CN1556203A - 动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法及其培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法，包括如下步骤：(1)纤维素多孔微载体预处理；(2)细胞接种：搅拌瓶中加入处理好的多孔微载体和含血清培养基，将细胞悬液按所需接种密度接种到搅拌瓶中培养；(3)细胞驯化：将生长在多孔微载体上的细胞悬液在搅拌瓶中逐级放大培养，并将培养基中的血清含量逐渐降到0％；(4)细胞培养：将细胞悬液转移至反应器中逐级放大培养，定期更新部分微载体，对细胞进行无血清培养。本发明的优点是：(1)细胞培养密度高；(2)可方便放大培养规模；(3)细胞培养时间长，一般可达100天左右；(4)无血清培养基价格低廉；(5)反应器的生产能力高；(6)适用于贴壁细胞和悬浮细胞的培养。
Description
技术领域
本发明涉及动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法及其培养基，更具体地说是利用多孔微载体将动物细胞固定化，在生物反应器中无血清高密度培养动物细胞，高效表达基因工程产品或其他生物制品的方法以及所使用的培养基，属于细胞工程领域和生物制药领域。
背景技术
以基因工程和细胞融合技术为标志的现代生物技术在医药工业中形成了一支新的高科技产业——现代生物技术制药工业。据统计，2001年全球现代生物技术药品的销售额超过300亿美元，并且每年以15％-20％的速度增长，而常规药物的增长率为5％-8％。动物细胞大规模培养技术是生物制药产业中的最关键的一个技术平台，目前一半以上获得批准用于临床治疗的生物制品均通过细胞培养技术来生产，而且，随着大分子功能蛋白和人源(化)抗体的开发，基因治疗和细胞治疗的进步，以及组织工程和人造生物器官产品的研发，细胞培养技术将在生物制药产业化领域中发挥更大的作用。
用动物细胞大规模培养技术生产的生物制品包括所有治疗性单克隆抗体、病毒疫苗、干扰素、t-PA、EPO、凝血因子、G-CSF、融合蛋白(如Enbrel)、组织工程产品及其他生物制品。美国FDA批准的很大部分生物制品均是由动物细胞表达生产的。目前主要有细菌(E.coli)、酵母、哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞，即CHO细胞)三种表达系统表达重组蛋白。细菌等原核表达系统繁殖快、易于培养，但表达的蛋白质缺乏转录后的修饰，如缺乏蛋白质限制性酶切位点、二硫键、特殊的糖基化、磷酸化、酰胺化作用以及形成天然蛋白质精确的三维结构的环境等。而许多蛋白的生物活性与转录后的修饰有关，并且原核系统表达的蛋白一般为胞内产物，需要破碎细胞才能提取产物，给产物的分离纯化带来困难，同时还容易受到外源毒素的污染。而真核表达系统如CHO细胞表达的蛋白具有转录后的修饰作用，与人体自身分泌的天然蛋白无论在结构和功能上都非常近似，因而美国FDA倾向在21世纪采用真核表达系统生产蛋白质药物。几乎所有用原核细胞表达的蛋白均可采用真核表达系统生产，反之则不尽然，用动物细胞表达系统表达的蛋白都是胞外分泌的，产物的分离纯化过程非常简单，但是，由于细胞大规模培养技术比较复杂，目前仍处于发展完善阶段，因而许多重组蛋白仍选用原核表达系统生产。2001年全球销售额位列前20位的生物制品，用CHO动物细胞表达的占11种，销售额占总数的65％。由此可见动物细胞表达产品的大规模高效培养技术在生物制药领域中的重要性。
技术的发展要求用动物细胞真核表达系统生产的生物制品的比重越来越大。原核表达系统一般用于小分子、结构简单的蛋白生产，蛋白转录后无需修饰，如胰岛素。而真核表达系统主要用于生产大分子、结构复杂的蛋白，并且转录后的修饰对蛋白的生物活性具有重要影响，如组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、促红细胞生成素等(EPO)。生物制品的一个发展趋势是开发分子量较大的功能蛋白和人源抗体、基因治疗产品、治疗用疫苗以及组织工程产品，这些产品一般都是通过动物细胞大规模培养技术来生产的。尤其是治疗用抗体药物的开发是最近5年生物制品研发的重要领域。目前几乎所有的嵌合抗体和人源化抗体都是用CHO细胞表达的，而且检测用鼠源单克隆抗体的生产也可经培养杂交瘤细胞获得。因此，随着生物制药产业的发展，通过动物细胞大规模培养技术生产的生物制品比重将越来越大。
动物细胞表达产品生产能力不能满足市场需求。动物细胞培养技术复杂，至今还没有一种公认的比较标准的高效培养技术。由于各制药公司技术保密的需要，在公开发表的论文中很难看到真正应用于生产的工艺和技术。一般来讲，几乎所有的制药公司都采用与细菌发酵相似的批式培养工艺，这种培养工艺技术难度相对较低，但反应器的生产能力也很低，大大限制了动物细胞表达产品的生产和供应。剂量在几百毫克～几克/人/年的药物如Enbrel，生产商已经应用6个12,500L的生物反应器生产，年产量低于10公斤，可见其反应器的生产效率并不高。据Bains&Company预计，今后十年，用哺乳动物细胞生产的生物制品远不能满足市场的需求。
为了提高反应器的生产效率，降低运行成本，理想的商业用工业化的动物细胞培养工艺应具有以下特点：“大规模、高密度、长时间、高表达”。用较小规模的反应器高效率生产生物制品一直是动物细胞大规模培养技术研究的重点，自1980年代以来，动物细胞大规模培养技术成为生化工程领域最为重要的研究内容之一，但是由于存在以下难点，至今仍没有一种成熟的细胞高效培养技术，这些难点包括：
(1)动物细胞非常脆弱，如何解决供氧与细胞损伤的矛盾。这是细胞高密度培养的主要限制因素。提高氧传递速率一般会增加混合强度，从而可能对细胞造成损伤。引起细胞机械损伤的因素主要包括机械碰撞、流体剪切、气泡凝聚破裂等，解决的主要方法是：添加保护剂如Pluronic F68、血清等；膜包埋培养如中空纤维膜反应器；采用多孔细胞支持物培养，如多孔微载体、烧结陶瓷等；改进反应器结构，使搅拌温和，气泡与细胞隔离，如笼式曝气反应器、无泡通气反应器，气液双升反应器等。
(2)如何解决传质混合与过程放大的矛盾。这是实现动物细胞大规模培养的关键。反应器放大培养后应保证具有良好的传质混合性能和温和的细胞生长环境。许多类型反应器如固定床反应器和中空纤维膜反应器在小规模实验中具有很好的细胞培养效果，但都难以用于商业化、大规模生产，主要原因是不能放大培养。目前能够做到放大培养的一般是采用细胞悬浮培养技术。在过去一度认为多孔微载体培养难以逐级放大。
(3)如何解决细胞长期连续培养的细胞凋亡问题。这是保持细胞长期高密度培养的关键。细胞体外培养时，诱发细胞凋亡的主要原因是细胞生长的环境条件较恶劣，如营养缺乏，代谢产物的累积，pH和溶氧控制不当，机械搅拌剪切力较大等，尤其在无血清培养基中更易发生。细胞凋亡大大影响了细胞培养时间，从而严重降低反应器的生产能力和利用效率，增加了运行成本和劳动强度。正因如此，近几年来对细胞培养中细胞凋亡的研究正成为细胞培养技术中的一个热门课题。为解决这一问题，许多学者尝试利用基因工程技术改造细胞株，将抑制细胞凋亡的基因bcl-2转染到宿主细胞中，或在细胞培养基中加入昂贵的抑制细胞凋亡的因子，期望抑制或延缓细胞凋亡，延长单个细胞的寿命以延长培养时间，但目前效果并不明显，存在效果不稳定，成本较昂贵，延长时间不长(延长2-3天)等不足，在大规模细胞培养中并未见有应用。
(4)如何解决细胞在高密度条件下，由于存在密度效应，单个细胞的表达水平下降问题。如何保持或提高细胞在高密度生长条件下的表达水平，关系到产物的浓度和产量以及培养基的利用率。细胞生命活动赖依存在的内部结构是自然界最复杂的非线性系统之一，简单用传统的化学反应工程原理来设计和运行生物反应器是远不够的，尤其是培养结构更为复杂的动物细胞(细胞表面具有与细胞通讯有关的受体，信息在细胞与环境之间、细胞与细胞之间以及细胞内部的传递直接影响细胞的生长、增殖、代谢及产物表达)。不少文献尝试利用温度的变化、培养液渗透压的变化及其他外部刺激，提高细胞的表达水平。
(5)无血清培养基的研究与开发。用含血清培养基生产生物制品有许多不利，如增加培养成本和污染机会，增加纯化难度和成本，增加产品质控指标，因此，大规模生产临床使用的生物制品应尽可能使用无血清培养基。
(6)细胞截留技术的研究。由于单个细胞表达产物的水平是一定的，提高细胞密度就能够提高上清中产物浓度，从而提高反应器的生产能力。而要获得较高的细胞培养密度，前提是要将细胞截留在反应器中。截留细胞的方法主要有三类：(A)分离法，如在位离心、旋转滤器、循环反应器、超声波隔离等；(B)包埋法(封闭式)，如中空纤维膜反应器、微囊化、膜反应器；(C)裹夹法(开放式)，如多孔陶瓷、无纺布培养、海绵/泡沫基质、多孔微载体等。
(7)动物细胞批式培养与连续培养的选择及细胞生长动力学模型的建立。选择培养方式应根据细胞和产物的具体特点来确定。从培养效果讲，连续培养细胞密度高，一般截留细胞的连续培养细胞密度均在107/ml，比批式培养高10倍左右，因而反应器生产能力也比批式培养高10倍以上，并且连续培养的劳动强度小，生产成本低，但是前提是整个连续培养系统，包括反应器控制系统、细胞截留系统等必须保证长时间运行正常可靠。但是绝大多数生物制药公司都还采用批式培养模式，因为动物细胞批式悬浮培养运行比较简单可靠，易实现过程放大，不涉及细胞凋亡和高密度培养表达水平下降的问题，悬浮细胞个体较小，受流体剪切力的影响相对较小，比较容易借鉴细菌发酵的技术。这也说明目前还没有一种理想的连续培养技术可供制药公司选择。但是，动物细胞批式悬浮培养生产能力低，设备和厂房投资高，生产成本也比较高。以生产t-PA为例，动物细胞反应器的规模达到6×6000L，相应的纯化设备也很庞大，即要求纯化设备能够一次性处理细胞培养上清几万升。用这种工艺生产1g基因工程蛋白的成本约10,000美元，而年产量只有10公斤级水平，并且批式培养方式不适合不稳定的蛋白质的生产，如尿激酶原的生产。动物细胞表达的产品如各种人源化抗体、Enbrel、t-PA等，剂量一般都在毫克级甚至克级(EPO除外)，因此，要满足市场需求，采用批式培养动物细胞反应器的规模都很大，如生产Enbrel的反应器规模已达12,500L，但产量仍不能满足市场需求。
用较小规模的反应器高效率生产生物制品一直是动物细胞大规模培养技术研究的重点，这一方向更符合我国国情，并且还没有动物细胞大规模高密度长期连续培养的成熟技术的专利。
发明内容
本发明的目的是提供一种连续培养动物细胞的多孔微载体固定化高效培养方法。
本发明的另一个目的是提供一种成本低廉、质量可控、使用安全的无血清培养基。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法，包括如下步骤：
(1)纤维素多孔微载体预处理：将纤维素多孔微载体用0.1mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液(PBS)浸泡4h后，倾去PBS，再用PBS洗涤3次。121℃高压灭菌30min后，吸出PBS，用DMEM/F12培养基洗涤2次后置4℃备用；
(2)细胞接种：搅拌瓶中加人处理好的多孔微载体和含血清培养基，将细胞悬液按所需接种密度接种到搅拌瓶中培养，培养条件为温度37.0℃±0.1℃，pH值7.0±0.05，转速20-100r/min；
(3)细胞驯化：将生长在多孔微载体上的细胞悬液在搅拌瓶中逐级放大培养，并将培养基中的血清含量逐渐降到0％，培养条件为温度37.0℃±0.1℃，pH值7.0±0.05，转速20-100r/min，至细胞密度大于5×106细胞/mL，换液量一般为1/2-1个培养体积；
(4)细胞培养：将细胞悬液转移至反应器中逐级放大培养，使用无泡通气供氧系统，采用批式换液连续培养工艺，定期更新部分微载体，对细胞进行无血清培养。
所述纤维素多孔微载体是Cytopore-2。
所述(2)细胞接种步骤中多孔微载体的浓度为1-4g/L。
所述(2)细胞接种步骤中血清培养基的浓度为2％。
所述(2)细胞接种步骤中细胞悬液的接种密度为2×105-5×105细胞/mL。
所述(4)细胞培养步骤中的转移是指使用管道将长满细胞的多孔微载体直接导入下一级反应器中。
所述(4)细胞培养步骤中的反应器中预先加入适量培养基和经过处理的多孔微载体。
所述(4)细胞培养步骤采用批式换液连续培养是指每天通过细胞截留系统换液1-1.2个工作体积，将微载体和细胞截留在反应器中，收获含产品的上清并加入等量新鲜培养基。
所述(4)细胞培养步骤的无血清培养是指依次使用无血清生长培养基和无血清表达培养基对反应器内的细胞进行培养。
所述动物细胞为贴壁细胞如CHO细胞或悬浮细胞如杂交瘤细胞。
用于动物细胞多孔微载体固定化高效培养的无血清培养基，该无血清培养基包括生长型无血清培养基和表达型无血清培养基，每10L培养基的成分及其含量分别见下表：
生长型无血清培养基成分及其含量(每10L培养基)
| 成分 | 称取量 | 成分 | 称取量 |
| DMEM/F12(1∶1) | 156g | 葡萄糖 | 20g-60g |
| 碳酸氢钠 | 10g-20g | 蛋白胨 | 10g |
| 谷氨酰胺 | 5g | 6-氨基己酸 | 6.5g |
| 脯氨酸 | 110mg | 亮氨酸 | 500mg |
| 天冬氨酸 | 70mg | 半胱氨酸 | 320mg |
| 甲硫氨酸 | 600mg | 丝氨酸 | 300mg |
| 甘氨酸 | 75mg | 叶酸 | 100mg |
| 维生素B1 | 500mg | 维生素B2 | 100mg |
| 维生素B6 | 500mg | 维生素B12 | 50mg |
| 维生素C | 1000mg | 肌醇 | 2000mg |
| 烟酰胺 | 500mg | 胰岛素 | 800U |
| 转铁蛋白 | 25mg | 乙醇胺 | 20mg |
| FeSO4·7H2O | 10mg | ZnSO4 | 20mg |
表达型无血清培养基成分及其含量(每10L培养基)
| 成分 | 称取量 | 成分 | 称取量 |
| DMEM/F12(1∶1) | 156g | 葡萄糖 | 20g-60g |
| 碳酸氢钠 | 10g-20g | 蛋白胨 | 10g |
| 谷氨酰胺 | 5g | 6-氨基己酸 | 6.5g |
| 脯氨酸 | 110mg | 亮氨酸 | 500mg |
| 天冬氨酸 | 70mg | 半胱氨酸 | 320mg |
| 甲硫氨酸 | 600mg | 丝氨酸 | 300mg |
| 甘氨酸 | 75mg | 叶酸 | 100mg |
| 维生素B1 | 1000mg | 维生素B2 | 200mg |
| 维生素B6 | 1000mg | 维生素B12 | 100mg |
| 维生素C | 2000mg | 肌醇 | 2000mg |
| 烟酰胺 | 500mg | 胰岛素 | 400U |
| FeSO4·7H2O | 10mg | ZnSO4 | 20mg |
本发明采用多孔微载体固定化细胞培养技术，保护细胞免受机械损伤，并将贴壁细胞或悬浮细胞截留在反应器中，提高细胞培养密度；利用细胞在多孔微载体间自动转移的规律，建立简单可靠的细胞培养过程放大的技术方法；采用无泡通气供氧系统，解决在细胞培养过程中直接通气供氧带来的泡沫泛滥及损伤细胞的问题；研制的无血清培养基，降低细胞培养成本、污染机会及后续产品纯化成本和难度；采用批式换液连续培养工艺，及时去除培养过程中的废物累积，降低批式培养过程中产物降解的比例，并提高反应器的生产能力；采用定期更新部分微载体的方法，使动物细胞在微载体之间相互转移，改善细胞生长的微环境，解决细胞长期培养的细胞凋亡问题。
本发明的优点是：采用生化工程技术，建立了一种简单、可靠的大规模高密度动物细胞长期连续培养和高效表达的技术，采用该技术培养动物细胞(1)细胞培养密度高，一般培养密度＞2×107/ml；(2)可方便放大培养规模；(3)解决了培养中的细胞凋亡问题，培养时间长，一般可达100天左右，细胞活力保持在95％以上；(4)无血清培养基价格低廉，并能很好支持细胞生长和表达；(5)反应器的生产能力高，表达水平为5μg/106cells/d的工程细胞采用本发明中的技术培养，年生产能力可达到10g/L反应器/年，较目前的反应器生产能力提高100倍左右；(6)既可用于贴壁细胞如CHO细胞的培养，又可用于悬浮细胞如杂交瘤细胞的培养。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制。
具体实施方式
实施例1、Cytopore-2纤维素多孔微载体培养动物细胞
一、Cytopore-2纤维素多孔微载体的预处理
Cytopore-2纤维素多孔微载体(Pharmacia Biotech AB，瑞典，CatNo.17-1271-02)是一种物化特性非常适合动物细胞大规模培养的细胞支持物，其主要物化特性见表1。
用前用0.1mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液(PBS)浸泡4h后，倾去PBS，再用PBS洗涤3次。121℃高压灭菌30min后，吸出PBS，用DMEM/F12培养基洗涤2次后置4℃备用。
表1 Cytopore-2多孔微载体物化特性
| 材质粒径d50有效表面积密度孔径溶胀系数电荷密度 | 100％纤维素200-280μm1.1m2/g dry1.03g/mL约30μm40mL/g dry约1.8meq/g |
Cytopore多孔微载体机械强度高，培养细胞后可回收重复使用。回收方法如下：(1)将约300mL内部长有细胞的多孔微载体置于2000mL瓶中，加1000mL水，用力振荡2分钟后，用150目不锈钢滤网滤除液体，以初步去除脱落的细胞及细胞碎片。(2)将微载体重新悬浮于0.2mol/L的柠檬酸溶液中，置于室温6小时，并每隔1小时振荡2分钟，使多孔微载体内部中的大多数细胞裂解并脱落出来，用150目滤网滤除液体。(3)重复第一步，用水多次清洗多孔微载体，直至待微载体沉降后液体清亮透明为止。如果有必要，可再次用柠檬酸溶液浸泡洗涤。(4)用5％的碳酸氢钠溶液浸泡洗涤一次，尔后用水洗涤三次。(5)显微镜下观察，如果多孔微载体内部还有较多的死细胞，可用0.2％的粗胰酶溶液浸泡，于37℃孵育3小时并每隔半小时摇荡2分钟，之后用水清洗至液体清亮透明。(4)用去离子水洗涤三次，再用pH7.0～7.5的0.1M PBS缓冲液洗涤三次后，在121℃下高压灭菌备用。(5)如有必要，加至含0.02mol/L-0.05mol/L DEAE盐酸盐、0.2mol/L NaOH的溶液中，置60℃下不断搅拌10h，使其交联-DEAE弱碱性阴离子交换基团，以促进细胞贴壁。交联后用1％的柠檬酸溶液洗涤一次，再用蒸馏水洗涤三次，尔后用0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)洗涤3次，于121℃蒸汽灭菌30min后。(6)吸出PBS，用DMEM/F12培养基(美国Hyclone公司生产，CatNo.SH30004.04)洗涤2次，再用DMEM/F12培养基浸泡置4℃备用。
二、细胞接种
将处理好的多孔微载体按1-1.5g/L的浓度加到搅拌瓶中，并加入含1％血清的培养基。在方瓶和转瓶中培养的贴壁细胞如CHO细胞，经0.25％的胰酶消化，用培养基吹打制成细胞悬液，直接接种到搅拌瓶中，而在方瓶中培养的杂交瘤等悬浮细胞，可直接用培养基吹打制成细胞悬液接种到搅拌瓶中培养。一般接种密度需大于2×105细胞/mL，最好接种密度为5×105细胞/mL。接种后5h内，搅拌转速一般为(20-40)r/min，以让细胞较充分接触多孔微载体，随后可将转速提高至(50-60)r/min，培养温度为37.0℃±0.1℃。
三、细胞驯化
将生长在多孔微载体上的细胞悬液在搅拌瓶中逐级放大培养，培养3d后，可根据培养基中葡萄糖浓度适量换液，培养条件为温度37.0℃±0.1℃，pH值7.0±0.05，转速50-60r/min，至细胞密度大于5×106细胞/mL，换液量一般为1/2-1个培养体积；并将培养基中的血清含量逐渐降到0％，以驯化细胞适应无血清培养基。
四、细胞培养
将细胞悬液由搅拌瓶转移至7.5L Biostat CT反应器(工作体积为5L，B.Braun公司，德国)，尔后再转移至30L Biostat UC反应器(工作体积为20L，B.Braun公司，德国)逐级放大培养反应器中逐级放大培养，使用无泡通气供氧系统，采用批式换液连续培养工艺，定期更新部分微载体，对细胞进行无血清培养。
由于细胞能在长满细胞的载体和空载体之间自动转移，每级放大培养时，先在更大规模的反应器中预先加入适量培养基和经过处理的多孔微载体，长满细胞的多孔微载体通过管道直接进入下一级反应器中，而无需胰酶的消化来帮助细胞培养的接种和放大。这种种子细胞制备方法和反应器细胞接种方法非常简便，并且可以严格保证无菌，为多孔微载体细胞培养的规模放大提供了条件。
五、多孔微载体中生长细胞的染色与计数
1.MTT染色法：取出样品后用5mg/ml MTT溶液染色，置37℃下2h-4h后，在显微镜下观察，长有细胞的多孔微载体为黑色，未长细胞的多孔微载体仍为本白色。
2.结晶紫染色法：取样5ml于10ml试管中，待多孔微载体沉降后用吸管尽可能多地吸出上清，尔后加入等量的含0.1％结晶紫的0.1mol/L柠檬酸溶液，每隔1h用吸管吹打、摇荡，置于37℃下3小时后，摇匀待微载体稍沉降后，用吸管紧靠液面吸取适量液体于血球计数板上，数出被染成深紫色的细胞核数。
实施例2、无血清培养基的制备
细胞培养密度大于2×106细胞/mL后，可以逐渐换用无血清培养基。无血清培养基有两种：一种为生长型无血清培养基，当细胞密度大于2×106细胞/mL后，用这种培养基培养CHO细胞，其比生长速率约为0.22d-1；另一种为表达型无血清培养基，当细胞密度大于107细胞/mL后，用这种培养基培养CHO细胞，其比生长速率约为0.11d-1，较低的生长速率有利于维持高密度培养条件下的细胞密度的相对稳定，对保持溶氧水平和细胞表达水平有利。
1、生长型无血清培养基的制备：
(1)成分及含量见表2。
表2 配制10L生长型无血清培养基成分一览表
| 成分 | 称取量 | 成分 | 称取量 |
| DMEM/F12(1∶1) | 156g | 葡萄糖 | 20g-60g |
| 碳酸氢钠 | 10g-20g | 蛋白胨 | 10g |
| 谷氨酰胺 | 5g | 6-氨基己酸 | 6.5g |
| 脯氨酸 | 110mg | 亮氨酸 | 500mg |
| 天冬氨酸 | 70mg | 半胱氨酸 | 320mg |
| 甲硫氨酸 | 600mg | 丝氨酸 | 300mg |
| 甘氨酸 | 75mg | 叶酸 | 100mg |
| 维生素B1 | 500mg | 维生素B2 | 100mg |
| 维生素B6 | 500mg | 维生素B12 | 50mg |
| 维生素C | 1000mg | 肌醇 | 2000mg |
| 烟酰胺 | 500mg | 胰岛素 | 800U |
| 转铁蛋白 | 25mg | 乙醇胺 | 20mg |
| FeSO4·7H2O | 10mg | ZnSO4 | 20mg |
(2)制备方法
按表2称取各成分于10L无菌无热源的容器中，加入10L纯净水搅拌溶解，用0.22μm滤膜过滤除菌。
2、表达型无血清培养基的制备：
(1)成分及含量见表3。
表3 配制10L表达型无血清培养基成分一览表
| 成分 | 称取量 | 成分 | 称取量 |
| DMEM/F12(1∶1) | 156g | 葡萄糖 | 20g-60g |
| 碳酸氢钠 | 10g-20g | 蛋白胨 | 10g |
| 谷氨酰胺 | 5g | 6-氨基己酸 | 6.5g |
| 脯氨酸 | 110mg | 亮氨酸 | 500mg |
| 天冬氨酸 | 70mg | 半胱氨酸 | 320mg |
| 甲硫氨酸 | 600mg | 丝氨酸 | 300mg |
| 甘氨酸 | 75mg | 叶酸 | 100mg |
| 维生素B1 | 1000mg | 维生素B2 | 200mg |
| 维生素B6 | 1000mg | 维生素B12 | 100mg |
| 维生素C | 2000mg | 肌醇 | 2000mg |
| 烟酰胺 | 500mg | 胰岛素 | 400U |
| FeSO4·7H2O | 10mg | ZnSO4 | 20mg |
(2)制备方法
按表3称取各成分于10L无菌无热源的容器中，加入10L纯净水搅拌溶解，用0.22μm滤膜过滤除菌。
用无血清培养基培养杂交瘤细胞时，在细胞密度大于5×106cells/mL后换用表达型培养基，可以在表3的基础上添加5×10-5mol/L巯基乙醇。
实施例3、生物反应器高密度长期培养基因重组CHO细胞并高效表达基因重组尿激酶原(rhPro-UK)
一、纤维素多孔微载体预处理，见实施例1。
二、细胞接种：将处理好的多孔微载体按1-1.5g/L的浓度加到搅拌瓶中，并加入含1％血清的培养基。在方瓶和转瓶中培养的贴壁细胞Pro-UK的基因重组CHO细胞系CL-11G(见中国专利，专利号为ZL96119836.2，国际专利主分类号C12N 15/58)，经0.25％的胰酶消化，用培养基吹打制成细胞悬液，直接接种到搅拌瓶中，接种密度需大于2×105细胞/mL，最好接种密度为5×105细胞/mL。接种后5h内，搅拌转速一般为(20-40)r/min，以让细胞较充分接触多孔微载体，随后可将转速提高至(50-60)r/min，培养温度为37.0℃±0.1℃。
三、细胞驯化：将生长在多孔微载体上的细胞悬液在搅拌瓶中逐级放大培养，培养3d后，可根据培养基中葡萄糖浓度适量换液，培养条件为温度37.0℃±0.1℃，pH值7.0±0.05，转速50-60r/min，至细胞密度大于5×106细胞/mL，换液量一般为1/2-1个培养体积；并将培养基中的血清含量逐渐降到0％，以驯化细胞适应无血清培养基。
四、细胞培养：将驯化好的种子细胞接种到30L Biostat UC(工作体积为20L，B.Braun，德国)无泡通气搅拌式反应器中，接种密度一般为106细胞/mL，先用无血清生长型培养基，控制pH＝7.0±0.05，溶氧(DO)＝20％-40％，温度＝37.0℃±0.1℃，搅拌转速为70rpm-90rpm，多孔微载体的浓度为2g/L-4g/L培养基。采用批式换液连续培养方式，在细胞密度大于107细胞/mL后，改用无血清表达型培养基，每天通过细胞截留系统换液1-1.2个工作体积，将微载体截留在反应器中，收获含产品的上清并加入等量新鲜培养基。为保持长期培养细胞的活力，并维持高密度培养条件下细胞的表达水平，当多孔微载体中长满细胞后，在细胞表达水平急剧下降前，用新多孔微载体部分更换长满细胞的多孔微载体。微载体的更换量和更换频率视细胞表达水平而定。一般地，如果一次更换1/2-2/3的多孔微载体，可以维持细胞良好生长1个月以上，而如果每次更新1/4左右的微载体，一般每隔15d左右就需更换部分微载体。采用这种培养模式，细胞密度可一直维持在(1-2)×107细胞/mL，活细胞比例可维持在90％-95％，培养上清中Pro-UK浓度可以维持在50mg/L-100mg/L，每天可收获上清20L-25L，可获得产品(1-2.5)g/d，整个培养时间可维持在3个月以上。
实施例4、生物反应器高密度培养鼠-鼠杂交瘤细胞3G7-anti-Pro-UK生产抗尿激酶原单克隆抗体
一、纤维素多孔微载体预处理，见实施例1。
二、细胞接种：将处理好的多孔微载体按1-1.5g/L的浓度加到搅拌瓶中，并加入含1％血清的培养基。将分泌抗尿激酶原抗体的鼠-鼠杂交瘤细胞系3G7-anti-scuPA细胞悬液(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，北京市海淀区中关村北一条13号，100080，电话：010-62542758，保藏日为2003年9月8日，保藏号为CGMCC No.0999，建议的分类命名为3G7-anti-scuPA鼠-鼠杂交瘤细胞系)。直接接种到搅拌瓶中，接种密度需大于5×105细胞/mL。接种后5h内，搅拌转速一般为(20-40)r/min，以让细胞较充分接触多孔微载体，随后可将转速提高至(50-60)r/min，培养温度为37.0℃±0.1℃。
三、细胞驯化
将生长在多孔微载体上的细胞悬液在搅拌瓶中逐级放大培养，培养3d后，可根据培养基中葡萄糖浓度适量换液，培养条件为温度37.0℃±0.1℃，pH值7.0±0.05，转速50-60r/min，至细胞密度大于5×106细胞/mL，换液量一般为1/2-1个培养体积；并将培养基中的血清含量逐渐降到0％，以驯化细胞适应无血清培养基。
四、细胞培养
将驯化后的细胞悬液直接接种到5L搅拌式反应器(Biostat CT5，B.Braun公司，德国)中培养，接种密度一般为106细胞/mL，先用无血清生长型培养基，控制pH＝7.0±0.05，溶氧(DO)＝20％-40％，温度＝37.0℃±0.1℃，搅拌转速为70rpm-90rpm，多孔微载体的浓度为2g/L-4g/L培养基。采用批式换液连续培养方式，在细胞密度大于107细胞/mL后，改用无血清表达型培养基，每天通过细胞截留系统换液1-1.2个工作体积，将微载体截留在反应器中，收获含产品的上清并加入等量新鲜培养基。采用本发明中的培养模式，细胞密度可达1×107细胞/mL，活细胞比例可维持在90％-95％，培养上清中抗体滴度一般可达1∶150000-1∶300000，整个培养时间可维持在2个月以上。
Claims (11)
1、动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法，包括如下步骤：
(1)纤维素多孔微载体预处理：将纤维素多孔微载体用0.1mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液(PBS)浸泡4h后，倾去PBS，再用PBS洗涤3次；121℃高压灭菌30min后，吸出PBS，用DMEM/F12培养基洗涤2次后置4℃备用；
(2)细胞接种：搅拌瓶中加入处理好的多孔微载体和含血清培养基，将细胞悬液按所需接种密度接种到搅拌瓶中培养，培养条件为温度37.0℃±0.1℃，溶氧20％-40％，pH值7.0±0.05，转速20-100r/min；
(3)细胞驯化：将生长在多孔微载体上的细胞悬液在搅拌瓶中逐级放大培养，并将培养基中的血清含量逐渐降到0％，培养条件为温度37.0℃±0.1℃，溶氧20％-40％，pH值7.0±0.05，转速20-100r/min，至细胞密度大于5×106细胞/mL，换液量一般为1/2-1个培养体积；
(4)细胞培养：将细胞悬液转移至反应器中逐级放大培养，使用无泡通气供氧系统，采用批式换液连续培养工艺，定期更新部分微载体，对细胞进行无血清培养。
2、根据权利要求1所述的动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法，其特征在于：所述纤维素多孔微载体是Cytopore-2。
3、根据权利要求1所述的动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法，其特征在于：所述(2)细胞接种步骤中多孔微载体的浓度为1-4g/L。
4、根据权利要求1所述的动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法，其特征在于：所述(2)细胞接种步骤中血清培养基的浓度为2％。
5、根据权利要求1所述的动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法，其特征在于：所述(2)细胞接种步骤中细胞悬液的接种密度为2×105-5×105细胞/mL。
6、根据权利要求1所述的动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法，其特征在于：所述(4)细胞培养步骤中的转移是指使用管道将长满细胞的多孔微载体直接导入下一级反应器中。
7、根据权利要求1所述的动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法，其特征在于：所述(4)细胞培养步骤中的反应器中预先加入适量培养基和经过处理的多孔微载体。
8、根据权利要求1所述的动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法，其特征在于：所述(4)细胞培养步骤采用批式换液连续培养是指每天通过细胞截留系统换液1-1.2个工作体积，将微载体和细胞截留在反应器中，收获含产品的上清并加入等量新鲜培养基。
9、根据权利要求1所述的动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法，其特征在于：所述(4)细胞培养步骤的无血清培养是指依次使用无血清生长培养基和无血清表达培养基对反应器内的细胞进行培养。
10、根据权利要求1至9中任何一项所述的动物细胞多孔微载体固定化高效培养方法，其特征在于：所述动物细胞为贴壁细胞或悬浮细胞。
11、用于动物细胞多孔微载体固定化高效培养的无血清培养基，其特征在于：该无血清培养基包括生长型无血清培养基和表达型无血清培养基，每10L培养基的成分及其含量分别见下表：
生长型无血清培养基成分及其含量
成分
称取量
成分
称取量
DMEM/F12(1∶1)
156g
葡萄糖
20g-60g
碳酸氢钠
10g-20g
蛋白胨
10g
谷氨酰胺
5g
6-氨基己酸
6.5g
脯氨酸
110mg
亮氨酸
500mg
天冬氨酸
70mg
半胱氨酸
320mg
甲硫氨酸
600mg
丝氨酸
300mg
甘氨酸
75mg
叶酸
100mg
维生素B1
500mg
维生素B2
100mg
维生素B6
500mg
维生素B12
50mg
维生素C
1000mg
肌醇
2000mg
烟酰胺
500mg
胰岛素
800U
转铁蛋白
25mg
乙醇胺
20mg
FeSO4·7H2O
10mg
ZnSO4
20mg
表达型无血清培养基成分及其含量
成分
称取量
成分
称取量
DMEM/F12(1∶1)
156g
葡萄糖
20g-60g
碳酸氢钠
10g-20g
蛋白胨
10g
谷氨酰胺
5g
6-氨基己酸
6.5g
脯氨酸
110mg
亮氨酸
500mg
天冬氨酸
70mg
半胱氨酸
320mg
甲硫氨酸
600mg
丝氨酸
300mg
甘氨酸
75mg
叶酸
100mg
维生素B1
1000mg
维生素B2
200mg
维生素B6
1000mg
维生素B12
100mg
维生素C
2000mg
肌醇
2000mg
烟酰胺
500mg
胰岛素
400U
FeSO4·7H2O
10mg
ZnSO4
20mg
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