KR20100012153A - 인간 줄기세포에서 고활성 줄기세포를 분리하는 방법 및상기 방법에 의해 분리된 고활성 줄기 세포 - Google Patents

인간 줄기세포에서 고활성 줄기세포를 분리하는 방법 및상기 방법에 의해 분리된 고활성 줄기 세포 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 줄기세포에서 고활성 줄기세포를 분리하는 방법, 상기 방법에 의해 분리된 고활성 줄기세포, 상기 줄기세포를 포함하는 세포 치료제 및 특정 사이토카인을 포함하는 줄기세포에서 고활성 줄기세포를 분리하기 위한 배지에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 방법을 이용시 다양한 기원의 중배엽 줄기세포에서 고효율의 줄기세포를 분리해 내는데 매우 유용할 것이며, 또한 다른 조건에서 배양되고 있는 다양한 기원의 줄기세포에서도 적용이 가능하므로, 고효율성의 세포 치료제를 개발하는데 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이다. 체외에서 여러 계대에 따른 증가되는 노화된 줄기세포를 효과적으로 분리해 낼 수 있으며, 이에 따라 줄기세포의 활성을 되돌릴 수 있는 방법으로 제시될 수 있다.
인간 줄기세포, 구체형성, 사이토카인, 고효율성, 중배엽 줄기세포

Description

인간 줄기세포에서 고활성 줄기세포를 분리하는 방법 및 상기 방법에 의해 분리된 고활성 줄기 세포{Method for separating high activity stem cells form human stem cells and high activity stem cells separated by the method}
본 발명은 인간 줄기세포의 고활성 세포 분리 방법, 상기 방법에 의해 분리된 줄기세포, 상기 줄기세포를 포함하는 세포 치료제 및 특정 배지에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 생물을 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서, 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.
줄기세포는 크게 배아(embryo)에서 얻어지고 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력(totipotent)을 지닌 전분화능(pluripotency)의 배아줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)와 각 조직에서 얻어지는 다분화능(multipotency)의 성체줄기세포(adult stem cell)로 구분된다. 배아발생 초기인 포배기(blastocyte)의 세포내괴(inner cell mass)는 장차 태아를 형성할 부분으로서 이 세포내괴로부터 형성된 배아줄기세포는 이론적으로 한 개체를 구성하는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 줄기세포이다. 즉, 배아줄기세포는 무제한적으로 증식이 가능한 미분화 세포이고, 모든 세포로 분화할 수 있으며 성체줄기세포와 달리 배(germ) 세포도 만들 수 있어 다음 세대로 유전될 수 있다.
인간 배아줄기세포는 인간 배아(blastocyst) 형성시 세포내괴(inner cell mass) 만을 분리하여 배양함으로써 제조되는데, 현재 전 세계적으로 만들어진 인간 배아줄기세포는 불임시술 뒤 남은 냉동배아로부터 얻어졌다. 이 세포의 특징은 모든 세포로 분화가능한 잠재력(totipotent)을 갖고 있어, 어떠한 조직 세포로도 분화될 수 있으며, 또한 사멸하지 않고(immortal) 미분화상태에서 배양가능하며 배 세포(germ cell)의 제조도 가능하므로 다음 세대로 유전될 수 있는 특징을 가지고 있다 (Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff et al., Nat. Biotechnol., 18: 399-404, 2000).
여러 세포로의 분화능을 가진 인간배아 줄기세포를 세포 치료제로 이용하기 위한 다양한 시도는 아직 암화 형성과 면역 거부 반응의 높은 벽을 완전히 제어하지 못하는 상황이다.
최근 이러한 문제점을 극복하기 위한 대안으로 면역 조절 기능을 가지고 있는 것으로 보고되어지고 있는 중배엽 줄기세포가 제시되고 있다. 중배엽 줄기세포 는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포로의 분화가 가능한 다능성을 가진 세포로 면역 반응을 조절하는 기능도 가지고 있는 것으로 보고되고 있다. 다양한 조직에서 분리, 배양이 가능하나 각 기원에 따른 능력은 조금씩 다르며 세포표면 표식자도 달라 현재 중배엽 줄기세포의 정의는 골세포, 연골세포, 근육세포로 분화가 가능하며, 소용돌이 모양의 형태와 기본적인 세포표면 표식자 SH2(+), SH3(+), CD34(-), CD45(-)의 발현 정도로 규정하고 있다.
세포 치료나 재생의학에서 최소 필요한 세포의 수는 1X10^9 정도이다. 그러나 조건을 잡고 기준을 정하는 실험까지 포함한다면 그 양은 더욱 늘어난다. 기존의 다양한 기원의 중배엽 줄기세포로 이 정도의 양을 공급하려면 최소 in vitro에서 10번 이상의 계대가 필요하게 된다. 세포는 노화되고 변형되어 더 이상 치료의 개념에 적합하지 않게 된다. 이는 지금의 중배엽 줄기세포의 배양시스템이 가지고 있는 풀어야 할 문제점의 하나이다. 또한 이러한 세포로 조건과 기준을 잡았다 하더라도 치료에 사용할 시에는 이미 그 세포는 바닥이 나고 다른 사람의 중배엽 줄기세포를 써야 하는 경우가 발생하고 그럴 경우 또 다른 세포이용에 따른 부가적인 실험을 다시 거처야 한다. 기존의 중배엽 줄기세포를 세포치료제로 사용하기 위해서는 이러한 문제점을 해결 할 수 있는 새로운 방법 제시가 필요하다.
한국특허공개 제2008-3418호에는 배아줄기세포의 췌장세포로의 유도 방법이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제10-593397호에는 중배엽 줄기세포 및/또는 Ｐ 물질을 함유하는 상처 치유 또는 상처 치유 촉진제, 또는 세포 치료제가 개시되어 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 기존의 만들어진 인간 줄기세포의 체외 배양의 한정성을 극복하고, 노화된 세포의 재활성 유지 및 여러 다양한 유전적 배경을 가진 줄기세포에서도 동일한 결과를 만들어 내어 본 발명의 방법이 세포치료 및 재생의학에 필요한 세포를 만들어 낼 수 있는 적합한 발명임을 제시하고자 한다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 인간 줄기세포에서 고 활성 줄기세포를 분리하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 분리된 줄기세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 줄기세포를 포함하는 세포 치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 줄기세포에서 고활성 줄기세포를 분리하기 위한 특정 배지를 제공한다.
본 발명에 따르면, 세포 치료제의 가장 좋은 자원인 중배엽 줄기세포의 공급 원으로 기존의 확립된 중배엽 줄기세포를 이용할 수 있으며, 또한 이 방법은 현재 사용되고 있는 여러 기원, 다양한 배양 조건의 인간 중배엽 줄기세포 모두에 적용될 수 있는 광범위한 규정화된 분리 방법이 될 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
인간 줄기세포에서 구체 (sphere)를 형성하는 단계를 포함하는 인간 줄기세포에서 고활성 줄기세포의 분리 방법을 제공한다. 상기 방법은 보다 구체적으로,
a) 인간 줄기세포에서 구체를 형성하는 단계; 및
b) 상기 형성된 구체와, 구체 형성에 포함되지 않은 세포를 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에서, 상기 a) 단계는 소혈청 배제 배지와 저부착 페트리 디쉬에서 수행할 수 있다. 상기 소혈청 배제 배지는 소혈청 배지가 없는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)과 20% SR (Serum Replacement)을 포함하는 배지인 것이 바람직하다. 저부착 페트리 디쉬는 고착형 성장세포를 5 % 미만의 효율로 부착 시키는 페트리 디쉬를 말한다.
바람직하게는, 상기 a) 단계는 인간 줄기 세포를 단백질분해효소 처리 후, 소혈청 배지가 없는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)과 20% SR을 포함하는 배지에서 20-28시간 동안, 바람직하게는 24시간 동안 저부착 페트리 디쉬를 이용하여 부유시킴으로써 수행될 수 있다.
상기 단백질분해효소는 트립신을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 b) 단계는 상기 형성된 구체와, 구체 형성에 포함되지 않은 세포를 스트레이너(strainer)를 이용하여 분리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 줄기세포는 바람직하게는 중배엽 줄기세포이다.
본 발명에서 사용된 용어 '줄기세포'는 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 마스터 세포를 지칭한다. 줄기세포는 발달가능한 만능성 또는 다능성 세포이다. 줄기세포는 2개의 딸줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래('전이(transit)') 세포로 분열될 수 있으며, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다.
본 발명에서 사용된 용어 '중배엽 줄기세포'는 골세포, 연골세포, 근육세포 등으로 분화가 가능하며, 소용돌이 모양의 형태와 기본적인 세포표면 표식자 SH2(+), SH3(+), CD34(-), CD45(-)의 발현 정도로 규정하고 있다.
본 발명의 방법은 소혈청 배제 배지와 낮은 부착율의 페트리 디쉬(petri dish)에서 인간 줄기세포의 구체 형성으로 이루어져 있다. 상기 처리 단계 중에서 구체 형성에 사용된 소혈청 배제 배지는 DMEM 기본배지에 Serum Replacement (SR) 등의 조합이다. 여기에 상황에 따른 여러 사이토카인의 첨가가 가능하다는 것은 당업자가 용이하게 인식할 수 있다.
본 발명의 방법에 이용되는 Serum Replacement (SR)은 동물유래의 인자를 제거하기 위한 목적으로 인간 배아줄기세포 배양에서, 소혈청을 대신하여 이용되어 왔다. 본 발명에서는 부착세포의 부착률을 지지하는 소혈청을 대신하여, 부착을 지지하지 않는 SR을 영양분 공급과 부유의 두 가지 목적에 맞추어 사용하였다.
본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해 분리된 고효율의 줄기세포를 제공한다. 분리된 줄기세포는 사이토카인 분비능 향상과 줄기세포 유전자 발현률의 증가, 세포 생존력 및 생장력 향상을 보여준다 (도 2 내지 4 참고).
상기 방법을 통해 분리한 줄기세포는 각기 다른 기원의 줄기세포에서도 동일한 결과를 도출하였으며, 이것은 형광세포 분석기 (FACS)와 항원 항체 반응 (ELISA) 및 실시간 연쇄 중합반응 (Real-Time PCR)로 확인하였다.
본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해 분리된 줄기세포를 포함하는 세포 치료제를 제공한다. 구체적으로, 상기 세포 치료제는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포 형성 등에 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 '세포치료제'는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류되며 본 발명은 특히 줄기세포 치료제에 관한 것이다.
본 발명은 또한, SR 등을 포함하는 줄기세포에서 고효율 줄기세포를 분리하기 위한 배지를 제공한다. 상기 배지는 바람직하게는 소혈청 배지가 없는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)과 20% SR을 포함할 수 있다. 상기 줄기세포 는 바람하게는 중배엽 줄기세포이다.
상기 배지에는 줄기세포에서 고효율 줄기세포를 분리하는데 도움을 주는 기타 성분이 포함될 수 있다는 것은 당업자가 용이하게 인식할 수 있다.
이하, 하기 실시예를 들어 본 발명의 실시 형태를 구체적으로 설명 하겠으나, 하기 실시예는 본 발명을 예시 하는 것일뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
구체(sphere) 형성
체외에서 유지되던 인간 줄기 세포를 단백질분해효소(0.25% trypsin/EDTA)) 처리 후, 소혈청배지가 없는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium ; WelGENE Inc.)+20% SR (GIBCO) 배지에서 24시간동안 저부착 페트리 디쉬 (SPL)를 이용하여 부유시켰다.
구체형성 세포 분리
24시간동안 부유를 통해 만들어진 구체와, 구체형성에 포함되지 않은 그 외의 세포를 스트레이너(strainer)를 이용하여 분리하였다.
분리된 세포의 특성 분석
1. 실시간 연쇄중합반응을 통한 정량적 유전자 발현율 확인
분리된 세포의 RNA를 이용하여 cDNA를 합성 후 줄기세포 관련 유전자 프라이머를 이용하여 실시간 연쇄중합 반응을 실시하였다.
2. 항원 항체 반응을 이용한 사이토카인 분비능 확인
분리된 세포의 배양액에서 항체를 이용하여 여러 사이토카인의 분비능을 확인하였다.
3. 형광세포분석기를 이용한 세포주기 분석
분리된 세포의 핵염색을 이용하여 세포주기에 따른 변화를 확인하였다.
실시예 1: 인간 탯줄혈액 유래 중배엽 줄기세포를 이용한 고효율성 세포 분리
인간 탯줄혈액 유래 중배엽 줄기세포를 이용하여 본 발명의 방법으로 고효율의 중배엽 줄기세포를 분리하였다. 체외배양으로 유지되던 줄기 세포를 단백질분해효소(0.25% trypsin/EDTA) 처리 후, 소혈청 배지가 없는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) +20% SR 배지에서 24시간동안 저부착 페트리 디쉬를 이용하여 부유시켰다. 24시간동안 부유를 통해 만들어진 구체와, 구체형성에 포함되지 않은 그 외의 세포를 스트레이너를 이용하여 분리하였다. 분리된 세포의 RNA를 이용하여 cDNA를 합성 후 줄기세포 관련 유전자 프라이머를 이용하여 실시간 연쇄중합 반응을 실시하여 줄기세포 표지자 관련 유전자의 발현 정도를 확인하였다. 여러 사이토카인의 분비능은 분리된 세포의 배양액에서 항체를 이용하여 확인하였으며, 세포의 핵염색을 이용하여 세포주기에 따른 변화를 확인하였다.
구체 형성 후 줄기세포 관련 유전자의 발현율이 증가되었으며, 합성기인 S phase 가 유의적으로 증가함을 관찰하였다. 혈관형성과 성장관련 사이토카인의 증가 또한 유의적으로 증가함을 확인 하였다.
실시예 2: 인간 배아줄기세포 유래 중배엽 줄기세포를 이용한 고효율성 세포 분리
인간 배아줄기세포 유래 중배엽 줄기세포를 이용하여 본 발명의 방법으로 고효율의 중배엽 줄기세포를 분리하였다. 체외배양으로 유지되던 줄기 세포를 단백질분해효소(0.25% trypsin/EDTA) 처리 후, 소혈청배지가 없는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) +20% SR 배지에서 24시간동안 저부착 페트리 디쉬를 이용하여 부유시켰다. 24시간동안 부유를 통해 만들어진 구체와, 구체형성에 포함되지 않은 그 외의 세포를 스트레이너를 이용하여 분리하였다. 분리된 세포의 RNA를 이용하여 cDNA를 합성 후 줄기세포 관련 유전자 프라이머를 이용하여 실시간 연쇄중합 반응을 실시하여 줄기세포 표지자 관련 유전자의 발현 정도를 확인하였다. 여러 사이토카인의 분비능은 분리된 세포의 배양액에서 항체를 이용하여 확인하였으며, 세포의 핵염색을 이용하여 세포주기에 따른 변화를 확인하였다.
구체 형성 후 줄기세포 관련 유전자의 발현율이 증가되었으며, 합성기인 S phase 가 유의적으로 증가함을 관찰하였다. 혈관형성과 성장관련 사이토카인의 증가 또한 유의적으로 증가함을 확인하였다.
도 1은 본 발명의 방법에 적용하여 구체를 형성한 결과이다.
도 2는 본 발명의 방법에 적용한 후 분리된 줄기세포의 세포 주기 FACS 결과로 활발한 증식력을 나타내는 합성기인 S기의 증가를 확인할 수 있다.
도 3은 본 발명의 방법으로 분리된 줄기세포의 사이토카인 분비능을 분석한 결과로, IL-6, GM-CSF, VEGF, HGF, IL-8, IFN-g, bFGF 등이 유의적으로 증가함을 알 수 있다.
도 4는 본 발명의 방법으로 분리된 줄기세포의 역으로의 분화를 확인한 결과로, 만능세포 표지자인 OCT-4와 E-cadherin의 증가를 확인할 수 있다.
도 5는 본 발명의 방법을 도식화한 것이다.

Claims (8)

  1. a) 인간 줄기세포에서 구체(sphere)를 형성하는 단계; 및
    b) 상기 형성된 구체와, 구체 형성에 포함되지 않은 세포를 분리하는 단계를 포함하는 인간 줄기세포에서 고활성 줄기세포를 분리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계는 소혈청 배제 배지와 저부착 페트리 디쉬에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 소혈청 배제 배지는 소혈청 배지가 없는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)과 20% SR (Serum Replacement)을 포함하는 배지임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계는 인간 줄기 세포를 단백질분해효소 처리 후, 소혈청 배지가 없는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)과 20% SR을 포함하는 배지에서 20-28시간 동안 저부착 페트리 디쉬를 이용하여 부유시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 중배엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 의해 분리된 고활성 줄기세포.
  7. 제6항의 고활성 줄기세포를 포함하는 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 또는 심근세포 형성용 세포 치료제.
  8. 소혈청 배지가 없는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)과 20% SR을 포함하는, 인간 줄기세포에서 고활성 줄기세포를 분리하기 위한 배지.
KR1020080073383A 2008-07-28 2008-07-28 인간 줄기세포에서 고활성 줄기세포를 분리하는 방법 및상기 방법에 의해 분리된 고활성 줄기 세포 KR101175175B1 (ko)

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