CN104114693A - 与褐色脂肪样细胞相关的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

提供了用于治疗疾病包括代谢疾病及其他重量相关紊乱的方法和治疗剂。一般而言，本发明公开了用于制备褐色脂肪样细胞的方法，所述方法包括在足以增加至少一种脂肪细胞标记的表达的时间段和条件下，在成脂诱导培养基中培养动脉衍生的细胞群体，相比于未经处理的动脉衍生的细胞，所述至少一个脂肪细胞标记的表达处于更高水平。还提供了分离的动脉衍生的、离体分化的褐色脂肪样细胞，包括其药物组合物和细胞递送系统。在另一个实施例中，本发明公开了治疗受试者的方法，所述方法包括获得动脉衍生的褐色脂肪样细胞群体，并将褐色脂肪样细胞施用到受试者中的靶区域内。

Description

与褐色脂肪样细胞相关的方法和组合物
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求于2012年2月15日提交的名称为“Methods andComposition Related to Brown Adipose-Like Cells”的美国临时申请序列号61/599,080的优先权，其据此全文以引用方式并入。
技术领域
本发明涉及与褐色脂肪样细胞相关的方法和组合物以及代谢疾病及其他疾病的治疗。
背景技术
肥胖症代表最普遍的体重紊乱，并且它是西方世界最重要的营养紊乱，据估计其患病率范围为30％至50％的中年群体。超重和肥胖美国人的数目自从1960年后已持续增加，该趋势从未减慢。当今，大约64.5百分比的成年美国人被分类为超重或肥胖。随着肥胖人数持续增加，肥胖症正变得越来越引人关注，并且关于肥胖的负面健康影响更多地被了解。每年，肥胖症促使美国中的至少300,000例死亡，并且患有肥胖症的美国成人的卫生保健费用量超过$1250亿(美国肥胖症协会(American ObesityAssociation))。严重的肥胖症患者(体重超过理想体重100磅或更多的人)有严重健康问题的风险非常大。因此，大量注意力正集中于治疗患有肥胖症的患者。
即使轻度肥胖症也增加过早死亡、糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、胆囊疾病和某些类型的癌症的危险。因为肥胖症的高患病率和显著的健康后果，它的治疗应成为高度公共卫生优先事项。因此，存在用于治疗肥胖症和诱导重量减轻的更佳方法和治疗剂的需要。
发明内容
本发明大体提供了治疗疾病包括代谢疾病和重量相关紊乱的方法和组合物，所述方法和组合物涉及增加褐色脂肪组织，补充褐色脂肪组织或用褐色脂肪样组织替换白色脂肪组织。一个方面公开了关于分离的动脉衍生的、离体分化的褐色脂肪样细胞的方法和组合物。另一个方面公开了通过获得动脉衍生的褐色脂肪样细胞群体并将褐色脂肪样细胞施用到受试者中的靶区域内，用于治疗受试者的方法和组合物。
在另一个实施例中，制备褐色脂肪样细胞的方法可包括增加选自以下的脂肪细胞标记的表达：脂肪酸结合蛋白4(aP2)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、脂联素(ADN或ADIPOQ)、解偶联蛋白1(UCP-1)、含PR域蛋白16(PRDM16)、PPAR辅激活物-1α(PGC-1α)、CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)、细胞死亡诱导DFFA样效应蛋白A(CIDE-A)和延伸因子极长链脂肪酸样蛋白3(ELOVL3)。此外，脂肪细胞标记可以是褐色脂肪细胞标记，例如解偶联蛋白1(UCP-1)、含PR域蛋白16(PRDM16)、PPAR辅激活物-1α(PGC-1α)、CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)、细胞死亡诱导DFFA样效应蛋白A(CIDE-A)和延伸因子极长链脂肪酸样蛋白3(ELOVL3)。该方法还可包括分离褐色脂肪样细胞。
此外，动脉衍生的细胞可以是乳内动脉细胞或iMAC。这些细胞可对于HLA-1是阳性的，并且对于CD10、CD31、CD34、CD45、CD133、CD141和KDR/Flk-1是阴性的。动脉衍生的细胞可另外对于CD29、CD44、CD73、CD166是阳性的，并且另外对于CD15、CD23、CD24、CD62p、CD80、CD86、CD104、CD117、CD138、CD146、VE-钙粘蛋白和HLA-2是阴性的。
制备褐色脂肪样细胞的方法包括在成脂诱导培养基中培养动脉衍生的细胞群体。成脂诱导培养基可包括选自以下的化合物或化合物组合：骨形态发生蛋白(BMP)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、类视色素X受体-α(RxRα)、胰岛素和T3、噻唑烷二酮(TZD)、维生素A、视黄酸、胰岛素、糖皮质激素或其激动剂、无翅型(Wnt)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)-α、TGF-β、肿瘤坏死因子α(TNFα)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、血管内皮生长因子(VEGF)和血小板衍生的生长因子(PDGF)。
示例性实施例包括通过公开的方法制备的细胞群体，所述公开的方法包括在足以增加至少一种脂肪细胞标记的表达的时间段和条件下，在成脂诱导培养基中培养动脉衍生的细胞群体，相比于未经处理的动脉衍生的细胞，所述脂肪细胞标记的表达处于更高水平。
另一个方面包括分离的动脉衍生的、离体分化的褐色脂肪样细胞。褐色脂肪样细胞的特征可在于选自以下的至少一种脂肪细胞标记的表达：脂肪酸结合蛋白4(aP2)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、脂联素(ADN或ADIPOQ)、解偶联蛋白1(UCP-1)、含PR域蛋白16(PRDM16)、PPAR辅激活物-1α(PGC-1α)、CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)、细胞死亡诱导DFFA样效应蛋白A(CIDE-A)和延伸因子极长链脂肪酸样蛋白3(ELOVL3)。另外，脂肪细胞标记可以是选自以下的褐色脂肪细胞标记：解偶联蛋白1(UCP-1)、含PR域蛋白16(PRDM16)、PPAR辅激活物-1α(PGC-1α)、CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)、细胞死亡诱导DFFA样效应蛋白A(CIDE-A)和延伸因子极长链脂肪酸样蛋白3(ELOVL3)。相比于未经处理的动脉衍生的细胞，脂肪生成标记可在褐色脂肪样细胞中以更高水平表达。
褐色脂肪样细胞的特征还可在于其产热潜力。褐色脂肪细胞的该专门功能源自高线粒体含量和能够通过物理或化学刺激解偶联细胞呼吸(引起跨越线粒体膜的质子漏)或者通过解偶联蛋白(UCP)的上游受体发信号，以生成热。产热潜力可通过暴露于儿茶酚胺和环状AMP中的至少一种进行刺激。
此外，分离的动脉衍生的、离体分化的褐色脂肪样细胞可由乳内动脉细胞或iMAC分化。
分离的动脉衍生的、离体分化的褐色脂肪样细胞还可包括在具有可药用载体的药物组合物中。作为另外一种选择，分离的动脉衍生的、离体分化的褐色脂肪样细胞可包括在细胞递送系统中，所述细胞递送系统具有储库和与储库流体接触的递送装置，所述储库含有在可药用载体中的褐色脂肪样细胞。在示例性实施例中，储库可以是针或插管。此外，递送装置可容纳在单一容器或外壳的室例如小瓶或注射器中的褐色脂肪样细胞。
在另一个方面，公开了通过获得动脉衍生的褐色脂肪样细胞群体并将褐色脂肪样细胞施用到受试者中的靶区域内，来治疗受试者的方法。在一个实施例中，该方法还包括将褐色脂肪样细胞制备为可注射组合物。
在另一个实施例中，动脉衍生的褐色脂肪样细胞对于受试者可以是自体的。作为另外一种选择，褐色脂肪样细胞对于受试者可以是同种异体的或异种的。
受试者还可患有选自肥胖症、糖尿病或高脂血症的代谢紊乱。另外，受试者可以是肥胖的并且需要治疗。在示例性实施例中，受试者是人。
治疗受试者的方法还可增加受试者中的产热潜力。产热潜力的特征可在于跨越线粒体膜的质子漏，所述质子漏生成热。另外，该方法可包括刺激动脉衍生的褐色脂肪样细胞，以增加产热潜力来治疗受试者。
附图说明
通过以下结合附图所作的详细说明，将更充分地理解本发明，其中：
图1是间充质干细胞分化成白色脂肪细胞、褐色脂肪细胞、肌细胞和骨细胞的图例；
图2A显示了暴露于成脂培养基并用油红O溶液染色的乳内动脉细胞(iMAC)具有显著增加的脂质蓄积；
图2B显示了暴露于对照培养基(维持培养基)并用油红O溶液染色的iMAC未展示出显著的脂质蓄积；
图3A显示了相比于未经处理的iMAC，在分化的iMAC中的脂肪细胞标记脂肪酸结合蛋白4(aP2)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、脂联素(ADN或ADIPOQ)的相对定量的RT-PCR表达水平；并且
图3B显示了相比于未经处理的iMAC，在分化的iMAC中的褐色脂肪细胞标记解偶联蛋白1(UCP-1)、含PR域蛋白16(PRDM16)、PPAR辅激活物-1α(PGC-1α)、CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)、细胞死亡诱导DFFA样效应蛋白A(CIDE-A)和延伸因子极长链脂肪酸样蛋白3(ELOVL3)的相对定量的RT-PCR表达水平。
具体实施方式
现在将描述某些示例性实施例，以提供本文公开的治疗剂和方法的结构、功能、制造和用途的原理的总体理解。这些实施例的一个或多个实例在附图中示出。本领域技术人员应当理解，在本文中具体描述并在附图中举例说明的治疗剂和方法是非限制性的示例性实施例，并且本发明的范围仅由权利要求书限定。就一个示例性实施例进行图解说明或描述的特征，可与其它实施例的特征进行组合。这种修改形式和变化形式旨在包括在本发明的范围之内。
本公开提供了可用于增加受试者中的褐色脂肪组织(BAT)和/或BAT功能的组合物和方法，用于治疗疾病例如肥胖症以及其他重量相关疾病和紊乱。这些方法包括促进祖细胞(例如能够分化成脂肪细胞的祖细胞)分化为BAT细胞谱系或朝向BAT细胞谱系分化。更具体而言，本公开至少部分基于以下发现：动脉衍生的细胞例如乳内动脉细胞能够分化为褐色脂肪样细胞或BAT细胞谱系，或者朝向褐色脂肪样细胞或BAT细胞谱系分化。如本文所述，这些组合物和方法可用于增加BAT细胞数目和/或BAT功能和/或增加BAT与白色脂肪组织(WAT)的比率，并且从而治疗受试者中的代谢疾病例如肥胖症以及重量相关疾病和紊乱。
本文描述的方法中的一些包括植入动脉衍生的细胞，所述动脉衍生的细胞已用成脂诱导培养基进行处理。一般而言，该方法包括用成脂诱导或分化培养基处理(例如接触)祖细胞例如动脉衍生的细胞，并且其后将脂肪样细胞(例如至少一种细胞或此类细胞的群体)植入受试者中。
褐色脂肪组织
体重指数(BMI)是基于数学公式的表示重量与身高的关系(或比率)的量度，在所述数学公式中以千克表示的个人体重除以以米表示的他或她的身高的平方(即重量/(身高)2)。参见美国国立卫生研究院(NationalInstitute of Health)的Clinical Guidelines on the Identification，Evaluation，andTreatment of Overweight and Obesity in Adults(1998)。
肥胖症通常指个体具有30kg/m2或更大的BMI。超重描述个体具有25kg/m2或更大，但小于30kg/m2的BMI。然而，并非所有患有代谢疾病的个体均为肥胖或超重的。非肥胖个体可患有代谢疾病例如糖尿病和高脂血症，具有小于25kg/m2的BMI。
脂肪细胞对于能量平衡和脂质稳态控制是关键的。在脂肪组织中贮存过量能量的能力是重要的进化适应。存在两类脂肪或脂肪组织：白色脂肪组织(WAT)，能量贮存的主要部位，和专门用于能量消耗和产热的褐色脂肪组织。有趣的是，在褐色脂肪组织的量和体重指数之间存在反相关，其中肥胖个体具有比消瘦个体明显更少的该组织；这提示褐色脂肪可能是维持消瘦表型的重要因素，或肥胖表型已导致BAT储存的大小和/或活性中的缩减。
脂肪组织部分地由对于WAT或BAT特定的脂肪细胞(adipocyte)或脂肪细胞(adipose cell)组成。脂肪细胞还可产生脂肪因子，例如肿瘤坏死因子α(TNFα)、瘦蛋白、抵抗素、视黄醇结合蛋白4(RBP4)、心血管活性多肽(apelin)和脂联素，以调节全身代谢。在脂肪组织中适当贮存三甘油酯的无能导致对肝脏和骨骼肌中的葡萄糖代谢的不利作用。与WAT形成对比，BAT的生理作用是代谢脂肪酸并通过产热消耗能量。褐色脂肪细胞的该专门激活功能源自高线粒体含量和能够通过物理或化学刺激解偶联细胞呼吸或者通过解偶联蛋白(UCP)的上游受体发信号，以生成热。产热是由通过暴露于冷来激活的代谢速率引起的热产生。例如，褐色脂肪细胞变得被激活，并且由于跨越线粒体膜的质子漏而显示出产热潜力，所述质子漏生成热。该功能潜力还可通过暴露于儿茶酚胺如去甲肾上腺素、环状AMP和瘦蛋白中的至少一种进行刺激。由于WAT和BAT之间的这些功能差异，WAT与BAT的比率可影响全身能量平衡，所述全身能量平衡可促成肥胖症的发展。
本发明公开了通过增加受试者中的BAT总量来增加BAT活性或能量消耗的方法和组合物。这可通过多重机制来实现，所述机制例如干细胞/祖细胞分化为褐色脂肪细胞，例如动脉衍生的细胞诱导分化成褐色脂肪样细胞；以及干细胞/祖细胞、经诱导的多能干细胞(iPSC)、动脉衍生的细胞、褐色脂肪细胞和/或褐色脂肪样细胞移植到BAT储存或具有足够神经支配和血管供应的任何其他部位内。
分化成褐色脂肪样细胞
间充质干细胞在适当条件下产生骨、肌肉和脂肪细胞的前体细胞。参见图1。一般而言，褐色脂肪细胞来自中间胚胎层或中胚层，肌细胞(myocyte)(肌细胞(muscle cell))、脂肪细胞和软骨细胞(chondrocyte)(软骨细胞(cartilage cell))的来源。脂肪生成一般描述为两步过程。第一步包括由间充质干细胞(MSC)生成定型脂肪细胞祖先(或前脂肪细胞)。第二步涉及这些前脂肪细胞终末分化为成熟的功能脂肪细胞。
如本文所用，术语“脂肪细胞”(adipocyte)或“脂肪细胞”(adipose cell)包含白色脂肪细胞和褐色脂肪细胞两者。术语“褐色脂肪细胞”(brownadipocyte)和“褐色脂肪细胞”(brown adipose cell)可互换使用。如本文所用，术语“动脉衍生的细胞”和“脂肪细胞前体细胞”指可增殖并被诱导分化为褐色脂肪样细胞的细胞。脂肪细胞前体细胞包含但不限于动脉衍生的细胞，例如乳内动脉细胞(iMAC)以及其他可分化产生褐色脂肪样细胞的细胞。术语“增殖”或“增殖的”也可与单词“扩增”或“扩增的”互换使用。
扩大受试者中的BAT细胞数目以增加总体能量消耗可提供治疗代谢紊乱例如肥胖症、糖尿病和高脂血症的机制。在一个实施例中，褐色脂肪组织可通过以下得到扩大：分离脂肪细胞前体细胞，使脂肪细胞前体细胞分化成褐色脂肪样细胞，并且将褐色脂肪样细胞转移到褐色脂肪组织内。
在一个方面，脂肪细胞前体细胞例如动脉衍生的细胞可从体内取出并培养，以生长并扩增。动脉衍生的细胞例如乳内细胞(iMAC)可在任何适当的培养基例如生长培养基中进行培养，所述适当的培养基维持细胞的活力和增殖状态。例如，从哺乳动物乳内动脉中分离的iMAC是自我更新的，并且可分化成褐色脂肪样细胞，另外产生具有相等潜力的子细胞。这些细胞从乳内动脉中“分离”，所述分离指细胞与周围组织的分开，如美国申请公开号：2011/0076769中公开的。如本文所用的术语“分离的”指已纯化掉其他组分的细胞、细胞组、细胞群体、组织或器官。
具有不同功效的常规方法技术可用于纯化并分离所需细胞群体。采用的分离技术应使待收集的细胞级分的活力的保留达到最大。采用的具体技术当然将取决于分离的效率、方法的细胞毒性、分离的容易和速度、以及需要何种设备和/或工艺技术。一些非限制性例子可包括但不限于通过其转录组、细胞因子概况、蛋白质组和细胞表面生物标记检测来表征脂肪细胞前体细胞。术语“生物标记”、“表面标记”和“标记”可互换使用，并且指作用于帮助鉴定细胞的，在细胞表面上表达的蛋白质、糖蛋白、受体或其他分子。细胞表面标记一般可通过本领域技术人员已知的常规方法进行检测。用于检测细胞表面标记的方法的具体的非限制性例子为免疫组织化学、荧光激活细胞分选(FACS)或酶促分析。
脂肪细胞前体细胞可通过与固相连接的抗体结合的一种或多种感兴趣的标记的表达进行鉴定。结合的细胞随后通过任何适当的方法与固相分离，主要取决于采用的固相和抗体的性质。抗体可与生物素缀合，所述生物素随后可用与载体或荧光染料结合的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白去除，所述载体或荧光染料可与荧光激活细胞分选器(FACS)一起使用，以允许细胞分离。
在一个实施例中，脂肪细胞前体细胞例如iMAC的特征可在于HLA-1的阳性表达以及CD10、CD31、CD34、CD45、CD133、CD141和KDR/Flk-1的阴性表达。iMAC的特征还可在于另外对于CD29、CD44、CD73、CD166为阳性以及另外对于CD15、CD23、CD24、CD62p、CD80、CD86、CD104、CD117、CD138、CD146、VE-钙粘蛋白和HLA-2为阴性。虽然早期实验显示iMAC对于CD105是阴性的，但进一步实验显示iMAC对于CD105是阳性的。
动脉衍生的细胞可从动脉组织例如乳内动脉中分离。细胞可通过多种方法包括机械和/或酶促方法进行分离。在一个实施例中，分离的细胞群体包括大于约50％、大于约70％、大于约75％、大于约80％、大于约85％、大于约90％、大于约95％、大于约96％、大于约97％、大于约98％或大于约99％的感兴趣的细胞。感兴趣的细胞可包括但不限于脂肪细胞前体细胞、脂肪细胞和褐色脂肪样细胞。在另一个实施例中，分离的细胞群体是其中无法检测到具有与感兴趣的细胞不同的表型的其他细胞的细胞群体。在进一步的实施例中，分离的细胞群体是这样的细胞群体，其包括具有与感兴趣的细胞不同表型的小于约15％、小于约10％的细胞、小于约5％的细胞、小于约4％的细胞、小于约3％的细胞、小于约2％的细胞或小于约1％的细胞。
分离操作可包括使用抗体涂布的磁珠的磁性分离、亲和色谱、与单克隆抗体连接或与补体结合使用的细胞毒素剂、以及利用与固体基质附着的单克隆抗体的“淘选”、或另一种常规技术。与磁珠以及其他固体基质例如琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、空心纤维膜和塑料培养皿附着的抗体允许直接分离。由抗体结合的细胞可通过使固体载体与细胞悬浮液简单地物理分离，从细胞悬浮液中取出。细胞与固相连接的抗体温育的确切条件和持续时间将取决于对于采用的系统特定的几种因素。然而，适当条件的选择完全在本领域的技术内。
在一些方法中，细胞亚群可根据与固体基底的附着进行分离(称为“贴壁细胞”)，所述固体基底例如细胞培养容器(例如培养皿、培养瓶或设计用于组织培养的珠)。在一些实施例中，固体基底可包含细胞外基质(ECM)基底。ECM基底包括例如纤连蛋白、胶原、层粘连蛋白、玻连蛋白、聚赖氨酸、腱糖蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖(例如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)、巢蛋白、MatrigelTM、与疏水生物相容性支架(例如聚乙二醇(PEG)、聚乙醇酸(PGA)、聚(D，L-丙交酯共乙交酯)(PLGA)或其他)共价交联的合成含RGDS肽、或其组合。本文考虑了特定ECM基底的任何或所有形式。例如，胶原通常已知以多重同种型存在(Molecular Biology of theCell，第3版，由Alberts等人编辑，New York：Garland Publishing，1994年，第19章)，包括十八种不同的胶原同种型(例如胶原I、II、III、IV、V及其他)。类似地，层粘连蛋白(Ekblom等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，857：194-211，1998年)和纤连蛋白(Molecular Biology of the Cell，第3版，由Alberts等人编辑，New York：Garland Publishing，1994年，第19章)的多重同种型是已知的。在具体的非限制性实施例中，ECM基底包含1-1000ng/ml纤连蛋白涂布的固体基底，例如10ng/ml纤连蛋白涂布的固体基底。
众多培养基是已知的并适合于维持培养中的脂肪细胞前体细胞。一般而言，生长培养基包括最低必需培养基。在一个实施例中，培养基是DMEM/F12。生长培养基可补充有血清。血清的具体的非限制性例子为马、小牛或胎牛血清(FBS)。培养基可具有按体积计约2％至按体积计约20％的血清，或按体积计约5％、或约10％的血清。在一个实施例中，生长培养基补充有约10％FBS。在一个实施例中，培养基含有一种或多种另外的添加剂，例如抗生素或营养物质。营养物质可包括氨基酸，例如10-1000U/ml L-谷氨酰胺。抗生素的具体的非限制性例子包括10-1000U/ml青霉素和约0.01mg/ml至约10mg/ml链霉素。在具体例子中，生长培养基含有约50U/ml L-谷氨酰胺、50U/ml青霉素和约50μg/ml链霉素。
培养基可以是维持细胞活力的任何培养基或任何缓冲液，例如生长培养基。众多培养基是已知并适用的。一般而言，生长培养基包括最低必需培养基。在一个实施例中，培养基是DMEM-低糖(DMEM-LG)。生长培养基可补充有血清。血清的具体的非限制性例子为马、小牛或胎牛血清(FBS)。培养基可具有按体积计约2％至按体积计约10％的血清，或按体积计约5％、或约2％的血清。在一个实施例中，生长培养基补充有约5％FBS。在一个实施例中，培养基含有一种或多种另外的添加剂，例如抗生素或营养物质。抗生素的具体的非限制性例子包括10-1000U/ml青霉素和约0.01mg/ml至约10mg/ml链霉素。在具体例子中，生长培养基含有约100U青霉素和约1mg/ml链霉素。
脂肪细胞前体细胞例如动脉衍生的细胞或iMAC可在生长培养基中扩增。脂肪细胞前体细胞例如动脉衍生的细胞或iMAC的单细胞衍生的集落，可使用本领域已知的任何技术例如克隆环进行分离用于扩增。作为另外一种选择，脂肪细胞前体细胞例如动脉衍生的细胞或iMAC的单细胞衍生的集落可合并用于扩增。在具体实施例中，iMAC在生长培养基中培养足够天数，以获得所需数目的iMAC。在一个实施例中，iMAC在生长培养基中培养至少约2天。在另一个实施例中，iMAC在生长培养基中培养至少约7天。在另外一个实施例中，iMAC在生长培养基中培养至少约14天。
在另一个方面，褐色脂肪样细胞可通过脂肪细胞前体细胞例如动脉衍生的细胞或iMAC的分化来生成。脂肪细胞前体细胞例如动脉衍生的细胞或iMAC可被诱导分化成对于本公开有用的褐色脂肪样细胞。如本文所用的术语“分化”指由此相对非特化的细胞(例如未分化的细胞，例如多谱系可诱导细胞)获得成熟细胞特征性的专门结构和/或功能特点的过程。通常，在分化过程中，细胞结构改变并且组织特定蛋白质出现。“成脂分化”是由此未分化的细胞获得脂肪细胞例如褐色脂肪细胞特征性的一种或多种特性(例如形态、生物化学或功能特性)的过程。本领域技术人员应当理解“褐色脂肪样细胞”包括源自MSC、脂肪细胞祖细胞、前脂肪细胞和动脉衍生的细胞的褐色脂肪细胞。
脂肪细胞前体细胞诱导分化为褐色脂肪样细胞可通过本领域技术人员已知的方法执行。例如，已知方法可包括但不限于用化合物处理脂肪细胞前体细胞，所述化合物例如关于核激素受体(地塞米松)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ、吡格列酮、罗格列酮、AvandiaTM)的配体、吲哚美辛、胰岛素、噻唑烷二酮、以及增加cAMP的细胞内水平的化合物(异丁基甲基黄嘌呤)。在一个实施例中，脂肪细胞前体细胞在成脂诱导培养基中进行培养，所述成脂诱导培养基包括以下中的一种或多种：氢化可的松、关于核激素受体(地塞米松)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ、吡格列酮、罗格列酮、AvandiaTM)的配体、骨形态发生蛋白(BMP)、类视色素X受体-α(RxRα)、胰岛素和T3、噻唑烷二酮(TZD)、维生素A、视黄酸、胰岛素、糖皮质激素或其激动剂、无翅型(Wnt)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)-α、TGF-β、肿瘤坏死因子α(TNFα)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、血管内皮生长因子(VEGF)和血小板衍生的生长因子(PDGF)、吲哚美辛、以及增加cAMP的细胞内水平的化合物(异丁基甲基黄嘌呤)。脂肪细胞前体细胞还可通过已知诱导分化的分子的表达和过表达而被诱导分化。这些包括但不限于用骨形态发生蛋白例如BMP7、PPARγ、生肌因子5(myf5)、含PR域16(PRDM16)处理，以及转录调节物例如PRDM16和PPARγ转染，以诱导分化。
在示例性例子中，成脂诱导培养基包括约0.2μM至约1.0μM氢化可的松，例如约0.3μM至约0.7μM、或约0.4μM至约0.6μM氢化可的松。在另外一个例子中，成脂诱导培养基包括约0.5μM氢化可的松。在另一个实施例中，成脂诱导培养基包括约0.2mM至约1.0mM异丁基甲基黄嘌呤，例如约0.3mM至约0.7mM、或约0.4mM至约0.6mM异丁基甲基黄嘌呤。在具体实施例中，成脂诱导培养基包括约0.5mM异丁基甲基黄嘌呤。在另一个具体例子中，成脂诱导培养基包括约30μM至约120μM吲哚美辛，例如约40μM至约90μM、或约50μM至约70μM吲哚美辛。在另外一个例子中，成脂诱导培养基包括约60μM吲哚美辛。
此外，成脂诱导培养基还可含有一种或多种另外的添加剂，例如一种或多种抗生素、生长因子、营养物质或其组合。一般而言，成脂诱导培养基包括最低必需培养基。在一个实施例中，培养基是最低必需培养基，例如α-MEM。成脂诱导培养基还可补充有血清，例如马、小牛或胎牛血清或其组合。成脂诱导培养基可具有按体积计约5％至按体积计约25％的血清，或按体积计约20％、或约10％的血清。在一个实施例中，成脂诱导培养基补充有10％FBS和10％马血清。
在一个非限制性例子中，脂肪细胞前体细胞可与成脂诱导培养基接触，所述成脂诱导培养基包含α-MEM、10％FBS、10％马血清、0.5μM氢化可的松、0.5mM异丁基甲基黄嘌呤和60μM吲哚美辛。在一个更具体的例子中，α-MEM进一步补充有100U/ml青霉素和1mg/ml链霉素。脂肪细胞分化可预期例如在具有95％空气、5％CO2的潮湿大气环境(例如100％湿度)中在37℃下发生。
脂肪细胞前体细胞可在成脂诱导培养基中培养足以增加至少一种脂肪细胞标记的表达的时间段。脂肪细胞前体细胞可培养约1周至约6周，使得可检测到脂肪细胞分化。在其他实施例中，脂肪细胞分化可在小于约1周、2周、3周、4周、5周、6周以及其间的任何时间段内检测到。
脂肪细胞分化可通过一种或多种脂肪相关标记的表达进行检测。如本文所用，术语“脂肪相关标记”包括脂肪细胞标记、褐色脂肪细胞标记和褐色脂肪样标记。相比于未经处理的脂肪细胞前体细胞，脂肪相关标记例如脂肪细胞标记可上升至更高水平。脂肪细胞相关标记可以是脂肪细胞标记或褐色脂肪细胞标记。脂肪细胞标记的例子可包括但不限于脂肪酸结合蛋白4(aP2)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、脂联素(AND或ADIPOQ)、解偶联蛋白1(UCP-1)、含PR域蛋白16(PRDM16)、PPAR辅激活物-1α(PGC-1α)、CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)、细胞死亡诱导DFFA样效应蛋白A(CIDE-A)和延伸因子极长链脂肪酸样蛋白3(ELOVL3)。褐色脂肪细胞标记的例子可包括但不限于解偶联蛋白1(UCP-1)、含PR域蛋白16(PRDM16)、PPAR辅激活物-1α(PGC-1α)、CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)、细胞死亡诱导DFFA样效应蛋白A(CIDE-A)和延伸因子极长链脂肪酸样蛋白3(ELOVL3)。
在具体实施例中，脂肪细胞前体细胞是动脉衍生的细胞，例如iMAC，其在足以增加至少一种脂肪细胞标记的表达的时间段和条件下，在成脂诱导培养基中进行培养，相比于未经处理的动脉衍生的细胞，所述至少一种脂肪细胞标记的表达处于更高水平。在另一个实施例中，脂肪细胞前体细胞还可在足以增加至少一种褐色脂肪细胞标记的表达的条件下进行培养，相比于未经处理的脂肪细胞前体细胞，所述至少一种褐色脂肪细胞标记的表达处于更高水平。脂肪细胞标记表达在经处理的脂肪细胞前体细胞中可增加超过未经处理的脂肪细胞前体细胞至少约2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5000倍、10,000倍、50,000倍、100,000倍、150,000倍、200,000倍、250,000倍、300,000倍、450,000倍、500,000倍、550,000倍、600,000倍、650,000倍、700,000倍、750,000倍、800,000倍、850,000倍、900,000倍，或至少约1,000,000倍。在示例性实施例中，在经处理的脂肪细胞前体细胞中的脂肪细胞标记表达中的增加超过未经处理的脂肪细胞前体细胞至少约10倍。在另一个示例性实施例中，在经处理的脂肪细胞前体细胞中的脂肪细胞标记表达中的增加超过未经处理的脂肪细胞前体细胞至少约100倍。在另外一个示例性实施例中，在经处理的脂肪细胞前体细胞中的脂肪细胞标记表达中的增加超过未经处理的脂肪细胞前体细胞至少约1000倍。
脂肪细胞前体细胞例如动脉衍生的细胞或iMAC分化成褐色脂肪样细胞可通过本领域技术人员已知的任何方法进行测量。具体的非限制性例子是免疫组织化学分析，以检测脂肪相关标记的表达，使用诸如RNA印迹、RNA酶保护和RT-PCR的技术。在另一个实施例中，脂肪细胞功能的测定法可测量，包括三甘油酯的细胞质蓄积。
例如，脂肪酸结合蛋白4(aP2)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、脂联素(ADN或ADIPOQ)、解偶联蛋白1(UCP-1)、含PR域蛋白16(PRDM16)、PPAR辅激活物-1α(PGC-1α)、CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)、细胞死亡诱导DFFA样效应蛋白A(CIDE-A)和延伸因子极长链脂肪酸样蛋白3(ELOVL3))表达可通过诸如ELISA测定法和蛋白质印迹分析的测定法进行测量。细胞的分化还可通过测定编码骨相关多肽(例如脂蛋白脂肪酶或过氧化物酶体增殖物激活受体γ-2)的mRNA水平进行测量。在示例性实施例中，褐色脂肪样细胞表达至少一种脂肪生成标记，例如aP2、PPARα、PPARγ和ADIPOQ。在另一个示例性实施例中，褐色脂肪样细胞表达至少一种褐色脂肪细胞标记，例如UCP1、PRDM16、PGC1α、C/EBPβ、CIDEA和ELVOL3。在另外一个示例性实施例中，褐色脂肪样细胞表达至少一种脂肪生成标记，例如aP2、PPARα、PPARγ和ADIPOQ，以及至少一种褐色脂肪细胞标记，例如UCP1、PRDM16、PGC1α、C/EBPβ、CIDEA和ELVOL3。
脂肪细胞前体细胞的分化还可通过细胞的功能潜力例如产热潜力或应答进行测定。例如，当氧化磷酸化与ATP合酶通道解偶联时，跨越线粒体膜的质子漏生成热并消耗能量。在示例性实施例中，可测量质子漏以测定褐色脂肪样细胞的产热潜力。另外，褐色脂肪样细胞可通过暴露于儿茶酚胺如去甲肾上腺素、环状AMP和瘦蛋白中的至少一种进行激活。
褐色脂肪样细胞还可从分化培养物中进行分离。细胞可通过多种方法进行分离，所述方法包括本领域已知的机械和/或物理分离方法。
治疗方法
一般而言，本文描述的方法和组合物可用于治疗疾病，包括代谢疾病和重量相关紊乱。一般而言，该方法包括从受试者中获得脂肪细胞前体细胞群体，任选培养和/或富集脂肪细胞前体细胞以获得纯化的脂肪细胞前体细胞群体，如本文描述的使细胞分化以获得褐色脂肪样细胞，并将褐色脂肪样细胞施用于有此需要的受试者，包括已诊断为需要此类治疗的受试者。
在一些实施例中，该方法包括鉴定需要治疗的受试者(例如超重或肥胖受试者，例如具有25-29或30或以上的体重指数(BMI)，或者患有重量相关紊乱的受试者)，并且给受试者施用有效量的褐色脂肪样细胞。需要用本文描述的方法治疗的受试者可基于受试者的体重或体重指数加以选择。在一些实施例中，该方法包括就以下中的一种或多种评估受试者：重量、脂肪组织贮存、脂肪组织形态、胰岛素水平、胰岛素代谢、葡萄糖水平、产热能力和冷敏感性。在一些实施例中，受试者选择可包括评价受试者中的褐色脂肪组织的量或活性，并且记录这些观察。
本文描述的方法和组合物例如可用于治疗受试者中的代谢疾病，例如肥胖症、高脂血症和胰岛素抗性，或用于治疗与线粒体缺乏相关的疾病，例如糖尿病、癌症、神经变性和衰老。
褐色脂肪细胞样细胞的制剂
在一个实施例中，褐色脂肪样细胞可掺入适合于施用于受试者的药物组合物内。药物组合物还可包括一种或多种可药用载体。如本文所用，“可药用载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。可药用载体的例子包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇及其组合。在许多情况下，药物组合物可在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇例如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。
治疗组合物通常在制造和贮存条件下必须是无菌和稳定的。无菌注射溶液可通过将细胞以所需量与上文列举的一种或多种成分一起掺入适当溶液中进行制备，所述适当溶液已进行过滤灭菌。
褐色脂肪样细胞的组合物可以多种形式施用。如本领域技术人员应当理解的，施用途径和/或方式将取决于所需结果而变。药物组合物可包括“治疗有效量”的褐色脂肪样细胞。“治疗有效量”指在所需剂量和时间段有效实现所需治疗结果的量。褐色脂肪样细胞的组合物的治疗有效量可根据以下因素而变：例如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，以及载体在个体中引发所需应答的能力。治疗有效量也是其中载体的治疗有益效应远远超过任何毒性或有害效应的量。
还提供了递送系统。在一个实施例中，褐色脂肪样细胞可以是试剂盒的一部分。该试剂盒还可包括另外的组分，例如如上所述的一种或多种可药用载体。递送系统可包括含有如本文描述的一种或多种细胞类型的储库、一种或多种可药用载体和与储库流体接触的递送装置，例如针或插管。在示例性实施例中，褐色脂肪样细胞可容纳在单一容器或外壳的室例如小瓶或注射器中。本领域技术人员应当理解可使用本领域已知的任何外壳系统。
典型的示例性组合物采取注射或输注溶液的形式，例如类似于用于人的被动免疫接种的组合物。一种示例施用方式是肠胃外的(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一个实施例中，褐色脂肪样细胞通过静脉内输注或注射进行施用。在另一个实施例中，褐色脂肪样细胞通过肌内或皮下注射进行施用。在另外一个实施例中，褐色脂肪样细胞递送至特定位置。在示例性实施例中，褐色脂肪样细胞可注射并递送到至少一个褐色脂肪组织储存或具有足够神经支配和血管供应的任何其他部位。褐色脂肪样细胞的局部和/或靶向施用可例如用生物可降解的基质来实现。生物可降解的基质可以是可植入的递送系统，其中褐色脂肪样细胞掺入生物可降解的基质内或接种到生物可降解的基质上。
褐色脂肪样细胞还可与不可吸收/可吸收的支架一起例如通过封装递送。许多用于封装细胞或制备支架的技术是本领域已知的，并且可与公开的细胞一起使用。封装材料和支架可由包括但不限于天然或合成聚合物的材料制成，所述材料可通过以受控速率的水解降解和/或再吸收。
褐色脂肪样细胞还可包括在可植入装置内，例如具有包含褐色脂肪样细胞的生物可降解核心的网孔室。该装置可被配置成含有细胞并阻止细胞释放到受试者的系统内，但允许可溶性因子的交换。在具体实施例中，褐色脂肪样细胞可包括在可植入装置的生物可降解核心内。
剂量方案可进行调整，以提供最佳所需应答(例如治疗或预防应答)。例如，可施用单次推注，可随着时间过去施用几个分份剂量，或如由治疗情况的紧急指示可按比例减少或增加剂量。尤其有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以易于施用和剂量的一致性。如本文所用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗的哺乳动物受试者的单元剂量的物理上不连续单位；每个单位含有与所需可药用载体结合的预定数量的活性化合物，所述预定数量计算为产生所需治疗效应。本发明的剂量单位形式的规格由以下指示并直接取决于：(a)活性化合物的独特特征和待实现的具体治疗或预防效应，和(b)用于治疗个体中的敏感性的此类活性化合物的调配领域中固有的局限性。褐色脂肪样细胞还可掺入体外装置内，用作对于患者机体外部的治疗储存。
在一个方面，褐色脂肪组织可通过褐色脂肪样细胞的移植得到增加或扩大。在一个实施例中，褐色脂肪组织可通过褐色脂肪样细胞的移植增加约2％-20％。在另一个实施例中，褐色脂肪组织可增加约5-10％的褐色脂肪样细胞。在另一个实施例中，褐色脂肪组织可增加约50-100％的褐色脂肪样细胞。在其他实施例中，褐色脂肪组织可通过褐色脂肪样细胞的移植在感兴趣的区域/储存或患者中增加至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％。如本文所用的术语“移植”指细胞从一个机体或机体的一部分转移到另一个机体或机体的另一部分或者从离体转移到体内。褐色脂肪样细胞可以是自体、同种异体或异种的。必要时，可施用免疫抑制，以预防同种异体或异种细胞的排斥。褐色脂肪样细胞还可使用多种技术进行封装，以预防排斥，所述技术包括封装以及其他屏障方法。“同种异体移植”或“异源移植”是从一个个体移植到另一个个体，其中所述个体具有在一个或多个基因座处在两个个体之间在序列中不相同的基因。同种异体移植可在遗传上不同的相同物种的两个个体之间，或在两个不同物种的个体之间发生。“自体移植”是组织或细胞从相同个体中的一个位置移植到另一个位置，或者组织或细胞从一个个体移植到另一个个体，其中两个个体是遗传上相同的。
在一个实施例中，脂肪细胞前体细胞例如iMAC、MSC、脂肪细胞祖细胞等，或褐色脂肪样细胞可悬浮于合适的移植介质，例如磷酸盐缓冲盐水以及其他盐水中。细胞移植混合物可经由具有范围为30至18号的针的注射器注射到靶位置内，其中针号取决于此类因素如脂肪细胞悬浮液的总体粘度。可使用范围为22至18号和30至27号的针。
如本文所用的术语“靶部位”指体内的区域或机体结构中的区域。在一些实施例中，靶区域可以是本文讨论的褐色脂肪组织储存中的一种或多种，例如锁骨上区域、颈背、肩胛骨上方、沿脊髓、接近在褐色脂肪组织储存中终止的交感神经系统的近侧分支、至少一个肾周围、肾囊、肝脏、皮肤、具有足够神经支配和血管供应的任何其他部位或其他地方。
另外，靶区域是其中希望通过施用褐色脂肪样细胞增加或扩大褐色脂肪组织的区域，如本领域技术人员应当理解的，通过经由使用PET-CT成像、断层摄影术、温度记录或任何其他技术成像或扫描患者，定位患者中的褐色脂肪组织储存，可在个体化患者的基础上测定一种或多种褐色脂肪组织储存的鉴定。基于非放射性的成像技术可用于测量与储存内的褐色脂肪组织刺激相关的血流中的变化。
在一个实施例中，含有微泡的造影剂可用于定位褐色脂肪组织。造影剂可注射到其褐色脂肪组织已激活的患者内。任何能源例如低频超声可应用于感兴趣的区域，以引起来自造影剂的气泡的破坏。可定量该空间的再填充速率。增加的再填充速率可与活性褐色脂肪组织储存相关。
在另一个实施例中，含有荧光介质的造影剂可用于定位褐色脂肪组织。造影剂可注射到其褐色脂肪组织已激活的患者内。基于针的探针可置于感兴趣的区域中，感兴趣的区域能够计数经过探针的荧光造影剂的量。增加的计数/单位时间对应于增加的血流，并且可与激活的褐色脂肪组织储存相关。因为人可具有相对少量的褐色脂肪组织，并且因为即使接近典型的褐色脂肪组织储存例如颈背，也可能难以预测褐色脂肪组织在哪里是最普遍的，所以使患者成像以更精确地找到褐色脂肪组织储存，并且可允许支配褐色脂肪组织的更多神经以更大的精确度进行刺激。通过患者成像鉴定的任何数目的褐色脂肪组织储存可使用永久或暂时标记进行标记用于未来参考。如本领域技术人员应当理解的，任何类型的标记均可用于标记褐色脂肪组织储存，例如应用于表皮上和/或下的墨水、染料注射等。标记可被配置成仅在特定光照条件例如紫外线例如黑光下可见。
评价治疗
在一些实施例中，本文描述的方法可包括在治疗后评价受试者中的BAT量或活性，并且记录这些观察。这些治疗后观察可相比于在受试者选择过程中作出的观察。在一些实施例中，受试者将具有增加的BAT水平和/或活性。在一些实施例中，受试者将显示减少的症状。在一些实施例中，评价可包括在治疗前和/或后测定受试者的重量或BMI，并且比较受试者在治疗前的重量或BMI与治疗后的重量或BMI。成功的指示将是观察到重量或BMI的降低。在一些实施例中，治疗另外施用一次或多次，直至实现靶重量或BMI。作为另外一种选择，可使用围长的测量，例如腰、胸、臀、大腿或臂周长。
这些评价可用于测定用于受试者的未来治疗过程。例如，治疗可继续而不改变，伴随改变而继续(例如另外的治疗或更侵袭性的治疗)，或治疗可停止。在一些实施例中，该方法包括另外一轮或多轮褐色脂肪样细胞的植入，以维持或进一步减少受试者中的代谢疾病的症状。
实例
本领域技术人员应当理解进一步的特点和优点可基于上述实施例。相应地，公开的方法和组合物并不受已在例子或附图中具体显示并描述的内容限制，除非如所附权利要求指示的那样。本文引述的所有出版物和参考文献都明确地以引用方式全文并入本文中。
实例1：褐色脂肪细胞前体细胞的分离和表征
候选褐色脂肪祖细胞从人乳内动脉中进行分离。随后通过使细胞暴露于成脂分化培养基，研究这些分离的细胞(乳内动脉细胞或iMAC)分化为BAT细胞的能力。
一部分人乳内动脉得自全国疾病研究交流中心(National DiseaseResearch Interchange)(NDRI，Philadelphia，PA)。为了去除血液和碎片，将动脉修剪并在达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM-低糖；Invitrogen，Carlsbad，CA)或磷酸盐缓冲盐水(PBS；Invitrogen)中进行洗涤。然后将整个动脉转移至50毫升锥形管。然后在酶混合物中消化组织，所述酶混合物含有0.25单位/毫升胶原酶(Serva Electrophoresis，Heidelberg，Germany)和2.5单位/毫升分散酶(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis IN)。随后将酶混合物与iMAC生长培养基(含有10％胎牛血清(FBS)的高级DMEM/F12(Gibco)、L-谷氨酰胺(Gibco)青霉素(50单位/毫升)和链霉素(50ug/mL，Gibco))组合。将含有组织、iMAC生长培养基和消化酶的锥形管在37℃下以225rpm的定轨振荡器中温育1小时。部分消化的动脉随后转移至含有新鲜的酶和iMAC生长培养基的混合物的50mL锥形管，并且进一步在37℃下消化1小时。
从50mL锥形管中取出消化的动脉并弃去。随后将所得的消化产物以150xg离心5分钟，抽吸上清液。将团块重悬浮于20毫升iMAC生长培养基中。随后通过70微米尼龙BD FALCON细胞滤网(BD Biosciences，SanJose，CA)来过滤细胞悬浮液。随后将滤液重悬浮于iMAC生长培养基(总体积50毫升)中，并以150×g离心5分钟。抽吸上清液，并且将细胞重悬浮于另外15毫升的新鲜iMAC生长培养基中，并且在涂布有50ug/cm2牛I型胶原(Inamcd，Frccmont，CA)的组织培养瓶中铺平板。细胞随后在37℃和5％CO2下进行培养。
随后使iMAC暴露于成脂诱导培养基(Lonza)平均3周的时期。使对照细胞暴露于成脂维持培养基(Lonza)。任一培养基均每第二天进行更换。随后将细胞固定用于油红O染色，并且分离RNA用于定量RT-PCR。
实例2：如由油红O染色证实的，iMAC能够分化为成脂谱系。
脂质蓄积使用油红O染色进行分析。细胞用4％缓冲多聚甲醛溶液在室温下固定20分钟。细胞在室温下用过滤的油红O溶液(在异丙醇中的0.5％油红O(Sigma-Aldrich)染色30分钟。细胞用PBS洗涤两次，并且用Olympus IX70显微照相机获取图像。
如图2A所示，如由因为增加的油红O蓄积而更暗的iMAC外观指示，相比于图2B所示的对照培养基(维持培养基)暴露的细胞群体，暴露于成脂培养基引起iMAC中的脂质蓄积中的显著增加。
该数据提示iMAC能够经历成脂谱系分化，所述成脂谱系分化导致增加的脂质蓄积。它进一步指示IMAC是潜在的脂肪祖先。
实例3：iMAC分化成BAT样表型
随后使iMAC暴露于成脂诱导培养基(Adipogenic BulletKit，Lonza)平均3周的时期。使对照细胞暴露于成脂维持培养基(Adipogenic BulletKit，Lonza)。任一培养基均每第二天进行更换。在测试前，使细胞暴露于环状AMP(cAMP)类似物二丁酰cAMP(Sigma)4小时。
随后执行定量RT-PCR，以测定脂肪生成标记和对于褐色脂肪细胞特定的脂肪生成标记两者的表达水平。分析的脂肪生成标记为过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、脂肪酸结合蛋白4(aP2)和脂联素(ADN或ADIPOQ)。对于褐色脂肪细胞特定的脂肪生成标记为UCP-1、CIDEA、PPARγ辅激活物(PGC)-1α和ELVOL3。
RNA根据制造商的说明书(RNeasy迷你试剂盒；Qiagen，目录#74106)进行分离。样品还按照试剂盒说明书用DNA酶I进行处理。最终RNA用30μl ddH20进行洗脱。RNA样品使用2μl每种样品并使用NanoDrop 2000仪器(Thermo Scientific)进行定量。cDNA使用Applied Biosystem“大容量cDNA库试剂盒”(Applied Biosystems)进行制备，根据制造商的说明书，使用在50μl最终体积中的5μg RNA(100ng/μl cDNA)。通过加入100-200ng大容量cDNA(1-2μl)加上7-8μl无DNA酶/RNA酶水加上10μl Taqman PCR主混合物(Master Mix)加上1μl所需引物/探针/反应(20μl总反应体积)运行PCR。
表1：使用的引物/探针来自Applied Biosystems。
PCR根据由制造商指定的条件一式三份进行，使用具有ABI prism7900SDS软件的7900序列检测系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)。热循环条件为最初50℃进行2分钟和95℃进行10分钟，随后为95℃进行15秒和60℃进行1分钟的40个循环。
如图3A和图3B所示，用成脂诱导培养基的延长处理导致脂肪生成标记(aP2、PPARα、PPARγ和ADIPOQ，图3A)和褐色脂肪细胞标记(UCP1、PRDM16、PGC1α、C/EBPβ、CIDEA和ELVOL3，图3B)两者中的显著增加。对于PPARα观察到最低诱导，所述PPARα呈现超过对照的2倍增加，并且因此可视为未改变的。所有其他标记均呈现超过对照的显著倍数增加。对于aP2和ADIPOQ观察到最大增加，所述aP2和ADIPOQ分别呈现超过对照的100,000倍和几乎50,000倍增加。
这些观察提示用成脂诱导培养基的延长处理促进iMAC分化为真正的BAT细胞。
为了进一步证实iMAC已分化为能够产热的成熟的褐色脂肪细胞，使成脂诱导培养基处理的细胞和未经处理的对照细胞暴露于环状AMP(cAMP)类似物二丁酰cAMP(Sigma)。该化合物模拟冷诱导的产热的诱导，并且因此触发涉及产热的基因的表达，所述产热在成熟褐色脂肪细胞中唯一地发生。它通常用于在功能上表征褐色脂肪细胞，并且区分褐色脂肪细胞与白色脂肪细胞。
在处理后，如上所述，UCP1表达通过定量RT-PCR进行分析。
如图3B所示，相比于对照细胞群体，iMAC显示在cAMP处理后的UCP1表达中的大约20,000倍增加。该观察提示暴露于成脂诱导培养基随后为cAMP处理的iMAC分化，以表达褐色脂肪细胞特定标记，并且具有响应儿茶酚胺刺激以开启产热程序的能力。
实例4：从多个供体中分离的iMAC分化成BAT样表型的能力
为了研究从不同供体中分离的iMAC之间的功能差异，如实例2和3中所述，将两个另外的iMAC批次分离，培养并暴露于成脂诱导培养基。对照条件涉及在成脂维持培养基中的培养。使用RT-PCR评价BAT特定标记UCP-1、PRDM16、PGC1α、CIDEA和elvol3的水平。
表2：指定的褐色脂肪生成标记基因超过对照(维持培养基)的诱导 倍数。数据针对两个分开实验(1)和(2)进行显示。
PGC1α UCP1 PRDM16 C/EBPβ ELOVL3 CIDEA
I031011诱导(1) 226.2 2933.6 0.3 2.7 13.2 1259.5
I032511诱导(1) 66.0 0.3 0.3 2.3 66.5 8.0
I031011诱导(2) 262.0 16.1 0.7 9.8 21.9 10791.7
I032511诱导(2) 80.5 14.2 1.2 2.6 42.3 0.5
如表2所示，相比于对照条件，从两个另外供体中分离并用成脂诱导培养基处理的iMAC，导致UCP-1表达水平以及其他褐色脂肪组织标记中的增加。这些观察提示iMAC的脂肪生成潜力并不限于某些遗传背景，而是可由从多个供体中分离的细胞实现。
实例5：iMAC褐变对线粒体生物发生的作用
BAT的分化伴随线粒体生物发生，其程度至所得的丰富线粒体和细胞色素引起该组织的褐色。辅激活物PGC-1α在集成调节褐色脂肪生成和线粒体功能的转录级联中起关键作用，PGC-1α刺激核呼吸因子(NRF)-1和NRF-2的表达，并且共激活这些因子对线粒体转录因子A(Tfam)的表达的转录功能，所述线粒体转录因子A是线粒体复制和转录的直接调节物。
表3：使用的引物/探针来自Applied Biosystems。
表4：指定的褐色脂肪生成标记基因超过对照(维持培养基)的诱导 倍数。数据针对两个分开实验(1)和(2)进行显示。
CYCS TFAM NRF1 PGC1β PGC1α
I031011诱导(1) 8.2 1.7 0.6 17.6 226.2
I032511诱导(1) 2.2 1.0 0.4 12.9 66.0
I031011诱导(2) 18.0 2.0 0.8 33.0 262.0
I032511诱导(2) 1.1 0.3 0.1 1.6 80.5
在iMAC中，用成脂诱导培养基的3周处理足以使PGC-1α和PGC-1β的表达分别增强100至10倍(表4)，伴随细胞色素C(CYCS)表达中的大约2-18倍增加。PGC-1α也已知增强褐色脂肪细胞中的PPARγ和甲状腺激素受体对UCP-1启动子的转录活性。因此，iMAC中通过成脂诱导培养基有力诱导的UCP-1蛋白质表达可能由PGC-1α介导。不存在线粒体转录因子A(TFAM)和核呼吸因子1(NRF1)表达中的变化。
实例6：iMAC的BAT表型的更多证据
迄今为止，关于BAT功能和发育的许多了解源自小型哺乳动物，在其中充分确定BAT是一生关键的代谢组织，它帮助维持体温并且调节能量消耗并影响体重。此类研究已阐明解偶联过程，并且已开始解释褐色脂肪细胞的细胞前体和分化过程。相比之下，关于人BAT在分子水平上知之甚少。此外，基于在啮齿类模型中进行的研究，制药工业已开发β-3肾上腺素能受体的激动剂，希望此类化合物也将增加人中的能量消耗。尽管该受体的激动剂有效减少啮齿类中的肥胖症，但它们在临床试验中失败。此类失败导致许多研究者得出结论：在BAT基因表达中存在物种特定差异。近来，Svenson等人已鉴定在人BAT中差异表达的基因，并且在BAT基因表达中存在物种特定差异。考虑到这些发现，已使用RT-PCR研究这些基因在iMAC中的表达。
RNA分离和cDNA合成如实例3中所述进行。以下引物用于研究iMAC中的KCNK3、CKMT1B、COBL、HMGCS2和TGM2的表达。
表4：使用的引物/探针来自Applied Biosystems。
表6：指定的褐色脂肪生成标记基因超过对照(维持培养基)的诱导 倍数。数据显示三次重复实验的结果。
TGM2 HMGCS2 COBL CKMT1B KCNK3
iMAC Maint(1) 0.1 68.2 26.6 3861.6 34.9
iMAC Maint(2) 0.2 199.6 21.2 660.8 81.0
iMAC Maint(3) 0.1 32.9 35.1 229.0 44.0
如表5所示，探测的基因中除一个(TGM2)外的全部均发现在iMAC中是上调的。这进一步指示iMAC可能是褐色脂肪细胞真正的前体，并且可容易地诱导沿褐色脂肪组织途径分化。
实例7：褐色脂肪样细胞在天然材料或合成材料中的封装
iMAC使用所述方案分化成褐色脂肪样细胞(BFLC)。源自iMAC或其他来源细胞(白色脂肪细胞、脂肪细胞祖先、成纤维细胞和iPSC)的褐色脂肪样细胞随后使用本领域已知的方法(aggrewell板、低簇皿及其他)聚集，以形成类球体(50-500μm，最佳为150-200μm)。BFLC类球体随后使用常规或共形或微封装涂布方法进行封装。
BFLC可在多种聚合水凝胶基质中微封装，所述聚合水凝胶基质包括海藻酸盐、丙烯酸衍生物、聚乙二醇(PEG)共形微涂层、纳米涂层、纤维素和/或琼脂糖。微封装的BFLC可移植到腹膜空间、现有白色脂肪储存、网膜囊、皮下或肌内区域中。
容纳褐色脂肪细胞的另一个机制可以是生物人工植入物。特别地，植入物可以是封装细胞的薄片层，可经过延长时间段是完全生物相容的，并且可不诱导纤维化。含高密度细胞的薄片层可以是完全可取回的，并且具有的尺度允许通过营养物质和氧的快速扩散来维持最佳组织活力，并且还允许响应改变的生理学的快速改变。
实例8：源自iMAC的褐色脂肪样细胞的植入用于治疗肥胖症
源自iMAC(或其他来源细胞)的褐色脂肪样细胞可以是用于治疗肥胖症的良好的同种异体细胞来源。这些BFLC在免疫抑制剂的存在下可无需封装而使用，或封装在不含免疫抑制剂的可植入装置中。
BFLC进入肌内、皮下或白色脂肪组织内的移植应以100-200μl悬浮液的小储存进行，以允许周围组织的血管化和神经支配。
植入的BFLC的活性可通过激活或上调细胞的产热功能的多种非神经刺激激活物进行调节，所述非神经刺激激活物包括b3-肾上腺素能受体、G蛋白、cAMP、TGR5胆汁酸类似物和2型50-脱碘酶分子。
褐色脂肪样细胞的功效可在啮齿类模型中进行评价。在BFLC植入动物内之后，BAT激活可通过能量消耗进行测定，所述能量消耗涉及热输出的连续测量(直接量热法)或吸入/呼出气体交换(间接量热法)。间接量热法可通过氧消耗、二氧化碳产生和/或氮排泄进行测量，以计算反映BFLC植入前和后的能量消耗的比率。还可使用热成像方法。
术语
本文引用的所有出版物、专利和专利申请均据此全文以引用方式并入。如本说明书和所附权利要求中所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数参考。本公开所用的术语坚持由本领域普通技术人员一般公认的标准定义。在可能需要任何进一步说明的情况下，下文已进一步解释了一些术语。
如本文所用，术语“受试者”指在其中引发免疫应答的任何活生物体。术语受试者包括但不限于人、非人灵长类例如黑猩猩及其他猿和猴物种；农场动物例如牛、绵羊、猪、山羊和马；驯养动物例如犬和猫；实验室动物包括啮齿类例如小鼠、大鼠、兔和豚鼠等等。该术语不指示特定年龄或性别。在具体的实施例中，受试者是人。
如本文所用，术语“代谢紊乱”指特征在于生物体的代谢问题的医学状况。因为健康的有功能代谢对于生命是关键的，所以代谢紊乱被非常认真地加以对待。广泛范围的状况包括但不限于糖尿病(包括1型和2型糖尿病)、甲状腺机能减退和肥胖症是可分类为代谢紊乱的一些紊乱例子。代谢紊乱可导致过度重量增加。术语“代谢综合征”指一起发生并且增加心脏病、中风和糖尿病危险的一组状况。仅具有这些状况之一例如血压增加、胰岛素水平上升、腰周围的过度体脂肪或胆固醇水平异常会增加上述疾病的危险。组合起来，冠心病、中风和糖尿病的危险甚至更大。代谢综合征的主要特点包括胰岛素抗性、高血压、胆固醇异常和凝血危险增加。患者最通常为超重或肥胖的。

Claims (20)

1.分离的动脉衍生的、离体分化的褐色脂肪样细胞。
2.根据权利要求1所述的褐色脂肪样细胞，其特征还在于选自以下的至少一种脂肪细胞标记的表达：脂肪酸结合蛋白4 (aP2)、过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARα)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ)、脂联素(ADN)、解偶联蛋白1 (UCP-1)、含PR域蛋白16 (PRDM16)、PPAR辅激活物-1α (PGC-1α)、CCAAT/增强子结合蛋白β (C/EBPβ)、细胞死亡诱导DFFA样效应蛋白A (CIDE-A)和延伸因子极长链脂肪酸样蛋白3 (ELOVL3)。
3.根据权利要求2所述的褐色脂肪样细胞，其中所述脂肪细胞标记是选自以下的褐色脂肪细胞标记：解偶联蛋白1 (UCP-1)、含PR域蛋白16 (PRDM16)、PPAR辅激活物-1α (PGC-1α)、CCAAT/增强子结合蛋白β (C/EBPβ)、细胞死亡诱导DFFA样效应蛋白A (CIDE-A)和延伸因子极长链脂肪酸样蛋白3 (ELOVL3)。
4.根据权利要求2所述的褐色脂肪样细胞，其中相比于未经处理的动脉衍生的细胞，所述脂肪生成标记在褐色脂肪样细胞中以更高水平表达。
5.根据权利要求1所述的褐色脂肪样细胞，其特征还在于产热潜力通过暴露于儿茶酚胺和环状AMP中的至少一者进行刺激。
6.根据权利要求1所述的褐色脂肪样细胞，其中所述动脉衍生的细胞由乳内动脉细胞分化。
7.一种药物组合物，包含可药用载体和根据权利要求2所述的褐色脂肪样细胞。
8.一种制备褐色脂肪样细胞的方法，包括：
在足以增加脂肪细胞标记的表达的时间段和条件下，在成脂诱导培养基中培养动脉衍生的细胞群体，相比于未经处理的动脉衍生的细胞，所述脂肪细胞标记的表达处于更高水平。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述脂肪细胞标记选自脂肪酸结合蛋白4 (aP2)、过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARα)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ)、脂联素(ADN)、解偶联蛋白1 (UCP-1)、含PR域蛋白16 (PRDM16)、PPAR辅激活物-1α (PGC-1α)、CCAAT/增强子结合蛋白β (C/EBPβ)、细胞死亡诱导DFFA样效应蛋白A (CIDE-A)和延伸因子极长链脂肪酸样蛋白3 (ELOVL3)。
10.根据权利要求8所述的方法，还包括分离所述褐色脂肪样细胞。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述动脉衍生的细胞是乳内动脉细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述动脉衍生的细胞对于HLA-1是阳性的，并且对于CD10、CD31、CD34、CD45、CD133、CD141和KDR/Flk-1是阴性的。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述动脉衍生的细胞另外对于CD29、CD44、CD73、CD166是阳性的，并且另外对于CD15、CD23、CD24、CD62p、CD80、CD86、CD104、CD117、CD138、CD146、VE-钙粘蛋白和HLA-2是阴性的。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述成脂诱导培养基包含选自以下的化合物：骨形态发生蛋白(BMP)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ)、类视色素X受体-α (RxRα)、胰岛素和T3、噻唑烷二酮(TZD)、维生素A、视黄酸、胰岛素、糖皮质激素或其激动剂、无翅型(Wnt)、胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)-α、TGF-β、肿瘤坏死因子α (TNFα)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、血管内皮生长因子(VEGF)和血小板衍生的生长因子(PDGF)。
15.一种治疗受试者的方法，包括：
获得动脉衍生的褐色脂肪样细胞群体；以及
将所述褐色脂肪样细胞施用到所述受试者中的靶区域内。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述受试者患有选自肥胖症、糖尿病或高脂血症的代谢紊乱。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述受试者是肥胖的并且需要治疗。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述动脉衍生的褐色脂肪样细胞对于所述受试者是自体的。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述动脉衍生的褐色脂肪样细胞对于所述受试者是同种异体的或异种的。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法包括将所述褐色脂肪样细胞制备为可注射组合物。
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