CN110257319A

CN110257319A - 一种微载体上细胞维持培养的培养液及方法

Info

Publication number: CN110257319A
Application number: CN201910648190.0A
Authority: CN
Inventors: 付正莉; 张文健; 娄晋宁
Original assignee: Suzhou Rui Lai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Rui Lai Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2019-09-20

Abstract

本发明提供一种微载体上细胞维持培养的培养液及方法。所述维持培养液是在基础培养基的基础上添加0.5~5%的胎牛血清、2mM谷氨酰胺和50μg/ml~500μg/ml的氯化胆碱。所述维持培养方法是当微载体培养的细胞在生长培养基中达到对数生长期后，换成本发明提供的维持培养液，并降低培养温度至32℃‑35℃继续培养。本发明的维持培养液配方和维持培养方法简单易行，可以使细胞在微载体上维持更多天而不至于生长汇合后凋亡和脱落，不仅节约成本，而且有利于微载体培养细胞的后期使用。

Description

一种微载体上细胞维持培养的培养液及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种微载体上细胞维持培养的培养液及方法。

背景技术

微载体细胞培养技术由Van Wezel 于1967年最先开发。这一技术的出现使大规模培养贴壁细胞成为可能。目前这一技术已在用细胞作为基质的生物制品生产中得到广泛应用，随着细胞治疗技术的发展，微载体细胞培养技术有望在更多领域发挥作用，同时也要求微载体上培养的细胞能够维持长时间的存活和功能。

大规模细胞培养扩增的技术关键在于细胞培养条件的优化、减少外界环境对其造成的影响，使细胞能够在保持良好功能和较高存活率的情况下维持更久。与传统的培养细胞方法相比，利用微载体大规模培养细胞具有明显的优势：（1）比表面积大，培养基利用率高；（2）结合悬浮培养与单层培养的优点；（3）温度、pH、CO₂等环境条件易检测和监控；（4）细胞生长环境均一。经过几十年的发展，微载体培养技术经过逐步改进，已在细胞工程领域发挥作用。

微载体培养细胞生长影响因素有很多，总体分为三个方面即：微载体、生长环境、细胞类型。细胞方面如细胞的生长状态、细胞的类型；微载体方面如微载体类型、表面状态及表面吸附的分子离子等；最重要的一方面为细胞生长环境，如pH、温度、培养基成分、代谢废物等将显著影响细胞在微载体上的生长状况。优化培养条件以为细胞提供更合适的生长环境在大规模的微载体细胞培养中尤为重要。降低培养温度和血清浓度以减缓细胞代谢是维持培养阶段的常用的手段。

亚低温培养细胞被报道是一种简单的长时间维持细胞培养方法，可以提高细胞存活率，减少死细胞的裂解，降低营养消耗率，提高生产力，进而提高重组治疗蛋白的生产。有文献报道利用双相培养进一步优化亚低温培养方法。双相培养是指细胞在37度培养，等达到一定的活细胞密度后，降低温度以延长细胞寿命。降低温度后，葡萄糖和谷氨酰胺的消耗率、乳酸和氨的产量以及葡萄糖的乳酸产量均显著降低。

细胞培养中血清是重要元素，能够促进细胞生长，提供细胞生长所需的各种因子。当培养细胞降低血清浓度时，细胞会出现生长减慢、凋亡率增加、贴壁性能降低等。当大规模培养细胞时，血清则导致较高的成本。当细胞生长密度达到一定程度时，降低血清浓度，可一定程度维持细胞状态，降低生产成本。通过改变培养基中的成分，使细胞贴壁正常，可使细胞短时间低血清培养。

不同细胞类型的生长要求不同，紧靠单纯降低温度和血清浓度往往达不到理想效果。大规模细胞培养过程中，如何做到更好地且更长时间维持细胞状态，以利于收获更多分泌产物，或有更长时间利用细胞进行后续应用，均具有很强实用价值。

发明内容

为解决微载体细胞维持培养的问题，本发明目的之一在于提供一种微载体上细胞维持培养的培养液；本发明的另一个目的是提供利用本发明的培养液维持微载体细胞长期存活的方法。本发明的维持培养液配方和维持培养方法简单易行，可以使细胞在微载体上维持更多天而不至于生长汇合后凋亡和脱落，不仅节约成本，而且有利于微载体培养细胞的后期使用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种微载体上细胞维持培养的培养液，该培养液为基础培养基中加入体积分数0.5-5%的胎牛血清、2mM谷氨酰胺、50-500μg/ml的氯化胆碱。

优选的，所述微载体上细胞维持培养的培养液包括0.5%-1%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100μg/ml~400 μg/mL氯化胆碱。

最优选的，所述微载体上细胞维持培养的培养液包括：1%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、250 μg/mL氯化胆碱。

本发明还提供一种微载体上细胞维持培养的方法，其中微载体上培养的细胞包括但不局限于人肝脏来源的细胞，例如永生化人肝细胞、人肝脏肿瘤细胞及人肝窦内皮细胞等。

一种微载体上细胞维持培养的方法，包括以下步骤：

（1）利用常规平面培养容器培养细胞，达到一定数量后接种至微载体上；

（2）使用生长培养基，将微载体细胞在37℃、合适的CO₂和O₂分压下培养至对数生长期。其中生长培养基中胎牛血清浓度根据细胞类型不同而有所不同，一般细胞培养的血清浓度在5%~20%，常用细胞系的培养基血清浓度为10%；

（3）细胞生长至对数生长期后将培养液更换为本发明提供的维持培养液，并降低培养温度至32℃-35℃继续培养。

优选地，维持培养肝脏来源的细胞时，培养温度降为34度。在34度培养时，细胞代谢减缓、营养物质消耗减慢，同时也能保持细胞的高密度和高活力，延长微载体细胞维持时间。

本发明的有益效果：

综上所述，本发明的有益效果体现在：

1、本发明提供的微载体上细胞维持培养的培养液配方简单，效果良好：配方中降低了血清浓度，同时添加氯化胆碱，在降低细胞代谢的同时促进细胞在微载体上的粘附和存活；

2、将本发明提供的培养液和亚低温培养联合的方法进一步促进了微载体上细胞的更好维持，方法操作简单，易于实现。

附图说明

图1：不同培养条件对人肝癌细胞系Bel-7402在微载体上维持情况的影响。纵坐标表示细胞数，横坐标表示培养天数。1为实验组，2为对照组。实验条件见实施例4。

图2：不同培养条件对永生化人肝细胞IHH在微载体上维持情况的影响。纵坐标表示细胞数，横坐标表示培养天数。1为实验组，2为对照组。实验条件见实施例5。

图3：不同培养条件对人肝窦内皮细胞系LSEC在微载体上维持情况的影响。纵坐标表示细胞数，横坐标表示培养天数。1为实验组，2为对照组。实验条件见实施例6。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂耗材均为商业获得。

实施例1：

一种微载体上细胞维持培养的培养液，包含的成分和含量为：0.5%FBS、50μg/ml氯化胆碱、2mM谷氨酰胺。具体配制方法如下：

（1）称取氯化胆碱(购自Sigma公司)0.5g，用10mL灭菌注射用水充分溶解，配制成浓度50mg/mL的氯化胆碱母液，用0.2 μm针头滤器过滤除菌，贮存于-4℃待用；

（2）用移液枪精确量取2.5mL FBS（Lonsera公司）、500 μL氯化胆碱母液、5ml谷氨酰胺贮存液（200mM）到500mL DME/F12基础培养基（Sigma公司）充分混匀，放4℃备用。如需更大体积，按照上述比例增加各成分用量即可。

实施例2：

一种微载体上细胞维持培养的培养液，包含的成分和含量为：1%FBS、250μg/ml氯化胆碱、2mM谷氨酰胺。具体配制方法如下：

（1）称取氯化胆碱(sigma)0.5g，用10mL灭菌注射用水充分溶解，配制成浓度50mg/mL的氯化胆碱母液，用0.2 μm针头滤器过滤除菌，贮存于-4℃待用；

（2）用移液枪精确量取5 mL FBS（Lonsera公司）、 2.5mL氯化胆碱母液、5ml谷氨酰胺贮存液（200mM）到500mL DME/F12基础培养基（Sigma公司）充分混匀，放4℃备用。如需更大体积，按照上述比例增加各成分用量即可。

实施例3：

一种微载体上细胞维持培养的培养液，包含的成分和含量为：5%FBS、500μg/ml氯化胆碱、2mM谷氨酰胺。具体配制方法如下：

（2）用移液枪精确量取25 mL FBS（Lonsera公司）、 5mL氯化胆碱母液、5ml谷氨酰胺贮存液（200mM）到500mL DME/F12基础培养基（Sigma公司）充分混匀，放4℃备用。如需更大体积，按照上述比例增加各成分用量即可。

实施例4：

一种微载体上细胞维持培养的培养方法，包括以下步骤：

本实施例所用的培养液按照实施例1的配方和方法配制

（1）常规方法培养人肝癌细胞系BEL-7402，使用含10%胎牛血清的DMEM/F12作为生长培养基。达到一定数量后接种至微载体上，直至微载体培养的细胞在生长培养基中达到对数生长期，约1.0×10⁶cell/mL；

（2）细胞生长至对数生长期后更换上述实施例1的维持培养液，并降低培养温度至32℃继续培养。以使用生长培养基、37℃培养为对照组；

（3）培养期间每隔一天更换培养液，观察微载体上细胞数目变化；

（4）微载体上细胞数：采用结晶紫染色法检测微载体上细胞数。具体地，待检测的微载体细胞悬液用D-Hanks溶液洗涤，弃上清，将微载体与0.1%结晶紫工作液以1:10（V/V）混合均匀，漩涡振荡器振荡混匀，然后在37℃孵育1h，孵育后，剧烈震荡使细胞核释放出来，待微载体自然沉降，吸取上清液（含细胞核）到一干净离心管中，然后用血球计数板计数被染成淡紫色的释放的细胞核，根据总体积技术细胞数。

试验结果见图1，结果表明，本实施例的微载体细胞维持培养液能显著延长细胞在微载体上维持时间。

实施例5：

一种微载体上细胞维持培养的培养方法，包括以下步骤：

本实施例所用的培养液按照实施例2的配方和方法配制

（1）常规方法培养永生化人肝细胞（IHH），使用含10%胎牛血清的DMEM/F12作为生长培养基。达到一定数量后接种至微载体上，直至微载体培养的细胞在生长培养基中达到对数生长期，约1.0×10⁶细胞/mL；

（2）细胞生长至对数生长期后更换上述实施例2的维持培养液，并降低培养温度至34℃继续培养。以使用生长培养基，37℃培养为对照组；

（4）微载体上细胞数：结晶紫染色检测细胞数，具体检测方法同实施例4。

试验结果见图2，结果表明，本实施例的微载体细胞维持培养液能显著延长细胞在微载体上维持时间。

实施例6：

一种微载体上细胞维持培养的培养方法，包括以下步骤：

本实施例所用的培养液按照实施例3的配方和方法配制

（1）常规方法培养人肝窦内皮细胞（LSEC），使用含10%胎牛血清的DMEM作为生长培养基。当LSEC细胞生长达到一定数量后接种至微载体上，直至微载体培养的细胞在生长培养基中达到对数生长期，约1.0×10⁶cell/mL；

（2）细胞生长至对数生长期后更换上述实施例3的维持培养液，并降低培养温度至35℃继续培养。以使用生长培养基，37℃培养为对照组；

试验结果见图3，结果表明，本实施例的微载体细胞维持培养液能显著延长细胞在微载体上维持时间。

Claims

1.一种微载体上细胞维持培养的培养液，其特征在于所述维持培养液是在基础培养基的基础上添加0.5~5%的胎牛血清、2mM谷氨酰胺和50μg/ml~500 μg/mL的氯化胆碱。

2.根据权利要求书1所述的一种微载体上细胞维持培养的培养液，其特征在于基础培养基中添加成分比例优选为：0.5%-1%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100μg/ml~400 μg/mL氯化胆碱。

3.根据权利要求书1所述的一种微载体上细胞维持培养的培养液，其特征在于基础培养基中添加成分比例最优选为：1%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、250 μg/mL氯化胆碱。

4.根据权利要求书1所述的一种微载体上细胞维持培养的培养液，其特征在于所述的细胞包括但不限于人肝脏来源的细胞，例如永生化人肝细胞、人肝脏肿瘤细胞及人肝窦内皮细胞等。

5.一种微载体上细胞维持培养的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)利用常规方法培养细胞，达到一定数量后接种至微载体上，直至微载体培养的细胞在生长培养基中达到对数生长期；

(2)细胞生长至对数生长期后更换本发明提供的维持培养液，并降低培养温度至32℃-35℃继续培养。

6.根据权利要求5所述的一种微载体上细胞维持培养的方法，其特征在于所述的维持培养温度优选为34度。