CN104630128B - 一种用于再生处理细胞和病毒培养用微载体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细胞及病毒培养用微载体的再生处理方法。该方法是通过特殊处理液和合适的处理手段对已使用过的微载体即已培养过贴壁细胞的微载体进行有效的处理，使其达到与新微载体一样的培养效果。并且通过本方法处理，可使微载体反复使用4至5次，即便是第5次使用处理过的微载体，其细胞及病毒培养效果仍达到新微载体的90%以上的培养效果。所以本方法的建立不仅使微载体的利用率提高了近4倍，也使规模利用微载体培养细胞和病毒的成本得到了大幅度的降低。本发明所述的微载体再生处理方法可广泛用于处理在细胞培养中使用的其它微载体。

Description

一种用于再生处理细胞和病毒培养用微载体的方法

技术领域

本发明涉及一种细胞及病毒培养用微载体的再生处理方法，其属于生物技术领域。

背景技术

上个世纪60年代以来，随着细胞生物学、培养系统以及培养方法等领域的不断丰富和完善，动物细胞体外培养技术得到了突飞猛进地发展，现已成为生物医药和医学研究中广泛采用的技术方法。目前，利用动物细胞培养技术生产出很多具有重要医用价值的疫苗、单抗、细胞因子、蛋白类药物和酶类物质。

毋庸置疑，动物细胞大规模培养技术已成为了生物技术制药中非常重要的环节。而微载体作为细胞领域绝大多数的贴壁动物细胞贴壁介质，其质量的优劣会直接影响细胞的生长，甚至可以影响以细胞为宿主的病毒的增殖。因此，大规模动物细胞培养技术中，经常把生物反应器和微载体一起称为生物反应器微载体培养系统，可见二者在规模化培养过程中的密切关系和重要性。

作为细胞培养介质，早在1967年，Van Wezel为贴壁依赖性细胞的高产培养就已提出“微载体”培养系统的概念。经过以后几十年，尤其是生物反应器在细菌发酵罐控制模式基础上的升级换代，微载体培养技术现已广泛地应用于动物细胞的大规模体外培养。但是，由于我国在微载体制造技术上还不成熟，微载体来源还只能依赖于国外进口。进口的微载体由于技术的垄断，其价格昂贵，致使大规模的细胞或病毒培养工艺中，微载体的成本占据了大部分研发和生产成本，无形中给国内生物制药技术的发展造成了很大影响。

为了降低这部分成本，以及避免在大规模细胞或病毒培养过程中意外原因造成培养终止而使微载体没有充分利用而废弃。许多利用微载体大规模培养细胞或病毒来开发和生产生物医药的企业，对使用过的微载体进行了重复处理方法的摸索与建立(如申请号201210075589.2专利，以及文献《微载体再生的研究》(作者：李志强、王妍、官桂范、李云富等，发表于《中国生物制品学杂志》1994年第7第3期))，但对于采用这些方法处理再生的微载体，尚未在细胞培养效果或病毒培养效果方面进行评估。其中，对于微载体处理效果的好坏，不仅要评估处理后的微载体表面是否干净，不贴附异物，更重要的是评估该微载体再生处理后在培养细胞或病毒过程中的培养效果好坏。

因此，本领域还需要提供新的微载体再生处理方法，并且提供评估该方法再生处理得到的微载体是否能够保证细胞和病毒正常、良好的培养应用。

发明内容

本发明的目的在于克服上述的技术的不足，而提供一种细胞及病毒培养用微载体再生处理方法，该方法使处理后的微载体培养效果可达到新使用的微载体细胞及病毒培养效果的95％-100％。并且采用这种再生处理方法，最少可以使微载体反复使用4-5次，第5次使用时，细胞或病毒培养效果仍为第1次使用的新微载体培养效果的90％-95％。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现：

本发明提供的一种用于再生处理微载体的方法包括以下步骤：

1)微载体收集：用硅化好的玻璃瓶收集含细胞和/或培养过的微载体的培养液，自然沉降15-30分钟，弃掉上清液，保留微载体在玻璃瓶中；

2)微载体碱处理：向经沉降得到的微载体中加入氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.1-1.0mol/L，微载体与加入的氢氧化钠溶液的体积比为1:1-1:2，摇动3-5分钟后，自然沉降15-30分钟，弃掉上清液；

3)微载体的第一次洗涤：向经沉降得到的微载体中加入洗涤液Ⅰ，所述洗涤液I为含有0.01％-0.05％聚山梨酯80的10-30mmol/L、pH值7.4-7.8磷酸盐缓冲液，微载体与加入的洗涤液I的体积比为1:2-1:3，摇动3-5分钟后，自然沉降15-30分钟，弃掉上清液，并重复此项操作2次；

4)微载体消化液处理：向经沉降得到的微载体中加入消化液，所述消化液以质量百分比含量计包含0.2％-0.4％胰蛋白酶、0.02％乙二胺四乙酸二钠、0.85％氯化钠、0.01％-0.05％聚山梨酯80，微载体与加入的消化液的体积比为1:1-1:2，摇动3-5分钟后，自然沉降20-40分钟，弃掉上清液；

5)微载体酸处理：向经沉降得到的微载体中加入柠檬酸溶液，所述柠檬酸溶液的浓度为0.05-0.1mol/L，微载体与柠檬酸溶液的体积比为1:1，摇动3-5分钟后，自然沉降15-30分钟，弃掉上清液；

6)微载体第二次洗涤：向经沉降得到的微载体中加入洗涤液Ⅱ，所述洗涤液Ⅱ为10-30mmol/L、pH值7.4-7.8磷酸盐缓冲液，微载体与洗涤液Ⅱ的体积比为1:2-1:3，摇动3-5分钟后，自然沉降20-40分钟，弃掉上清液，重复此项操作2-3次。

并且，根据实际应用，所述方法还包括：

7)取处理好的微载体样品在显微镜下观察及pH值测定；和/或

8)处理好的微载体灭菌处理：将微载体进行121℃高压灭菌15-45分钟，室温自然冷却后，置于2-8℃的情况下保存备用。

在本发明的优选技术方案中，上述步骤中用到的氢氧化钠溶液浓度为0.5mol/L。

优选地，所述洗涤液Ⅰ为含有0.05％聚山梨酯80的10mmol/L、pH值7.6磷酸盐缓冲液。

优选地，所述消化液中各成分的质量百分比为胰蛋白酶0.2％、乙二胺四乙酸二钠0.02％、氯化钠0.85％、聚山梨酯80 0.05％。

优选地，所述柠檬酸溶液的浓度为0.08mol/L。

优选地，所述洗涤液Ⅱ为20mmol/L，pH值7.5磷酸盐缓冲液。

优选地，所述步骤7)包括：在显微镜下观察5-10个视野，所看到的微载体表面均无细胞残骸。

最终得到的微载体悬液pH值为7.0-7.8。

以下是本发明的详细描述。

本发明所述的一种微载体再生处理方法，包括以下步骤：

1.微载体收集：使用硅化好的玻璃瓶收集用于细胞和/或病毒培养过的微载体和培养液，自然沉降15-30分种，使微载体沉淀下来，弃掉上清液；

2.微载体的碱处理：按照上述沉淀与氢氧化钠溶液体积比1:1-1:2，加入0.1-1.0mol/L氢氧化钠溶液，摇动3-5分种，使微载体在溶液中呈均匀悬浊液，然后，微载体悬浊液自然沉降15-30分种，使微载体沉淀下来，弃掉上清液；

3.微载体的第一次洗涤：按照微载体和洗涤液Ⅰ(10-30mmol/L，pH值7.4-7.8磷酸盐缓冲液，含有0.01％-0.05％聚山梨酯80)体积比1:2-1:3加入洗涤液I，摇动3-5分种，使微载体在溶液中呈均匀悬浊液，然后，微载体悬浊液自然沉降15-30分种，使微载体沉淀下来，弃掉上清液，重复操作此步骤2次；

4.微载体的消化液处理：按照微载体与消化液体积比为1:1-1:2，加入质量百分比含量为0.2％-0.4％胰蛋白酶、0.02％乙二胺四乙酸二钠(简称EDTA二钠)、0.85％氯化钠(简称NaCl)、0.01％-0.05％聚山梨酯80的消化液。摇动3-5分种，使微载体与消化液混合成均匀的悬浊液，然后，室温下静止，自然沉降20-40分种，弃掉上清液；

5.微载体的酸处理：按照微载体与柠檬酸溶液体积比1:1，加入0.05-0.1mol/L柠檬酸溶液，摇动3-5分种，使微载体在溶液中呈均匀悬浊液，然后，微载体悬浊液自然沉降15-30分种，使微载体沉淀下来，弃掉上清液；

6.微载体的第二次洗涤：按照微载体悬液和洗涤液Ⅱ体积比1:2-1:3，加入洗涤液Ⅱ(10-30mmol/L，pH值7.4-7.8磷酸盐缓冲液)，摇动3-5分种，使微载体在溶液中呈均匀悬浊液，微载体悬浊液自然沉降20-40分种，使微载体沉淀下来，弃掉上清液，重复此项操作2-3次，最后的一次，弃掉50％的上清的培养液；

7.取样观察及pH值测定：取处理后的微载体悬浊液样品，进行显微镜观察和pH测定，在变换的5-10个视野中，所看到的微载体表面均无细胞残骸，微载体悬液pH的测定值为7.0-7.8；

8.微载体的灭菌处理：洗涤好的微载体进行121℃高压灭菌15-45分种，室温自然冷却后，置于2-8℃的情况下保存备用。

与现有微载体再生处理方法相比，本发明的重要步骤在于：

首先，用碱溶液处理收获的使用过的微载体，其目的不仅是对微载体进行清洁处理，更重要的是对使用过的微载体进行消毒灭菌。因为有些微载体培养细胞的同时也培养了病毒，如果不利于碱溶液处理消毒，会造成微载体处理过程中，病毒污染环境，造成交叉污染的风险。

其次，在微载体第一次洗涤的程中，加入了表面活性剂，使细胞残骸或蛋白类物质不易结团或形成再大的大分子物质。

再次，在微载体消化处理过程中，其消化液中加入了表面活性剂，使细胞残骸或蛋白类大分子物质很好地与微载体表面分离。

最后，利用极弱的酸性物质——柠檬酸对消化后的微载体进行电荷修复，使微载体表面的电荷恢复到新微载体的水平。

上述方法显著区别于申请号201210075589.2专利，以及文献《微载体再生的研究》中介绍的微载体处理方法：首先对使用过的微载体处理方法不同；其次在处理方法中利用了新的消化液和洗涤液(或新的配方)，对载体进行彻底的清理；再次利用合适的处理程序对使用过的微载体处理，从而达到再生的微载体即表明干净，如同新微载体一样(见图1，图2)，而且在细胞及病毒的培养过程中，保证了细胞及病毒的培养效果。利用本发明的方法，可以使微载体重复使用5次，而即便是微载体的第5次使用，其培养效果也可以达到新微载体培养效果的90％、甚至95％以上。所以本方法的建立，不仅使微载体的利用率提高了近4倍，同时也使得大规模利用微载体培养细胞和病毒的成本大幅地降低。本发明所述的微载体再生处理方法也可广泛用于其它用于细胞培养的微载体处理。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示了新微载体(第1次用)40倍放大照片；

图2为采用实施例6得到的微载体(拟第2次用)40倍放大照片；

图3为采用实施例1得到的微载体(拟第2次用)40倍放大照片；

图4为采用实施例2得到的微载体(拟第2次用)40倍放大照片；

图5为实施例6中拟处理的微载体40倍放大照片；

图6为实施例6中碱处理后微载体40倍放大照片；

图7为实施例6初次洗涤后微载体40倍放大照片；

图8为实施例6消化后的微载体40倍放大照片；

图9为实施例6酸处理后的微载体40倍放大照片；

图10为实施例6再次洗涤后微载体40倍放大照片；

图11为利用五次使用的微载体培养细胞各天的细胞密度比较；

图12为利用五次使用的微载体培养细胞增殖病毒过程中每天维持液的乙脑病毒滴度比较；

图13为利用五次使用的微载体培养细胞增殖病毒过程中每天维持液的乙脑病毒抗原比较。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

以下各实施例所用的微载体均为细胞/细胞和病毒培养过的微载体，作为对照的是新使用的微载体。实施例中，有采用文献《微载体再生的研究》和申请号201210075589.2的“一种提高微载体重复使用次数的回收处理方法”专利中的方法，作为对照方法，以对比本发明方法的优劣。

实施例1

本实施例的方法是依据申请号201210075589.2专利的微载体处理方法。

1)微载体经过一次病毒培养后，用200目的不锈钢筛网过滤，去除残留的病毒液和细胞残骸，并将微载体放置到已硅化的玻璃容器中。

2)加入2倍于微载体体积的浓度为0.1M并含有浓度为10mM的EDTA二钠的PBS溶液，再用75％酒精稀释至微载体的体积浓度至20％。

3)以60～120rpm速度搅拌2～4h。

4)搅拌2小时后，过滤去掉溶剂并更换0.1M并含有浓度为10mM的EDTA二钠的PBS溶液一次，继续搅拌。

5)搅拌结束后，用300目的筛网过滤回收微载体，同时从溶液中滤除微载体表面脱落的细胞碎片。

6)过滤后收集的微载体放入到容器中，然后加入1倍于微载体体积的浓度为0.1M氢氧化钠溶液，加入同时搅拌，搅拌过程中每隔15分钟用显微镜检测微载体表面，至贴在微载体表面80～90％细胞碎片都脱落，停止搅拌。

7)搅拌停止后，再用300目的筛网回收微载体，并用0.1M的PBS冲洗微载体5～6次，直至溶液的pH值为6.5～7.5。

8)之后将微载体转入到三通瓶中，加入2倍于微载体体积的质量浓度为0.25％的胰酶-EDTA二钠溶液进消化处理，条件为：室温、10～50rpm/分钟连续搅拌10～20h，1～2h用显微镜观察微载体表面，至微载体表面干净后停止消化。

9)用浓度为0.1M的PBS溶液冲洗5～6次，直至PBS冲洗液中不再出现细胞碎片，并取样在显微镜下观察(见图3)。

10)将上述冲洗后的微载体进行灭菌处理，之后用于细胞培养。

实施例2

本实施例的方法是依据文献《微载体再生的研究》的微载体处理方法。

1)事先硅化好准备收集微载体的玻璃瓶(一般收集5L或14L反应器的微载体使用2L/5L蓝盖瓶)。

2)收集反应器培养结束的微载体于硅化过的玻璃瓶中，盖好瓶盖。

3)收集的微载体悬液最短沉淀15分钟，然后用导液管，虹吸排走上清培养液。

4)按照微载体与20mM PBS的体积比1:2，加入20mMPBS。摇动3分钟至均匀的悬液，必要时，取样在倒置显微镜下进行观察。

5)将微载体悬液静止15分钟后，用导液管虹吸排走上清。

6)重复“步骤4”和“步骤5”操作两次。

7)按照微载体与胰酶溶液的体积比1:1，加入0.4％胰酶溶液。摇动3分钟至均匀的悬液后，室温静止4分钟，再摇动3分钟，至均匀的悬液。这时，取样并在倒置显微镜下观察。

8)如果微载体上的细胞及残骸完全从微载体上脱落，则将微载体胰酶悬液沉淀20分钟后，用导液管虹吸排走胰酶上清液；如果微载体上的细胞及残骸尚未从微载体上脱落，则继续进行消化，至细胞及残骸完全从微载体上脱落，再用导液管虹吸排走胰酶上清液。

9)按照“步骤4”和“步骤5”的操作，洗涤微载体两次。

按照微载体与CH₃COOH溶液的体积比1:1，加入0.1mM的CH₃COOH溶液。摇动3分钟至均匀的悬液。室温静置15分钟，然后用导液管，虹吸排走上清培养液。

10)按照“步骤4”和“步骤5”的操作，洗涤微载体三次，最后一次洗涤时，取样在显微镜下观察(见图4)，并测定pH值，其测定值在7.2-7.3。

11)按照微载体与20mMPBS的体积比:1，加入20mMPBS溶液，摇动3分钟至均匀的悬液时，取样在倒置显微镜下观察，并按照40倍和100倍的放大倍数，各拍照5张存档。然后，用5M的氢氧化钠溶液调整微载体混悬液的pH值在7.34-7.45范围内，盖好透气瓶盖，进行高压灭菌。

实施例3

1)事先硅化好准备收集微载体的2L玻璃瓶。

2)收集5L生物反应器培养结束的初次使用的微载体于硅化过的玻璃瓶，沉淀15分钟，用导管虹吸的方法将上清液排到0.5mol/L的氢氧化钠溶液中，上清液与0.5mol/L氢氧化钠溶液的比例为1:1；

3)按照沉淀的微载体与氢氧化钠溶液的体积比1:1，加入0.5mol/L的氢氧化钠溶液，摇动3分钟至均匀的悬浊液，然后静止15分钟后，用导液管虹吸排走上清，并取样在显微镜下观察。

4)按照沉淀的微载体与洗涤液的体积比1:2，加入洗涤液Ⅰ(20mmol/L，pH值7.4磷酸盐缓冲液)。摇动3分钟至均匀的悬浊液，然后静止15分钟后，用导液管虹吸排走上清。再重复此洗涤操作2次，并取样在显微镜下观察。

5)按照微载体与消化液体积比为1:1，加入质量百分比含量为0.2％胰蛋白酶、0.02％EDTA二钠的消化液。摇动5分种，使微载体与消化液混合成均匀的悬浊液，然后，室温下静止，自然沉降20分种，用导液管虹吸排走上清，并取样在显微镜下观察。

6)按照微载体悬液和洗涤液体积比1:2，加入洗涤液Ⅱ(20mmol/L，pH值7.4磷酸盐缓冲液)，摇动5分种，使微载体在溶液中呈均匀悬浊液，微载体悬浊液自然沉降20分种，使微载体沉淀下来，用导液管虹吸排走上清，重复此项操作2次，最后一次上清排走一半。

7)取处理后的微载体悬浊液样品，进行显微镜观察和pH测定。观察到的结果为，5个视野，微载体颗粒表面均无细胞残骸；微载体悬液的pH值测定结果为7.3。

8)将装有处理过的微载体瓶，盖好透气瓶盖，放入到高压柜中，进行121℃灭菌30分钟，之后，室温冷却后，放入2-8℃冰箱中放置备用。

实施例4

1)事先硅化好准备收集微载体的2L玻璃瓶。

2)收集5L生物反应器培养结束的初次使用的微载体于硅化过的玻璃瓶，沉淀15分钟，用导管虹吸的方法将上清液排到0.5mol/L的氢氧化钠溶液中，上清液与0.5mol/L氢氧化钠溶液的比例为1:1；

3)按照沉淀的微载体与氢氧化钠溶液的体积比1:1，加入0.5mol/L的氢氧化钠溶液，摇动3分钟至均匀的悬浊液，然后静止15分钟后，用导液管虹吸排走上清，并取样在显微镜下观察。

4)按照沉淀的微载体与洗涤液Ⅰ的体积比1:2，加入洗涤液Ⅰ(10mmol/L，pH值7.4磷酸盐缓冲液，含有0.01％聚山梨酯80)。摇动3分钟至均匀的悬浊液，然后静止15分钟后，用导液管虹吸排走上清。再重复此洗涤操作两次，并取样在显微镜下观察。

5)按照微载体与消化液体积比为1:1，加入质量百分比含量为0.2％胰蛋白酶、0.02％EDTA二钠、0.85％NaCl、0.01％聚山梨酯80的消化液。摇动5分种，使微载体与消化液混合成均匀的悬浊液，然后，室温下静止，自然沉降20分种，用导液管虹吸排走上清，并取样在显微镜下观察。

6)按照微载体与柠檬酸溶液体积比1:1，加入0.05mol/L柠檬酸溶液，摇动5分种，使微载体在溶液中呈均匀悬浊液，然后，微载体悬浊液自然沉降30分种，使微载体沉淀下来，用导液管虹吸排走上清，并取样在显微镜下观察。

7)按照微载体悬液和洗涤液Ⅱ体积比1:2，加入洗涤液Ⅱ(10mmol/L，pH值7.4磷酸盐缓冲液)，摇动5分种，使微载体在溶液中呈均匀悬浊液，微载体悬浊液自然沉降20分种，使微载体沉淀下来，用导液管虹吸排走上清，重复此项操作3次，最后一次上清排走一半。

8)取处理后的微载体悬浊液样品，进行显微镜观察和pH测定。观察到的结果为，5个视野，微载体颗粒表面均无细胞残骸；微载体悬液的pH值测定结果为7.8。

9)将装有处理过的微载体瓶，盖好透气瓶盖，放入到高压柜中，进行121℃灭菌15分钟，之后，室温冷却后，放入2-8℃冰箱中放置备用。

实施例5

1)事先硅化好准备收集微载体的5L蓝盖玻璃瓶。

2)收集14L生物反应器培养结束的初次使用的微载体于硅化过的5L蓝盖玻璃瓶，沉淀30分钟，用导管虹吸的方法将上清液排到0.5mol/L的氢氧化钠溶液中，上清液与0.5mol/L的氢氧化钠溶液的比例为1:2；

3)按照沉淀的微载体与氢氧化钠溶液的体积比1:2，加入0.5mol/L的氢氧化钠溶液，摇动5分钟至均匀的悬浊液，然后静止30分钟后，用导液管虹吸排走上清，并取样在显微镜下观察。

4)按照沉淀的微载体与洗涤液Ⅰ的体积比1:2，加入洗涤液Ⅰ(10mmol/L，pH值7.6磷酸盐缓冲液，含有0.05％聚山梨酯80)。摇动5分钟至均匀的悬浊液，然后静止15分钟后，用导液管虹吸排走上清。再重复此洗涤操作两次，并取样在显微镜下观察。

5)按照微载体与消化液体积比为1:1，加入质量百分比含量为0.4％胰蛋白酶、0.02％EDTA二钠、0.85％NaCl、0.05％聚山梨酯80的消化液。摇动5分种，使微载体与消化液混合成均匀的悬浊液，然后，室温下静止，自然沉降40分种，用导液管虹吸排走上清，并取样在显微镜下观察。

6)按照微载体与柠檬酸溶液体积比1:1，加入0.1mol/L柠檬酸溶液，摇动3分种，使微载体在溶液中呈均匀悬浊液，然后，微载体悬浊液自然沉降15分种，使微载体沉淀下来，用导液管虹吸排走上清，并取样在显微镜下观察。

7)按照微载体悬液和洗涤液Ⅱ体积比1:2，加入洗涤液Ⅱ(30mmol/L，pH值7.8磷酸盐缓冲液)，摇动5分种，使微载体在溶液中呈均匀悬浊液，微载体悬浊液自然沉降40分种，使微载体沉淀下来，用导液管虹吸排走上清，重复此项操作3次，最后一次上清排走一半。

8)取处理后的微载体悬浊液样品，进行显微镜观察和pH测定。观察到的结果为，10个视野，微载体颗粒表面均无细胞残骸；微载体悬液的pH值为7.0。

9)将装有处理过的微载体瓶，盖好透气瓶盖，放入到高压柜中，进行121℃灭菌45分钟，之后，室温冷却后，放入2-8℃冰箱中放置备用。

实施例6

1)事先硅化好准备收集微载体的2L玻璃瓶。

2)收集5L生物反应器培养结束的初次使用的微载体于硅化过的玻璃瓶，取样显微镜下观察(见图5)，并沉淀20分钟，用导管虹吸的方法将上清液排到0.5mol/L的氢氧化钠溶液中，上清液与0.5mol/L氢氧化钠溶液的比例为1:1。

3)按照沉淀的微载体与氢氧化钠溶液的体积比1:1，加入0.5mol/L的氢氧化钠溶液，摇动5分钟至均匀的悬浊液，然后静止20分钟后，用导液管虹吸排走上清，并取样在显微镜下观察(见图6)。

4)按照沉淀的微载体与洗涤液Ⅰ的体积比1:2，加入洗涤液Ⅰ(10mmol/L，pH值7.6磷酸盐缓冲液，含有0.05％聚山梨酯80)。摇动4分钟至均匀的悬浊液，然后静止20分钟后，用导液管虹吸排走上清。再重复此洗涤操作两次，并取样在显微镜下观察(见图7)。

5)按照微载体与消化液体积比为1:2，加入质量百分比含量为0.2％胰蛋白酶、0.02％EDTA二钠、0.85％NaCl、0.05％聚山梨酯80的消化液。摇动5分种，使微载体与消化液混合成均匀的悬浊液，然后，室温下静止，自然沉降30分种，用导液管虹吸排走上清，并取样在显微镜下观察(见图8)。

6)按照微载体与柠檬酸溶液体积比1:1，加入0.08mol/L柠檬酸溶液，摇动5分种，使微载体在溶液中呈均匀悬浊液，然后，微载体悬浊液自然沉降30分种，使微载体沉淀下来，用导液管虹吸排走上清，并取样在显微镜下观察(见图9)。

7)按照微载体悬液和洗涤液Ⅱ体积比1:2，加入洗涤液Ⅱ(20mmol/L，pH值7.5磷酸盐缓冲液)，摇动5分种，使微载体在溶液中呈均匀悬浊液，微载体悬浊液自然沉降30分种，使微载体沉淀下来，用导液管虹吸排走上清，重复此项操作3次，最后一次上清排走一半。

8)取上述处理后的微载体悬浊液样品，进行显微镜观察(见图10)和pH测定。观察到的结果为，5个视野，微载体颗粒表面均无细胞残骸，微载体悬液的pH值测定结果为7.2。

9)将装有处理过的微载体瓶，盖好透气瓶盖，放入到高压柜中，进行121℃灭菌30分钟，之后，室温冷却后，放入2-8℃冰箱中放置备用。

实施例7

采用实施例6的方法，对于5L生物反应器中使用过2次细胞培养的微载体进行处理，该处理过的微载体再用于细胞培养时，为第3次使用的微载体。

实施例8

采用实施例6的方法，对于5L生物反应器中使用过4次细胞培养的微载体进行了处理，该处理过的微载体再用于细胞培养时，为第5次使用的微载体。

为了验证实验实施例中再生微载体处理的效果，进行了微载体显微镜照片对比，细胞接种后贴壁速度和贴壁效果对比，细胞在微载体上培养时间长短对比，利用再生微载体培养的细胞增殖乙脑病毒及生产乙脑抗原的对比，以及利用优选处理方法处理的微载体1-5次重复使用的细胞培养效果对比等等。

验证例1：不同处理方法的再生微载体的显微镜观察结果比较

1)将未使用过新的微载体，用20mmol/L的磷酸盐缓冲液浸泡2小时后，取微载体悬液作为参照；

2)取实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6的微载体样品，进行显微镜下观察；

3)每个样品观察5个视野，视野中不少于10个微载体，观察放大倍数为100倍；

4)观察5个视野每个微载体上有无细胞残骸的比较结果：

验证例2：对于不同处理方法的再生微载体及多次处理后的再生微载体，其细胞贴壁效果的比较试验

1)用未使用过的微载体作为细胞贴壁试验的对照组，其他为上述实施例中得到的微载体作为试验组；

2)利用能够磁力搅拌的四颈瓶作为培养细胞的容器，培养过程中使用的微载体密度为3g/L，培养工作体积为2L；

3)细胞采用Vero细胞，接种前的细胞种子来源为培养瓶培养的细胞经消化后收集得到的细胞悬液，四颈瓶中初始细胞接种密度控制在2.6×10⁵细胞/ml，相当每粒载体理论上可以平均贴附20个细胞；

4)细胞培养基为含有10％小牛血清的M199培养液；

5)接种后的细胞培养过程中，搅拌速度为每分钟35转；

6)接种细胞后，每3小时取样进行显微镜观察，共取样3次，以观察不同时间各组细胞贴壁的情况；

7)接种细胞后不同时间细胞贴壁于微载体的比较结果：

8)从接种后3、6、9小时培养液中的游离细胞数量比较来看，优选实施例6处理的微载体(拟第2次用的微载体)，其细胞游离密度最接近新微载体。反映出实施例6的细胞贴壁速度最接近新载体，而实施例1、实施例2的细胞贴壁速度最慢，说明实施例6的微载体处理效果很理想，细胞的贴壁速度很快。

9)从实施例6、实施例7以及实施例8得到的再生微载体培养效果来看，处理次数越多，细胞贴附微载体的贴壁速度越慢，细胞贴壁率也逐渐降低。

验证例3：对于多次处理后的再生微载体细胞培养效果比较

1)使用新微载体，即第一次使用的微载体作为细胞贴壁试验的对照组，其他为上述实施例中得到的微载体作为试验组。

2)利用5L生物反应器，培养过程中使用的微载体密度为3g/L，培养工作体积为3.5L。

3)细胞采用Vero细胞，接种前的细胞种子来源为培养瓶培养的细胞经消化后收集得到的细胞悬液，接种密度控制在2.6×10⁵细胞/ml，相当每粒载体理论上可以平均贴附20个细胞。

4)细胞培养基为含有10％小牛血清的M199培养液。

5)接种后的细胞培养过程中，搅拌速度为每分钟35转。

6)接种细胞后，每天取样进行显微镜观察，并计数生物反应器内的细胞密度。

7)培养5天，各培养过程中细胞密度变化比较结果，见图11。

8)从图表可以看出，细胞在第5次使用的微载体上培养速度虽不及新微载体，但培养第6天的细胞数量可达到新微载体的90％以上，所以这样看来，通过优选的处理方法(实施例6的方法)处理使用过的微载体，微载体除了第一次使用之外，还可以再重复使用四次。

验证例4：使用多次处理后的再生微载体培养Vero细胞，进而增殖乙脑病毒的效果比较

1)使用新微载体，即第1次使用的微载体做为Vero细胞增殖乙脑病毒试验的对照，另外使用重复使用3次的微载体，即实施例7得到的再生微载体，以及重复使用5次的微载体，即实施例8得到的再生微载体，分别培养Vero细胞增殖乙脑病毒试验。

2)三次培养增殖病毒均利用5L生物反应器，培养过程中使用的微载体密度为3g/L，培养工作体积为3.5L。

3)Vero细胞的接种密度以及培养条件设置，三次培养增殖均一致。

4)三次病毒增殖实验均按照Vero细胞培养5天时感染乙脑病毒，感染量为0.05MOI，感染后每天取样测定病毒滴度和抗原含量，直至感染后第8天。

5)病毒滴度采用蚀斑形成试验检测，抗原含量采用ELISA方法检测。

6)乙脑病毒增殖培养8天，每天病毒滴度及抗原含量变化的比较结果(见图12、图13)从每天的培养维持液的乙脑病毒滴度和抗原含量来看，第5次使用的微载体培养细胞增殖病毒的效果可达到第1次使用微载体增殖效果的90％以上。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (9)

1.一种用于再生处理微载体的方法，所述方法由按以下顺序进行的步骤组成：

1)微载体收集：用硅化好的玻璃瓶收集含培养用过的微载体的培养液，自然沉降15-30分钟，弃掉上清液，保留微载体在玻璃瓶中；

2)微载体碱处理：向经沉降得到的微载体中加入氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.1-1.0mol/L，微载体与加入的氢氧化钠溶液的体积比为1:1-1:2，摇动3-5分钟后，自然沉降15-30分钟，弃掉上清液；

3)微载体的第一次洗涤：向经沉降得到的微载体中加入洗涤液Ⅰ，所述洗涤液Ⅰ为含有0.01％-0.05％聚山梨酯80的10-30mmol/L、pH值7.4-7.8磷酸盐缓冲液，微载体与加入的洗涤液I的体积比为1:2-1:3，摇动3-5分钟后，自然沉降15-30分钟，弃掉上清液，并重复此项操作2次；

4)微载体消化液处理：向经沉降得到的微载体中加入消化液，所述消化液以质量百分比含量计包含0.2％-0.4％胰蛋白酶、0.02％乙二胺四乙酸二钠、0.85％氯化钠、0.01％-0.05％聚山梨酯80，微载体与加入的消化液的体积比为1:1-1:2，摇动3-5分钟后，自然沉降20-40分钟，弃掉上清液；

5)微载体酸处理：向经沉降得到的微载体中加入柠檬酸溶液，所述柠檬酸溶液的浓度为0.05-0.1mol/L，微载体与柠檬酸溶液的体积比为1:1，摇动3-5分钟后，自然沉降15-30分钟，弃掉上清液；

6)微载体第二次洗涤：向经沉降得到的微载体中加入洗涤液Ⅱ，所述洗涤液Ⅱ为10-30mmol/L、pH值7.4-7.8磷酸盐缓冲液，微载体与洗涤液Ⅱ的体积比为1:2-1:3，摇动3-5分钟后，自然沉降20-40分钟，弃掉上清液，重复此项操作2-3次；

7)取处理好的微载体样品在显微镜下观察及pH值测定；和

8)处理好的微载体灭菌处理：将微载体进行121℃高压灭菌15-45分钟，室温自然冷却后，置于2-8℃的情况下保存备用。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养液还包含细胞。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.5mol/L。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述洗涤液Ⅰ为含有0.05％聚山梨酯80的10mmol/L、pH值7.6磷酸盐缓冲液。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述消化液中各成分的质量百分比为胰蛋白酶0.2％、乙二胺四乙酸二钠0.02％、氯化钠0.85％、聚山梨酯80 0.05％。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述柠檬酸溶液的浓度为0.08mol/L。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述洗涤液Ⅱ为20mmol/L，pH值7.5磷酸盐缓冲液。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤7)包括：在显微镜下观察5-10个视野，所看到的微载体表面均无细胞残骸。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤7)得到的微载体悬液，其pH值为7.0-7.8。