CN102146356A - 一种再生微载体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种再生微载体的方法，适用于生物制药领域，其特点是有以下步骤：(1)将装有微载体的塑料桶内上层废液倒出；(2)微载体碱处理；(3)微载体酸处理；(4)微载体电荷处理：(5)调节微载体混悬液的pH值在7.35～7.45范围内；将处理好的微载体装入容器待用。本发明可有效降低微载体的成本，并可多次处理，再生后的微载体的细胞贴壁效果理想与新微载体几乎一样，可在不影响培养效果前提下降低使用成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物制品的再生方法，特别是涉及一种广泛应用于生物制药领域的微载体的再生方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
微载体是指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。微载体培养优点有：1表面积/体积大，因此单位体积培养液的细胞产率高；2把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；3可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；4简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；5培养基利用率较高；6放大容易；7细胞收获过程不复杂；8劳动强度小；9培养系统占地面积和空间小。
美国GE公司销售的微载体广泛应用于生物制药领域，是一种化学稳定细胞培养基质。但这种微载体制造技术要求高，国内只能依靠进口，成本比较高，很难推广。
国外大公司出于种种考虑仅使用一次，而国内企业却希望能够多次使用，从而降低生产成本。但据本申请人的检索，一直都没有比较好的再生方法披露。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题提供一种使用方便、价格便宜且高效的再生微载体的方法。
据研究，控制细胞贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质。若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度过大，反而会产生“毒性”效应。细胞与微载体的相融性，是与微载体表面理化性质有关。一般细胞在进入生理PH值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用静电引力可加快细胞贴壁速度。若微载体带负电荷，因静电斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒介时，则带负电荷的细胞也能贴附。正是基于此原理，微载体可以再生。
本发明给出的技术解决方案是：这种再生微载体的方法，其特征在于有以下步骤：
(1)将装有微载体的塑料桶内上层废液倒出；
(2)微载体碱处理：向桶内加入固体分析纯氢氧化钠，使其浓度为0.6-1.0M，充分搅拌后静止放置过夜；
(3)微载体酸处理：分层后倒出上清液，在带有筛网的容器内用注射用水清洗微载体，洗去多余的碱至PH值约为8.0-10.0，后加入37％的盐酸(单位体积加入40ml盐酸)，使HCL终浓度为0.3-0.5M，充分搅拌后静止放置过夜；
(4)微载体电荷处理：分层后倒出上清液，在筛网容器内用注射用水清洗微载体，洗去多余的酸至PH值约为4.0-6.0，用注射用水配制0.5M磷酸盐缓冲液100升，然后用缓冲液清洗两遍，使微载体带正电荷，根据体积折算质量，每100克微载体的沉降体积为1.6升，将每100g微载体装入瓶内，补加磷酸盐缓冲液；
(5)调节pH值：用5M的氢氧化钠溶液调整微载体混悬液的pH值在7.35～7.45范围内。将处理好的微载体装入容器待用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1可有效降低微载体的成本，并可多次处理
2细胞贴壁效果理想与新微载体几乎一样，可在不影响培养效果前提下降低使用成本。
具体实施方式
本发明可以通过以下实施例实现，但不受以下实施例中比例、组成、方法、步骤的限制。应该理解，这里讨论的实施例和实施方案只是为了说明，对熟悉该领域的人可以提出各种改进和变化，这些改进和变化将包括在本申请的精神实质和范围以及所附的权利要求范围内。
实施例1
1将装有微载体的塑料桶内上层废液倒出。
2微载体碱处理：按一定比例向桶内加入固体分析纯氢氧化钠，使其浓度为0.6M，充分搅拌后静止放置过夜。
3微载体酸处理：分层后倒出上清液，在带有筛网的容器内用注射用水清洗微载体，洗去多余的碱至PH值为8.0。后加入37％的盐酸(单位体积加入40ml盐酸)，使HCL终浓度为0.3M，充分搅拌后静止放置过夜。
4微载体电荷处理：分层后倒出上清液，在筛网容器内用注射用水清洗微载体，洗去多余的酸至PH值为4.0。用注射用水配制0.5M磷酸盐缓冲液100升。然后用缓冲液清洗两遍，使微载体带正电荷。根据体积折算质量，每100克微载体的沉降体积为1.5升，将100g沉降后微载体装入瓶内，补加磷酸盐缓冲液。
5调节pH值：用5M的氢氧化钠溶液调整微载体混悬液的pH值在7.35。将处理好的微载体装入容器待用。
实施例2
1将装有微载体的塑料桶内上层废液倒出。
2微载体碱处理：按一定比例向桶内加入固体分析纯氢氧化钠，使其浓度为1.0M，充分搅拌后静止放置过夜。
3微载体酸处理：分层后倒出上清液，在带有筛网的容器内用注射用水清洗微载体，洗去多余的碱至PH值为10.0。后加入37％的盐酸(单位体积加入40ml盐酸)，使HCL终浓度为0.5M充分搅拌后静止放置过夜。
4微载体电荷处理：分层后倒出上清液，在筛网容器内用注射用水清洗微载体，洗去多余的酸至PH值约为6.0。用注射用水配制0.5M磷酸盐缓冲液100升。然后用缓冲液清洗两遍，使微载体带正电荷。根据体积折算质量，每100克微载体的沉降体积为1.4升，将100g沉降后微载体装入瓶内，补加磷酸盐缓冲液。
5调节pH值：用5M的氢氧化钠溶液调整微载体混悬液的pH值在7.45。将处理好的微载体装入容器待用。
实施例3
1将装有微载体的塑料桶内上层废液倒出。
2微载体碱处理：按一定比例向桶内加入固体分析纯氢氧化钠，使其浓度为0.8M，充分搅拌后静止放置过夜。
3微载体酸处理：分层后倒出上清液，在带有筛网的容器内用注射用水清洗微载体，洗去多余的碱至PH值为9.0。后加入37％的盐酸(单位体积加入40ml盐酸)，使HCL终浓度为0.4M，充分搅拌后静止放置过夜。
4微载体电荷处理：分层后倒出上清液，在筛网容器内用注射用水清洗微载体，洗去多余的酸至PH值为5.0。用注射用水配制0.5M磷酸盐缓冲液100升。然后用缓冲液清洗两遍，使微载体带正电荷。根据体积折算质量，每100克微载体的沉降体积为1.6升，将100g沉降后微载体装入瓶内，补加磷酸盐缓冲液。
5调节pH值：用5M的氢氧化钠溶液调整微载体混悬液的pH值在7.4。将处理好的微载体装入容器待用。
Claims (1)
1.一种再生微载体的方法，其特征在于有以下步骤：
(1)将装有微载体的塑料桶内上层废液倒出；
(2)微载体碱处理：向桶内加入固体分析纯氢氧化钠，使其浓度为0.6-1.0M，充分搅拌后静止放置过夜；
(3)微载体酸处理：分层后倒出上清液，在带有筛网的容器内用注射用水清洗微载体，洗去多余的碱至PH值约为8.0-10.0，后加入37％的盐酸(单位体积加入40ml盐酸)，使HCL终浓度为0.3-0.5M，充分搅拌后静止放置过夜；
(4)微载体电荷处理：分层后倒出上清液，在筛网容器内用注射用水清洗微载体，洗去多余的酸至PH值约为4.0-6.0，用注射用水配制0.5M磷酸盐缓冲液100升，然后用缓冲液清洗两遍，使微载体带正电荷，根据体积折算质量，每100克微载体的沉降体积为1.6升，将每100g微载体装入瓶内，补加磷酸盐缓冲液；
(5)调节pH值：用5M的氢氧化钠溶液调整微载体混悬液的pH值在7.35～7.45范围内。将处理好的微载体装入容器待用。
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2010
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