CN113493764A - 一种体外诱导小鼠耳朵间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞诱导技术领域，具体涉及一种体外诱导小鼠耳朵间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法。将小鼠耳朵间充质干细胞于DMEM培养基中培养至细胞长满后，使其接触抑制48‑50h，然后更换为分化培养基Ⅰ，48‑50h后换为分化培养基Ⅱ，直至得到脂肪细胞；所述分化培养基Ⅰ组成为：50mL 10％血清培养基+50μL地塞米松+50μL IBMX+100μL胰岛素+4‑6μL三碘甲状腺原氨酸；所述分化培养基Ⅱ组成为：50mL 10％血清培养基+100μL胰岛素+4‑6μL三碘甲状腺原氨酸；所述10％血清培养基组成为：45mL DMEM+5mL FBS+50μL庆大霉素。本发明的方法通过在分化培养基中加入三碘甲状腺原氨酸，显著的提高了脂肪细胞的分化效率。

Description

一种体外诱导小鼠耳朵间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞诱导技术领域，具体涉及一种体外诱导小鼠耳朵间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法。
背景技术
脂肪组织工程概念的提出为软组织缺损的修复与重建提供了全新的治疗途径,已成为组织工程研究领域的热点之一。间充质干细胞(mesechymalstemcells，MSCs)是一小群存在于骨髓中的非造血细胞，具有高度的自我更新和多向分化潜能，在适宜的条件下可诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞等，这些特点使得它成为组织工程理想的种子细胞。
目前，现有技术已经公开了一些诱导间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法，但是分化效率较低，仅能达到30％-40％，且分化周期长。
发明内容
有鉴于上述技术问题，本发明的的目的在于提供一种体外诱导小鼠耳朵间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种体外诱导小鼠耳朵间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法，将小鼠耳朵间充质干细胞于DMEM培养基中培养至细胞长满后，使其接触抑制48-50h，然后更换培养基为分化培养基Ⅰ，48-50h后换为分化培养基Ⅱ，直至得到脂肪细胞；
所述分化培养基Ⅰ组成为：50mL 10％血清培养基+地塞米松50μL+IBMX50μL+100μL胰岛素+4-6μL三碘甲状腺原氨酸；
所述分化培养基Ⅱ组成为：50mL 10％血清培养基+100μL胰岛素+4-6μL三碘甲状腺原氨酸；
所述10％血清培养基组成为：45mL DMEM+5mL FBS+50μL庆大霉素。
进一步的，培养条件为37℃，CO2体积分数5％。
进一步的，所述小鼠耳朵原代细胞的分离包括以下步骤：
S1、剪下4周龄小鼠的外耳，将外耳脱去毛发，PBS缓冲液洗涤2-3次后，置于胶原酶混合物中，并将外耳剪碎；
S2、将剪碎的外耳及胶原酶混合物于37℃下培养40-60min，后用70μm滤网过滤，保留滤液；
S3、在滤液中加入等体积的含15％胎牛血清的DMEM培养基，离心，保留沉淀，用含15％胎牛血清的DMEM培养基将沉淀混成悬液，混匀，于37℃，CO2体积分数为5％的条件下培养，期间更换为含10％胎牛血清的DMEM培养基，培养5-10天后，得到小鼠耳朵间充质干细胞。
更进一步的，S1中，所述小鼠为C57BL/6J小鼠。
更进一步的，S2中培养为50rpm培养1h或水浴40min、且每隔5min吹打混匀一次。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明人经过不断的探索，通过诱导将小鼠耳朵间充质干细胞分化为脂肪细胞，并意外地发现可以通过三碘甲状腺原氨酸提高脂肪细胞分化效率，可以达到80％-90％分化效率，同时缩短分化周期。本发明的方法可高效进行，不涉及转基因操作，获得的脂肪细胞安全性好，适用于组织再生、修复等领域和产业中应用。
附图说明
图1为实施例1分离的小鼠耳朵间充质干细胞图。
图2为实施例1的小鼠耳朵间充质干细胞分化不同时间点的结果图。
图3为实施例1的小鼠耳朵间充质干细胞分化成的脂肪细胞的油红O染色。
图4为对比例1(A)和实施例1(B)的脂肪细胞的细胞油红O染色结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种体外诱导小鼠耳朵间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法，包括以下步骤：
将小鼠耳朵间充质干细胞37℃，CO2体积分数为5％的条件下培养，待细胞长满后，使其接触抑制48h，然后更换为分化培养基Ⅰ，48h后换为分化培养基Ⅱ，培养15天后，得到脂肪细胞；
所述分化培养基Ⅰ组成为：50mL 10％血清培养基+地塞米松50μL+IBMX50μL+100μL胰岛素+5μL三碘甲状腺原氨酸；
所述分化培养基Ⅱ组成为：50mL 10％血清培养基+100μL胰岛素+5μL三碘甲状腺原氨酸；
所述10％血清培养基组成为：45mL DMEM+5mL FBS+50μL庆大霉素。
小鼠耳朵间充质干细胞的获得包括以下步骤：
S1、剪下4周龄C57 WT小鼠的两只外耳，用体积分数75％的乙醇将外耳脱去毛发，使用PBS缓冲液洗涤3次后，置于胶原酶混合物中，将外耳剪碎，具体剪至有粘稠感即可。
S2、将剪碎的外耳及胶原酶混合物收集至15mL离心管中，再用另一小皿盛有的2mL胶原酶混合物去冲洗上一个小皿，尽可能将组织全部移至15mL离心管中，将15mL离心管放至摇床，37℃，50rpm，1h，取出15mL离心管后，先吹打混匀，再用70μm滤网将滤液过滤至50mL离心管中。
S3、在滤液中加入与滤液等体积的含15％胎牛血清的DMEM培养基，离心，保留沉淀，用含15％胎牛血清的DMEM培养基将沉淀混成悬液，混匀，于37℃，CO2体积分数为5％的培养箱中培养，期间更换为含10％胎牛血清的DMEM培养基，培养8天后，得到小鼠耳朵间充质干细胞，分离的细胞如图1所示。
分化不同时间点的镜检结果如图2所示，脂肪细胞的鉴定采用细胞油红染色，使用油红O染色液，具体操作如下：
1.油红O 0.5g，50％乙醇100ml。将油红O溶于乙醇内，且不断搅拌至完全溶解即可。配制好的染液置于磨口瓶内保存备用。
2.染色步骤
(1)将分化的细胞去除培养液，置于6孔板中，用PBS缓冲液洗两遍。
(2)每孔加入1mL固定液固定15min(4％甲醛固定液)。
(3)取600μL油红O储存液+400μL超纯水(温度50℃-60℃)于1.5mL Ep管内，用力摇匀，13000rpm离心10min，共制2管，每管染1个孔。
(4)将固定液吸出，加入60％异丙醇1mL(3mL异丙醇纯+2mL超纯水)洗细胞后，吸出晾干。
(5)每孔加入离心好的油红O工作液(只吸中央清澈液体)，避光染色20min。
(6)吸出染液，自来水洗两遍，显微镜下观察拍照。
对比例1
一种体外诱导小鼠耳朵间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法，包括以下步骤：
将小鼠耳朵间充质干细胞37℃，CO2体积分数为5％的条件下培养，待细胞长满后，使其接触抑制48h，然后更换为分化培养基Ⅰ，48h后换为分化培养基Ⅱ，培养33天后，得到脂肪细胞，并进行鉴定，鉴定方法同实施例1；
所述分化培养基Ⅰ组成为：50mL 10％血清培养基+地塞米松50μL+IBMX50μL+胰岛素100μL；
所述分化培养基Ⅱ组成为：50mL 10％血清培养基+100μL胰岛素；
所述10％血清培养基组成为：45mL DMEM+5mL FBS+50μL庆大霉素。
小鼠耳朵间充质干细胞的获得方法同实施例1。
将实施例1和对比例1方法分化得到的脂肪细胞的进行油红O染色对比(均为培养33天)，结果如图4所示，结果表明：对比例1未加三碘甲状腺原氨酸，33天分化效率仅为30％-40％，实施例1加了三碘甲状腺原氨酸后，分化效率可达80％-90％。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.一种体外诱导小鼠耳朵间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，将小鼠耳朵间充质干细胞于DMEM培养基中培养至细胞长满后，使其接触抑制48-50h，然后更换培养基为分化培养基Ⅰ，48-50h后换为分化培养基Ⅱ，直至得到脂肪细胞；
所述分化培养基Ⅰ组成为：50mL 10％血清培养基+地塞米松50μL+IBMX 50μL+100μL胰岛素+4-6μL三碘甲状腺原氨酸；
所述分化培养基Ⅱ组成为：50mL 10％血清培养基+100μL胰岛素+4-6μL三碘甲状腺原氨酸；
所述10％血清培养基组成为：45mL DMEM+5mL FBS+50μL庆大霉素。
2.根据权利要求1所述的一种体外诱导小鼠耳朵间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，培养条件为37℃，CO2体积分数5％。
3.根据权利要求2所述的一种体外诱导小鼠耳朵间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，所述小鼠间充质干细胞的获得包括以下步骤：
S1、剪下4周龄小鼠的外耳，将外耳脱去毛发，使用PBS缓冲液洗涤2-3次后，置于胶原酶混合物中，并将外耳剪碎；
S2、将剪碎的外耳及胶原酶混合物于37℃下培养40-60min，后用70μm滤网过滤，保留滤液；
S3、在滤液中加入等体积的含15％胎牛血清的DMEM培养基，离心，保留沉淀，用含15％胎牛血清的DMEM培养基将沉淀混成悬液，混匀，于37℃，CO2体积分数为5％的条件下培养，期间更换为含10％胎牛血清的DMEM培养基，培养5-10天后，得到小鼠耳朵间充质干细胞。
4.根据权利要求3所述的一种体外诱导小鼠耳朵间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，S1中，所述小鼠为C57 WT小鼠。
5.根据权利要求4所述的一种体外诱导小鼠耳朵间充质干细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，S2中培养条件为：50rpm培养1h或水浴40min、且每隔5min吹打混匀一次。
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