부터 유도되는 것으로 보인다 (문헌 [Krause, 2008, Proc Am Thorac Soc 5:323-327]). 출발 물질이 세포제거된 폐 및 hBM-MSC 또는 hAT-MSC이기 때문에, 본 결과는 폐 상피에 기여할 수 있는 hBM-MSC의 능력을 추가로 확고히 한다. 본 연구에서 세포제거된 폐에는 폐 상피 세포가 완전하게 없다 (도 2b). 이는 오염성인 비-골수 또는 지방 유래 세포가 폐 상피로서 잘못 해석될 수 있는 가능성을 배제시킨다.
무세포성 폐 스캐폴드와 비교하여 재세포화된 폐의 기능이 개선되었다는 것을 밝히는 것도 제시되었다. 폐포 2형 세포의 주요 기능 중 하나는 계면활성제 단백질 생산이다. hAT-MSC 및 hBM-MSC 집단은 면역형광법, RT-PCR에 의하면, 계면활성제 단백질 C를 발현하였고, TEM에 의해 제시된 바와 같이, 층판소체를 함유함과 동시에, 또한 재세포화된 폐에서 배양된 MSC는 ELISA에 의한 SPC를 활발하게 생산하고, 또한 폐 슬라이스에 인접한 배지에 육안상 보이는 계면활성제 소적을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 본원에 제시된 데이터는 배양 3일째 hBM-MSC에 의해 3.3 ng/mL SPC가 분비된 것과 비교하였을 때, hAT-MSC는 최대 5.5 ng/mL의 SPC를 배지로 분비할 수 있다는 것을 나타낸다. 상기 데이터는 추가로 MSC가 유형-2 세포 표현형을 취할 수 있을 뿐만 아니라, 세포제거된 폐 기질에 부착됨과 동시에, 계면활성제를 생산할 수도 있다는 것을 지지한다. 흥미롭게도, 세포 분화에서 배양 배지의 중요성을 지지하여 어느 한 MSC 집단으로부터의 10% FBS 중에서 유지된 배양물 중 계면활성제 분비를 입증하는 시각적 증거는 없었다 (도 5 및 도 8).
세포 분화를 조정하는 데 있어 ECM의 중요성을 평가하기 위해, MSC를 또한 상이한 종류의 ECM 중 SAGM에서 배양하고, RT-PCR에 의해 수개의 상피 머커에 대한 유전자 발현 수준을 평가하고, 집단 마커 발현을 FACS 분석에 의해 평가하였다. 상기 데이터는 MSC 집단은 상이한 ECM 기재 상에서 성장되었을 때, 마커 발현에 있어 큰 차이를 보였다는 것을 나타낸다. 관련 실험에서, hBM-MSC를 SAGM 또는 10% FBS 중에서 3일 동안 세포제거된 간 상에서 배양하였다 (도 11). 본 실험은 특히 기본적이지만, 놀랍게도 드물게 평가되고 있는 질문인, 세포제거된 장기 상에서의 배양 이후 보유된 ECM의 중요성 및 그가 세포 분화에 미치는 영향에 관한 질문에 답변하는 것으로 목표로 하였다. 본 실험에서 hBM-MSC는 무세포성 간 상에서의 배양 후, 시토케라틴-5를 발현하지 않고, 대개는 프로-SPC 발현에 대해 음성인 것으로 나타났다.
종합해 보면, 본 실험은 지방 및 골수, 둘 모두로부터의 MSC는 세포제거된 래트 폐 생물반응기 시스템에서의 배양 후, 2형 세포 표현형 및 기능을 취할 수 있지만, 반면, 오직 hAT-MSC만은 CCSP 양성인 세포와 함께 기도에 콜로니를 형성할 수 있다는 것을 입증한다. 본 데이터는 추후 폐 재세포화 노력이 전체 장기 재증식을 위해 도너 세포로서 다양한 MSC 공급원을 사용할 수 있기 때문에 중요한 것이 된다. 이러한 목적을 달성하기 위해 제대 및 폐 조직으로부터 유래된 것을 비롯한 대체 MSC 공급원의 잠재성이 재세포화 프로세스를 증진시키기 위해 단리물로 또는 공배양 시나리오로 연구되고 있다.
본원에 인용된 각각의 모든 특허, 특허 출원, 및 공개 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 본 발명은 구체적인 실시양태를 참조로 하여 개시되었지만, 본 발명의 진실된 정신 및 범주로부터 벗어남 없이 본 발명의 다른 실시양태 및 변형이 당업자에 의해 고안될 수 있다는 것은 자명하다. 첨부된 청구범위는 상기와 같은 실시양태 및 등가인 변형 모두를 포함하는 것으로 해석하고자 한다.
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Claims (4)

  1. 치료학적 유효량의 세포 집단을 포함하는, 포유동물에서 폐 결함을 완화 또는 치료하기 위한 조성물로서, 상기 치료학적 유효량의 세포 집단이 다음 단계를 포함하는 방법에 따라 제조된 폐 세포를 포함하는, 조성물:
    골수-유래 중간엽 줄기 세포(BM-MSC) 또는 지방 조직-유래 중간엽 줄기 세포(AT-MSC)를 세포제거된(decellularized) 폐 조직 및 세포외 기질을 포함하는 코팅물로 구성된 군으로부터 선택되는 기재 상에 시딩(seeding)하는 단계; 및
    BM-MSC 또는 AT-MSC 시딩된 기재를 레티노산 및 인간 표피 성장 인자 중 적어도 하나를 포함하는 성장 배지에 노출시켜 BM-MSC 또는 AT-MSC를 적어도 하나의 표피 마커를 발현하는 폐 세포로 분화시키는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 폐 세포가 클라라(Clara) 세포의 특징 중 적어도 하나를 나타내는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 클라라 세포의 특징 중 적어도 하나가 클라라 세포 분비 단백질 (CCSP)의 발현인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 세포외 기질이 인간 ECM, 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐 IV, 및 콜라겐 I 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.

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