CN1316014C - 骨髓间充质干细胞的规模化制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种骨髓间充质干细胞的规模化制备方法。具体包括如下步骤：1.MSCs分离培养，2.MSCs的微载体系统悬浮培养，3.收获细胞。采用本发明的方法，可以消除常规静态培养系统中的面积限制以及营养物、代谢副产物的浓度梯度，避免了频繁的传代操作，有利于细胞生长和保持干细胞特性，采用生物反应器培养，可收获1×10⁹细胞，真正实现规模化制备骨髓间充质干细胞，为工程化组织构建、细胞治疗、基因治疗或其它科学研究提供大量的种子细胞。

Description

骨髓间充质干细胞的规模化制备方法

技术领域

本发明涉及一种骨髓间充质干细胞的规模化制备方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)是存在于骨髓基质系统中的组织干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，在特定的理化环境和细胞因子诱导下能分化为成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、成肌细胞等多种间充质组织细胞。随着细胞生物学和组织工程学的发展，利用MSC的这些特性，将其作为种子细胞用于治疗修复组织缺损已成为当前研究的热点。人体自身无法修复的组织缺损通常体积较大，因此组织构建需要大量的种子细胞。然而MSCs在骨髓中含量很少，大约每10⁴～10⁵个骨髓单个核细胞中才有一个MSC，以骨组织工程为例，构建1cm³的骨至少需要10⁷个间充质干细胞，而5ml骨髓样品原代培养后只能获得约1～3×10⁵个干细胞，远远无法满足组织构建的需要，因此如何得到大量的MSC成为临床应用亟需解决的问题。

理论上干细胞具有无限增殖能力，MSCs在体外传代培养过程中也表现出高度的扩增能力，这为其应用于细胞治疗和基因治疗提供了基础。但是由于干细胞增殖分化的调控机制尚未阐明，体外培养时MSCs的未分化状态只能维持有限的时间，随着培养时间延长、传代次数增加，MSCs增殖能力下降，形态由长梭形变为宽大扁平，逐渐丧失多向分化能力，这已为国内外众多的研究者证明(Paolo Bianco，Mara Riminucci et al.Bonemarrow stromal stem cells：nature，biology，and potential applications.StemCells 2001，19：180-192；Andrea Banfl，Anita Muraglia.Proliferation kineticsand differentiation potential of ex vivo expanded human bone marrow stromalcells：implication for their use in cell therapy.Experimental hematology.2000，28：707-715)。

目前体外扩增MSCs普遍采用静态培养方法，在孔板或平皿中进行，细胞长至汇合后将其从生长表面消化下来，再进行传代培养。采用这种扩增方式一方面受到方瓶或平皿生长表面的限制，要得到足够数量的细胞往往需要多次传代和扩增，过程繁琐，容易污染；另一方面由于静态系统中存在营养物和代谢副产物的浓度梯度，培养环境不均一，不利于细胞的生长，而在动态系统中营养物混合均匀，培养环境相对稳定，因此更有利于细胞的生长和胞外基质的分泌。目前对MSCs的生物学特性了解得还远远不够，有关扩增的研究仍处于探索阶段。很多研究者发现，在体外培养过程中，MSCs的扩增能力与接种密度有一定的关系。在较低的接种密度下细胞实现了更高的扩增倍数。Colter等人发现，以1.5或3cells/cm²的密度接种时，细胞在2周内可扩增600～2000倍，仍然维持了干细胞特性。以此计算一份骨髓样品培养后传代三次可获得的细胞数目达10¹³，相当于人体细胞的总和(David C Colter，Reiner Class.Rapid expansion of recyclingstem cells in culture of plastic-adherent cells from human bone marrow.PNAS，2000，97(7)：3213-3218)。但是这种采用极低密度接种以实现MSCs迅速扩增的方法是以大量的培养容器、高强度的实验操作为前提的，推广应用有诸多不便，几乎无法实现。以常用的100mm培养皿为例，如果以3cells/cm²的密度接种，按每代扩增2000倍计算，要达到10¹³cells共需10⁷个培养皿，这显然不可能。

另外一些研究人员从细胞因子的角度寻找促进MSCs增殖的方法。美国专利5766950公开了一种采用酸性成纤维细胞生长因子和肝素协同作用促进MSCs增殖的方法，添加后明显提高细胞的增殖速度以及传代次数。碱性成纤维细胞生长因子也是研究较多的一种对细胞增殖有促进作用的细胞因子。这些细胞因子作用机制尚未完全阐明，对干细胞的增殖及分化的影响十分复杂，这就给临床应用安全性的评估带来困难。因此，建立经济高效且规模化的MSCs扩增方法已成为MSCs研究开发和临床应用的关键。

微载体具有比表面积大的特点，每克CT-3微载体能够提供2700cm²的生长表面，是贴壁细胞大规模培养普遍采用的方法。将微载体用于骨髓间充质干细胞扩增的研究尚未普遍开展。Qiu Q等人采用Cytodex 3微载体在旋转反应器中培养鼠骨髓基质细胞，考察了动态条件下胞外基质的分泌情况。结果表明，鼠骨髓基质细胞可在微载体表面贴附生长，这意味着有可能通过微载体系统实现骨髓间充质干细胞的大规模培养(Qiu Q，Ducheyne P，Gao H，et al.Formation and differentiation of three-dimensional rat marrowstromal cell culture on microcarriers in a rotating-wall vessel.TissueEngineering，1998，4(1)：19-34)。

综上所述，目前还没有十分有效的扩增MSCs的方法，严重限制了其在组织工程、细胞治疗和基因治疗中的应用。微载体培养系统为大规模扩增骨髓间充质干细胞提供了新的途径。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是公开一种骨髓间充质干细胞的规模化制备方法，以满足有关领域的需要。

发明的技术构思是这样的：

MSCs扩增的主要难题是无法保持干细胞特性：随培养时间延长细胞形态改变，增殖能力降低，丧失多向分化能力。有关MSCs体外培养过程中干细胞特性丢失的原因有种种猜测。既然在低密度条件下细胞每代能够扩增数百乃至数千倍仍然保持了多向分化潜能，这就说明并不是由于细胞分裂次数达到极限开始衰老所致，更可能是由于培养环境引起了细胞基因表达的变化，因此需要改善细胞的培养环境、缩短MSCs的体外培养时间，这样更有利于干细胞特性的保持。MSCs属于贴壁依赖细胞，细胞之间存在接触抑制，体外培养时生长面积在一定程度上限制了细胞的扩增倍数。细胞长至汇合后需要消化传代才能继续增殖，频繁的传代操作对细胞有不利影响，而且细胞消化后重新贴壁生长需要较长的延迟期，这就延长了细胞的体外培养时间。微载体是常用的贴壁细胞培养载体，能够提供大的比表面积，可以在转瓶和生物反应器中搅拌悬浮培养，不但有利于营养物的传递，而且可以提供类似于体内环境的三维立体环境，利于细胞的生长及胞外基质的分泌。微载体培养系统操作简单，易于放大，与静态培养相比扩增相同数目细胞所需的时间可大大缩短。

本发明的方法包括如下步骤：

1.MSCs分离培养

采用常规的方法从骨髓细胞悬液中分离单个核细胞，以1～5×10⁵cells/cm²的密度接种在添加了10～20％胎牛血清的α-MEM中进行原代培养，12～24小时后更换培养液，除去未贴壁细胞，此后每1～3天换液一次。原代细胞长至汇合后以0.25％胰酶+0.02％EDTA消化细胞，视收获细胞数目而决定是否需要再次扩增。一般原代或一代收获的细胞即可满足转瓶培养的需要，也可应用生物反应器进行更大规模的培养和扩增；。

所说的从骨髓细胞悬液中分离单个核细胞的方法可采用文献公开的方法(David C.Colter，Reiner Class，Carla M.DiGirolamo，et al.Rapid expansionof recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bonemarrow.PNAS，2000，97(7)：3213-3218)。

2.MSCs在微载体系统中悬浮培养

细胞以0.5～2.5×10⁵cells/mL密度接种于预先硅化过的搅拌悬浮培养装置中，与充分浸泡并灭菌的CT-3微载体共同培养。微载体用量为2～10mg/ml，采用10～30rpm转速进行接种，6～24小时后提高转速至40～80rpm进行培养。转瓶培养装置及其磁力搅拌系统置于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中，生物反应器系统设定操作条件为：pH7.0～7.2，温度37℃，溶氧为30％～50％空气饱和度。培养过程中的培养基更换速率依据细胞生长密度、营养物消耗速率和副产物生成速率确定。

预先硅化过的搅拌悬浮培养装置在文献中已有公开的报道，为一种常规的装置(Bok-Hwan Chun，Soo-H Chung.Attachment characteristics ofnormal human cells and virus-infected cells on microcarriers.Cytotechnology，2001，37：1-12.)。

3.收获细胞

细胞长满微载体后，以胰酶消化细胞，或以胶原酶消化微载体表面包被的胶原，使细胞从微载体表面脱落下来，通过静止沉降法分离微载体和细胞。

采用本发明的方法，可以消除常规静态培养系统中的面积限制以及营养物、代谢副产物的浓度梯度，避免了频繁的传代操作，有利于细胞生长和保持干细胞特性，采用生物反应器培养，可收获1×10⁹细胞，真正实现规模化制备骨髓间充质干细胞，为工程化组织构建、细胞治疗、基因治疗或其它科学研究提供大量的种子细胞。

附图说明

图1为兔MSCs在方瓶和转瓶中的生长曲线。

图2为兔MSCs在方瓶和转瓶中的的克隆形成率。

具体实施方式

实施例1

兔骨髓间充质干细胞的分离和原代培养

1月龄新西兰大耳白兔空气栓塞法处死，分离双侧股骨、胫骨，碎骨钳剪碎后冲出骨髓悬液，以Amersham Biosciences公司生产的percoll分离液密度梯度离心分离单个核细胞，PBS洗涤两次，用含10％胎牛血清的α-MEM培养基重新悬浮细胞，以2.5×10⁵cells/cm²的密度接种于100mm平皿，置于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中进行培养。24小时后更换培养液，除去未贴壁细胞，此后每2天换液一次。

实施例2

兔骨髓间充质干细胞的方瓶培养

原代细胞长至汇合后以0.25％胰酶+0.02％EDTA消化细胞，并计数，将细胞以5×10⁴cells/ml的密度接种于50ml方瓶中，置于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中进行培养，所用培养基为含10％胎牛血清的α-MEM，每2天换液一次。细胞扩增情况如图1所示，对培养结束后的细胞进行克隆形成率测定，结果如图2。

实施例3

兔骨髓间充质干细胞的微载体转瓶培养

转瓶硅化处理后按3mg/ml用量称取CT-3微载体，PBS清洗三次，灭菌后以含10％胎牛血清的α-MEM培养基浸泡过夜备用。

原代细胞大约10天左右长至汇合，以0.25％胰酶+0.02％EDTA消化细胞，并计数，一般原代收获细胞即满足微载体培养需要。将细胞以1×10⁵cells/ml的密度接种于转瓶，置于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中进行培养，所用培养基为含10％胎牛血清的α-MEM，加液量50ml，搅拌速率为20rpm。

24小时后贴壁完成，提高转速至40rpm进行培养，每天半量换液，3天后每天全换液。每天取样，结晶紫染色计数细胞核。细胞扩增情况如图1所示。对培养结束后的细胞进行克隆形成率测定，结果如图2。

培养结束后，停止搅拌，长满细胞的微载体迅速沉降，除去培养上清，用PBS缓冲液清洗微载体两次，加入15ml 0.25％胰酶消化细胞，搅拌2分钟，使细胞从微载体表面脱落下来，停止搅拌，加入5ml小牛血清，吸取含细胞和小牛血清的消化液，加入离心管中，1500rpm离心5分钟，倾去上清夜，获得兔骨髓间充质干细胞。

由图1可见，采用微载体和转瓶悬浮搅拌系统培养兔骨髓间充质干细胞，细胞密度可达到5×10⁵cells/ml，5倍于方瓶静态培养所能达到的细胞密度，大大减少了传代次数。而图2说明了转瓶培养的细胞与方瓶培养得到的细胞在克隆形成率方面没有明显差别。

实施例4

采用生物反应器和微载体系统规模化培养和扩增兔骨髓间充质干细胞

将兔骨髓间充质干细胞以1×10⁵cells/ml的密度接种到含有1.2升培养基(培养基为含10％胎牛血清的α-MEM)和5mg/ml微载体浓度的1.5升CelliGen生物反应器系统(美国New Brunswick Scientific公司)中进行培养。用空气、氧气、氮气和二氧化碳四种气体调节、控制培养基pH7.0、溶氧(DO)50％空气饱和度，反应器温度控制在37℃，接种细胞时设定转速25rpm，24小时后将转速加大到45rpm，使细胞混合均匀，到第4天时转速调至60rpm。每2天换液一次，从第4天起，每天半量换液，至培养结束。每天取样，以结晶紫染色，计算细胞数。细胞扩增情况如图1所示。对培养结束后的细胞进行克隆形成率测定，结果如图2。

由图1可见，采用微载体和生物反应器培养兔骨髓间充质干细胞，细胞密度可达到1×10⁶cells/ml，远远高于方瓶静态培养所能达到的细胞密度，其培养规模相当于方瓶培养的1000倍。而图2说明了反应器培养的细胞与方瓶静态培养得到的细胞在克隆形成率方面没有明显差别。

Claims (1)

1.一种骨髓间充质干细胞的规模化制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)MSCs分离培养

将从骨髓细胞悬液中分离的单个核细胞，以1～5×10⁵cells/cm²的密度接种接种在添加了10％胎牛血清的α-MEM中进行原代培养，24小时后更换培养液，除去未贴壁细胞，此后每1～3天换液一次，原代细胞长至汇合后以0.25％胰酶+0.02％EDTA消化细胞；

(2)MSCs的微载体系统悬浮培养

细胞以0.5～2.5×10⁵cells/ml密度接种于预先硅化过的搅拌悬浮培养装置中，与CT-3微载体共同培养，微载体用量为2～10mg/ml，采用10～30rpm转速进行接种，24小时后提高转速至40～60rpm进行培养，培养基为添加了10％胎牛血清的α-MEM，每天至每2天，半量换液至全换液，3～4天后每天半量换液至全换液；培养条件为37℃、5％CO₂、饱和湿度，生物反应器系统设定操作条件为：pH7.0～7.2，温度37℃，溶氧为30％～50％空气饱和度；

(3)收获细胞

细胞长满微载体后，以胰酶或胶原酶消化微载体表面包被的胶原，使细胞从微载体表面脱落下来，通过静止沉降法分离微载体和细胞。