CN110157664A

CN110157664A - 一种可提高脐带间充质干细胞cd106和cd54亚群比例的培养基

Info

Publication number: CN110157664A
Application number: CN201910348027.2A
Authority: CN
Inventors: 杨超; 陈强
Original assignee: SICHUAN NEW LIFE STEM CELLS TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SICHUAN NEW LIFE STEM CELLS TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2019-04-22
Filing date: 2019-04-22
Publication date: 2019-08-23
Anticipated expiration: 2039-04-22
Also published as: CN110157664B

Abstract

CD106和CD54阳性间充质干细胞亚群具有较强的免疫抑制能力，可广泛用于免疫性疾病的治疗，但目前仅有通过免疫吸附方法纯化前述干细胞亚群的方法，其效率较低。为了解决前述问题，本发明提供了一种可提高脐带间充质干细胞CD106和CD54阳性亚群比例的无血清培养基及培养方法，具体地，添加肿瘤坏死因子配置成无血清间充质干细胞培养基，通过该培养基的培养及培养方法的优化达到提高脐带间充质干细胞CD106和CD54阳性亚群比例的目的。本发明可将脐带间充质干细胞CD106阳性亚群比例从10～20％提高至27.71％～86.63％，将CD54阳性亚群从85～90％提高至97.74％～100％。

Description

一种可提高脐带间充质干细胞CD106和CD54亚群比例的培养基

技术领域

本发明涉及干细胞培养领域，具体涉及一种可提高脐带间充质干细胞CD106和CD54亚群比例的培养基及培养方法。

背景技术

间充质干细胞是一种具有多向分化潜能、自我更新能力的一类细胞，广泛用于再生医学研究。以往研究人员往往关注利用间充质干细胞的多向分化能力用于受损细胞的替换以达到受损器官的修复。随着研究的深入，现在大量研究表明间充质干细胞还具有强大的免疫调节能力，对间充质干细胞免疫调节的机制，目前主要认为是通过分泌多种旁分泌因子(HGF、PGE2、IDO、TGF-β1、IL-4及IL-10等)及粘附因子(CD106和CD54)发挥免疫调节的作用。治疗系统免疫疾病时(治疗系统性红斑狼疮等)，主要机制为旁分泌因子抑制机体整体免疫细胞的增殖和活性；但在治疗局部炎性引发的疾病时，则主要机制是由于细胞表面粘附因子粘附免疫细胞，通过一氧化氮-环氧化物水解酶信号途径达到抑制免疫细胞增殖和活性的目的。

脐带间充质干细胞是一种具有较高分化潜能的干细胞，可向多个方向进行分化。在治疗局部炎性引发的疾病时，脐带间充质干细胞CD106和CD54阳性亚群具有比阴性亚群更显著的疗效。

脐带间充质干细胞的CD54阳性率较高，通常在80％以上；但CD106阳性率较低，一般只有10～20％。专利《一种CD106阳性细胞、其鉴定、制备方法及应用》(授权公告号CN102539736 B)通过免疫纯化的方法来富集CD106阳性间充质干细胞，其操作复杂、容易污染、得率低，往往不能满足治疗所需。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种培养基，其特征在于，它是在StemPro MSCSFM Medium CTS完全培养基的基础上加入终浓度5～50ng/ml肿瘤坏死因子α的培养基；

如前述的培养基，其特征在于，所述StemPro MSC SFM Medium CTS完全培养基由如下成分组成：

500体积份的StemPro MSC SFM Basic Medium CTS、75体积份的StemPro MSC SFMSupplement CTS、5体积份的L-谷氨酰胺或谷氨酰胺替代物GlutaMAX。

如前述的培养基，所述StemPro MSC SFM Basic Medium CTS、StemPro MSC SFMSupplement CTS、GlutaMAX是Gibco公司产品。

如前述的培养基，所述肿瘤坏死因子α终浓度为15～50ng/ml。

如前述的培养基，所述肿瘤坏死因子α是Peprotech公司的重组人源肿瘤坏死因子α。

本发明还提供了一种可提高脐带间充质干细胞CD106和CD54阳性亚群比例的培养方法，它包括：

使用如前所述培养基处理脐带间充质干细胞24～48h。

如前述的培养方法，它还包括：使用如前所述StemPro MSC SFM Medium CTS完全培养基对脐带间充质干细胞进行原代培养。

如前述的培养方法，它还包括：使用如前所述StemPro MSC SFM Medium CTS完全培养基对脐带间充质干细胞进行驯化。

本发明使用特定的细胞培养基与肿瘤坏死因子α相配合，实现了如下有益效果：

1)本发明可将脐带间充质干细胞CD106阳性亚群比例从10％～20％提高50％以上，最高可提高至86.63％。

2)本发明可将脐带间充质干细胞CD54阳性亚群比例从85～90％提高至98～100％。

3)本发明对干细胞的增殖活性影响较小，使用本发明处理脐带间充质干细胞48h后，其增殖活性未见显著改变。

4)本发明操作简单，只需普通细胞培养操作即可，杜绝了纯化过程所带来的人工成本提高和污染问题。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：实施例1和实施例2获得脐带间充质干细胞的原代和传代培养形态图。

图2：实施例3和实施例4获得脐带间充质干细胞经不同浓度重组人源TNF-α因子处理24和48小时后形态变化。

图3：实施例3和实施例4获得脐带间充质干细胞经不同浓度重组人源TNF-α因子处理24和48小时后CD54和CD106亚群比例变化峰形图。

图4：实施例3和实施例4获得脐带间充质干细胞经不同浓度重组人源TNF-α因子处理24和48小时后CD54和CD106亚群比例变化柱形统计图。#表示对照组与各TNF-α处理实验组相比具有极显著性差异，P＜0.01；*表示同TNF-α浓度和同处理时间下，DMEM/F12组与StemPro组相比具有显著差异，P＜0.05；**表示同TNF-α浓度和同处理时间下，DMEM/F12组与StemPro组相比具有极显著差异，P＜0.05。

图5：实施例3和实施例4获得脐带间充质干细胞经不同浓度重组人源TNF-α因子处理24和48小时后脐带间充质干细胞的增殖情况。

具体实施方式

实施例1含胎牛血清培养基中获取脐带间充质干细胞

将50毫升胎牛血清添加至500毫升DMEM/F12基础培养基中，配制成含10％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基。将脐带剪成1厘米小段，去除动脉及静脉血管及脐带外围的羊膜组织，获得脐带华通氏胶，利用眼科剪将脐带华通氏胶剪成肉糜状并混合2毫升含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，均匀地分散在培养皿内，置于37℃5％CO₂培养箱内，24小时后补液8毫升；待原代细胞汇合度达40％，用胰酶替代物CTS TrypLE Select Enzyme消化并接种培养于事先利用基质包被的培养瓶内，待达到90％再进行新一轮消化和传代，从而获取脐带间充质干细胞(图1)。

实施例2无血清培养基中获取脐带间充质干细胞

将500毫升StemPro MSC SFM Basic Medium CTS(Gibco公司)、75毫升StemProMSC SFM Supplement CTS(Gibco公司)、5毫升L-谷氨酰胺或谷氨酰胺替代物GlutaMAX(Gibco公司)混合后获得StemPro MSC SFM Medium CTS完全培养基。首先利用浓度为10μg/ml的人源纤粘蛋白或Gibco公司商品化CELLstart CTS产品工作液37℃包被培养皿60分钟或4℃包被培养皿12小时；将脐带剪成1厘米小段，去除动脉及静脉血管及脐带外围的羊膜组织，获得脐带华通氏胶，利用眼科剪将脐带华通氏胶剪成肉糜状并混合2毫升StemProMSC SFM Medium CTS无血清完全培养基，均匀地分散在培养皿内，置于37℃5％CO₂培养箱内，24小时后补液8毫升。待原代细胞汇合度达40％，用胰酶替代物CTS TrypLE SelectEnzyme消化并接种培养于事先利用基质包被的培养瓶内，待达到90％再进行新一轮消化和传代，从而获取脐带间充质干细胞(图1)。

实施例3不同浓度肿瘤坏死因子α(TNF-α)处理含胎牛血清培养基中获取的脐带间充质干细胞CD106和CD54亚群比例的影响

1.方法

按比例将重组人源TNF-α因子加入到实施例1中所述的含10％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基中，使获得的溶液中重组人源TNF-α因子的终浓度分别为5、15、30和50ng/ml；将实施例1中所获得的P2代脐带间充质干细胞分别利用含上述浓度重组人源TNF-α因子的DMEM/F12完全培养基处理；分别处理24和48小时后，消化收获细胞(图2)。将上述细胞孵育CD54和CD106抗体后，利用流式细胞仪检测上述两种抗体的阳性率，从而分析CD54和CD106阳性细胞亚群比例。

2.结果

如图3和4所示，添加TNF-α的含10％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基，都能使CD54亚群比例达到或接近100％；而CD106亚群比例则随着TNF-α浓度或处理时间的增加而增加，其中50ng/ml TNF-α处理48h后，CD106阳性率不到40％。

实施例4本发明无血清培养基中获取的脐带间充质干细胞CD106和CD54亚群比例的影响

1.方法

按比例将重组人源TNF-α因子加入到实施例2中所述的StemPro MSC SFM MediumCTS无血清完全培养基中，使获得的溶液中重组人源TNF-α因子的终浓度分别为5、15、30和50ng/ml；将实施例2中所获得的P2代脐带间充质干细胞分别利用含上述浓度重组人源TNF-α因子的StemPro MSC SFM Medium CTS无血清完全培养基处理；分别处理24和48小时后，消化收获细胞(图2)。将上述细胞孵育CD54和CD106抗体后，利用流式细胞仪检测上述两种抗体的阳性率，从而分析CD54和CD106阳性细胞亚群比例。

2.结果

如图3和4所示，含TNF-α的StemPro MSC SFM Medium CTS无血清完全培养基，都能使CD54亚群比例达到或接近100％；而CD106亚群比例则随着TNF-α浓度或处理时间的增加而增加，其中50ng/ml TNF-α处理48h后，CD106阳性率接近80％。

实施例5不同浓度TNF-α重组因子对无血清培养基中获取的脐带间充质干细胞增殖活性的影响

1.方法

使用CCK-8检测前述两种培养基中TNF-α浓度与处理时间对脐带间充质干细胞增殖活性的影响。具体操作如下：

含血清培养基组：将实施例1中所获得的P2代脐带间充质干细胞分别接种在96孔板的孔中，每孔植入2×10³个细胞；将实施例3所获得的含重组人源TNF-α因子终浓度分别为5、15、30和50ng/ml的含10％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基分别处理24和72小时后，在培养基中添加CCK-8溶液，使CCK-8终浓度为10％；4小时后利分光光度计测定每孔吸光值。

无血清培养基组：将实施例2中所获得的P2代脐带间充质干细胞分别接种在96孔板的孔中，每孔植入2×10³个细胞；将实施例4所获得的含重组人源TNF-α因子终浓度分别为5、15、30和50ng/ml的StemPro MSC SFM Medium CTS无血清完全培养基分别处理24和72小时后，在培养基中添加CCK-8溶液，使CCK-8终浓度为10％；4小时后利分光光度计测定每孔吸光值。

2.结果

如图5所示，与未添加TNF-α因子脐带间充质干细胞相比，含5、15、30和50ng/ml浓度TNF-α因子的中的脐带间充质干细胞在24和48小时的增殖活性未受到显著性影响。

综上，本发明的培养基可以显著提高脐带间充质干细胞CD106和CD54阳性亚群的比例，且不会显著影响细胞的增殖活性。将本发明应用于干细胞治疗领域，具有突出的商业价值。

Claims

1.一种培养基，其特征在于，它是在StemPro MSC SFM Medium CTS完全培养基的基础上加入终浓度5～50ng/ml肿瘤坏死因子α的培养基。

2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述StemPro MSC SFM Medium CTS完全培养基由如下成分组成：

3.如权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述StemPro MSC SFM Basic MediumCTS、StemPro MSC SFM Supplement CTS、GlutaMAX是Gibco公司产品。

4.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述肿瘤坏死因子α的终浓度是15～50ng/ml。

5.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述肿瘤坏死因子α是Peprotech公司的重组人源肿瘤坏死因子α。

6.一种可提高脐带间充质干细胞CD106和CD54阳性亚群比例的培养方法，其特征在于，它包括：

使用如权利要求1～5任一所述培养基处理脐带间充质干细胞24～48h。

7.如权利要求6所述的培养方法，其特征在于，它还包括：使用如权利要求1～5任一所述StemPro MSC SFM Medium CTS完全培养基对脐带间充质干细胞进行原代培养。

8.如权利要求6所述的培养方法，其特征在于，它还包括：使用如权利要求1～5任一所述StemPro MSC SFM Medium CTS完全培养基对脐带间充质干细胞进行驯化。