CN1556202A - 一种动物细胞培养用多孔微载体、其制备方法及专用锐孔喷射器 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种动物细胞培养用多孔微载体及其制备方法，属于生化工程和细胞工程领域。该方法包括以下步骤：(1)溶解：用铜氨溶液溶解脱脂棉；(2)造粒：将脱脂棉铜氨溶液经锐孔喷射进入温度低于－30℃的油性冷冻液中制成含冰晶的微球；(3)致孔：用浓硫酸再生脱脂棉微球并溶解其中的冰晶形成多孔微球；(4)修饰：用2－二乙氨基氯乙烷盐酸盐修饰多孔微球表面，使其交联－DEAE弱碱性阴离子交换基团；(5)洗涤、灭菌。用这种方法制备的多孔微载体培养动物细胞，细胞密度高，比表面积大，可保护细胞免受机械损伤，机械强度高，可高压灭菌和回收利用，成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及一种动物细胞培养用多孔微载体、其制备方法及专用锐孔喷射器，更具体地说是利用微粒制备技术，使用脱脂棉制备可支持动物细胞生长的多孔微载体、其制备方法和专用设备，属于生化工程和细胞工程领域。
背景技术
动物细胞大规模培养技术是生物制药行业的关键技术，目前一半以上获得批准用于临床治疗的生物制品均通过细胞培养技术来生产，而且，随着大分子功能蛋白和人源(化)抗体的开发，基因治疗和细胞治疗的进步，以及组织工程和人造生物器官产品的研发，细胞培养技术将在生物制药产业化领域中发挥更大的作用。多孔微载体(porous microcarriers)是近年来才发展起来的一种用于大规模高密度动物细胞培养的优秀的细胞支持物。多孔微载体内部有许多网状的相互连通的小孔通向载体表面，细胞易于进入孔中生长、分裂。
目前多孔微载体具有理想细胞支持物的大部分特征，如生物相容性、简便的无毒害固定化过程、良好的传质特性和机械稳定性、最大的比表面积、适合细胞生长的形状和大小、粒径分布均一、能高压灭菌、可重复利用、易于清洗、接种方便、易使细胞、载体与培养基分离、适合于贴壁细胞和悬浮细胞的培养等，尤其解决了细胞固定化和剪切力对细胞损伤两大难题，能提高细胞培养密度，便于大规模细胞培养。
细胞固定化是连续灌流培养的基础。传统的实心微载体只能固定贴壁细胞，而且在培养后期，许多细胞由于老化而降低了贴壁能力，容易从微载体上脱落下来，细胞贴壁需要血清中的某些物质和某些细胞因子的帮助，低血清培养基不利于实心微载体培养细胞。多孔微载体能使细胞在其内部生长，可降低血清用量，增加细胞固定化稳定性，适合于长期培养。多孔微载体不仅能培养贴壁细胞，也适合于悬浮细胞的固定化连续灌流培养。由于悬浮细胞个体较小，通过筛网过滤难于将细胞截留在反应器中，因而在连续培养中要损失大量细胞，不利于提高培养密度。通过离心作用使细胞与培养基分离，设备投资与运行费用均较高，而多孔微载体内部网状小孔可以裹夹悬浮细胞，有效、低廉、简便地解决了悬浮细胞固定化灌流培养的难题，大大提高了悬浮细胞的培养密度。
在细胞培养中，流体剪切力等容易对缺乏细胞壁的动物细胞带来机械损伤，而用多孔微载体培养细胞，一方面可为细胞创造良好的微环境，细胞生长不受流体流动、气泡凝聚破裂及各种机械碰撞的影响，另一方面还可增加搅拌强度，增大通气量，提高气体与培养基间的传质速率和培养基与细胞间的传质速率，适合于搅拌式、气升式、固定床和流化床等各种生物反应器的培养。
现有技术中的多孔微载体存在着如下一些不足：实心微载体只适合培养贴壁细胞，并且无法保护细胞免受机械搅拌传质供养所带来的机械损伤，而且在长期培养的后期，细胞容易脱弱，细胞高密度培养维持时间较短，实心微载体不能用于悬浮细胞的培养。用胶原制备的微载体如Cultispher G能够很好地支持贴壁细胞和悬浮细胞的培养，但机械强度差，在培养过程中由于机械搅拌而易导致微载体破碎，并且胶原多孔微载体不能采用常用的蒸汽高压灭菌的方法灭菌，只能用γ射线照射灭菌，使用不很方便。胶原多孔微载体无法回收利用，使用成本高。
发明内容
本发明的目的是提供一种比表面积大、机械稳定性良好、成本低廉的动物细胞培养用多孔微载体。
本发明的另一个目的是提供这种多孔微载体的制备方法。
本发明的第三个目的是提供制备这种动物细胞培养用多孔微载体的专用锐孔喷射器。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种动物细胞培养用多孔微载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)溶解：用铜氨溶液溶解脱脂棉；
(2)造粒：将脱脂棉铜氨溶液经锐孔喷射进入温度低于-30℃的油性冷冻液中制成含冰晶的微球；
(3)致孔：用浓硫酸再生脱脂棉微球并溶解其中的冰晶形成多孔微球；
(4)修饰：用2-二乙氨基氯乙烷盐酸盐(DEAE盐酸盐，Sigma公司)修饰多孔微球表面，使其交联-DEAE弱碱性阴离子交换基团，以促进细胞贴壁；
(5)洗涤、灭菌。
所述步骤(1)溶解是指用含1％Cu2+、10％-12％氨的铜氨溶液将脱脂棉完全浸润，捣烂成糊状，并加入明胶，配成含1％-2％脱脂棉和0.1％明胶的铜氨溶液。
所述步骤(2)中的油性冷冻液为二甲基硅油201-500和正己烷按1∶4的比例配成的油性冷冻液。
所述步骤(3)致孔是指向造粒的油性冷冻液中加入-30℃、40wt％的H2SO4溶液不断搅拌，形成多孔微球。
所述步骤(4)修饰是指将洗涤干净的多孔微球，加至含0.1mol/L DEAE盐酸盐、0.5mol/L NaOH的溶液中，置60℃下不断搅拌10h，使其交联-DEAE弱碱性阴离子交换基团。
所述步骤(5)洗涤、灭菌是指将交联后的多孔微载体用1％的柠檬酸溶液洗涤一次，再用蒸馏水洗涤三次，尔后用0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤3次，于121℃蒸汽灭菌30min后，吸出PBS，用含1％小牛血清的培养基洗涤二次后置4℃冰箱中备用。
根据上述方法制备得到的动物细胞培养用多孔微载体。
一种制备动物细胞培养用多孔微载体的专用锐孔喷射器，由贮液器、顶盖、液滴分散器和喷孔结构组成；其中贮液器为上端敞口、下端设有开口的中空容器，其侧壁上沿设有与顶盖固定的结构(螺口连接)，侧壁下沿设有与液滴分散器固定的结构(螺口连接)，可以通过螺接或类似方式固定。贮液器下端的开口呈与喷孔(7号注射针头，也可为其它型号的注射针头)相配适的形状，例如中空管状，以放置入喷孔(7号注射针头)结构内；顶盖的中央设有进气口，可与控制压力的气体管道连接，进气口的气体作用是将贮液器中的液体从喷孔压出，顶盖与贮液器连接的部位设有与贮液器侧壁上沿相配适的固定结构，并且中间夹有硅胶材料制成的密封垫圈；液滴分散器上端开口，其侧壁的上沿设有与贮液器侧壁下沿相配适的固定结构(螺口连接)，其下端设有供喷孔(7号注射针头)伸出的开口，其侧壁上设有进气口，进气口处的管道可与外部调节气压的装置连接；喷孔上端与贮液器下端开口结构套合，喷孔(7号注射针头)下端为中空管状结构，开口与液滴分散器下端开口齐平或比液滴分散器下端开口略长1-2mm，喷孔(7号注射针头)外侧壁与液滴分散器下端开口内侧壁之间有0.2-0.3mm的缝隙，以让吹散气体可以自由通过并将喷孔流出的较大液滴分散成直径较小的液滴。
本发明的优点是：本发明提供的动物细胞培养用多孔微载体(1)与实心微载体相比，具有非常大的比表面积，为细胞的生长提供了充分的生长空间；易实现贴壁细胞和悬浮细胞固定化，生长在多孔微载体上的细胞不易脱落；可很好地保护细胞免受流体剪切力、机械碰撞等引起的细胞损伤；(2)与用胶原制备的多孔微载体如Cultispher G相比，本发明制备的多孔微载体具有良好的机械稳定性，可高压灭菌，并可回收多次重复使用；(3)原料采用脱脂棉，来源充足，制作成本低廉。本发明提供的动物细胞培养用多孔微载体的制备方法操作简单、高效、成本低，便于实施和推广；其专用锐孔喷射器结构简单、使用方便、价格低。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制。
附图说明
图1为用脱脂棉制备多孔微载体的制备方法示意图
图2为制备多孔微载体采用的锐孔喷射装置图
图3为制备的多孔微载体图
图4为CHO细胞在多孔微载体中生长的照片图
具体实施方式
实施例1、多孔微载体的制备
如图1所示，本发明多孔微载体的制备方法如下：
一、脱脂棉的溶解
用CuSO4·5H2O和等当量的NaOH反应生成Cu(OH)2沉淀，加入氨水使沉淀逐步溶解最终配成含1％Cu2+、8％氨的铜氨溶液。取市售脱脂棉于适量铜氨溶液中(脱脂棉完全浸润既可)，不断捣烂，最终成糊状，继续加入铜氨溶液并不断搅拌，并加入少许明胶，配成含约1.5％脱脂棉、0.1％明胶的铜氨溶液，置于4℃避光保存。
二、脱脂棉溶液冷冻成球
将二甲基硅油201-500(北京化工二厂)和正己烷按1∶4的比例配成油性冷冻液，置于-70℃环境过夜。用锐孔喷射装置(自制装置，见图2)将脱脂棉铜氨溶液加压喷射进入温度低于-30℃的油性冷冻液中(整个喷射过程油性冷冻液温度都必须低于-30℃)，由于表面张力的作用，水溶液在非极性溶液中收缩成圆球，并冷冻成冰，此时，微球中包含了许多水和明胶等致孔物质。溶液喷射过程中需要不断地温和搅拌冷冻液。微球的大小主要通过锐孔喷射装置中的针头孔径调节，针头孔径越小，喷射形成的微球的粒径越小。改变吹气孔的气体流量也可以调节形成微球的粒径，气体流量Q吹越大，雾化作用越强，形成的微球粒径越小。在造粒过程中选择的实验条件是，7号针头，P压＝0.5bar，Q吹＝5L/min，1L冷冻液中可喷射约100mL脱脂棉铜氨溶液，此时形成的微球粒径一般均在200μm-300μm。
三、浓硫酸再生脱脂棉微球形成多孔微球
尽量将上层的油性冷冻液取出(可重复使用)，加入-30℃、40％(wt％)的H2SO4溶液不断搅拌，此时冷冻微球中溶解铜氨溶液里的脱脂棉会再生成固态，并熔化了微球中的冰晶，形成多孔微球。用100目的不锈钢筛网过滤收集多孔微球，而滤过液在自然分层后可回收其中的油性冷冻液。将收集的多孔微球置于80℃热水中，加入家用洗衣粉反复洗涤多次以彻底洗除二甲基硅油。用不锈钢筛网筛分其中的粒径在200μm-300μm范围内的多孔微球。
四、多孔微球的表面修饰
将用去离子水洗涤干净的多孔微球，加至含0.1mol/L DEAE盐酸盐、0.5mol/LNaOH的溶液中，置60℃下不断搅拌10h，使其交联-DEAE弱碱性阴离子交换基团，以促进细胞贴壁。
五、洗涤、灭菌
交联后的多孔微载体(图3)用1％的柠檬酸溶液洗涤一次，再用蒸馏水洗涤三次，尔后用0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)洗涤3次，于121℃蒸汽灭菌30min后，吸出PBS，用含1％小牛血清的培养基洗涤二次后置4℃冰箱中备用。
本发明获得的多孔微载体的理化指标见表1。
表1自制多孔微载体物化特性
| 材质粒径d50密度孔径溶胀系数 | 医用脱脂棉200-300μm约1.03g/mL约30μm约45mL/g dry |
实施例2、多孔微载体的制备
一、脱脂棉的溶解
用CuSO4·5H2O和等当量的NaOH反应生成Cu(OH)2沉淀，加入氨水使沉淀逐步溶解最终配成含1％Cu2+、8％氨的铜氨溶液。取市售脱脂棉于适量铜氨溶液中(脱脂棉完全浸润既可)，不断捣烂，最终成糊状，继续加入铜氨溶液并不断搅拌，并加入少许明胶，配成含约1.5％脱脂棉、0.1％明胶的铜氨溶液，置于4℃避光保存。
二、脱脂棉溶液冷冻成球
将二甲基硅油201-500和正己烷按1∶4的比例配成油性冷冻液，置于-70℃环境过夜。用锐孔喷射装置(自制装置，见图2)将脱脂棉铜氨溶液加压喷射进入温度低于-30℃的油性冷冻液中(整个喷射过程油性冷冻液温度都必须低于-30℃)，由于表面张力的作用，水溶液在非极性溶液中收缩成圆球，并冷冻成冰，此时，微球中包含了许多水和明胶等致孔物质。溶液喷射过程中需要不断地温和搅拌冷冻液。微球的大小主要通过锐孔喷射装置中的针头孔径调节，针头孔径越小，喷射形成的微球的粒径越小。改变吹气孔的气体流量也可以调节形成微球的粒径，气体流量Q吹越大，雾化作用越强，形成的微球粒径越小。在造粒过程中选择的实验条件是，7号针头，P压＝0.5bar，Q吹＝5L/min，1L冷冻液中可喷射约100mL脱脂棉铜氨溶液，此时形成的微球粒径一般均在200μm-300μm。
三、浓硫酸再生脱脂棉微球形成多孔微球
尽量将上层的油性冷冻液取出(可重复使用)，加入-30℃、40％(wt％)的H2SO4溶液不断搅拌，此时冷冻微球中溶解铜氨溶液里的脱脂棉会再生成固态，并熔化了微球中的冰晶，形成多孔微球。用100目的不锈钢筛网过滤收集多孔微球，而滤过液在自然分层后可回收其中的油性冷冻液。将收集的多孔微球置于80℃热水中，加入家用洗衣粉反复洗涤多次以彻底洗除二甲基硅油。用不锈钢筛网筛分其中的粒径在200μm-300μm范围内的多孔微球。
四、多孔微球的表面修饰
将用去离子水洗涤干净的多孔微球，加至含0.1mol/L DEAE盐酸盐、0.5mol/LNaOH的溶液中，置60℃下不断搅拌10h，使其交联-DEAE弱碱性阴离子交换基团，以促进细胞贴壁。
五、洗涤、灭菌
交联后的多孔微载体(图3)用1％的柠檬酸溶液洗涤一次，再用蒸馏水洗涤三次，尔后用0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)洗涤3次，于121℃蒸汽灭菌30min后，吸出PBS，用含1％小牛血清的培养基洗涤二次后置4℃冰箱中备用。
本发明获得的多孔微载体的理化指标见表2。
表2自制多孔微载体物化特性
| 材质粒径d50密度孔径溶胀系数 | 医用脱脂棉200-300μm约1.03g/mL约30μm约45mL/g dry |
实施例3、多孔微载体的制备
一、脱脂棉的溶解
用CuSO4·5H2O和等当量的NaOH反应生成Cu(OH)2沉淀，加入氨水使沉淀逐步溶解最终配成含1％Cu2+、8％氨的铜氨溶液。取市售脱脂棉于适量铜氨溶液中(脱脂棉完全浸润既可)，不断捣烂，最终成糊状，继续加入铜氨溶液并不断搅拌，并加入少许明胶，配成含约1.5％脱脂棉、0.1％明胶的铜氨溶液，置于4℃避光保存。
二、脱脂棉溶液冷冻成球
将二甲基硅油201-500和正己烷按1∶4的比例配成油性冷冻液，置于-70℃环境过夜。用锐孔喷射装置(自制装置，见图2)将脱脂棉铜氨溶液加压喷射进入温度低于-30℃的油性冷冻液中(整个喷射过程油性冷冻液温度都必须低于-30℃)，由于表面张力的作用，水溶液在非极性溶液中收缩成圆球，并冷冻成冰，此时，微球中包含了许多水和明胶等致孔物质。溶液喷射过程中需要不断地温和搅拌冷冻液。微球的大小主要通过锐孔喷射装置中的针头孔径调节，针头孔径越小，喷射形成的微球的粒径越小。改变吹气孔的气体流量也可以调节形成微球的粒径，气体流量Q吹越大，雾化作用越强，形成的微球粒径越小。在造粒过程中选择的实验条件是，7号针头，P压＝0.5bar，Q吹＝5L/min，1L冷冻液中可喷射约100mL脱脂棉铜氨溶液，此时形成的微球粒径一般均在200μm-300μm。
三、浓硫酸再生脱脂棉微球形成多孔微球
尽量将上层的油性冷冻液取出(可重复使用)，加入-30℃、40％(wt％)的H2SO4溶液不断搅拌，此时冷冻微球中溶解铜氨溶液里的脱脂棉会再生成固态，并熔化了微球中的冰晶，形成多孔微球。用100目的不锈钢筛网过滤收集多孔微球，而滤过液在自然分层后可回收其中的油性冷冻液。将收集的多孔微球置于80℃热水中，加入家用洗衣粉反复洗涤多次以彻底洗除二甲基硅油。用不锈钢筛网筛分其中的粒径在200μm-300μm范围内的多孔微球。
四、多孔微球的表面修饰
将用去离子水洗涤干净的多孔微球，加至含0.1mol/L DEAE盐酸盐、0.5mol/LNaOH的溶液中，置60℃下不断搅拌10h，使其交联-DEAE弱碱性阴离子交换基团，以促进细胞贴壁。
五、洗涤、灭菌
交联后的多孔微载体(图3)用1％的柠檬酸溶液洗涤一次，再用蒸馏水洗涤三次，尔后用0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)洗涤3次，于121℃蒸汽灭菌30min后，吸出PBS，用含1％小牛血清的培养基洗涤二次后置4℃冰箱中备用。
本发明获得的多孔微载体的理化指标见表3。
表3自制多孔微载体物化特性
| 材质粒径d50密度孔径溶胀系数 | 医用脱脂棉200-300μm约1.03g/mL约30μm约45mL/g dry |
实施例4、用自制的多孔微载体培养基因重组中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)
一、细胞培养
培养的动物细胞是表达pro-UK的基因重组CHO细胞系CL-11G(中国专利ZL96119836.2)，培养基为DMEM/F12＝1/1，加入0.5g/L谷氨酰胺，1.8g/L Hepes，10KIU/ml Aprotini，1g/L蛋白胨，补加多种氨基酸和低血清添加剂，另加适量小牛血清和胰岛素，过滤除菌。在100ml搅拌瓶中加入10ml溶涨的经高压灭菌的自制多孔微载体，并接种由方瓶培养制得的细胞悬液，接种密度为5×105cells/mL，加含1％小牛血清的培养基至50ml，置37℃培养箱中搅拌培养，搅拌转速为30r/min。培养3d后每天换液20mL，12d后用MTT法染色可见所有的微载体上都长有细胞，用结晶紫染色法记数细胞，细胞密度可达约5×106cells/mL，收获的培养上清中pro-UK浓度一般在1000IU/mL-2000IU/mL。多孔微载体中长满细胞后，将长有细胞的多孔微载体直接转入1000ml搅拌瓶中，并加入50ml自制微载体，加培养基至500ml，接种密度为5×105cells/mL，于37℃搅拌培养，搅拌转速为50r/min，培养3d后每天换液200-300mL，12d后所有的微载体上都长有细胞，细胞密度可达约5×106cells/mL，收获的培养上清中pro-UK浓度一般在1000IU/mL-2000IU/mL。培养15d后，将培养基中的血清浓度从1％降至0.1％，每天分两次换液300mL-500mL，培养上清中的pro-UK浓度一般在2000IU/mL-2500IU/mL，培养30d MTT染色，所有的微载体上均长满细胞(图4)。表明自制的微载体可以较好支持CHO细胞生长，并且可使用低血清培养基培养，而且细胞放大培养时，无需消化细胞再转至更大规模的反应器中培养，由于细胞可在在新旧微载体之间的自动转移，直接接种长满细胞的多孔微载体即可，大大简化了接种和放大培养过程。
二、细胞记数与观察
1.MTT染色法：取出样品后用5mg/ml MTT溶液染色，置37℃下2h～4h后，在显微镜下观察，长有细胞的多孔微载体为黑色(见图4)，未长细胞的多孔微载体仍为本白色。
2.结晶紫染色法：取样5ml于10ml试管中，待多孔微载体沉降后用吸管尽可能多地吸出上清，尔后加入等量的含0.1％结晶紫的0.1mol/L柠檬酸溶液，每隔1h用吸管吹打、摇荡，置于37℃下3小时后，摇匀待微载体稍沉降后，用吸管紧靠液面吸取适量液体于血球计数板上，数出被染成深紫色的细胞核数。
实施例5、自制的多孔微载体的回收
自制的多孔微载体机械强度高，可回收重复使用。回收方法如下：(1)将约50mL内部长有细胞的多孔微载体置于1000mL瓶中，加500mL水，用力振荡2分钟后，用150目不锈钢滤网滤除液体，以初步去除脱落的细胞及细胞碎片。(2)将微载体重新悬浮于0.2mol/L的柠檬酸溶液中，置于室温6小时，并每隔1小时振荡2分钟，使多孔微载体内部中的大多数细胞裂解并脱落出来，用150目滤网滤除液体。(3)重复第一步，用水多次清洗多孔微载体，直至待微载体沉降后液体清亮透明为止。如果有必要，可再次用柠檬酸溶液浸泡洗涤。(4)用5％(wt％)的碳酸氢钠溶液浸泡洗涤一次，尔后用水洗涤三次。(5)显微镜下观察，如果多孔微载体内部还有较多的死细胞，可用0.2％的粗胰酶溶液浸泡，于37℃孵育3小时并每隔半小时摇荡2分钟，之后用水清洗至液体清亮透明。(6)如果发现回收的微载体吸附细胞的能力减弱，可以用DEAE盐酸盐再次修饰微载体，将回收的微载体加至含0.02mol/L-0.05mol/L DEAE盐酸盐、0.2mol/L NaOH的溶液中，置60℃下不断搅拌10h，使其交联-DEAE弱碱性阴离子交换基团。交联后用1％的柠檬酸溶液洗涤一次，再用蒸馏水洗涤三次，尔后用0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)洗涤3次，于121℃蒸汽灭菌30min后。(7)吸出PBS，用DMEM/F12培养基洗涤2次，再用DMEM/F12培养基浸泡置4℃备用。
本发明提供的多孔微载体具有非常大的比表面积，为细胞的生长提供了充分的生长空间；易实现贴壁细胞和悬浮细胞固定化，生长在多孔微载体上的细胞不易脱落；可很好地保护细胞免受流体剪切力、机械碰撞等引起的细胞损伤；具有良好的机械稳定性，可高压灭菌，并可回收多次重复使用，制作成本低廉。
实施例6、锐孔喷射器
如图2所示，制备动物细胞培养用多孔微载体的专用锐孔喷射器1，由贮液器11、顶盖12、液滴分散器14和喷孔结构13组成；其中贮液器11为上端敞口、下端设有开口的中空容器，其侧壁上沿设有与顶盖12固定的结构111(螺口连接)，侧壁下沿设有与液滴分散器固定的结构112(螺口连接)，可以通过螺接或类似方式固定。贮液器下端的开口呈与喷孔13(7号注射针头，也可为其它型号的注射针头)相配适的形状，例如中空管状，以放置入喷孔13(7号注射针头)结构内；顶盖的中央设有进气口121，可与控制压力的气体管道连接，进气口121的气体作用是将贮液器11中的液体从喷孔13压出，顶盖12与贮液器11连接的部位设有与贮液器11侧壁上沿相配适的固定结构122，并且中间夹有硅胶材料制成的密封垫圈15：液滴分散器14上端开口，其侧壁的上沿设有与贮液器11侧壁下沿相配适的固定结构142(螺口连接)，其下端设有供喷孔13(7号注射针头)伸出的开口，其侧壁上设有进气口141，进气口121处的管道可与外部调节气压的装置2和3连接；喷孔3上端与贮液器11下端开口结构113套合，喷孔13(7号注射针头)下端为中空管状结构，开口与液滴分散器下端开口齐平或比液滴分散器下端开口略长1-2mm，喷孔(7号注射针头)外侧壁与液滴分散器下端开口内侧壁之间有0.2-0.3mm的缝隙，以让吹散气体可以自由通过并将喷孔流出的较大液滴分散成直径较小的液滴。
Claims (8)
1、一种动物细胞培养用多孔微载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)溶解：用铜氨溶液溶解脱脂棉；
(2)造粒：将脱脂棉铜氨溶液经锐孔喷射进入温度低于-30℃的油性冷冻液中制成含冰晶的微球；
(3)致孔：用浓硫酸再生脱脂棉微球并溶解其中的冰晶形成多孔微球；
(4)修饰：用2-二乙氨基氯乙烷盐酸盐修饰多孔微球表面，使其交联-DEAE弱碱性阴离子交换基团；
(5)洗涤、灭菌。
2、根据权利要求1所述的动物细胞培养用多孔微载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)溶解是指用含1％Cu2+、8％氨的铜氨溶液将脱脂棉完全浸润，捣烂成糊状，并加入明胶，配成含1％-2％脱脂棉和0.1％明胶的铜氨溶液。
3、根据权利要求1所述的动物细胞培养用多孔微载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的油性冷冻液为二甲基硅油201-500和正己烷按1∶4的比例配成的油性冷冻液。
4、根据权利要求1所述的动物细胞培养用多孔微载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)致孔是指向造粒的油性冷冻液中加入-30℃、40wt％的H2SO4溶液不断搅拌，形成多孔微球。
5、根据权利要求1所述的动物细胞培养用多孔微载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)修饰是指将洗涤干净的多孔微球，加至含0.1mol/L DEAE盐酸盐、0.5mol/L NaOH的溶液中，置60℃下不断搅拌10h，使其交联-DEAE弱碱性阴离子交换基团。
6、根据权利要求1所述的动物细胞培养用多孔微载体的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)洗涤、灭菌是指将交联后的多孔微载体用1％的柠檬酸溶液洗涤一次，再用蒸馏水洗涤三次，尔后用0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤3次于121℃蒸汽灭菌30min后，吸出PBS，用含1％小牛血清的培养基洗涤二次后置4℃冰箱中备用。
7、根据权利要求1至6中任何一项所述方法制备的动物细胞培养用多孔微载体。
8、一种制备动物细胞培养用多孔微载体的专用锐孔喷射器，其特征在于：该锐孔喷射器由贮液器、顶盖、液滴分散器和喷孔结构组成；其中贮液器为上端敞口、下端设有开口的中空容器，其侧壁上沿设有与顶盖固定的结构，侧壁下沿设有与液滴分散器固定的结构，可以通过螺接或类似方式固定；贮液器下端的开口呈与喷孔相配适的形状，以放置入喷孔结构内；顶盖的中央设有进气口，可与控制压力的气体管道连接，进气口的气体作用是将贮液器中的液体从喷孔压出，顶盖与贮液器连接的部位设有与贮液器侧壁上沿相配适的固定结构，并且中间夹有硅胶材料制成的密封垫圈；液滴分散器上端开口，其侧壁的上沿设有与贮液器侧壁下沿相配适的固定结构，其下端设有供喷孔伸出的开口，其侧壁上设有进气口，进气口处的管道可与外部调节气压的装置连接；喷孔上端与贮液器下端开口结构套合，喷孔下端为中空管状结构，开口与液滴分散器下端开口齐平或比液滴分散器下端开口略长1-2mm，喷孔外侧壁与液滴分散器下端开口内侧壁之间有0.2-0.3mm的缝隙，以让吹散气体可以自由通过并将喷孔流出的较大液滴分散成直径较小的液滴。
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