CN117603908A - 一种msc成球培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于干细胞培养技术领域，提供了一种MSC的培养方法及培养基。所述MSC成球培养基是在MSC完全培养基中添加以下10ng/mL‑50ng/mL VEGF、10ng/mL‑50ng/mL KGF和1ng/mL‑10ng/mL二甲双胍。利用该成球培养基制备的MSC细胞球，大小为50‑500μm左右，细胞活率不小于90%。本发明提供的成球培养基能提高单位容积中细胞密度、提高MSC扩增倍数，利用生物反应器的培养方式使其能更好地实现大规模生产，获得的MSC具有较好的三系分化潜能、成血管能力、抗炎能力，且具有较高的PGE2分泌水平，能够更好地发挥其临床功能。
Description
技术领域
本发明属于干细胞培养技术领域，涉及一种MSC的培养方法及培养基。
背景技术
间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是具有自我更新、多向分化潜能的干细胞，MSCs能够分泌大量生物活性因子，这些因子可以通过旁分泌的方式作用于邻近的细胞，在关键的生物学过程的调节中起着重要作用，可以增强细胞的增殖、迁移、血管生成，并具有抗凋亡和抗炎症的作用，因此在组织修复和多系统疾病治疗中具有良好的应用前景。
传统的间充质干细胞体外培养方式为二维平面的单层贴壁培养，这种培养方式占地面积大，人力成本高，且往往无法模拟细胞在体内的三维环境。与贴壁培养相比，借助生物反应器的三维细胞培养 对生产场地的要求比传统的2D低，且占用场地面积大幅降低，并能不同程度的节省设备、人力及检测成本，批产量提高，能更好的满足临床需求，且能可以更好地模拟体内微环境，对于细胞生长、分化以及细胞间相互作用的研究具有重大意义。
目前的间充质干细胞三维培养体系主要分为：（1）借助于水凝胶进行间充质干细胞培养，主要用于组织工程中，如促进伤口愈合。（2）借助微载体，使细胞在微载体表面贴壁，增殖，普遍存在细胞得率低，或细胞产品微载体残留量高的问题。（3）细胞自发聚集成细胞球，主要包括悬滴法、低吸附涂层培养法，芯片法等，难以实现规模化生产。
中国专利CN 111334466A中，公开了间充质干细胞球及其制备方法和应用以及成球培养基在制备间充质干细胞球中的应用，通过改良培养基配方，使二维贴壁生长的细胞自发聚集成球状，但是使用该方法细胞初始接种密度高，借助传统二维培养瓶，细胞成球速度慢，难以实现大规模生产；而且也没有增加间充质干细胞在成血管、抗炎等临床功能上的能力。
发明内容
针对目前MSC成球培养中的问题，本发明提供一种MSC成球培养基，初始密度低、成球速度快。
本发明的另一目的是提供一种利用上述MSC成球培养基培养MSC细胞的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种MSC成球培养基，在MSC完全培养基中添加以下浓度的成分：
10ng/mL-50ng/mL血管内皮生长因子（VEGF）、10ng/mL-50ng/mL角质形成细胞生长因子（KGF）和1ng/mL-10ng/mL二甲双胍。
所述MSC完全培养基可以选择已公开的用于MSC培养的培养基。
所述MSC为哺乳动物来源的，如大鼠、小鼠、猪、猴、人；优选为人源的。为了避免MSC中有潜在病原或异种物质排斥，MSC完全培养基为添加同物种血清甚至血清替代物的完全培养基；在优选的实施例中，所述血清替代物为商业购买的UltraGROTM-Advanced，其添加浓度可以按照说明进行，如按照培养基4%-5%体积分数添加。
一种MSC的培养方法，包括以下步骤：
（1）获得原代MSC；
（2）将原代MSC接种至上述MSC成球培养基中，培养获得继代MSC细胞球；
（3）将继代MSC细胞球消化成单细胞悬液，然后在接种至上述MSC成球培养基中传代。
所述原代MSC的来源并无特别限定，可以是一切可以分离获得间充质干细胞的组织或器官。如，脐带血、脐带组织、脂肪、骨髓，牙髓等。所述原代MSC还可以是为了实现临床治疗或永生化目的进行改造后的。所述改造可以是通过转染病毒或其他公知的方法进行基因改造，所述基因改造包括但不限于对某些功能基因进行敲减、敲除、增加或过表达。所述原代MSC可以是由相关组织、器官分离获得的，也可以是由直接分离的MSC继代培养1-15次获得的。
接种浓度可以为每毫升培养基接种104-105数量级的细胞，如1×104个细胞/mL、5×104个细胞/mL、8×104个细胞/mL、1×105个细胞/mL、2×105个细胞/mL、3×105个细胞/mL、4×105个细胞/mL、5×105个细胞/mL、9×105个细胞/mL。在一些实施例中，接种密度为5×104-5×105个细胞/mL。
为了使MSC细胞球提高内部和外部的细胞均一性或提高培养器皿内的导热或传质、提高同批次MSC细胞球的均一性，培养过程进行搅拌，搅拌的速度可以按照细胞培养的周期和需要的细胞球的大小获得，如较高的搅拌速度下获得的细胞球较小。在一些实施例中，搅拌的速度为30转/分钟（rpm）-200转/分钟；具体的，可以选择30rpm、50rpm、80rpm、90rpm、100rpm、120rpm、150rpm、180rpm、200rpm。
一种利用上述MSC成球培养基或培养方法制备的MSC细胞球。细胞球大小为50-500μm左右，细胞活率不小于90%；相比MSC完全培养基，具有较好的三系分化潜能、成血管能力、抗炎能力，且具有较高的PGE2分泌水平。
本发明具有以下优点：
本发明利用特定的成球培养基对间充质干细胞进行成球培养，细胞能在较低的细胞初始密度（1×105个细胞/mL）下，在培养24h内细胞可自发成球，成球速度快，培养5-7天后可收获细胞。此外，本发明优选的成球培养基中不含有动物源性成分，有助于临床应用。在成球培养基内MSC扩增倍数高，还可利用生物反应器的培养方式，实现规模化生产。相较贴壁培养模式，获得的间充质干细胞增殖能力、三系分化能力和成血管能力好，PGE2蛋白的表达提高，抗炎能力强。间充质干细胞的成球培养能够提高单位容积中细胞密度、使其能更好地实现大规模生产，并更好地发挥其临床功能。
附图说明
图1为不同培养基中脐带组织来源间充质干细胞球的显微镜图；
图2为不同培养基中脐带组织来源间充质干细胞的增殖曲线图；
图3为不同培养基中脐带组织来源间充质干细胞的成骨、成脂、成软骨诱导；
图4为不同培养基中脐带组织来源间充质干细胞的培养上清中PGE2含量的检测结果图；
图5为不同培养基中脐带组织来源间充质干细胞培养上清中HUVEC细胞形态；
图6为不同培养基中脐带组织来源间充质干细胞培养上清中促进血管生成结果；
图7为不同培养基中脐带组织来源间充质干细胞培养上清中对巨噬细胞中炎症相关基因表达水平的影响；
图8为不同培养基中脂肪组织来源间充质干细胞球的显微镜图；
图9为不同培养基中的脂肪组织来源间充质干细胞培养上清中PGE2含量的检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 脐带来源间充质干细胞球的培养
1. 原代MSC的分离
取脐带组织，剪成小段，小心地将1根静脉血管和2根动脉血管剖离，然后用组织镊将脐带组织撕成长条状，再用剪刀将组织剪为肉糜状，将组织块接种至培养瓶中，加入不含VEGF和KGF的MSC完全培养基，置于二氧化碳培养箱中培养10-13天，获得脐带来源的原代间充质干细胞（原代MSC）。
2. 间充质干细胞球的培养
按照以下两种配方配制培养基：
MSC完全培养基（表示为正常培养基）：在500mL的MSC基础培养基（深圳市达科为生物工程有限公司，MSC专用基础培养基，货号6114011）加入20mL的UltraGROTM-Advanced血清替代物（AventaCellBioMedical Corp. Ltd.，UltraGRO™-Advanced，货号HPCFDCGL50）。
成球培养基：在上述配制的MSC完全培养基中，按照20ng/mL加入血管内皮生长因子（VEGF）、20ng/mL加入角质形成细胞生长因子（KGF）和5ng/mL加入二甲双胍。
按照以下方法进行培养：
将同源同批的原代MSC一分为二，分别置于成球培养基和完全培养基中，于125mL生物反应器中，置于二氧化碳培养箱中培养5天，培养体积为35mL，细胞接种密度为5×104个细胞/mL。在初始培养的24h，每搅拌培养5min，停止20min；24h后，恒速搅拌培养，搅拌速度为30rpm。第三天进行半量换液。
培养的第一天（18h），第三天，第五天，显微镜下观察细胞并拍照，每次观察时两种细胞取同等量的悬液，对其中的全部细胞球消化计数，结果如图1-2所示：使用成球培养基培养18h，间充质干细胞自发聚集成球，较使用正常培养基的成球速度快，成球效果好，且细胞球增殖速度快。在成球培养的第三天和第五天，使用成球培养基，间充质干细胞的扩增倍数显著高于使用正常培养基的细胞扩增倍数。
培养的第五天，收获细胞球消化为单细胞，使用MSC完全培养基，将细胞接种于涂布0.1%明胶的6孔板中，细胞密度2×104个细胞/孔，第二天，更换为成骨诱导培养基或成脂诱导培养基，每周换液2次。成脂诱导14天后，进行油红O染色。成骨诱导21天后，进行1%茜素红S染色。图3结果表明，间充质干细胞用成球培养基培养，成骨和成脂分化能力优于使用正常培养基培养的间充质干细胞成球。
对于成软骨试验，则将培养五天后消化获得的单细胞调整密度至8×106个细胞/mL。向含有成软骨诱导培养基的6孔板中分散滴入4-6滴细胞悬液，20μL/滴，每周换液1次，成软骨诱导21天后，进行阿利新蓝染色。图3结果表明，两种培养基中获得的间充质干细胞成软骨分化能力无显著性差异。
培养的第五天，取细胞上清，通过ELISA检测上清中PGE2的含量。PGE-2被证明具有抗纤维化的作用，能抑制Th1分化、B细胞功能、T细胞活化和过敏反应。此外，PGE-2还可对中性粒细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等天然免疫细胞发挥抗炎作用。图4结果表明，用成球培养基进行间充质干细胞成球培养时PGE2的分泌水平显著高于使用正常培养基培养的间充质干细胞。
培养的第五天，取细胞上清，分别加入铺有基质胶的96孔板中培养HUVEC细胞，观察细胞排列情况。图5和6结果表明，用成球培养基在生物反应器中进行间充质干细胞成球培养，间充质干细胞促进血管生成的能力显著提高。
选取状态良好的RAW264.7细胞，以1×105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，当细胞密度达到70-80%时，将细胞随机分为空白对照组（Control，不做任何处理）、MSC LPS处理组（LPS）、正常培养基培养组上清与LPS共处理组（LPS+正常培养基上清）、成球培养基培养组上清与LPS共处理组（LPS+成球培养基上清）分别处理巨噬细胞，各处理中LPS的浓度均为10 ng/mL。24小时后收集细胞提取总RNA运用RT-PCR检测炎症相关基因的表达，与正常的MSC完全培养基相比，成球培养基处理组中促炎因子IL-1β、IL-10和TNF-αmRNA的表达水平显著下降，抗炎因子IL-10，TGF-β和Arg-1 mRNA的表达水平显著升高，成球培养基培养的MSC显示出更好的抗炎能力。
实施例2 脂肪来源间充质干细胞球的培养
（1）培养基配置
MSC完全培养基（表示为正常培养基）：在500mL的MSC基础培养基（深圳市达科为生物工程有限公司，MSC专用基础培养基，货号6114011）加入20mL的UltraGROTM-Advanced血清替代物（Aventa Cell Bio Medical Corp. Ltd.，货号HPCFDCGL50）；
成球培养基：在上述配制的MSC完全培养基中，按照下表分别加入血管内皮生长因子（VEGF）、角质形成细胞生长因子（KGF）和二甲双胍：
。
（2）取脂肪组织，洗去血细胞，加入等量脂肪体积0.1%的胶原酶I，置于振荡水浴锅中，37℃，80rpm，消化60min，将消化后的组织过100μm滤网，使用生理盐水清洗后，将细胞中加入MSC完全培养基，在培养瓶中进行培养，5天后获得原代脂肪来源间充质干细胞。
（3）将同源同批的原代MSC，分别置于不同配方的成球培养基和完全培养基中，细胞在125mL生物反应器中，置于二氧化碳培养箱中培养5天，培养体积为35mL，细胞接种密度为1×105个细胞/mL。在初始培养的24h，每搅拌培养5min，停止20min；24h后，恒速搅拌培养，搅拌速度为30rpm。培养24h内细胞可自发成球。第三天进行半量换液。
（4）在成球培养第5天后，显微镜下观察细胞球并拍照，结果如图8所示：在成球培养中收获的MSC细胞球显著大于完全培养基中的MSC细胞球。结果表明，10ng/mL-50ng/mL浓度范围的血管内皮生长因子（VEGF）、10ng/mL-50ng/mL浓度范围的角质形成细胞生长因子（KGF）和1ng/mL-10ng/mL浓度范围的二甲双胍均能有效促进MSC细胞球的形成及增殖，效果显著优于普通的MSC完全培养基。
（5）培养的第五天，取细胞上清，通过ELISA检测上清中PGE2的含量。图8结果表明，用不同配方（VEGF，KGF和二甲双胍的添加浓度不同）的成球培养基进行间充质干细胞成球培养时PGE2的分泌水平均显著高于使用正常培养基培养的间充质干细胞。
Claims (10)
1.一种MSC成球培养基，其特征在于，在MSC完全培养基中添加以下浓度的成分：
10ng/mL-50ng/mL血管内皮生长因子、10ng/mL-50ng/mL角质形成细胞生长因子和1ng/mL-10ng/mL二甲双胍。
2.根据权利要求1所述的MSC成球培养基，其特征在于，所述MSC为哺乳动物来源。
3.根据权利要求1所述的MSC成球培养基，其特征在于，所述MSC来源为大鼠、小鼠、猪、猴或人；优选为人源。
4.根据权利要求1所述的MSC成球培养基，其特征在于，MSC完全培养基为添加同物种血清或血清替代物的；
优选的，所述血清替代物为UltraGROTM-Advanced；添加浓度为培养基的4%-5%体积分数。
5.一种MSC的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）获得原代MSC；
（2）将原代MSC接种至如权利要求1-4任一所述的MSC成球培养基中，培养获得继代MSC细胞球；
（3）将继代MSC细胞球消化成单细胞悬液，然后在接种至如权利要求1-4任一所述的MSC成球培养基中传代。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，原代MSC的来源选自脐带血、脐带组织、脂肪、骨髓和牙髓中的任意一种；
原代MSC是基因改造后的，所述基因改造为对功能基因进行敲减、敲除、增加或过表达。
7.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，原代MSC是由相关组织、器官直接分离获得的，或，由直接分离的MSC继代培养1-15次获得的。
8.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，接种浓度为每毫升培养基接种104-105数量级的细胞；如，1×104个细胞/mL、5×104个细胞/mL、8×104个细胞/mL、1×105个细胞/mL、2×105个细胞/mL、3×105个细胞/mL、4×105个细胞/mL、5×105个细胞/mL、9×105个细胞/mL；优选的，接种密度为5×104-5×105个细胞/mL。
9.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，培养过程进行搅拌，搅拌的速度为30rpm-200rpm；如，30rpm、50rpm、80rpm、90rpm、100rpm、120rpm、150rpm、180rpm或200rpm。
10.一种利用如权利要求1-4任一所述的MSC成球培养基或如权利要求5-9任一所述的培养方法制备的MSC细胞球，其特征在于，细胞球大小为50μm-500μm，细胞活率不小于90%。
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