CN102586173B - 一种提高微载体重复使用次数的回收处理方法 - Google Patents
一种提高微载体重复使用次数的回收处理方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种微载体的回收处理方法，具体涉及一种提高微载体重复使用次数的回收处理方法；其包括筛选、溶剂稀释、搅拌、过滤、氢氧化钠处理、调节pH值、酶消化处理、冲洗及灭菌处理步骤。本发明所述的提高微载体重复使用次数的回收处理方法采用多个步骤结合，达到最佳的处理效果，其不仅明显增加微载的使用次数，节约了使用成本；而且经过多次处理后的微载体使用时对细胞在微载体上贴壁生长情况并没出现明显影响。本发明所述的处理方法可广泛适用各种微载体的回收。
Description
技术领域
本发明涉及一种微载体的回收处理方法，具体涉及一种提高微载体重复使用次数的回收处理方法。
背景技术
大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。近十数年来，人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞，例如BHK-21(仓鼠肾细胞)、MDCK、Marc-145等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、猪瘟兰耳病疫苗等产品。现在，由于动物细胞培养技术在规模和可靠性方面都不断发展，且从中得到的蛋白质也被证明是安全有效的，因此人们对动物细胞培养的态度已经发生了改变。1967年，Van Wezel首次开发了微载体系统，创建了生物反应器微载体培养细胞工艺，使动物细胞培养进入高密度培养阶段。目前，Pharmacia公司生产的Cytodex系列应用最为广泛。
虽然，微载体广泛用于生物制品行业，但是由于我国微载体制造技术不成熟，还不能运用于生物反应器细胞高密度培养。国内使用的微载体均为进口产品，但是进口微载体通常存在价格高的问题，给我国生物制品的发展带来了极大的影响，尤其是兽用生物制品的发展。同时，这些进口的微载体多数是一次性载体，只有少数微载体才能够重复使用，但是重使用次数较少，例如GE Healthcare 公司的产品说明书建议其微载体使用次数最多不超过4次，并且没有给出有效的回收方法。目前，普遍采用的微载体回收工艺过于简单，造成了微载体表面的残留细胞碎片处理不干净，影响微载体的重复利用；由于没有形成有效的系统回收方法，大多数的微载体使用之后都没有进行回收再利用，造成了严重的浪费。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提高微载体重复使用次数的回收处理方法。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种提高微载体重复使用次数的回收处理方法，其包括以下步骤
（1）筛选：使用60-300目的筛网过滤除去溶液，回收微载体，并放置到容器中；
（2）溶剂稀释：向上述装有微载体的容器中加入2-5倍于微载体体积的浓度为0.1M的并含有浓度为10-50mM的EDTA的PBS溶液，再用医用酒精稀释至载体的体积浓度至20%；
（3）搅拌：将上述溶液进行中速搅拌；
（4）过滤：搅拌结束后，用筛网过滤回收微载体，同时从溶液中取出从微载体上脱落的的细胞碎片；
（5）氢氧化钠处理：将上述过滤后收集的微载体放入到容器中，然后加入1-2倍于微载体体积的浓度为0.1-1M氢氧化钠溶液，加入同时搅拌，搅拌过程中用显微镜检测微载体表面，至贴在微载体表面80-90%的细胞碎片脱落；
（6）调节pH值：搅拌停止后用筛网回收载体，并用0.1M的PBS冲洗载体，至溶液的pH值为6.5-7.5；
（7）酶消化处理：将上述微载体转入到容器中，加入1-2倍于微载体体积的蛋白酶溶液进行消化处理，消化期间不断搅拌，并用显微镜观察微载体表面，至微载体表面干净后停止消化；
（8）冲洗：将上述消化完成后的微载体用浓度为0.1M的PBS冲洗，直至PBS冲洗液中不再出现细胞碎片；
（9）灭菌处理：将上述冲洗后的微载体进行灭菌处理，之后用于细胞培养。
本发明中氢氧化钠的作用是除去微载体表面的蛋白，有助于提高微载体的回收效果。
由于盛装微载体的容器材质不能与微载体发生相互吸引，否则会造成微载体的损失，因此，优选的，本发明所述的装微载体的容器为硅化玻璃容器。
所述（3）搅拌步骤中，中速搅拌的速度为60-120转/分，搅拌时间为2-4小时。另外本发明中其他地方所提到的中速搅拌时，搅拌速度均为60-120转/分。
本发明中，所采用的氢氧化钠溶液优选的浓度为0.1-0.5M。
优选的，本发明中，所述的（7）酶消化处理步骤中，搅拌速度为10-50转/分。
为了避免颗粒较小的微载体丢失和提高溶液中其它物质例如细胞碎片过滤的效率，优选的，本发明中所述的网筛为150-200目的不锈钢网筛。
本发明中所采用的蛋白酶溶液是质量浓度为0.25%的胰酶-EDTA溶液。
本发明中，所述（7）酶消化处理步骤中，消化在室温下进行，消化时间为10-20h，搅拌速度为10-120转/分，在消化期间每隔1-2小时，使用显微镜观察微载体表面1次。
本发明所述的灭菌处理采用高压灭菌。高压灭菌多采用的高压灭菌器为上海申安医疗器械厂生产的智能型灭菌器 LDZM-60KCS。
为了进一步达到洗脱微载体上细胞碎片的目的，提高回收的微载体的使用次数，本发明的一个优选的方案中，所述（3）搅拌步骤中， 搅拌期间按照（2）步骤更换溶剂1-2次。
本发明中所采用的显微镜的放大倍数为40×40倍。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明所述的提高微载体重复使用次数的回收处理方法采用多个步骤结合，达到最佳的处理效果，其不仅明显增加微载的使用次数，节约了使用成本；而且经过多次处理后的微载体使用时对细胞在微载体上贴壁生长情况并没出现明显影响。本发明所述的处理方法可广泛适用各种微载体的回收，如cellulose（纤维素微载体）、polystyrene（聚苯乙烯微载体）以及瑞典Pharmacia 生技公司生产的Cytodex系列等。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明中实施例1新微载体的显微照片；
图2为本发明中实施例1微载体经过第四次处理后的显微照片；
图3为本发明中实施例1微载体经过第八次处理后的显微照片；
图4为本发明中实施例1微载体经过第十次处理后的显微照片；
图5为本发明中实施例1新的微载体培养细胞的效果的显微照片；
图6为实施例1微载体经过第四次处理后培养细胞的效果的显微照片；
图7为实施例1微载体经过第八次处理后培养细胞的效果的显微照片；
图8为实施例1微载体经过第十次处理后培养细胞的效果的显微照片。
具体实施方式
以下具体的实施例是对本发明所述的提高微载体重复使用次数的回收处理方法的具体应用。
实施例1
1. 载体：Cytodex Ⅰ源于Pharmacia（玛法西亚）公司，其材质为crosslink dextrin （交联葡聚糖），比表面积为270cm2/ml。
2.实验：具体操作如下：
（1）载体回收：将新购买的Cytodex I微载体经过一次使用后用200目的不锈钢筛网过滤除去溶液，并放置到容器中，加入2倍于微载体体积的浓度为0.1M并含有浓度为10mM的EDTA 的PBS溶液，再用医用酒精稀释至载体的体积浓度至20%，进行中速搅拌，搅拌过程中过滤去掉溶剂并更换0.1M并含有浓度为10mM的EDTA 的PBS溶液一次，继续搅拌，搅拌结束后，用300目的筛网过滤回收微载体，同时从溶液中取出从微载体上脱落的的细胞碎片；过滤后收集的微载体放入到容器中，然后加入1倍于微载体体积的浓度为0.1M氢氧化钠溶液，加入同时搅拌，搅拌过程中每隔15分钟用显微镜检测微载体表面，至贴在微载体表面绝大多数细胞碎片都脱落；停止搅拌，再用300目的筛网回收微载体，并用0.1M的PBS冲洗载体，至溶液的pH值为7，之后将微载体转入到容器中，加入2倍于微载体体积的质量浓度为0.25%的胰酶-EDTA溶液进行消化处理，消化期间不断搅拌，并用显微镜观察微载体表面，20小时后，微载体表面干净，停止消化并用浓度为0.1M的PBS溶液冲洗，直至PBS冲洗液中不再出现细胞碎片，然后对微载体进行灭菌处理；
（2）细胞培养：将上述灭菌处理后的微载体放入T75细胞瓶，以DMEM细胞培养基+10%胎牛血清培养为溶液，细胞接种的密度为2×105个/毫升，接种时溶液体积为15毫升，微载体的最终密度为1.0mg/ml，培养条件为37℃，在加入细胞后，每间隔3分钟晃动混匀微载体与细胞，持续2小时后，掉到细胞液，然后加入新的含有10%的Hyclone胎牛血清DMEM培养基培养2天，微载体在处理后和培养结束后进行显微镜观察并且拍照;
（3）重复试验：重复上述（1）和（2）步骤十次，每次重复后的微载体在处理后和培养结束后用40×40倍的显微镜观察并且拍照。
实施例2
1. 载体：Mica 来源于Anawa 公司，其材质为Polyacrylate （聚丙烯酸酯），比表面积为130 cm2/ml。
2. 实验：具体操作如下：
（1）载体回收：将新购买的Mica微载体经过一次使用后用200目的不锈钢筛网过滤除去溶液，并放置到容器中，加入3倍于微载体体积的浓度为0.1M并含有浓度为50mM的EDTA 的PBS溶液，再用医用酒精稀释至载体的体积浓度至20%，进行中速搅拌，搅拌过程中过滤去掉溶剂并更换0.1M并含有浓度为50mM的EDTA 的PBS溶液一次，继续搅拌，搅拌结束后，用300目的筛网过滤回收微载体，同时从溶液中取出从微载体上脱落的的细胞碎片；过滤后收集的微载体放入到容器中，然后加入1倍于微载体体积的浓度为0.5M氢氧化钠溶液，加入同时搅拌，搅拌过程中每隔15分钟用显微镜检测微载体表面，至贴在微载体表面绝大多数细胞碎片都脱落；停止搅拌，再用300目的筛网回收微载体，并用0.1M的PBS冲洗载体，至溶液的pH值为7，之后将微载体转入到容器中，加入1倍于微载体体积的质量浓度为0.25%的胰酶-EDTA溶液进行消化处理，消化期间不断搅拌，并用显微镜观察微载体表面，50小时后，微载体表面干净，停止消化并用浓度为0.1M的PBS溶液冲洗，直至PBS冲洗液中不再出现细胞碎片，然后对微载体进行灭菌处理；
（2）细胞培养：将上述灭菌处理后的微载体放入T75细胞瓶，，以DMEM细胞培养基+10%胎牛血清培养为溶液，细胞接种的密度为2×105个/毫升，接种时溶液体积为15毫升，微载体的最终密度为1.0mg/ml，培养条件为37℃，在加入细胞后，每间隔3分钟晃动混匀微载体与细胞，持续3小时后，掉到细胞液，然后加入新的含有10%的Hyclone胎牛血清DMEM培养基培养2天，微载体在处理后和培养结束后进行显微镜观察并且拍照;
（3）重复试验：重复上述（1）和（2）步骤十次，每次重复后的微载体在处理后和培养结束后用40×40倍的显微镜观察并且拍照。
实施例3
1. 载体：Biosilon，来源于 Nunc 公司，其材质为Polystyrene（聚苯乙烯），比表面积为160 cm2/ml。
2. 实验：具体操作如下：
（1）载体回收：将新购买的Biosilon微载体经过一次使用后用100目的不锈钢筛网过滤除去溶液，并放置到容器中，加入2倍于微载体体积的浓度为0.1M并含有浓度为10mM的EDTA 的PBS溶液，再用医用酒精稀释至载体的体积浓度至20%，进行中速搅拌，搅拌过程中过滤去掉溶剂并更换0.1M并含有浓度为10mM的EDTA 的PBS溶液一次，继续搅拌，搅拌结束后，用200目的筛网过滤回收微载体，同时从溶液中取出从微载体上脱落的的细胞碎片；过滤后收集的微载体放入到容器中，然后加入1倍于微载体体积的浓度为1M氢氧化钠溶液，加入同时搅拌，搅拌过程中每隔15分钟用显微镜检测微载体表面，至贴在微载体表面绝大多数细胞碎片都脱落；停止搅拌，再用200目的筛网回收微载体，并用0.1M的PBS冲洗载体，至溶液的pH值为7，之后将微载体转入到容器中，加入2倍于微载体体积的质量浓度为0.25%的胰酶-EDTA溶液进行消化处理，消化期间不断搅拌，并用显微镜观察微载体表面，20小时后，微载体表面干净，停止消化并用浓度为0.1M的PBS溶液冲洗，直至PBS冲洗液中不再出现细胞碎片，然后对微载体进行灭菌处理；
（2）细胞培养：将上述灭菌处理后的微载体放入T75细胞瓶，以DMEM细胞培养基+10%胎牛血清培养为溶液，细胞接种的密度为2×105个/毫升，接种时溶液体积为15毫升，微载体的最终密度为1.0mg/ml，培养条件为37℃，在加入细胞后，每间隔4分钟晃动混匀微载体与细胞，持续3小时后，掉到细胞液，然后加入新的含有10%的Hyclone胎牛血清DMEM培养基培养2天，微载体在处理后和培养结束后进行显微镜观察并且拍照;
（3）重复试验：重复上述（1）和（2）步骤十次，每次重复后的微载体在处理后和培养结束后用40×40倍的显微镜观察并且拍照。
本发明分别对新载体、第四次、第八次、第十次处理后的载体和其相应培养后细胞在载体上生长情况的显微镜照来说明这种微载体处理方法对微载体处理的效果及其对细胞在微载体上生长的影响。图1-8是本发明实施例2中对应的显微镜照片，显微镜照片结果显示：微载体在经过四次处理后没有明显的损坏，还可以继续使用，当经过8次回收处理之后，开始出现裂缝和穿洞，之后可以继续使用，效果不佳，到第10次时已经不能在继续使用了；因此本发明的处理方法处理后的微载体可以使用8次左右。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其架构形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。
Claims (7)
1.一种提高微载体重复使用次数的回收处理方法，其特征在于：其包括以下步骤
(1)筛选：使用60-300目的筛网过滤除去溶液，回收微载体，并放置到容器中；
(2)溶剂稀释：向上述装有微载体的容器中加入2-5倍于微载体体积的浓度为0.1M的并含有浓度为10-50mM的EDTA的PBS溶液，再用医用酒精稀释载体的体积浓度至20%；
(3)搅拌：将上述溶液进行中速搅拌；搅拌期间过滤并按照（2）步骤更换溶剂1-2次；所述（3）步骤中，中速搅拌的速度为60-120转/分，搅拌时间为2-4小时；
(4)过滤：搅拌结束后，用筛网过滤回收微载体，同时从溶液中取出从微载体上脱落的细胞碎片；
(5)氢氧化钠处理：将上述过滤后收集的微载体放入到容器中，然后加入1-2倍于微载体体积的浓度为0.1-1M氢氧化钠溶液，加入同时搅拌，搅拌过程中用显微镜检测微载体表面，至贴在微载体表面80-90%细胞碎片脱落，停止搅拌；
(6)调节pH值：搅拌停止后用筛网回收微载体，并用0.1M的PBS冲洗载体，至溶液的pH值为6.5-7.5；
(7)酶消化处理：将上述微载体转入到容器中，加入1-2倍于微载体体积的蛋白酶溶液进行消化处理，消化期间不断搅拌，并用显微镜观察微载体表面，至微载体表面干净后停止消化；
(8)冲洗：将上述消化完成后的微载体用浓度为0.1M的PBS冲洗，直至PBS冲洗液中不再出现细胞碎片；
(9)灭菌处理：将上述冲洗后的微载体进行灭菌处理，之后用于细胞培养。
2.根据权利要求1所述的提高微载体重复使用次数的回收处理方法，其特征在于：所述装微载体的容器为硅化玻璃容器。
3.根据权利要求1所述的提高微载体重复使用次数的回收处理方法，其特征在于：所述（7）步骤中，搅拌速度为10-50转/分。
4.根据权利要求1所述的提高微载体重复使用次数的回收处理方法，其特征在于：所述筛网为150-200目的不锈钢筛网。
5.根据权利要求1所述的提高微载体重复使用次数的回收处理方法，其特征在于：所述蛋白酶溶液为质量浓度为0.25%的胰酶-EDTA溶液。
6.根据权利要求1所述的提高微载体重复使用次数的回收处理方法，其特征在于：所述（7）步骤中，消化在室温下进行，消化时间为10-20h，搅拌速度为10-120转/分，在消化期间每隔1-2小时用显微镜观察微载体表面1次。
7.根据权利要求1所述的提高微载体重复使用次数的回收处理方法，其特征在于：所述灭菌处理采用高压灭菌。
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