CN112553148A - 一种用于培养肉种子细胞体外扩大培养的改良培养基及其应用 - Google Patents

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CN112553148A CN202011550587.5A CN202011550587A CN112553148A CN 112553148 A CN112553148 A CN 112553148A CN 202011550587 A CN202011550587 A CN 202011550587A CN 112553148 A CN112553148 A CN 112553148A
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朱浩哲
丁世杰
唐长波
徐幸莲
李春保
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Abstract

本发明提供一种用于培养肉种子细胞体外扩大培养的改良培养基,即培养肉目前最优的种子细胞：肌肉干细胞的体外扩大培养的改良培养基。改良后的培养基为添加有VC及其衍生物的细胞培养基，可以在体外扩大培养中获得正常培养基1000倍以上的细胞数量，并且更为重要的是，肌肉干细胞在体外长期连续传代，达到需要的细胞数量之后，仍能保持分化潜能。因此，改良培养基可以帮助体外大量扩培具有功能性的肌肉干细胞，较好地满足培养肉生产的对种子细胞的大规模需求。

Description

一种用于培养肉种子细胞体外扩大培养的改良培养基及其 应用
技术领域
本发明属于干细胞和动物细胞培养肉技术领域，具体地，涉及一种用于培养肉种子细胞体外扩大培养的改良培养基及其应用。
背景技术
培养肉是依据动物肌肉生长修复机理，利用其干细胞进行体外培养而获得的肉类，它不需要经过动物养殖，直接用细胞工厂化生产肉类。根据测算，相较于传统的畜牧业，培养肉产业能减少35％到60％的能耗、少占用98％的土地和少产生80％以上的温室气体。
培养肉在体外生产过程需要大量种子细胞的富集以及进一步分化得到可以使用的肌纤维，因此需求体外能扩增得到大量有功能的种子细胞。肌肉干细胞是目前培养肉种子细胞选择中的最具有潜力的一种细胞，除了在体外具有修复损伤的肌肉组织以及维持肌肉干细胞库的功能外，肌肉干细胞经体外分离后可以在体外进行培养，定向分化形成多核肌细胞，并表达肌肉特有的肌球蛋白重链。
目前公认的体外培养肌肉干细胞的培养基配方就是含有胎牛血清的F10基础培养基并添加10ng/ml的FGF。但是在此培养基的条件下，小鼠肌肉干细胞传代4、5代后就完全无法增殖，家畜类的，如猪、牛的肌肉干细胞在体外扩大培养过程中也同样面临着干性不断衰退的问题，传代后期的细胞增殖速度减缓，标记肌肉干细胞干性的PAX7阳性细胞下降以及标记分化成熟水平MyHC的表达下降。
细胞培养肉的生产首先需要体外大量扩培得到有功能的肌源性细胞，但是正常培养方式30天10代得到的肌肉干细胞仅扩增107倍，而制作一个85g汉堡需要约150亿个细胞，这意味着在不考虑后期分化潜能的情况下，理论上需要约1000到10000个初始细胞数量才能制作一个汉堡。目前的培养基体系无法避免体外扩大培养过程中的细胞干性衰退问题，无法满足细胞培养肉对种子细胞的数量和功能要求，产能太过低下，因此急需提供一种改善肌肉干细胞体外扩增效率，保持细胞干性的培养基体系。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种能够改善肌肉干细胞在体外扩大培养过程中的干性衰退并提高肌肉干细胞体外扩增效率的培养基。
本发明技术方案如下：
本发明的第一个目的是提供一种用于肌源性细胞体外长期扩大培养的改良培养基，所述改良培养基为添加有VC(维生素C)或VC衍生物Asc-2P(维生素C磷酸酯)的肌源性细胞生长培养基，所述肌源性细胞包括但不限于肌肉干细胞、肌肉祖细胞、肌肉前体细胞。
进一步的，所述肌源性细胞生长培养基包括79vol％基础培养基、20vol％胎牛血清、1vol％的青霉素链霉素双抗溶液以及FGF；
优选的，所述基础培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种
进一步的，所述肌源性细胞生长培养基中，FGF浓度为1-10ng/ml。
具体的，所述肌源性细胞生长培养基成分包括：20vol％胎牛血清、79vol％DMEM培养基、1vol％的青霉素链霉素双抗溶液以及1-10ng/ml成纤维细胞生长因子2(FGF)；
或者，所述肌源性细胞生长培养基成分包括：20vol％胎牛血清、79vol％MEM培养基、1vol％的青霉素链霉素双抗溶液以及1-10ng/ml成纤维细胞生长因子2(FGF)；
或者，所述肌源性细胞生长培养基成分包括：20vol％胎牛血清、79vol％DMEM/F12培养基、1vol％的青霉素链霉素双抗溶液以及1-10ng/ml成纤维细胞生长因子2(FGF)；
或者，所述肌源性细胞生长培养基成分包括：20vol％胎牛血清、79vol％F10培养基、1vol％的青霉素链霉素双抗溶液以及1-10ng/ml成纤维细胞生长因子2(FGF)；
以上所述青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素的含量均为10000U/ml，链霉素的含量均为10mg/ml。
进一步的，所述VC或VC衍生物Asc-2在肌源性细胞生长培养基中的浓度为50-200μmol/L。
本发明的第二个目的是提供VC或VC衍生物Asc-2P在促进肌源性细胞体外长期扩大培养过程中的增殖速度和/或维持肌源性细胞体外长期扩大培养过程中的分化能力中的应用，具体的，为将VC或VC衍生物Asc-2P添加到肌源性细胞生长培养基中，对肌源性细胞进行体外长期扩大培养。
进一步的，所述肌源性细胞生长培养基包括79vol％基础培养基、20vol％胎牛血清、1vol％的青霉素链霉素双抗溶液以及FGF；
优选的，所述基础培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种
进一步的，所述肌源性细胞生长培养基中，FGF浓度为1-10ng/ml。
进一步的，所述VC或VC衍生物Asc-2在肌源性细胞生长培养基中的浓度为50-200μmol/L。
本发明的第三个目的是提供前述的改良培养基在肌源性细胞体外长期扩大培养中的应用。
进一步的，前述的改良培养基在促进肌源性细胞体外长期扩大培养过程中的增殖速度和/或维持肌源性细胞体外长期扩大培养过程中的分化能力中的应用。
本发明的改良培养基在肌源性细胞体外长期扩大培养过程中维持分化潜能和增殖速度的研究，包括以下步骤：
(1)流式分选得到高纯度的猪肌源性细胞；
(2)将猪肌源性细胞分别接种到常规肌源性细胞生长培养基、添加有VC或VC衍生物Asc-2P的改良培养基的细胞培养皿中，并进行30天10代的换液传代培养，收集每代细胞的扩增倍数。
(3)将最后不断传代收获的肌源性细胞接种到分化培养皿中，用分化培养基进行诱导分化。
进一步的，所述流式分选所用抗体为CD56、CD29、CD45、CD31，分选出CD56+CD2+CD45-CD31-的高纯度肌源性细胞。
进一步的，所述常规生长培养基为20vol％胎牛血清、79vol％F10培养基、1vol％的青霉素链霉素双抗溶液以及1-10ng/ml成纤维细胞生长因子2(FGF)。
进一步的，所述分化培养皿为预涂了10-200μg/ml基质胶的3.5cm培养皿，分化培养基为2vol％马血清、97vol％DMEM培养基、1vol％的青霉素链霉素双抗。
进一步的，所述的青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素的含量均为10000U/ml，链霉素的含量均为10mg/ml。
采用本发明的改良培养基长期培养肌源性细胞，可加快长期体外扩大培养过程中肌肉干细胞体外增殖速度。相比于采用正常培养基扩大培养，使用本申请改良培养基，长期扩大培养肌源性细胞30天(10代)之后，能够收获100到1000倍的细胞数量。
采用本发明的改良培养基长期培养肌源性细胞，在相同扩增数量下可维持肌源性细胞的分化潜能。
本发明的第四个目的是提供前述的改良培养基在制备培养肉中的应用。
进一步的，所述培养肉制备为：将肌源性细胞接种到多孔网状培养肉生产模具中进行体外培养。
进一步的，所述将肌源性细胞接种到多孔网状培养肉生产模具中进行体外培养的方法包括以下步骤：
(1)将I型胶原、含酚红的DMEM培养基、氢氧化钠溶液混合，得到混合溶液；优选的，所述混合溶液中还包括基质胶；
(2)将待分化肌源性细胞与步骤(1)获得的混合溶液混合后，得到含细胞的混合溶液；
(3)将步骤(2)获得的含细胞的混合溶液加入到多孔网状培养肉生产模具中进行培养，形成水凝胶肌肉组织后，加入权利要求1所述的改良培养基，培养1-3天之后，将改良培养基换为分化培养基，培养5-7天后，获得培养肉。
进一步的，步骤(2)所述待分化肌源性细胞为将肌源性细胞接种到前述的改良培养基的细胞培养皿中，并进行30天10代的换液传代培养，将收集到的P1～P7代种子细胞作为待分化肌源性细胞，优选的，收集P3～P7代种子细胞作为待分化肌源性细胞，进一步优选的，收集P4和/或P5代种子细胞作为待分化肌源性细胞。在某一个特定的实施例中，收集P3和/或P7代种子细胞作为待分化肌源性细胞。
进一步的，所述多孔网状培养肉生产模具为专利号ZL201921875316.X专利记载的多孔的网状培养肉生产模具。
进一步的，所述I型胶原、含酚红的DMEM培养基的体积比为50:40，添加氢氧化钠溶液将pH值调节至7.3-7.5。
进一步的，所述步骤(1)中，还包括向混合溶液中添加基质胶，所述基质胶与混合溶液的体积比为8:91.5，将基质胶与混合溶液混匀后，加入模具进行培养，所述基质胶可帮助网状肌肉组织分化。
进一步的，所述步骤(2)肌源性细胞为肌肉干细胞、肌肉祖细胞、肌肉前体细胞中的一种，所述含细胞的混合溶液中，肌源性细胞的密度为1x105个/ml-1x107个/ml。
进一的，步骤(3)所述水凝胶肌肉组织为将步骤(2)获得的含细胞的混合溶液加入到多孔网状培养肉生产模具中，37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养2h后得到。
采用本发明所述的改良培养基，将肌肉干细胞接种到多孔网状培养肉生产模具中进行体外长期培养后得到的肌肉干细胞，与采用常规生长培养基长期培养所得到的肌肉干细胞相比，在相同传代次数下，可提高肌肉干细胞的分化标志肌球蛋白重链的表达。
具体的，在二维环境培养9天3代之后，接种孔网状培养肉生产模具形成水凝胶肌肉组织后，加入前述的改良培养基，进行三维环境进一步的分化，可以表达1.35倍肌球蛋白重链；在二维环境培养21天7代之后，接种孔网状培养肉生产模具形成水凝胶肌肉组织后，加入前述的改良培养基，进行三维环境进一步的分化可以表达3.3倍肌球蛋白重链。
本发明的第五个目的是提供采用前述改良培养基培养得到的培养肉。
本发明技术方案相对于现有技术有益效果在于：
本申请设计的用于肌源性细胞体外长期扩大培养的改良培养基，通过添加VC或VC衍生物Asc-2P，在体外长期扩大培养中极大的加快细胞增殖速度，维持肌源性细胞的分化潜能；保证其长时间传代后仍能保持一定的增殖水平，并且拥有正常生长培养基更快的扩大速度，在P7代(21天)时就能获得正常细胞培养基培养到P10代(30天)的细胞数量，在30天10代之后收获正常培养基扩大培养100到1000倍的细胞数量，从而可以在更短时间内获得大量的肌源性细胞，用于进一步的培养肉生产。该改良培养基扩大培养的肌源性细胞在接种孔网状培养肉生产模具生产培养肉时，拥有更好的分化水平，表达更多的肌球蛋白重链，能过够产出品质更高的培养肉。
附图说明
图1为对照细胞培养基、添加有Asc-2P的细胞培养基长期培养的肌肉干细胞生长曲线
图2为对照细胞培养基、添加有Asc-2P的细胞培养基长期培养的肌肉干细胞每代扩增倍数图
图3为相同扩增数量下对照细胞培养基(P10代)、添加有Asc-2P的细胞培养基(P7代)长期培养的肌肉干细胞分化结果(MyHC染色)
图4为P7代对照细胞培养基、添加有Asc-2P的细胞培养基长期培养的肌肉干细胞接种多孔网状培养肉生产模具培养5天后在培养肉生产模具中的生长情况。
图5为P3和P7代对照细胞培养基、添加有Asc-2P的细胞培养基长期培养的肌肉干细胞接种多孔网状培养肉生产模具培养5天后，蛋白免疫印记的实验结果(MyHC和MYOG蛋白)。
其中，图5A为P3和P7代对照细胞培养基、添加有Asc-2P的细胞培养基长期培养的肌肉干细胞接种多孔网状培养肉生产模具培养5天后，MyHC、MYOG和相应GAPDH的免疫印迹图片蛋白免疫印记，图5B为P3和P7代对照细胞培养基、添加有Asc-2P的细胞培养基长期培养的肌肉干细胞接种多孔网状培养肉生产模具培养5天后，MyHC以GAPDH标准化后的统计结果，图5C为P3和P7代对照细胞培养基、添加有Asc-2P的细胞培养基长期培养的肌肉干细胞接种多孔网状培养肉生产模具培养5天后，MYOG以GAPDH标准化后的统计结果。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域的技术人员更加全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
本发明发现，添加有VC或VC衍生物Asc-2P的肌源性细胞生长培养基可以在长期体外扩大培养中促进肌肉干细胞增殖速度，平均每一代能够比正常细胞培养基培养的肌肉干细胞多扩增1.5倍以上。传代后期的肌肉干细胞经过诱导分化之后，经过分化标记MyHC显示，能够保持更好分化效率和分化水平。此外我们将经过前述细胞培养基培养后的肌肉干细胞接种进多孔网状培养肉生产模具，5天后生产得到培养肉初级产品，经过蛋白免疫印迹验证分化标记MyHC，结果也能显示采用本发明的改良培养基扩大后的肌肉干细胞可以帮助培养肉产生更多肌纤维和肌肉蛋白，有助于培养肉产品的开发。
本发明的改良细胞培养基，为添加有VC或VC衍生物Asc-2P的肌源性细胞生长培养基，肌肉干细胞体外培养方法方面与常规肌肉干细胞体外培养方法一致。
下述实施例中采用的肌源性细胞生长培养基成分包括：20vol％胎牛血清、79vol％F10培养基、1vol％的青霉素链霉素双抗以及1-10ng/ml成纤维细胞生长因子2(FGF)，所述的青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素的含量均为10000U/ml，链霉素的含量均为10mg/ml。
下述实施例中采用的改良细胞培养基为添加有Asc-2P(维生素C磷酸酯)的肌源性细胞生长培养基。
Asc-2P作为维生素C的衍生物，通过缓慢释放游离的维生素C而发挥作用(CN201711399805.8一种维生素C磷酸酯的制备方法)，因此根据Asc-2P的实验结果，可以推知维生素C具有同样效果。
下述实施例中采用的肌源性细胞为幼猪肌肉干细胞，进一步的为贴壁细胞。
由于肌肉干细胞在培养过程中会不断分化成为肌肉祖细胞和肌肉前体细胞，理论上培养后的肌肉干细胞包含肌肉祖细胞和肌肉前体细胞，因此根据肌肉干细胞的实验结果，可以推知肌肉组细胞和肌肉前体细胞具有同样效果。
下述实施例中接种多孔网状培养肉生产模具的细胞密度为1x105个/ml-1x107个/ml，培养的时间为5天以上。
下述实施例中采用的培养条件皆为CO2培养箱中37℃培养，CO2的浓度皆为5％(v/v)。
下述实施例中采用的检测方法，除非另外说明，否则都是领域内公开的实验方法、检测方法和制备方法。
下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1猪肌肉干细胞分离分选与体外长期培养增殖速度的研究：
1)单细胞分离：取刚屠宰小猪在75％乙醇中浸泡一分钟，于无菌条件下取前后腿部位切开皮肤和筋膜，取整块肌肉组织于基础培养液中保存。在无菌条件下，将肌肉组织于DMEM中漂洗2-3min，移到另一干净的装有DMEM的培养皿中，用无菌手术刀剪碎至装有DMEM的离心管中，按1:6的总体系比例分别加入胶原酶D和消散酶II溶液，混匀后反复抽吸肌肉组织，于37°培养箱中孵育，其中每过15min再次反复抽吸，直到溶液可顺利通过10ml移液管30ml带针头的针筒，加入5ml基础培养基以及适量的PBS稀释溶液。100μm细胞滤器过滤溶液，800g离心5min取沉淀，加入5ml红细胞裂解液轻轻重悬沉淀，冰浴5min后800g离心5min取沉淀，用PBS清洗1-2次。40μm细胞滤器过滤，血细胞计数板进行计数，剩余细胞800g离心5min取细胞沉淀，并按1X106/ml冻存细胞。
2)流式分选高纯度肌肉干细胞：无菌条件下取单细胞用基础培养液按细胞量5x105接种于10cm的培养皿之中，每个培养皿8ml基础培养液。接种后的第二天用0.25％的胰酶消化，用等体积基础培养液终止消化反应，300G离心5min收集细胞沉淀，用含1％BSA的PBS溶液稀释的CD56-PE,CD29-488,CD31-APC,CD45-647抗体1ml重悬细胞，在冰上孵育30min，300G离心5min后用PBS清洗两次，用300ul另加双倍双抗的基础培养基重悬细胞，分组上机检测，分选出CD56和CD29阳性,CD31和CD45阴性的高纯度猪肌肉干细胞。
3)将猪肌肉干细胞分别接种到肌源性细胞生长培养基、添加有Asc-2P的改良培养基的细胞培养皿中，并进行30天10代的换液传代培养，收集每代细胞的扩增倍数：
将2)中分选后的原代猪肌肉干细胞分为常规肌源性细胞生长培养基(NC)、添加有Asc-2P的改良培养基培养组(Asc-2P)。
肌源性细胞生长培养基配方为：20vol％胎牛血清、79vol％F10培养基(厂家Gibco、批号11550043)、1vol％的青霉素链霉素双抗以及5ng/ml重组人成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)，所述的青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。
改良培养基配方为：在上述肌源性细胞生长培养基基础上添加Asc-2P，Asc-2P添加量为100μmol/L肌源性细胞生长培养基。
分别取将2)中分选后的原代猪肌肉干细胞按1.5X105/dish接种到各组10cm培养皿中，每两天进行换液，每三天为一代，用0.25％的胰酶消化并用血细胞计数板进行计数后，继续按照1.5X105/dish传代。
以时间(d)为横坐标，细胞数目(X104 cells)为纵坐标，绘制生长曲线(图1)；
以传代批次为横坐标，细胞扩增倍数为纵坐标，绘制每代扩增倍数图(图2)。
4)结果显示：所述的添加有Asc-2P的改良培养基长期培养的肌肉干细胞可以在传代前中期加快肌肉干细胞扩增速度，在P7代(21天)时就能获得正常细胞培养基培养到P10代(30天)的细胞数量(图1)。此外使用添加有Asc-2P的改良培养基在30天10代之后收获正常培养基扩大培养1000倍的细胞数量(图1)，且能在P7代之前一直维持比常规肌源性细胞生长培养基组更快的增殖速度，其中P4代和P5代增殖速度优势显著(图2)。
实施例2肌肉干细胞分化水平检测
1)肌肉干细胞诱导分化：取实施例1中两组猪肌肉干细胞移入分化培养皿中，持续培养直到细胞汇合度达到90％以上，更换为分化培养基培养，分化培养皿为预涂了10-200μg/ml基质胶的3.5cm培养皿，分化培养基为2vol％马血清、97vol％DMEM培养基、1vol％的青霉素链霉素双抗，所述的青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。每两天进行一次半换液，即吸去一半分化培养基，加入一半新的分化培养基，分化3-6天。
2)分化标志MyHC检测：取培养后的细胞，用PBS清洗一遍，用4％的多聚甲醛固定4℃过夜，用PBS清洗三遍,每次5min，并用免疫组化笔划定抗体使用的组化圈。
0.5％TritonX-100(PBS配置)室温通透15-20min，用PBS摇床清洗三遍,每次5min。在每个皿的组化圈中滴加1：800稀释的MyHC一抗100μl，并放入湿盒，4℃孵育过夜。用PBS清洗三遍,每次5min。滴加1：1000稀释的荧光二抗100μl，湿盒中20-37℃孵育1h，PBS浸洗2次，每次5min。注意从滴加二抗开始需要避光操作。滴加含DAPI的防荧光猝灭剂，盖上合适的盖玻片，晾一会后在玻片附近用指甲油封片。在共聚焦显微镜下观察采集图像(图3)。
3)结果显示：采用相同扩增数量，即P10代正常培养基培养的肌肉干细胞，P7代所述的添加有Asc-2P的细胞培养基长期培养的肌肉干细胞，进行分化成熟标志MyHC的染色实验可以发现，相比较正常培养基培养的肌肉干细胞几近无法分化的状态，添加有Asc-2P的改良培养基培养的肌肉干细胞能维持更好的分化水平，能分化成为成熟的肌管。
实施例3培养肉产品制备及分化水平检测
本实验分为常规生长培养基培养组(NC)、添加有Asc-2P的改良培养基培养组(Asc-2P)。
1)培养肉产品制备：取I型胶原(浓度为3.35-3.73mg/ml)，与含酚红的DMEM培养基，1M NaOH以及基质胶(厂家CORNING，批号356234)混匀制成混合溶液。I型胶原、含酚红的DMEM培养基、NaOH溶液、基质胶的体积比为50:40:1.5:8，氢氧化钠溶液将混合溶液的pH值调节至7.3-7.5，本实施例中胶原、含酚红的DMEM培养基、NaOH溶液、基质胶的具体添加量分别为500ul、400ul、15ul、8ul，得到混合溶液。
将幼猪肌肉贴壁干细胞分为两组，分别接种到含有常规培养基和改良培养基的不同细胞培养皿中，并进行30天10代的换液传代培养，分别收集各组P3和P7代种子细胞，作为待分化细胞，与混合溶液混匀后，得到含细胞的混合溶液接入专利号ZL201921875316.X专利记载的多孔网状培养肉生产模具中进行培养，含细胞的混合溶液中，幼猪肌肉贴壁干细胞密度为1x105个/ml混合溶液。
将含细胞的混合溶液在37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养2h以形成水凝胶肌肉组织，两实验组分别加入与实施例1中配方相同的常规生长培养基、添加有Asc-2P的改良培养基，水凝胶肌肉组织在培养1天之后，将生长培养基换为分化培养基，分化培养基为2vol％马血清、97vol％DMEM培养基(厂家为凯基生物、型号KG037663)、1vol％的青霉素链霉素双抗，所述的青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。凝胶肌肉组织在分化培养基中培养，在多孔网状培养肉生产模具中经过5天的分化得到网状肉的培养肉产品(图4)。
2)培养肉产品分化水平检测：取1)中分化结束的网状肉加入100μL的RIPA(另加终浓度1mM PMSF)，冷冻破碎仪破碎组织后，在冰上裂解30min收集-20℃保存待用。之后12000g离心5分钟，收集上清,使用赛默飞的BCA试剂盒测定和蛋白浓度，按照4:1(V:V)加入5X的loading buffer，混匀后95℃加热5min变性蛋白,-80℃保存。
SDS-page凝胶电泳:提前配置好电泳缓冲液和转印液(转印液需要另加10％的甲醇)，电泳缓冲液没过12％的变性琼脂糖预制凝胶板情况下，取含20ug变性后的蛋白分别加至上样孔之中，设置电压80V电泳30min和120电泳90min及以上两个程序，观察蛋白上样液是否到达预制板的底部。
转膜：将PVDF膜放入甲醇之中活化10s左右，放入转印液里保存待用，按照海绵、2层滤纸、凝胶、活化的PVDF膜、2层滤纸、海绵放置，用转印夹夹紧，放入电泳槽后加入配置好的转印液90V运行90min。
封闭：将转印结束的PVDF膜放入封闭液(用TBST配置的5％脱脂奶粉)之中，室温摇床封闭2h后吸掉封闭液。
一抗和二抗孵育：按照加入抗体的具体情况1:1000稀释的肌球蛋白重链(MyHC)一抗和1:1000稀释的肌细胞生成素(MYOG)一抗5ml，4℃孵育14-16h。一抗孵育结束后回收一抗，TBST清洗三遍，每遍5min。加入1：2000稀释后的二抗5ml并孵育2h，结束后TBST清洗三遍，每遍5min。
显影：使用显影液暗处覆盖PVDF膜，孵育5min后吸去显影液，凝胶成像仪下拍照。并使用Quantity One分析软件进行灰度分析。本实验使用的内参蛋白为Gapdh(图5)。
3)结果显示：肌细胞生成素(MYOG)可以显示肌肉干细胞分化的进程和潜力，而MyHC是分化成熟的标志。通过比较MYOG和MyHC可以发现，早期P2代的扩大培养后的肌肉干细胞生产的培养肉，添加有Asc-2P的改良培养基培养组(Asc-2P)分化较慢但仍然保持较好的分化潜力。而比较后期P7代的扩大培养后的肌肉干细胞生产的培养肉可以发现，添加有抗Asc-2P的改良培养基培养组(Asc-2P)扩大培养的肌肉干细胞能够更好的收缩，且能帮助肌肉干细胞在多孔网状培养肉生产中更优地分化并维持更优的分化潜能。
采用本发明所述的肌肉干细胞体外扩大培养的改良培养基，将肌肉干细胞接种到多孔网状培养肉生产模具中进行体外长期培养后得到的肌肉干细胞，与采用常规生长培养基长期培养所得到的肌肉干细胞相比，在相同传代次数下，可提高肌肉干细胞的分化标志肌球蛋白重链的表达。
具体的，在二维环境培养9天3代之后，接种孔网状培养肉生产模具形成水凝胶肌肉组织后，加入前述的改良培养基，进行三维环境进一步的分化，可以表达1.35倍肌球蛋白重链；在二维环境培养21天7代之后，接种孔网状培养肉生产模具形成水凝胶肌肉组织后，加入前述的改良培养基，进行三维环境进一步的分化可以表达3.3倍肌球蛋白重链。
实施例4不同Asc-2P浓度组肌肉干细胞增殖能力检测
本实施例处理方法除Asc-2P浓度，其他与实施例1相同，本实施例Asc-2P浓度为50和200μM，50μM处理组获得的细胞数量相对于正常培养基增加了800倍、100μM处理组获得的细胞数量相对于正常培养基增加了1000倍、200μM处理组获得的细胞数量相对于正常培养基增加了500倍
以上公开的实例是为了说明本发明公开的实施案例，但不能理解为本发明的局限，在不脱离本发明范围和精神的前提下，仍有许多不同可以进一步的组合，因此本发明不只局限于公开的实施案例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种用于肌源性细胞体外长期扩大培养的改良培养基，其特征在于，所述改良培养基为添加有VC或VC衍生物Asc-2P的肌源性细胞生长培养基。
2.根据权利要求1所述的改良培养基，其特征在于，所述肌源性细胞生长培养基包括79vol％基础培养基、20vol％胎牛血清、1vol％的青霉素链霉素双抗溶液以及FGF；
优选的，所述基础培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种。
3.根据权利要求1所述的改良培养基，其特征在于，所述肌源性细胞生长培养基中，FGF浓度为1-10ng/ml。
4.根据权利要求1所述的改良培养基，其特征在于，所述肌源性细胞生长培养基中VC或VC衍生物Asc-2P的浓度为50-200μmol/L。
5.VC或VC衍生物Asc-2P在促进肌源性细胞体外长期扩大培养过程中的增殖速度和/或维持肌源性细胞体外长期扩大培养过程中的分化能力中的应用，其特征在于，将VC或VC衍生物Asc-2P添加到肌源性细胞生长培养基中，对肌源性细胞进行体外长期扩大培养。
6.权利要求1所述的改良培养基在促进肌源性细胞体外长期扩大培养过程中的增殖速度和/或维持肌源性细胞体外长期扩大培养过程中的分化能力中的应用。
7.权利要求1所述的改良培养基在制备培养肉中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将I型胶原、含酚红的DMEM培养基、氢氧化钠溶液混合，得到混合溶液；优选的，所述混合溶液中还包括基质胶；
(2)将待分化肌源性细胞与步骤(1)获得的混合溶液混合后，得到含细胞的混合溶液；
(3)将步骤(2)获得的含细胞的混合溶液加入到多孔网状培养肉生产模具中进行培养，形成水凝胶肌肉组织后，加入权利要求1所述的改良培养基，培养1-3天之后，将改良培养基换为分化培养基，培养5-7天后，获得培养肉。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述待分化肌源性细胞为将肌源性细胞接种到权利要求1所述的改良培养基的细胞培养皿中，并进行30天10代的换液传代培养，收集P1～P7代种子细胞作为待分化肌源性细胞，优选的，收集P3～P7代种子细胞作为待分化肌源性细胞，进一步优选的，收集P4或P5代种子细胞作为待分化肌源性细胞。
10.采用权利要求1所述的改良培养基培养得到的培养肉。
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