CN104630269A - 磁性纳米颗粒介导igf-ⅰ基因转染的脂肪干细胞及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及关节软骨损伤修复领域，尤其涉及一种磁性纳米颗粒介导IGF-Ⅰ基因转染的脂肪干细胞及其制备方法。该方法包括ADSCs分离和培养、Fe₃O₄ MNPs的制备和体外转染三个步骤，本发明以氧化铁磁性纳米颗粒为载体介导的IGF-Ⅰ基因转染ADSCs实现IFG-Ⅰ过表达，并通过体外动态旋转磁场靶向提高干细胞归巢率，本研究中所用的氧化铁磁性纳米颗粒为非病毒型基因载体，具有安全无害、靶向性高、目的基因高效稳定表达等优点，能大幅度提高基因转染效率，更重要的是能够通过体外动态旋转磁场解决植入体内的支架内ADSCs归巢率低的问题，并能借助磁共振技术实现对干细胞在体内的定位追踪。

Description

磁性纳米颗粒介导IGF-Ⅰ基因转染的脂肪干细胞及其制备方法

技术领域

本发明涉及关节软骨损伤修复领域，尤其涉及一种磁性纳米颗粒介导IGF-Ⅰ基因转染的脂肪干细胞及其制备方法。

背景技术

关节软骨损伤作为一个基本的病理过程，几乎参与了所有临床常见的关节疾病病理变化早期阶段，如创伤性关节炎，类风湿性关节炎，股骨头坏死等。这些关节疾病虽然有着完全不同的病因和各异的病理变化过程，但在其病变早期都表现出相同的病理过程，即关节软骨的病变。如何能够在关节疾病病变早期控制软骨的损伤程度，尽早终止软骨进一步损伤，甚至完全磨损，尽早干预并促进软骨组织的修复，是治疗此类关节疾病的关键所在。然而，由于软骨组织内缺乏血管和淋巴分布，软骨细胞含量少，缺乏细胞分化所必须的祖母细胞且包埋于稠厚的细胞外基质中，缺乏迁徙能力，无法移动到损伤部位参与修复，因此其自我修复能力非常差，即使是微小的软骨缺损也难以自然修复。

目前临床上对于关节软骨损伤主要以手术治疗为主，包括：关节镜修复术、微骨折术、自体软骨移植术和自体软骨细胞移植术等。但是这些治疗方法临床疗效不够理想，且存在许多不足之处。其中关节镜修复术短期疗效较明显，但仅能延缓软骨磨损进程，无法促进软骨缺损修复，无法最终阻止关节炎的发生。微骨折术由于缺乏精确有效的定位和调控，且修复后形成的是以纤维软骨为主的混合组织，因此临床效果并不理想。自体软骨移植术和自体软骨细胞移植术目前临床较为常用，但存在着取材来源有限，供区感染、伤口难愈合，患者需遭受额外痛苦且不易接受等诸多问题。由于对关节软骨损伤缺乏有效的临床治疗方法，许多患者最后都进一步发展成为骨性关节炎，而作为临床治疗骨性关节炎唯一有效的人工关节置换术，其费用高昂，创伤大，并发症多，使用寿命有限，患者需遭受极大的身心痛苦和沉重的经济负担。由于此类关节疾病发病率高，致残性高，严重损害了患者的身体健康，危害巨大，因此被世界卫生组织定义为“第一致残疾病”。

组织工程技术的出现，为关节软骨损伤的治疗提供了一种全新的思路和方法。美国国家科学基金会于1987年首次提出了“组织工程”（tissue engineering）的概念，其基本原理是应用细胞生物学、生物材料和工程学的原理，研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的结构、功能的生物活性替代物。由于软骨组织中细胞成分单一，结构简单，只含有软骨细胞，因此组织工程技术非常适用于软骨缺损修复的研究。1977年，Green成功分离培养软骨细胞，并尝试与脱钙骨支架材料联合培养，为软骨组织工程研究的发展奠定了基础。1994年Vacanti等用分离的牛关节软骨细胞与可降解的生物材料在裸鼠皮下成功构建出透明软骨组织，此后软骨组织工程进入了快速发展阶段，我国科学家曹谊林等于1997年在裸鼠体内成功构建出具有皮肤覆盖的复杂三维空间结构的人耳廓形态软骨，标志着软骨组织工程研究迈向了一个新的台阶。此后，软骨组织工程技术迅速发展，成为了近十年来的研究热点。作为一门新兴的交叉学科，软骨组织工程的发展具有非常广阔的前景。

软骨组织工程的研究内容主要包括三个方面：支架材料、种子细胞和细胞因子。其中支架材料为种子细胞提供获取营养、气体交换、废物排泄和生长代谢的场所，种子细胞附着于支架材料上不断更新、代谢，分化繁殖新的细胞，细胞因子参与调控种子细胞代谢，促进细胞增殖、分化等，最终形成与正常软骨组织在形态和功能上完全一致且能正常代谢、增殖的新生软骨组织，从而达到治愈关节疾病的目的。目前，软骨组织工程研究的焦点主要集中在以下几个方面：三维生物支架材料的开发与研究，种子细胞的筛选和培养途径，干细胞归巢率的提高，各种细胞因子对种子细胞代谢、增殖的影响及其调控等。

目前软骨组织工程常用种子细胞包括软骨细胞和干细胞。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)是最早被研究的成体干细胞，可向骨组织、软骨组织、肌肉组织及神经组织等多种组织定向分化。但其取材创伤大，并发症多，且骨髓中含量低的特点限制了BMSCs的广泛应用，之后有学者从皮肤、肌肉、肝脏及滑膜等组织中均分离出与BMSCs具有类似生物学特性的间充质干细胞，也具有多向分化的能力。2001年日本学者Zuk从人体抽出的脂肪中获得了同样具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，称之为脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)。Ugarte等研究发现，ADSCs与BMSCs在细胞形态、生长动力学、细胞衰老性、表面标志、多向分化潜能以及外源基因的导入效率等方面没有明显区别。而且ADSCs能在多代培养后保持染色体核型和端粒转移酶活性不变；其在转化生长因子的诱导下可向软骨组织细胞分化，相比较而言，ADSCs具有以下优点：1.取材方便，创伤小，并发症少，病人易于接受；2.分离培养简单，容易获得；3来源充足，每1g脂肪组织可以获得5×10³干细胞，是lg骨髓组织获得干细胞的300倍。

细胞因子在ADSCs定向分化为软骨细胞的过程中起到了非常关键的作用。胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-Ⅰ, IGF-Ⅰ)能够促进软骨细胞增殖、再分化，保持软骨细胞的特异表型并抑制程序性凋亡，同时促进软骨基质合成代谢，抑制软骨基质的降解，是体内调节软骨蛋白聚糖合成最重要的生长因子。在软骨细胞体外培养中，IFG-Ⅰ能够增加蛋白聚糖的合成，使软骨蛋白聚糖的合成量达到与体内相当的水平。有研究表明IFG-Ⅰ能够诱导体外培养的ADSCs分化为软骨细胞。但外源性IGF-Ⅰ价格昂贵，稳定性不好，体内半衰期短，生物膜透过性差，且在游离状态下极易失活，从而限制了其有效性的发挥。应用基因转染技术使ADSCs自行大量分泌、表达特定的细胞因子，可以有效的促进ADSCs向软骨细胞分化，并且避免了免疫排斥反应等安全问题。近年来迅速成为了研究热点。而在基因转染技术中，安全且高效的基因转染载体是转染成功的关键。目前常用的基因转染载体主要分为病毒型和非病毒型,病毒型载体转染效率较高，但其潜在的致瘤性、装载容量有限和费用高等问题限制了其临床应用。非病毒型载体转染效率有待提高，但由于其可靠的生物安全性，近年来日趋受到关注。

干细胞归巢是指自体或外源性干细胞在多种因素的作用下趋向性迁移并定植到靶向组织参与组织修复的过程。目前的移植方式主要包括经静脉、经动脉和患处局部移植。近年来，随着干细胞治疗学的兴起，对于干细胞归巢的研究迅速升温。

然而，目前研究显示靶向组织中植入干细胞的归巢率非常低, 疗效有限，极大地影响了干细胞归巢技术在组织工程学中的应用。其主要的原因是难以确保足够数量的干细胞归巢定植至靶组织中。Barbash等对体外培养的BMSCs向梗死心肌的迁移归巢研究表明，在各时间段梗死心脏对MSCs的摄取率都低于1%，使得干细胞归巢的疗效大大降低。因此，如何促进和提高干细胞归巢率已成为干细胞治疗疾病的关键。

当将搭载有IGF-Ⅰ及种子细胞的复合支架植入动物模型体内时，由于极低的干细胞归巢率，再加上动物模型的日常活动及模型体内支架处的血液、关节液的流动，使得负载在支架内的靶细胞及细胞因子无法长期有效的聚集、增殖，严重影响了缺损软骨的正常修复速度和程度。如何通过适当有效的方法促进和提高干细胞归巢率，使干细胞牢固定位于特定损伤部位，并且维持细胞因子持续、高效释放以促进干细胞快速、稳定的定向分化、增殖和维持细胞表型，从而使损伤软骨尽早再生就成为了软骨组织工程学的关键所在。

磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles, MNPs)及以其为载体的基因转染技术的出现为解决以上问题提供了新的思路。MNPs是一类智能型的纳米磁性材料，属于非病毒型载体，研究表明MNPs能显著提高基因转染效率，且具有良好的生物相容性，对多种干细胞均无毒性，且对干细胞的表型、分化潜能无影响。MNPs既具有纳米材料的特质如粒径小、比表面积大、能被细胞吞噬等，又同时具有超顺磁性，能够响应磁场靶向应力，从而可以人为控制其在特定组织和细胞内的聚集和定位，并能作为标记探针实现对干细胞在体内的定位追踪。以MNPs为载体的基因转染技术既能够大幅提高转染效率，也能够借助MNPs的磁场靶向响应力特性极大地提高干细胞归巢率，同时又能作为标记物以追踪确认干细胞在体内的迁移情况。在软骨组织工程领域具有广阔的发展和应用前景。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种磁性纳米颗粒介导IGF-Ⅰ基因转染脂肪干细胞的方法，具有安全无害、靶向性高、目的基因高效稳定表达等优点，能大幅度提高基因转染效率，并能借助磁共振技术实现对干细胞在体内的定位追踪。本发明的另外一个目的是提供采用上述的方法获得的磁性纳米颗粒介导IGF-Ⅰ基因转染的脂肪干细胞。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种磁性纳米颗粒介导IGF-Ⅰ基因转染脂肪干细胞的方法，该方法包括以下的步骤：

一、ADSCs分离和培养

1）取脂肪组织，去除血管及其他组织，用含双抗的PBS缓冲液反复冲洗，去处杂质和血细胞；

2）用剪刀将脂肪组织充分剪碎后，置0.2%                                                型胶原酶中，37℃摇床100r/min消化 40min；消化用等体积的含10%胎牛血清的DMEM培养基中止；

3）反应液于800r/min离心 10min，弃去上层的脂肪及上清；沉淀用10%胎牛血清的DMEM培养基制成悬液，并用100um的筛网进行过滤以去除细胞团块；

4）细胞接种于 25cm培养瓶中，置37℃、5%的CO₂培养箱中常规培养，24h后换液，除去未贴壁细胞和剩余血细胞；细胞长满80%时用含0.01%EDTA的 0.25%胰酶消化，按照1:3传代培养；

二、Fe₃O₄ MNPs的制备

1）在250 mL的3颈瓶中加入100 mL 2-吡咯烷酮，10 mmol乙酰丙酮，除去空气，氩气保护下磁力搅拌，温度245℃下沸腾回流30 min；

2）停止加热，氩气继续保护冷却至室温；快速加入大量甲醇，得到黑色沉淀的磁流体；丙酮洗涤3次，60℃真空干燥后得到MNPs，干燥皿内存放；

三、 体外转染

1）将单层培养的ADSCs用胰蛋白酶消化，计数，接种在培养皿中， 37℃、5%CO₂培养箱中培养，在转染前12 h按6 U/ml加入睾丸透明质酸酶；

2）转染前先将MNPs与pcDNA3.1-hIGF-Ⅰ质粒混匀后室温下置于磁铁上30 min，MNPs与pcDNA3.1-hIGF-Ⅰ质粒的质量浓度均为5 mg/L，转染12 h后更换培养基，改用含有15%胎牛血清的DMEM培养基继续培养；培养12h后获得磁性纳米颗粒介导IGF-Ⅰ基因转染脂肪干细胞。

本发明还公开了采用上述的方法获得的磁性纳米颗粒介导IGF-Ⅰ基因转染的脂肪干细胞。

本发明由于采用了上述的技术方案，以氧化铁磁性纳米颗粒为载体介导的IGF-Ⅰ基因转染ADSCs实现IFG-Ⅰ过表达，并通过体外动态旋转磁场靶向提高干细胞归巢率，本研究中所用的氧化铁磁性纳米颗粒为非病毒型基因载体，具有安全无害、靶向性高、目的基因高效稳定表达等优点，能大幅度提高基因转染效率，更重要的是能够通过体外动态旋转磁场解决植入体内的支架内ADSCs归巢率低的问题，并能借助磁共振技术实现对干细胞在体内的定位追踪。

附图说明

图1为氧化铁磁性纳米颗粒透射电镜图。

图2为氧化铁磁性纳米颗粒转染ADSCs普鲁士蓝染色图。

图3为氧化铁磁性纳米颗粒转染ADSCs的荧光显微镜显示图。

具体实施方式

实施例1 兔ADSCs分离和培养

乙醚麻醉后，无菌条件下取兔腹股沟部脂肪组织，去除血管及其他组织，用含双抗的PBS缓冲液反复冲洗，去处杂质和血细胞。用剪刀将脂肪组织充分剪碎后，置0.2%型胶原酶中，37℃摇床100r/min消化 40min;消化用等体积的含10%胎牛血清的DMEM培养基中止。反应液于800r/min离心 10min，弃去上层的脂肪及上清;沉淀用10%胎牛血清的DMEM培养基制成悬液，并用100um的筛网进行过滤以去除细胞团块。细胞接种于 25cm培养瓶中，置37℃、5%的CO₂培养箱中常规培养，24h后换液，除去未贴壁细胞和剩余血细胞。细胞长满80%时用0.25%胰酶(含0.01%EDTA)消化，按照1:3传代培养。

实施例2 氧化铁磁性纳米颗粒(Fe ₃ O ₄  MNPs)的制备与检测

1、Fe ₃ O ₄  MNPs的制备

在250 mL的3颈瓶中加入100 mL 2-吡咯烷酮，10 mmol乙酰丙酮，除去空气，氩气保护下磁力搅拌，温度245℃下沸腾回流30 min。停止加热，氩气继续保护冷却至室温。快速加入大量甲醇，得到黑色沉淀的磁流体。丙酮洗涤3次，60℃真空干燥后得到MNPs，干燥皿内存放。

、Fe ₃ O ₄  MNPs表征分析及形态学观察

用X-射线衍射(XRD)对MNPs进行物相分析。用pH 7. 0的PBS稀释Fe₃O₄ MNPs样本， 200W超声震荡3 min，滴样于铜网上，静置15 min后用透射电镜(TEM)观察分析MNPs形貌和粒度分布。醋酸铀、硝酸铅染色后用细胞电镜观察并拍照。用粒度分析仪检测MNPs的有效粒径和分散度。如图1所示，透射电镜：MNPs呈球形，表面光滑，外形规则，分散较均匀。测定其粒径为10-45nm，平均粒径：25士5.37nm。

、Fe ₃ O ₄  MNPs磁化强度检测

用原子吸收光谱仪检测MNPs的比饱和磁化强度、剩磁和矫顽力及铁离子含量。磁化强度检测：外磁场从-25000oe到25000oe扫描，测得饱和磁化强度为71.23451emu/g Fe，比饱和磁化强度67.56932emu/g，比剩余磁化强度为32.3252emu/g，剩磁为0.0094emu/g，矫顽力为0.498oe。

体外转染实验

将单层培养的ADSCs用胰蛋白酶消化，计数，接种在培养皿中，设定转染组和对照组， 37℃、5%CO₂培养箱中培养，转染组在转染前12 h按6 U/ml加入睾丸透明质酸酶。对照组不予转染。转染组转染前先将MNPs与pcDNA3.1-hIGF-Ⅰ质粒混匀后室温下置于磁铁上30 min，MNPs与pcDNA3.1-hIGF-Ⅰ质粒的质量浓度均为5 mg/L，转染12 h后更换培养基，改用含有15%胎牛血清的DMEM培养基继续培养。于转染12 h后使用荧光显微镜检测转染效率（如图3所示）。

Claims (2)

1.一种磁性纳米颗粒介导IGF-Ⅰ基因转染脂肪干细胞的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

一、ADSCs分离和培养

1）取脂肪组织，去除血管及其他组织，用含双抗的PBS缓冲液反复冲洗，去处杂质和血细胞；

2）用剪刀将脂肪组织充分剪碎后，置0.2%                                                型胶原酶中，37℃摇床100r/min消化 40min；消化用等体积的含10%胎牛血清的DMEM培养基中止；

3）反应液于800r/min离心 10min，弃去上层的脂肪及上清；沉淀用10%胎牛血清的DMEM培养基制成悬液，并用100um的筛网进行过滤以去除细胞团块；

4）细胞接种于 25cm培养瓶中，置37℃、5%的CO₂培养箱中常规培养，24h后换液，除去未贴壁细胞和剩余血细胞；细胞长满80%时用含0.01%EDTA的 0.25%胰酶消化，按照1:3传代培养；

二、Fe₃O₄ MNPs的制备

1）在250 mL的3颈瓶中加入100 mL 2-吡咯烷酮，10 mmol乙酰丙酮，除去空气，氩气保护下磁力搅拌，温度245℃下沸腾回流30 min；

2）停止加热，氩气继续保护冷却至室温；快速加入大量甲醇，得到黑色沉淀的磁流体；丙酮洗涤3次，60℃真空干燥后得到MNPs，干燥皿内存放；

三、 体外转染

1）将单层培养的ADSCs用胰蛋白酶消化，计数，接种在培养皿中，37℃、5%CO₂培养箱中培养，在转染前12 h按6 U/ml加入睾丸透明质酸酶；

2）转染前先将MNPs与pcDNA3.1-hIGF-Ⅰ质粒混匀后室温下置于磁铁上30 min，MNPs与pcDNA3.1-hIGF-Ⅰ质粒的质量浓度均为5 mg/L，转染12 h后更换培养基，改用含有15%胎牛血清的DMEM培养基继续培养；培养12h后获得磁性纳米颗粒介导IGF-Ⅰ基因转染脂肪干细胞。

2.权利要求1所述的方法获得的磁性纳米颗粒介导IGF-Ⅰ基因转染的脂肪干细胞。