RU2823729C1

RU2823729C1 - Способ получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека и получаемые согласно данному способу мезенхимальные стволовые клетки

Info

Publication number: RU2823729C1
Application number: RU2022117235A
Authority: RU
Inventors: Ки Нам КИМ; Сон Хён ЦОЙ; Порам О; Ми Кюн ЦОЙ; Чон Квон Цо
Original assignee: Тэвун Фармасьютикал Ко., Лтд.
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2024-07-29

Abstract

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК), в котором используются культуральные среды без фидерных клеток, чужеродных компонентов и сыворотки. При культивировании в висячей капле или с помощью V-образной пробирки, 96-луночного планшета круглой формы или конической пробирки из ПСК получают сфероидальные эмбриоидные тельца, однородные по форме и размеру, которые затем индуцируют для дифференцировки в МСК путем адгезивного культивирования. Данное изобретение решает проблему загрязнения МСК посторонним материалом животного происхождения и эффективно для получения высокобезопасных мезенхимальных стволовых клеток человека, сохраняющих свои характеристики после продолжительного пересева, например 20 и более пассажей. 17 з.п. ф-лы, 12 ил., 2 табл., 4 пр.

Description

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к способу получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека и, более конкретно, к способу получения мезенхимальных стволовых клеток, причем данные мезенхимальные стволовые клетки характеризуются повышенной безопасностью и сохраняют свои характеристики в течение длительного периода времени даже после нескольких пересевов благодаря применению среды без чужеродных компонентов и сыворотки для получения мезенхимальных стволовых клеток и сфероидальных эмбриоидных телец для образования зрелых эмбриоидных телец, однородных по форме и размеру.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Стволовые клетки представляют собой клетки, которые могут дифференцироваться в различные клетки, составляющие биологические ткани, и в целом обозначают недифференцированные клетки на стадии преддифференцировки, которые можно получить из каждой ткани эмбриона, плода и взрослого человека. Стволовые клетки дифференцируются в специфические клетки под действием стимула дифференцировки (окружения), могут воспроизводить (самообновление) такие же клетки, как они сами, путем клеточного деления, и, таким образом, обладают свойствами пролиферации (размножения), в отличие от клеток, у которых дифференцировка завершена, а деление клеток остановилось, и характеризуются пластичностью дифференцировки, поскольку стволовые клетки могут дифференцироваться в различные клетки в различном окружении или под действием других стимулов дифференцировки.

Стволовые клетки можно разделить на плюрипотентные, мультипотентные и унипотентные стволовые клетки в соответствии с их способностью к дифференцировке. Плюрипотентные стволовые клетки представляют собой плюрипотентные клетки, способные дифференцироваться во все клетки, и эмбриональные стволовые клетки (ESC), индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) и аналогичные клетки представляют собой плюрипотентные стволовые клетки. Примерами взрослых стволовых клеток могут быть плюрипотентные и/или унипотентные стволовые клетки.

Эмбриональные стволовые клетки образуются из внутренней клеточной массы бластоцисты, которая представляет собой раннюю стадию эмбрионального развития, и способны к дифференцировке во все клетки, так что они могут дифференцироваться в любую тканевую клетку. Эмбриональные стволовые клетки бессмертны, их можно культивировать в недифференцированном состоянии, и они обладают признаками, которые могут быть переданы следующему поколению, поскольку они могут производить зародышевые клетки, в отличие от взрослых стволовых клеток (Thomson et al, Science, 282: 1145-1147, 1998; Reubinoff et al, Nat Biotechnoi, 18: 399-404, 2000).

Эмбриональные стволовые клетки человека получают путем выделения и культивирования только внутренней клеточной массы во время формирования человеческих эмбрионов, и в настоящее время эмбриональные стволовые клетки человека, производимые во всем мире, получают из замороженных эмбрионов, оставшихся после процедуры оплодотворения in vitro. Хотя были предприняты различные попытки применять плюрипотентные эмбриональные стволовые клетки человека, которые могут дифференцироваться во все клетки, в качестве клеточного терапевтического средства, до сих пор полностью не взяты под контроль риск рака и высокий барьер иммунного отторжения.

При этом индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), которые относятся к плюрипотентным стволовым клеткам, представляют собой клетки, когда полностью дифференцировавшиеся взрослые клетки различными путями дедифференцируются и возвращаются в состояние плюрипотентных стволовых клеток, что является начальной стадией дифференцировки. На сегодняшний день сообщалось, что дедифференцированные клетки обладают почти такими же характеристиками, что и эмбриональные стволовые клетки, которые являются плюрипотентными стволовыми клетками, по экспрессии генов и способности к дифференцировке. Однако даже в случае iPSC риск иммунного отторжения можно исключить с помощью аутологичных клеток, но риск рака все еще остается проблемой, требующей решения.

В качестве альтернативы для решения этой проблемы были предложены мезенхимальные стволовые клетки, не имеющие риска развития рака при иммуномодулирующей функции. Сообщалось, что мезенхимальные стволовые клетки представляют собой плюрипотентные клетки, способные дифференцироваться в адипоциты, остеоциты, хондроциты, миоциты, нервные клетки и кардиомиоциты, а также обладают функцией регуляции иммунного ответа. Хотя мезенхимальные стволовые клетки можно выделять и культивировать из различных тканей, четко определить мезенхимальные стволовые клетки непросто, поскольку характеристики и маркеры клеточной поверхности для каждого источника немного различаются. Однако, когда стволовые клетки могут дифференцироваться в остеоциты, хондроциты и миоциты, имеют веретенообразную форму и экспрессируют основные маркеры клеточной поверхности, такие как CD73(+), CD105(+), CD34(-) и CD45(-), эти стволовые клетки обычно определяют как мезенхимальные стволовые клетки.

Кроме того, для того чтобы мезенхимальные стволовые клетки можно было применять в качестве клеточного терапевтического средства, должно быть удовлетворено требование к минимальному количеству клеток (приблизительно 1×10⁹), необходимому в области регенеративной медицины и/или клеточной терапии, и необходимое количество клеток будет еще выше, если принять во внимание сходные эксперименты, в которых определяют соответствующие условия и определяют критерии. Поэтому для обеспечения этого количества из имеющихся мезенхимальных стволовых клеток из различных источников в экспериментах in vitro необходимо по меньшей мере 10 пассажей, и в этом случае клетки стареют и модифицируются, поэтому мезенхимальные стволовые клетки становятся непригодны для достижения цели применения в качестве клеточного терапевтического средства. Наконец, клетки, используемые для клинических испытаний, и клетки, проходящие оценку качества, неизбежно отличаются, поэтому существует недостаток, заключающийся в том, что нельзя исключить риск, возникающий в процессе постпроверочной формы. Таким образом, для того чтобы применять мезенхимальные стволовые клетки в качестве клеточного терапевтического средства, важно сохранять характеристики мезенхимальных стволовых клеток неизменными, даже если пересев повторяют в течение длительного периода времени.

В качестве альтернативы этим мезенхимальным стволовым клеткам, получаемым из взрослого организма, был предложен способ индуцирования дифференцировки из плюрипотентных стволовых клеток человека в мезенхимальные стволовые клетки. Однако известные на сегодняшний день способы являются дорогостоящими и имеют такие недостатки, как процесс индукции специфическими цитокинами (например, BMP), что требует контроля концентрации или индуцирования чужеродных фидерных клеток, что ведет к риску чужеродных патогенов, и использование фетальной бычьей сыворотки (FBS). Способ индуцирования дифференцировки из плюрипотентных стволовых клеток человека в мезенхимальные стволовые клетки предшествующего уровня техники (WO 2011052818) отличается возможностью миграции чужеродных клеток из-за использования фидерных клеток, поскольку плюрипотентные стволовые клетки человека культивируют на чужеродных фидерных клетках, что может быть проблемой из-за чужеродных патогенов во время культивирования плюрипотентных стволовых клеток человека. Кроме того, из-за опасений по поводу зоонозных инфекций, вызываемых использованием сыворотки животного происхождения, такой как бычья сыворотка или фетальная телячья сыворотка, во время культивирования плюрипотентных стволовых клеток, необходимо улучшить способ культивирования без чужеродных компонентов и сыворотки, в котором не используют чужеродную сыворотку животных, при разработке в будущем клеточного терапевтического средства.

Таким образом, авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования для решения проблем, связанных с безопасностью стволовых клеток и массовым производством стволовых клеток, с целью налаживания производства мезенхимальных стволовых клеток, дифференцировавшихся из плюрипотентных стволовых клеток человека, в качестве клеточного терапевтического средства, и в результате подтвердили, что безопасность клеток становится максимальной благодаря среде без чужеродных компонентов и сыворотки, для образования зрелых эмбриоидных телец, однородных по форме и размеру можно применять сфероидальные эмбриоидные тельца, а мезенхимальные стволовые клетки, дифференцировка которых индуцирована ими, сохраняют характеристики мезенхимальных стволовых клеток в течение длительного периода времени даже после повторных пересевов, тем самым выполнив настоящее изобретение.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Техническая задача

Целью настоящего изобретения является создание способа получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека, доступных в качестве клеточного терапевтического средства, путем получения мезенхимальных стволовых клеток, в котором решена проблема безопасности, обусловленная загрязнением материалами, происходящими от инородных клеток и инородных животных, и характеристики мезенхимальных стволовых клеток сохраняются в течение длительного периода времени даже после повторных пересевов.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление мезенхимальных стволовых клеток, получаемых согласно данному способу, и использующего их клеточного терапевтического средства.

Техническое решение

Для достижения данных целей настоящее изобретение имеет целью способ получения мезенхимальных стволовых клеток, у которых сохраняется стабильность при продолжительном пересеве, из плюрипотентных стволовых клеток человека, причем данный способ предусматривает:

(a) культивирование плюрипотентных стволовых клеток человека в бессывороточной культуральной среде для плюрипотентных стволовых клеток без чужеродных фидерных клеток для получения колонии плюрипотентных стволовых клеток человека и выделение плюрипотентных стволовых клеток человека из данной колонии;

(b) образование одиночных сфероидальных эмбриоидных телец путем суспендирования выделенных плюрипотентных стволовых клеток в среде для образования эмбриоидных телец и последующего культивирования выделенных плюрипотентных стволовых клеток таким образом, чтобы плюрипотентные стволовые клетки агрегировали;

(c) образование зрелых эмбриоидных телец путем суспензионного культивирования эмбриоидных телец в среде для созревания эмбриоидных телец;

(d) индуцирование дифференцировки в мезенхимальные стволовые клетки путем адгезивного культивирования эмбриоидных телец в культуральной среде для мезенхимальных стволовых клеток без чужеродных компонентов и сыворотки; и

(e) пролиферацию и культивирование дифференцировавшихся мезенхимальных стволовых клеток в культуральной среде для мезенхимальных стволовых клеток без чужеродных компонентов и сыворотки при сохранении идентичности мезенхимальных стволовых клеток.

Настоящее изобретение также относится к мезенхимальным стволовым клеткам, дифференцировавшимся и индуцированным из плюрипотентных стволовых клеток человека, полученных согласно данному способу, и клеточному терапевтическому средству, включающему в себя данные мезенхимальные стволовые клетки.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлен схематический вид существующего способа получения мезенхимальных стволовых клеток, получаемых из плюрипотентных стволовых клеток (WO 2011052818), и улучшенного способа получения мезенхимальных стволовых клеток, получаемых из плюрипотентных стволовых клеток согласно настоящему изобретению.

На фиг. 2 представлены фотографии колоний плюрипотентных стволовых клеток человека, полученные путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток человека в бессывороточной культуральной среде для плюрипотентных стволовых клеток без чужеродных фидерных клеток и их однородного фрагментирования до размера 200 мкм на 200 мкм (фиг. 2А), и выделенной из них клеточной морфологии (фиг. 2В).

Фиг. 3 иллюстрирует результаты проведения иммунофлуоресцентного окрашивания маркеров плюрипотентности ОСТ-4 и SSEA-4 для анализа характеристик плюрипотентных стволовых клеток, культивируемых в культуральной среде без фидерных клеток, чужеродных компонентов и сыворотки.

На фиг. 4 представлены фотографии, показывающие размеры и морфологию эмбриоидных телец, полученных с помощью существующего способа получения (WO 2011052818), и эмбриоидных телец, полученных с помощью улучшенного способа согласно настоящему изобретению.

На фиг. 5 представлены фотографии, показывающие эффективность дифференцировки из эмбриоидных телец, полученных с помощью существующего способа получения (WO 2011052818), и эмбриоидных телец, полученных с помощью улучшенного способа согласно настоящему изобретению, в мезенхимальные стволовые клетки и клеточную морфологию.

Фиг. 6 иллюстрирует результаты анализа экспрессии маркера клеточной поверхности происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток, культивируемых в культуральной среде без фидерных клеток, чужеродных компонентов и сыворотки.

Фиг. 7 иллюстрирует результаты анализа способности к дифференцировке происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток, культивируемых в культуральной среде без фидерных клеток, чужеродных компонентов и сыворотки.

Фиг. 8 иллюстрирует результаты анализа кариотипа происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток, культивируемых в культуральной среде без фидерных клеток, чужеродных компонентов и сыворотки, с помощью G-бэндинга.

На фиг. 9 представлено сравнение клеточной морфологии пассажа 7 и пассажа 12 происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток, полученных с помощью существующего способа получения мезенхимальных стволовых клеток, происходящих от плюрипотентных стволовых клеток (WO 2011052818), и происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток, полученных с помощью улучшенного способа получения мезенхимальных стволовых клеток, происходящих от плюрипотентных стволовых клеток, согласно настоящему изобретению.

Фиг. 10 подтверждает способность происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток согласно существующему способу получения мезенхимальных стволовых клеток, происходящих от плюрипотентных стволовых клеток (WO 2011052818), и улучшенному способу получения мезенхимальных стволовых клеток, происходящих от плюрипотентных стволовых клеток, согласно настоящему изобретению к дифференцировке в остеоциты, хондроциты, и адипоциты.

На фиг. 11 представлен схематический вид способа получения мезенхимальных стволовых клеток, происходящих от (А) западных эмбриональных стволовых клеток и (В) азиатских индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, которые культивируют посредством формирования зрелых эмбриоидных телец в культуральной среде без фидерных клеток, чужеродных компонентов и сыворотки.

На фиг. 12 представлен анализ плюрипотентности (А) западных эмбриональных стволовых клеток и (В) азиатских индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, культивируемых в культуральной среде без фидерных клеток, чужеродных компонентов и сыворотки.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Если не указано иное, все используемые в настоящем документе технические и научные термины имеют то значение, которое обычно понятно среднему специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. В общем, используемая в настоящем документе номенклатура хорошо известна и широко используется в данной области техники.

Используемый в настоящем документе термин «стволовые клетки» относится к основным клеткам, способным регенерировать неограничивающим образом с образованием специализированных клеток тканей и органов. Стволовые клетки представляют собой плюрипотентные или мультипотентные клетки, которые могут развиваться. Стволовые клетки могут делиться на две дочерние стволовые клетки или одну дочернюю стволовую клетку и одну производную («транзитную») клетку, а затем пролиферировать в клетки зрелой и неповрежденной формы ткани. Такие стволовые клетки могут быть классифицированы различными способами. Один из наиболее часто используемых способов основан на способности стволовых клеток к дифференцировке, и стволовые клетки можно классифицировать на плюрипотентные стволовые клетки, способные дифференцироваться в три зародышевых пласта, мультипотентные стволовые клетки, которые ограничиваются дифференцировкой в определенные зародышевые пласты или далее, и унипотентные стволовые клетки, способные дифференцироваться только в определенные зародышевые пласты.

Используемый в настоящем документе термин «плюрипотентные стволовые клетки» относится к стволовым клеткам, обладающим тотипотентностью, способным дифференцироваться во все три зародышевых пласта, образующих живой организм, и, как правило, им соответствуют эмбриональные стволовые клетки (ESC) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). Стволовые клетки взрослых можно разделить на мультипотентные и унипотентные стволовые клетки.

Используемый в настоящем документе термин «мезенхимальные стволовые клетки» относится к стволовым клеткам, обладающим мультипотентностью, способным дифференцироваться в такие клетки, как адипоциты, остеоциты, хондроциты, миоциты, нервные клетки и кардиомиоциты.

Используемый в настоящем документе термин «дифференцировка» относится к явлению, при котором структура или функция клетки специализируются во время деления, пролиферации и роста клетки. Плюрипотентные мезенхимальные стволовые клетки дифференцируются в клетки-предшественники ограниченного направления дифференцировки (например, мезодермальные клетки), а затем могут далее дифференцироваться в другие формы клеток-предшественников (например, остеобласты и аналогичные клетки), и затем могут дифференцироваться в терминально дифференцированные клетки (например, адипоциты, остеоциты, хондроциты и аналогичные клетки), которые играют свойственную им роль в конкретных тканях (например, в кости и аналогичных тканях).

Используемый в настоящем документе термин «эмбриоидное тельце (ЕВ)» относится к агрегату плюрипотентных стволовых клеток, получаемому для индуцирования дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток. В настоящем изобретении «зрелое эмбриоидное тельце» представляет собой агрегат плюрипотентных стволовых клеток, то есть эмбриоидное тельце в состоянии, в котором эмбриоидное тельце многократно делится в результате суспензионного культивирования и становится больше в размерах, и зрелое эмбриоидное тельце в настоящем изобретении используют в качестве материала для индуцирования дифференцировки в мезенхимальные стволовые клетки.

Используемый в настоящем документе термин «клеточное терапевтическое средство» относится к лекарственному средству, применяемому с целью лечения, диагностики и профилактики с помощью клетки или ткани, полученных путем выделения из человека, культивирования и специфических манипуляций (правила FDA США), и в частности, он относится к лекарственному средству, применяемому с целью лечения, диагностики и профилактики посредством ряда действий по размножению и сортировке in vitro живых аутологичных, аллогенных и ксеногенных клеток или изменению биологических характеристик клеток другими способами с целью восстановления функций клеток или тканей. Клеточные терапевтические средства в общем классифицируют на терапевтические средства на основе соматических клеток и терапевтические средства на основе стволовых клеток в соответствии со степенью дифференцировки клеток, и настоящее изобретение, в частности, относится к терапевтическому средству на основе стволовых клеток.

В настоящем изобретении для решения проблем, связанных с безопасностью и массовым производством клеток, с целью налаживания производства мезенхимальных стволовых клеток, индуцированных для дифференцировки из плюрипотентных стволовых клеток человека, в качестве клеточного терапевтического средства, плюрипотентные стволовые клетки человека индуцировали для дифференцировки в мезенхимальные стволовые клетки в среде без фидерных клеток, чужеродных компонентов и сыворотки. Кроме того, обеспечивали образование одиночных сфероидальных эмбриоидных телец путем межклеточной агрегации плюрипотентных стволовых клеток человека, разницу в качестве между зрелыми эмбриоидными тельцами минимизировали путем суспензионного культивирования таких эмбриоидных телец для образования зрелых эмбриоидных телец, однородных по форме и размеру, и итоговые эффективность и постоянство дифференцировки в мезенхимальные стволовые клетки были улучшены. Полученные таким образом мезенхимальные стволовые клетки продемонстрировали необычный эффект стабильного сохранения характеристик мезенхимальных стволовых клеток даже после повторных продолжительных пересевов после 20 или более пассажей. Таким образом, настоящее изобретение относится к происходящим от плюрипотентных стволовых клеток человека мезенхимальным стволовым клеткам, которые безопасны без загрязнения материалом, происходящим от инородных клеток и инородных животных, характеризуются однородным качеством за счет образования зрелых эмбриоидных телец, однородных по форме и размеру, с использованием сфероидальных эмбриоидных телец, и их можно производить массово, поскольку стабильность пересева остается превосходной в течение длительного периода времени. Таким образом, мезенхимальные стволовые клетки с повышенной продуктивностью и безопасностью, полученные с помощью способа согласно настоящему изобретению, позволяют непрерывно поставлять большое количество мезенхимальных стволовых клеток, необходимых в областях регенеративной медицины и клеточной терапии.

Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека, причем данный способ предусматривает:

Далее каждая стадия данного способа будет описана подробно.

(а) культивирование плюрипотентных стволовых клеток человека в бессывороточной культуральной среде для плюрипотентных стволовых клеток без чужеродных фидерных клеток для получения колонии плюрипотентных стволовых клеток человека и выделение плюрипотентных стволовых клеток человека из данной колонии

В настоящем изобретении плюрипотентные стволовые клетки человека могут представлять собой эмбриональные стволовые клетки или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Плюрипотентные стволовые клетки человека находятся в недифференцированном состоянии.

Как правило, для сохранения недифференцированного состояния при культивировании плюрипотентных стволовых клеток человека в предшествующем уровне техники требуется подложка, и в качестве подложки для человеческих плюрипотентных стволовых клеток в предшествующем уровне техники предпочтительно применяли фибробласты мышиного эмбриона. Однако, поскольку миграция различных патогенов между разными видами признана проблемой при попытках клинического применения плюрипотентных стволовых клеток, в качестве альтернативы для этой проблемы сообщалось о потенциале в качестве подложки для различных клеток человеческого происхождения. Однако невозможно преодолеть недостатки, заключающиеся в том, что также невозможно полностью исключить гетерологичные патогены, для сохранения недифференцированного состояния существенны инородные факторы (например, bFGF, IGF, ACTIVIN и аналогичные факторы), и невозможна непрерывная подача клеток человеческого происхождения для продолжительного культивирования, и аналогичные недостатки.

Однако в способе согласно настоящему изобретению недифференцированное состояние может сохраняться, даже когда применяют сосуд для культивирования, покрытый витронектином, без чужеродных фидерных клеток, и плюрипотентные стволовые клетки человека культивируют в бессывороточной среде.

В настоящем изобретении плюрипотентные стволовые клетки на стадии (а) предпочтительно представляют собой клетки, культивируемые в сосуде для культивирования, покрытом внеклеточным матриксом человеческого происхождения, внеклеточным матриксом, который не содержит компонентов животного происхождения, или синтетическим материалом, способным заменить внеклеточный матрикс, но без ограничения ими.

Внеклеточный матрикс человеческого происхождения предпочтительно представляет собой витронектин, коллаген или ламинин, и внеклеточный матрикс, который не содержит компонентов животного происхождения, отличных от человеческого, предпочтительно представляет собой Matrigel, не содержащий компонентов животного происхождения, а синтетический материал, способный заменить внеклеточный матрикс, предпочтительно представляет собой гепарансульфатпротеогликан, но без ограничения ими.

Таким образом, способ согласно настоящему изобретению отличается тем, что его проводят в среде, свободной на всех стадиях от чужеродных фидерных клеток, цитокинов и ксеногенных материалов. Таким образом, способ согласно настоящему изобретению отличается тем, что его проводят в среде без фидерных клеток, чужеродных компонентов и сыворотки.

В частности, в способе предшествующего уровня техники (WO 2011052818) плюрипотентные стволовые клетки культивировали с использованием чужеродных фидерных клеток, культивируемых в среде, содержащей FBS, а настоящее изобретение отличается применением плюрипотентных стволовых клеток человека, культивируемых в бессывороточной среде без чужеродных фидерных клеток.

Кроме того, в предшествующем уровне техники в качестве культуральной среды для плюрипотентных стволовых клеток применяли DMEM/F12, содержащую KSR, NEAA, β-меркаптоэтанол и bFGF, но в настоящем изобретении применяют бессывороточную культуральную среду для плюрипотентных стволовых клеток.

В настоящем изобретении бессывороточная среда для культивирования плюрипотентных стволовых клеток человека на стадии (а) может представлять собой без ограничения среду TeSR-Essential 8 (TeSR-E8), среду TeSR-2 или среду «StemMACS iPS-Brew XF, human».

Настоящее изобретение отличается тем, что для индуцирования дифференцировки из плюрипотентных стволовых клеток человека в мезенхимальные стволовые клетки применяют зрелые эмбриоидные тельца, однородные по форме и размеру. В способе предшествующего уровня техники было трудно ожидать постоянной эффективности дифференцировки в мезенхимальные стволовые клетки, поскольку было невозможно получать эмбриоидные тельца, однородные по форме и размеру, но в настоящем изобретении эти технические ограничения были преодолены за счет обеспечения образования одиночной сфероидальной формы плюрипотентных стволовых клеток человека путем межклеточной агрегации и суспензионного культивирования этих эмбриоидных телец для образования зрелых эмбриоидных телец, однородных по форме и размеру. Благодаря этому были получены исключительно превосходные мезенхимальные стволовые клетки, которые улучшили эффективность дифференцировки происходящих от плюрипотентных стволовых клеток человека мезенхимальных стволовых клеток и сохраняли характеристики стволовых клеток в течение длительного времени даже после повторных пересевов.

В способе предшествующего уровня техники (WO 2011052818) плюрипотентные стволовые клетки культивировали в суспензии во время образования эмбриоидных телец, но в настоящем изобретении, для того чтобы плюрипотентные стволовые клетки агрегировали друг с другом с образованием одиночного сфероидального эмбриоидного тельца, плюрипотентные стволовые клетки инокулировали на крышку сосуда для культивирования, а затем сосуд для культивирования переворачивали вверх дном для проведения культивирования в висячей капле в течение 24 часов, чтобы клетки могли агрегировать под действием силы тяжести, и образовавшиеся таким образом клеточные агрегаты, то есть эмбриоидные тельца, культивировали в суспензии, и они созревали в зрелые эмбриоидные тельца. В результате, как показано на фиг. 1, образовывались зрелые эмбриоидные тельца, однородные по форме и размеру, и эти зрелые эмбриоидные тельца могут демонстрировать постоянную эффективность дифференцировки в мезенхимальные стволовые клетки и стабильность во время пересева.

На фиг. 4 показано, что размер и форма зрелых эмбриоидных телец, полученных с помощью способа предшествующего уровня техники, не однородны, тогда как зрелые эмбриоидные тельца, полученные с помощью способа согласно настоящему изобретению, характеризуются однородным размером 300-500 мкм, и их форма также постоянна и представляет собой сфероид. Кроме того, можно видеть, что мезенхимальные стволовые клетки, дифференцировка которых индуцирована из зрелого эмбриоидного тельца, полученного таким образом, характеризуются постоянной эффективностью дифференцировки и постоянным размером мезенхимальных стволовых клеток. Однако мезенхимальные стволовые клетки, дифференцировка которых индуцирована из эмбриоидного тельца, полученного с помощью способа предшествующего уровня техники, не однородны по эффективности дифференцировки, а также по форме клеток (фиг. 5).

Более того, мезенхимальные стволовые клетки, дифференцировка которых индуцирована из зрелых эмбриоидных телец, однородных по форме и размеру, неожиданно продемонстрировали к пассажу 20 экспрессию поверхностных маркеров мезенхимальных стволовых клеток CD29, CD44, CD73 и CD105 90% или более. Кроме того, экспрессия маркеров клеточной поверхности для специфичного для гемопоэтических стволовых клеток поверхностного маркера CD45, маркера МНС класса II HLA-DR и специфичных для плюрипотентных стволовых клеток поверхностных маркеров SSEA-3, TRA-1-60 и TRA-1-81 составила 2% или менее. Таким образом, поскольку мезенхимальные стволовые клетки, получаемые с помощью способа согласно настоящему изобретению, можно пересевать в течение длительного периода времени, и они сохраняют высокую чистоту, возможно массовое производство стволовых клеток, которые можно использовать в качестве клеточного терапевтического средства. Когда мезенхимальные стволовые клетки, получаемые с помощью способа предшествующего уровня техники, соответствуют критериям для применения в качестве клеточного терапевтического средство, клетки стареют и модифицируются и, таким образом, больше не подходят для достижения цели применения в качестве клеточного терапевтического средства. Наконец, имел место недостаток, заключающийся в том, что клетки, применяемые для клинических испытаний, и клетки, проходящие оценку качества, должны были отличаться. Однако, поскольку мезенхимальные стволовые клетки согласно настоящему изобретению не модифицируются даже после повторных пересевов в течение длительного периода времени для применения в качестве клеточного терапевтического средства и сохраняют качественные характеристики мезенхимальных стволовых клеток, мезенхимальные стволовые клетки согласно настоящему изобретению хорошо применимы для налаживания производства клеточного терапевтического средства.

Хотя известны способ контроля размера эмбриоидного тельца (KR 10-2013-0013537) или способ получения эмбриоидных телец, однородных по размеру, способом висячей капли (KR 10-2007-0075006) и аналогичные способы, известно, что образование эмбриоидных телец, однородных по размеру, влияет на эффективность дифференцировки клеток, но влияние на ингибирование старения или клеточной модификации мезенхимальных стволовых клеток, дифференцировка которых индуцирована из эмбриоидных телец, однородных по размеру, вообще неизвестно. Однако в настоящем изобретении было подтверждено образование зрелых эмбриоидных телец, однородных по форме и размеру, для сохранения у мезенхимальных стволовых клеток, дифференцировка которых индуцирована из них, характеристик мезенхимальных стволовых клеток в течение длительного периода времени вплоть до пассажа 20. В частности, было подтверждено, что в мезенхимальных стволовых клетках, дифференцировка которых индуцирована из эмбриоидных телец, полученных с помощью способа предшествующего уровня техники, экспрессия CD105 снижена до 43,6% при пассаже 6 и до 26,6% при пассаже 12 (таблица 2). Таким образом, стволовые клетки, получаемые с помощью способа предшествующего уровня техники, не сохраняют характеристики мезенхимальных стволовых клеток вплоть до пассажа 20, но стволовые клетки согласно настоящему изобретению могут сохранять характеристики мезенхимальных стволовых клеток в течение длительного периода времени вплоть до пассажа 20 благодаря образованию эмбриоидных телец, однородных по размеру.

Таким образом, в настоящем изобретении были получены мезенхимальные стволовые клетки, которые высоко безопасны благодаря применению культуральной среды без фидерных клеток, чужеродных компонентов и сыворотки для решения проблемы загрязнения посторонним материалом животного происхождения, и одновременно получены происходящие от плюрипотентных стволовых клеток человека мезенхимальные стволовые клетки, демонстрирующие необычные эффекты повышения эффективности дифференцировки в мезенхимальные стволовые клетки благодаря применению сфероидальных эмбриоидных телец для образования зрелых эмбриоидных телец, однородных по форме и размеру, и стабильного сохранения характеристик мезенхимальных стволовых клеток даже после продолжительных пересевов, как например 20 или более пассажей.

Используемый в настоящем документе термин «сфероидальное эмбриоидное тельце» относится к округлому сферическому клеточному агрегату, причем сфероидальная форма часто имеет вид сфероидной формы.

В настоящем изобретении можно применять любой способ культивирования, пригодный для индуцирования межклеточной агрегации плюрипотентных стволовых клеток, для эмбриоидного тельца на стадии (b). Любой способ культивирования, пригодный для получения агрегата плюрипотентных стволовых клеток, то есть одиночного сфероидального эмбриоидного тельца, возможен без ограничения. Например, эмбриоидное тельце на стадии (b) может быть образовано путем культивирования в висячей капле или культивирования с помощью V-образной пробирки, 96-луночного планшета круглой формы или конической пробирки.

В настоящем изобретении можно применять любую среду, пригодную для индуцирования клеточной агрегации между плюрипотентными стволовыми клетками, в качестве среды для образования эмбриоидных телец на стадии (b). Например, среда для образования эмбриоидных телец на стадии (b) может представлять собой среду для образования ЕВ Aggrewell, среду Gibco Essential 6, среду CTS Essential 6 или TeSR-Е6. Культивирование на стадии (b) можно проводить в течение от 18 часов до 30 часов, например от 20 часов до 28 часов, от 22 часов до 26 часов, например 24 часа.

(с) образование зрелых эмбриоидных телец путем суспензионного культивирования эмбриоидных телец в среде для созревания эмбриоидных телец;

Стадия (с) представляет собой стадию, на которой эмбриоидное тельце выращивают при суспензионном культивировании, и зрелое эмбриоидное тельце, получаемое на этой стадии, характеризуется однородной формой и размером.

Тот факт, что зрелые эмбриоидные тельца характеризуются «однородной формой и размером», означает, что зрелые эмбриоидные тельца, получаемые путем суспензионного культивирования сфероидальных эмбриоидных телец, однородны по форме и размеру. Форма зрелых эмбриоидных телец является сфероидальной как эмбриоидное тельце, и размер зрелого эмбриоидного тельца является однородным в пределах ± 15% от среднего размера всех зрелых эмбриоидных телец. То есть, если принять, что средний размер зрелых эмбриоидных телец составляет 100%, минимальный размер зрелого эмбриоидного тельца находится в пределах 90%, а максимальный размер зрелого эмбриоидного тельца находится в пределах 120%, и их размер достаточно однороден. Предпочтительно, размер зрелого эмбриоидного тельца является однородным с размером ± 10% от среднего размера всех зрелых эмбриоидных телец. В этом случае, если принять, что средний размер зрелых эмбриоидных телец составляет 100%, минимальный размер зрелого эмбриоидного тельца составляет 90%, а максимальный размер зрелого эмбриоидного тельца находится в пределах 110%. Хотя средний размер зрелых эмбриоидных телец может быть различным в зависимости от условий культивирования при созревании и периода эмбриоидного тельца, средний размер зрелых эмбриоидных телец, подходящих для индуцирования дифференцировки в стволовые клетки, может составлять 350-450 мкм, например 380-420 мкм. Предпочтительно, зрелое эмбриоидное тельце характеризуется однородным размером 300-500 мкм.

В настоящем изобретении суспензионное культивирование на стадии (с) проводят с использованием для созревания эмбриоидных телец среды для созревания эмбриоидных телец. Можно использовать общеизвестную среду для созревания эмбриоидных телец без конкретного ограничения. В примере варианта осуществления настоящего изобретения среда для созревания эмбриоидных телец на стадии (с) может представлять собой без ограничения основную среду с добавлением нокаутного заменителя сыворотки (KSR), не незаменимых аминокислот (NEAA) и β-меркаптоэтанола. Основная среда может представлять собой без ограничения среды DMEM/F12, альфа-MEM, Хэма F12 или DMEM.

Суспензионное культивирование на стадии (с) можно проводить в течение 10-18 дней, например 12-16 дней, например 14 дней, но без ограничения этими сроками.

(d) индуцирование дифференцировки в мезенхимальные стволовые клетки путем адгезивного культивирования эмбриоидных телец в культуральной среде для мезенхимальных стволовых клеток без чужеродных компонентов и сыворотки

В случае индуцирования дифференцировки из плюрипотентных стволовых клеток человека в мезенхимальные стволовые клетки индуцирование дифференцировки обычно вызывают добавлением цитокина, например костного морфогенетического белка (BMP) или аналогичных цитокинов, извне, но в настоящем изобретении было подтверждено, что дифференцировка в мезенхимальные стволовые клетки индуцируется естественным образом без добавления BMP и аналогичных цитокинов. В способе предшествующего уровня техники (WO 2011052818) для дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток применяли среду DMEM, содержащую FBS, а для пролиферационного культивирования применяли среду EGM2-MV, содержащую FBS. Однако в настоящем изобретении пролиферацию и культивирование мезенхимальных стволовых клеток проводили в среде без чужеродных компонентов и сыворотки.

В настоящем изобретении культуральная среда для мезенхимальных стволовых клеток, применяемая на стадии (d), может представлять собой среду без чужеродных компонентов и сыворотки, содержащую L-глутамин. Предпочтительно, используют общую концентрацию L-глутамина в среде в пределах от 2 до 4 мМ, но без ограничения этими пределами.

Примеры культуральных сред для мезенхимальных стволовых клеток без чужеродных компонентов и сыворотки на стадии (d) включают без ограничения среду «Stempro SFM XenoFree», среду «PRIME-XV MSC Expansion XSFM», среду «Human Mesenchymal-XF Expansion», среду «MSC Nutristem XF», среду «StemMACS MSC Expansion Media Kit XF, human» или среду, содержащую от 5 до 20% лизата тромбоцитов человека вместо FBS.

Кроме того, в настоящем изобретении индуцирование дифференцировки в мезенхимальные стволовые клетки на стадии (d) может продолжаться от 12 до 20 дней, например от 14 до 18 дней, например 16 дней, но без ограничения этими сроками.

В примере варианта осуществления настоящего изобретения дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток индуцируют в среде «Stempro SFM XenoFree», которая не содержит факторов, индуцирующих дифференцировку, и сыворотки.

(е) пролиферация и культивирование дифференцировавшихся мезенхимальных стволовых клеток в культуральной среде для мезенхимальных стволовых клеток без чужеродных компонентов и сыворотки при сохранении идентичности мезенхимальных стволовых клеток

Стадия (е) представляет собой стадию пролиферации и культивирования мезенхимальных стволовых клеток, у которых индуцирована дифференцировка. Для налаживания производства клеточного терапевтического средства, содержащего человеческие мезенхимальные стволовые клетки, очень важным вопросом является обеспечение достаточного количества мезенхимальных стволовых клеток, получаемых на этой стадии, при одновременном сохранении идентичности мезенхимальных стволовых клеток, то есть характеристик мезенхимальных стволовых клеток.

В настоящем изобретении в пролиферационной культуре мезенхимальных стволовых клеток, у которых индуцирована дифференцировка, мезенхимальные стволовые клетки культивируют в среде без чужеродных компонентов, в которую не добавляют дополнительные факторы, индуцирующие дифференцировку, и фетальную бычью сыворотку (FBS).

Как и на стадии (d), в настоящем изобретении культуральная среда для мезенхимальных стволовых клеток, применяемая на стадии (е), может представлять собой среду без чужеродных компонентов и сыворотки, содержащую L-глутамин. Предпочтительно, используют общую концентрацию L-глутамина в среде в пределах от 2 до 4 мМ, но без ограничения этими пределами.

Примеры культуральных сред для мезенхимальных стволовых клеток без чужеродных компонентов и сыворотки на стадии (е) включают без ограничения среду «Stempro SFM XenoFree», среду «PRIME-XV MSC Expansion XSFM», среду «Human Mesenchymal-XF Expansion», среду «MSC Nutristem XF», среду «StemMACS MSC Expansion Media Kit XF, human» или среду, содержащую от 5 до 20% лизата тромбоцитов человека вместо FBS.

В примере варианта осуществления настоящего изобретения в качестве среды для пролиферации мезенхимальных стволовых клеток применяли среду «Stempro MSC SFM», к которой не добавляли FBS, но настоящее изобретение не ограничено ей, и можно применять среду, которая не содержит гетерологичный материал, такой как гетерологичный белок (среду без чужеродных компонентов).

Как описано выше, для того чтобы применять мезенхимальные стволовые клетки в качестве клеточного терапевтического средства, необходимо сначала предоставить достаточное количество клеток, и для этой цели требуется пересев мезенхимальных стволовых клеток. Однако, когда пересев продолжается, возникает проблема, заключающаяся в том, что мезенхимальные стволовые клетки стареют, теряют способность к делению и теряют свою активность (способность к дифференцировке). В связи с этим в настоящем изобретении было подтверждено, что характеристики и активность мезенхимальных стволовых клеток могут сохраняться в течение 20 или более пассажей при культивировании ex vivo даже в среде без чужеродных компонентов и сыворотки (таблица 1). То есть мезенхимальные стволовые клетки, получаемые с помощью способа согласно настоящему изобретению, могут сохранять характеристики мезенхимальных стволовых клеток в течение длительного периода времени, и, следовательно, их можно применять в качестве клеточного терапевтического средства для массового производства. Эти характеристики могут быть достигнуты благодаря среде для получения мезенхимальных стволовых клеток без чужеродных компонентов и сыворотки и благодаря получению эмбриоидных телец, однородных по размеру.

Мезенхимальные стволовые клетки характеризуются однородным веретенообразным фингерпринтом и уровнями экспрессии основных маркеров клеточной поверхности, таких как CD73(+), CD105(+), CD34(-) и CD45(-), и могут дифференцироваться в остеоциты, хондроциты, адипоциты и аналогичные клетки.

В настоящем изобретении мезенхимальные стволовые клетки на стадии (е) можно охарактеризовать как мезенхимальные стволовые клетки, обладающие мультипотентностью, способные дифференцироваться в клетки, выбранные из группы, состоящей из адипоцитов, остеоцитов, хондроцитов, миоцитов, нервных клеток и кардиомиоцитов.

В примере варианта осуществления настоящего изобретения для подтверждения сохраняемости (постоянства) характеристик стволовых клеток при пересеве происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток был проведен сравнительный анализ изменения маркеров клеточной поверхности вплоть до пассажа 20. В результате сравнительного анализа экспрессии маркеров клеточной поверхности для поверхностных маркеров мезенхимальных стволовых клеток CD29, CD44, CD73 и CD105, специфичного для гемопоэтических стволовых клеток поверхностного маркера CD45, маркера МНС класса II HLA-DR и специфичных для плюрипотентных стволовых клеток поверхностных маркеров SSEA-3, TRA-1-60 и TRA-1-81 с пассажа 12 до пассажа 20 было подтверждено, что экспрессия поверхностных маркеров мезенхимальных стволовых клеток CD29, CD44, CD73 и CD105 сохраняется на уровне 90% или более вплоть до пассажа 20 (таблица 1). Кроме того, было показано, что в происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клетках, получаемых с помощью способа предшествующего уровня техники (WO 2011052818), экспрессия CD105 составляет менее 50% в клетках пассажа 6, и, в частности, было подтверждено, что экспрессия снижалась до 26,6% после пассажа 12 (таблица 2). То есть стволовые клетки, получаемые с помощью способа предшествующего уровня техники, не сохраняют характеристики мезенхимальных стволовых клеток вплоть до пассажа 20, но стволовые клетки согласно настоящему изобретению могут сохранять характеристики мезенхимальных стволовых клеток в течение длительного времени вплоть до пассажа 20 благодаря образованию зрелого эмбриоидного тельца, характеризующегося однородной формой и размером.

CD105 известен как один из специфических поверхностных маркеров мезенхимальных стволовых клеток, и Duff SE et al, в 2003 г. сообщали, что CD105 играет важную роль в регенерации сосудов с помощью мезенхимальных стволовых клеток (The FASEB Journal 2003; 17(9):984-992). Кроме того, уровень CD105 снижается не только после дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в остеоциты (Levi B et al., The Journal of Biological Chemistry. 2011; 286(45): 39497-39509), но также после дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в такие клетки, как остеоциты, хондроциты и адипоциты, и таким образом известно, что он играет важную роль в поддержании стволовости мезенхимальных стволовых клеток (Jin HJ et al, BBRC 2009; 381(4):676-681).

В настоящем изобретении мезенхимальные стволовые клетки на стадии (е) можно охарактеризовать как мезенхимальные стволовые клетки, экспрессирующие маркеры клеточной поверхности CD29(+), CD44(+), CD73(+) и CD105(+).

В настоящем изобретении экспрессия маркера клеточной поверхности, предпочтительно, сохраняется на уровне 90% или более в мезенхимальных стволовых клетках после 20 или более пассажей, более предпочтительно, экспрессия маркера клеточной поверхности CD105(+) в мезенхимальных стволовых клетках после 20 или более пассажей сохраняется на уровне 90% или более, но без ограничения этими значениями.

В настоящем изобретении мезенхимальные стволовые клетки на стадии (е) можно охарактеризовать как мезенхимальные стволовые клетки CD34(-), CD45(-), HLA-DR(-), TRA-1-60(-) и TRA-1-81(-).

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к мезенхимальным стволовым клеткам, дифференцировавшимся из плюрипотентных стволовых клеток человека, полученных с помощью способа согласно настоящему изобретению.

Мезенхимальные стволовые клетки с индуцированной дифференцировкой из плюрипотентных стволовых клеток человека, полученные с помощью способа согласно настоящему изобретению, дали одинаковые результаты, несмотря на различия в расе происхождения (азиатская и западная) и типе (эмбриональные стволовые клетки и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки). Настоящее изобретение относится к нормализованному способу индуцирования дифференцировки и пролиферационного культивирования, который обычно можно применять для получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека различного генетического происхождения. То есть предписанный способ согласно настоящему изобретению представляет собой способ, который обычно можно применять для индуцирования дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных стволовых клеток с различным генетическим фоном и/или культуральной средой.

В примере варианта осуществления настоящего изобретения мезенхимальные стволовые клетки получали с использованием в качестве плюрипотентных стволовых клеток человека эмбриональных стволовых клеток SNUhES35/hES12011003, зарегистрированных в банке стволовых клеток в National Center for Stem Cell Regenerative Medicine, но настоящее изобретение не ограничено этими клетками.

Кроме того, в другом примере варианта осуществления настоящего изобретения мезенхимальные стволовые клетки получали с использованием в качестве западных эмбриональных стволовых клеток ESI-017/hES22014005 и ESI-035/hES22014006, зарегистрированных в банке стволовых клеток в National Center for Stem Cell Regenerative Medicine, но настоящее изобретение не ограничено этими клетками, и можно использовать такие эмбриональные стволовые клетки, как ESI-049/hES22014007, ESI-051/hES22014008 и ESI-053/hES22014009.

В еще одном примере варианта осуществления настоящего изобретения мезенхимальные стволовые клетки получали с использованием азиатских индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, но настоящее изобретение не ограничено этими клетками.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к клеточному терапевтическому средству, содержащему мезенхимальные стволовые клетки с индуцированной дифференцировкой из плюрипотентных стволовых клеток человека, полученные с помощью способа согласно настоящему изобретению, в качестве активного ингредиента. Клеточное терапевтическое средство может содержать воду для инъекций в дополнение к мезенхимальным стволовым клеткам. Кроме того, клеточное терапевтическое средство может содержать низкотемпературное вспомогательное средство, применяемое для замораживания. Низкотемпературное вспомогательное средство, предпочтительно, представляет собой без ограничения CryoStor 10 (CS10) или «STEM-CELLBANKER DMSO Free GMP grade», который не содержит компонентов животного происхождения. Обычно клеточное терапевтическое средство, содержащее мезенхимальные стволовые клетки, вводят субъекту в дозе от 1×10⁶ до 1×10⁸ клеток/кг. Клеточное терапевтическое средство, содержащее мезенхимальные стволовые клетки в соответствии с настоящим изобретением, можно применять без ограничения для лечения различных заболеваний, для которых общеизвестен эффект от лечения трансплантацией мезенхимальных стволовых клеток. В частности, клеточное терапевтическое средство, содержащее мезенхимальные стволовые клетки в соответствии с настоящим изобретением, можно применять для лечения пациентов, инфицированных вирусом COVID-19, тяжелым острым панкреатитом (SAP) или аналогичными заболеваниями.

Примеры

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью примеров. Эти примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения, и рядовым специалистам в данной области техники будет очевидно, что объем настоящего изобретения не следует толковать как ограниченный этими примерами.

Пример 1: Способ получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека

1-1: Подтверждение культивирования и плюрипотентности плюрипотентных стволовых клеток в среда без Фидерных клеток, чужеродных компонентов и сыворотки

Для того чтобы проверить, можно ли культивировать плюрипотентные стволовые клетки in vitro при сохранении плюрипотентности в среде без фидерных клеток, чужеродных компонентов и сыворотки, сосуд для тканевой культуры покрывали человеческим витронектином, который является компонентом внеклеточного матрикса человека, до конечной концентрации 10 мкг/мл, и затем получали колонии плюрипотентных стволовых клеток путем культивирования недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (эмбриональные стволовые клетки корейского происхождения: SNUhES35/hES12011003) с использованием среды TeSR-2 или TeSR-Essential 8 (TeSR-E8), которая представляет собой среду без чужеродных компонентов и сыворотки (фиг. 1, фотография культуры ESC слева). Когда конфлюентность достигала 60% (20 или более колоний), колонии плюрипотентных стволовых клеток равномерно фрагментировали до размера приблизительно 200 мкм на 200 мкм с помощью инструмента для пассирования EZPassage (фиг. 2А) и переносили в коническую пробирку с помощью пипетки, клетки осаждали, оставляя коническую пробирку стоять, а затем удаляли супернатант. Было подтверждено, что выделенные плюрипотентные стволовые клетки представляют собой сферические клетки с размером (диаметром) приблизительно 10-15 мкм (фиг. 2В).

Для того чтобы подтвердить плюрипотентность плюрипотентных стволовых клеток, культивируемых в среде без фидерных клеток, чужеродных компонентов и сыворотки, подтверждали экспрессию ОСТ-4 и SSEA-4, которые являются маркерами плюрипотентности стволовых клеток, с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания.

В результате экспрессировались ОСТ-4 и SSEA-4, которые являются маркерами, указывающими на плюрипотентность в плюрипотентных стволовых клетках, культивируемых в среде без клеток, чужеродных компонентов и сыворотки. Таким образом, можно считать подтвержденным, что культивируемые плюрипотентные стволовые клетки сохраняли плюрипотентность в среде без фидерных клеток, чужеродных компонентов и сыворотки (фиг. 3).

1-2: Образование зрелого эмбриоидного тельца плюрипотентных стволовых клеток

Определенный объем среды для образования эмбриоидных телец (среда для образования ЕВ Aggrewell), в которой суспендировали плюрипотентные стволовые клетки, инокулировали на крышку чашки Петри, а затем культивировали в висячей капле с образованием клеточных агрегатов, то есть эмбриоидных телец. Эмбриоидные тельца снова инокулировали в среду для созревания эмбриоидных телец, а затем культивировали в суспензии с образованием зрелого эмбриоидного тельца определенного размера.

Конкретнее, среду для образования эмбриоидных телец (среда для образования ЕВ Aggrewell) (концентрация 400 мкл на 20 колоний плюрипотентных стволовых клеток человека) помещали в коническую пробирку, содержащую выделенные плюрипотентные стволовые клетки, для суспендирования, так что выделенные плюрипотентные стволовые клетки становились одиночными клетками в среде для образования эмбриоидных телец благодаря пипетированию. После того, как 20 мкл среды для образования эмбриоидных телец, в которой были суспендированы плюрипотентные стволовые клетки, инокулировали на крышку сосуда для культивирования тканей, сосуд для культивирования тканей переворачивали вверх дном для проведения культивирования в висячей капле в инкубаторе при 37°С и 5% CO₂ в течение 24 часов, чтобы клетки могли агрегировать под действием силы тяжести. Через 24 часа инкубации образовывались одиночные сфероидальные формы клеточных агрегатов, то есть эмбриоидные тельца.

Образовавшиеся эмбриоидные тельца культивировали в суспензии в чашке Петри с использованием среды для эмбриоидного созревания (DMEM/F12, 20% нокаутный заменитель сыворотки (KSR), 0,1 мМ не незаменимые аминокислоты (NEAA), 0,1 мМ β-меркаптоэтанол), и культивировали в течение 14 дней при замене среды с интервалами от 2 до 3 дней (смотри фиг. 1).

В результате, можно считать подтвержденным образование зрелых эмбриоидных телец постоянной формы и однородных по размеру 300-500 мкм в виде сфероидального тельца (фиг. 4, фотография улучшенного способа справа).

1-3: Индуцирование и пролиферация зрелых эмбриоидных телец в мезенхимальные стволовые клетки

Зрелые эмбриоидные тельца, культивированные в течение 14 дней, прикрепляли к 6-луночному планшету, покрытому субстратом без чужеродных компонентов CellStart™ (Thermo Fisher Scientific) (концентрация 78 мкл/см²). Во время прикрепления, после того как в каждую лунку инокулировали от 4 до 5 эмбриоидных телец, индуцировали дифференцировку с использованием StemPro MSC SFM XenoFree™ (Thermo Fisher Scientific), которая представляет собой культуральную среду для мезенхимальных стволовых клеток без чужеродных компонентов и сыворотки, для того чтобы индуцировать дифференцировку в мезенхимальные стволовые клетки.

Для индуцирования дифференцировки в мезенхимальные стволовые клетки и начального культивирования проводили культивирование в течение 16 дней без пересева, заменяя заново среду один раз в каждые 2-3 дня.

После того, как с помощью микроскопа подтверждали, что мезенхимальные стволовые клетки, дифференцировавшиеся из прикрепленных зрелых эмбриоидных телец, в достаточной степени пролиферировали, проводили пересев.

Кроме того, происходящие от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальные стволовые клетки, полученные таким образом, подвергали пересеву и культивировали в инкубаторе при 37°С и 5% СО² с использованием среды StemPro MSC SFM XenoFree для дифференцировки и пролиферации в среде без чужеродных компонентов и сыворотки.

На фиг. 5 представлено сравнение эффективности дифференцировки из эмбриоидных телец, получаемых с помощью существующего способа получения (WO 2011052818), и из эмбриоидных телец, получаемых с помощью улучшенного способа согласно настоящему изобретению, в мезенхимальные стволовые клетки и клеточной морфологии. Для способа согласно настоящему изобретению можно считать подтвержденным, что эффективность дифференцировки в мезенхимальные стволовые клетки и клеточная морфология были постоянными благодаря однородной форме и размеру эмбриоидного тельца (нижняя часть фиг. 5). Однако мезенхимальные стволовые клетки, дифференцировка которых индуцирована из эмбриоидного тельца, полученного с помощью способа предшествующего уровня техники, не однородны по эффективности дифференцировки, а также клеточной морфологии (верхняя часть фиг. 5).

Пример 2: Характеристика происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток

2-1. Анализ экспрессии маркеров клеточной поверхности в мезенхимальных стволовых клетках

Для того чтобы проверить, обладают ли происходящие от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальные стволовые клетки, получаемые с помощью способа согласно примеру 1, характеристиками мезенхимальных стволовых клеток, анализировали маркеры клеточной поверхности с помощью проточной цитометрии, и анализировали, могут ли мезенхимальные стволовые клетки дифференцироваться в остеоциты, хондроциты и адипоциты.

На фиг. 6 представлены результаты анализа экспрессии маркера клеточной поверхности происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток, культивируемых в культуральной среде без фидерных клеток, чужеродных компонентов и сыворотки.

В результате было подтверждено, что CD73 и CD105, которые являются специфичными для мезенхимальных стволовых клеток поверхностными маркерами, положительно экспрессировались в происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клетках, и было подтверждено, что экспрессия HLA-DR, который является маркером клеточной поверхности МНС класса II, связанным с иммунным ответом, и CD34 и CD45, которые являются специфичными для гемопоэтических стволовых клеток маркерами клеточной поверхности, была отрицательной.

Кроме того, в результате подтверждения экспрессии TRA-1-60, который является специфичным для плюрипотентных стволовых клеток маркером клеточной поверхности, для подтверждения того, были ли инкорпорированы плюрипотентные стволовые клетки, было подтверждено, что полученные происходящие от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальные стволовые клетки экспрессировали специфические маркеры клеточной поверхности обычных мезенхимальных стволовых клеток, с помощью подтверждения того, что экспрессия TRA-1-60 была отрицательной (фиг. 6).

2-2: Анализ способности мезенхимальных стволовых клеток к дифференцировке

Для анализа способности к дифференцировке происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток, получаемых с помощью способа согласно примеру 1, индуцировали дифференцировку в адипоциты, остеоциты и хондроциты в течение 14 дней, и затем каждую способность к дифференцировке проверяли с помощью способа специфического химического окрашивания.

В результате проведения окрашивания с помощью Oil-Red-О после 14 дней индуцирования дифференцировки в адипоциты, было подтверждено, что полученные происходящие от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальные стволовые клетки дифференцировались в адипоциты, а в результате проведения окрашивания с помощью Alizarin-Red-S и щелочной фосфатазы после 14 дней индуцирования дифференцировки в остеоциты, было подтверждено, что полученные происходящие от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальные стволовые клетки дифференцировались в остеоциты. Кроме того, в результате проведения окрашивания с помощью Alcian Blue после 14 дней индуцирования дифференцировки в хондроциты, было подтверждено, что полученные происходящие от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальные стволовые клетки дифференцировались в хондроциты (фиг. 7).

Это указывает на то, что происходящие от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальные стволовые клетки, полученные в примере 1, характеризуются способностью к дифференцировке, аналогичной способности к дифференцировке обычных мезенхимальных стволовых клеток.

2-3: Анализ хромосомных аномалий в мезенхимальных стволовых клетках

Проводили кариотипирование с помощью G-бэндинга (Saccone et al, Proc Natl Acad Sci USA, 89:4913-4917, 1992) для проверки возникновения хромосомных аномалий в процессе дифференцировки происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток, получаемых с помощью способа согласно примеру 1.

В результате в полученных происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клетках был подтвержден нормальный кариотип 46XY, что указывает на отсутствие хромосомных аномалий в процессе дифференцировки происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток, получаемые в примере 1 (фиг. 8).

2-4: Анализ сохраняемости характеристик стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток

Для того чтобы подтвердить сохраняемость (постоянство) характеристик стволовых клеток при пересеве происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток, получаемых с помощью способа согласно примеру 1, изменение маркеров клеточной поверхности вплоть до пассажа 20 подвергали сравнительному анализу путем непрерывного пересева в сосуде для культивирования.

Экспрессию маркеров клеточной поверхности для поверхностных маркеров мезенхимальных стволовых клеток CD29, CD44, CD73 и CD105, специфичного для гемопоэтических стволовых клеток поверхностного маркера CD45, маркера МНС класса II HLA-DR и специфичных для плюрипотентных стволовых клеток поверхностных маркеров SSEA-3, TRA-1-60 и TRA-1-81 подвергали сравнительному анализу с пассажа 12 до пассажа 20 (таблица 1).

В результате было подтверждено, что в происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клетках, получаемых с помощью способа согласно примеру 1, экспрессия поверхностных маркеров мезенхимальных стволовых клеток CD29, CD44, CD73 и CD105 с пассажа 12 до пассажа 20 сохраняется на уровне 90% или более. Кроме того, было подтверждено, что экспрессия маркеров клеточной поверхности для специфичного для гемопоэтических стволовых клеток поверхностного маркера CD45, маркера МНС класса II HLA-DR и специфичных для плюрипотентных стволовых клеток поверхностных маркеров SSEA-3, TRA-1-60 и TRA-1-81 оставалась отрицательной.

Эти результаты свидетельствуют о том, что происходящие от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальные стволовые клетки, получаемые с помощью способа согласно примеру 1, сохраняют характеристики мезенхимальных стволовых клеток вплоть до пассажа 20, и можно сказать, что происходящие от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальные стволовые клетки характеризуются высокой стоимостью использования как важный клеточный ресурс не только для массового культивирования терапевтических средств, в которых применяют мезенхимальные стволовые клетки, в будущем, но также для разработки терапевтических средств на основе стволовых клеток с усиленной клеточной функцией посредством введения генов.

Пример 3: Сравнение характеристик происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток в зависимости от различий в способе получения

3-1: Сравнение клеточной морфологии

Клеточную морфологию двух типов происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток, получаемых с помощью различных способов получения мезенхимальных стволовых клеток из одних и тех же плюрипотентных стволовых клеток, сравнивали с использованием микроскопа. Проводили морфологическое сравнение пассажей 7 и 12 полученных происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток.

Было подтверждено, что как происходящие от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальные стволовые клетки, получаемые согласно способу (WO 2011052818), так и происходящие от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальные стволовые клетки, получаемые согласно приведенным выше примерам, имели форму веретена, и морфология клеток сохранялась сходной вплоть до пассажа 7. Однако в случае происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток, получаемых с помощью существующего способа, при пассаже 12 происходило явление агрегации клеток.

Однако было подтверждено, что происходящие от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальные стволовые клетки, получаемые согласно приведенным выше примерам, хорошо сохраняли веретенообразную клеточную морфологию даже после пассажа 12 (фиг. 9).

3-2. Сравнение экспрессии маркеров клеточной поверхности

Как и в примере 3-1, сравнивали экспрессию маркеров клеточной поверхности для происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток, получаемых с помощью существующего способа (WO 2011052818), и происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток, получаемых согласно настоящему изобретению.

Было подтверждено, что в происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клетках, получаемых с помощью способа согласно настоящему изобретению, экспрессия CD29, CD44, CD73, CD105, которые являются специфичными для мезенхимальных стволовых клеток маркерами клеточной поверхности, составляла 90% или более и была положительной вплоть до пассажей 6, 8 и 12. Кроме того, было подтверждено, что экспрессия специфичных для гемопоэтических стволовых клеток маркеров клеточной поверхности CD34 и CD45, маркера МНС класса II HLA-DR и специфичного для плюрипотентных стволовых клеток маркера клеточной поверхности TRA-1-60 была отрицательной (таблица 2).

Напротив, в происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клетках, получаемых с помощью существующего способа, экспрессия маркеров клеточной поверхности, за исключением CD105, сохранялась такой же, как и для происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток, получаемых с помощью способа согласно настоящему изобретению, вплоть до пассажей 6, 8 и 12, но экспрессия CD105 оказалась менее 50% в клетках пассажа 6, и, в частности, было подтверждено, что экспрессия снижалась до 26,6% после пассажа 12 (таблица 2).

3-3: Сравнение способности к дифференцировке в остеоциты, хондроциты и адипоциты

Как и в примере 3-1, сравнивали способность происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток, получаемых с помощью существующего способа (WO 2011052818), и происходящих от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальных стволовых клеток, получаемых согласно настоящему изобретению, к дифференцировке в остеоциты, хондроциты и адипоциты.

Было подтверждено, что происходящие от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальные стволовые клетки, получаемые с помощью способа согласно настоящему изобретению, характеризуются более высокой способностью к дифференцировке в остеоциты, хондроциты и адипоциты, чем происходящие от плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальные стволовые клетки, получаемые с помощью существующего способа (фиг. 10).

Пример 4: Сравнение мезенхимальных стволовых клеток в зависимости от различий в типах плюрипотентных стволовых клеток

4-1: Мезенхимальные стволовые клетки, получаемые из западных эмбриоидных стволовых клеток

Для того чтобы проверить, различаются ли мезенхимальные стволовые клетки, получаемые с помощью способа согласно настоящему изобретению, в зависимости от расы происхождения плюрипотентных стволовых клеток, западные эмбриональные стволовые клетки (ESI-017/hES22014005, ESI-035/hES22014006) культивировали в среде без фидерных клеток, чужеродных компонентов и сыворотки.

Таким же образом, как и в примере 1-1, сосуд для культивирования тканей покрывали человеческим витронектином, который является компонентом внеклеточного матрикса человека, до конечной концентрации 10 мкг/мл, и затем недифференцированные западные плюрипотентные стволовые клетки культивировали с использованием среды TeSR-2, которая представляет собой среду без чужеродных компонентов и сыворотки (фиг. 11А).

В результате подтверждения экспрессии ОСТ-4 и SSEA-4, которые являются маркерами плюрипотентности стволовых клеток, посредством иммунофлуоресцентного окрашивания, для того чтобы подтвердить плюрипотентность плюрипотентных стволовых клеток, культивируемых в среде без фидерных клеток, чужеродных компонентов и сыворотки, ОСТ-4 и SSEA-4, демонстрирующие плюрипотентность, экспрессировали в западных плюрипотентных стволовых клетках. Также можно было видеть, что культивируемые западные плюрипотентные стволовые клетки сохраняли плюрипотентность, благодаря подтверждению экспрессии щелочной фосфатазы (фиг. 12А).

Кроме того, для того чтобы индуцировать дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток из культивируемых западных плюрипотентных стволовых клеток, получали зрелые эмбриоидные тельца с помощью тех же способа и среды, что и в примере 1-2, и зрелые эмбриоидные тельца, культивированные таким образом в течение 14 дней, дифференцировали в мезенхимальные стволовые клетки с помощью тех же способа и среды, что и в примере 1-3. Затем подтверждали, что мезенхимальные стволовые клетки, дифференцировавшиеся из прикрепленных зрелых эмбриоидных телец, в достаточной степени пролиферируют под микроскопом, мезенхимальные стволовые клетки пересевали и культивировали в инкубаторе при 37°С и 5% СО₂ с использованием среды без чужеродных компонентов StemPro MSC SFM для дифференцировки и пролиферации в среде без чужеродных компонентов и сыворотки (фиг. 11А).

Таким образом, можно считать подтвержденным, что мезенхимальные стволовые клетки, получаемые с помощью способа согласно настоящему изобретению, не различаются в зависимости от расы происхождения плюрипотентных стволовых клеток.

4-2: Происходящие от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток мезенхимальные стволовые клетки

Для того чтобы проверить, различаются ли мезенхимальные стволовые клетки, получаемые с помощью способа согласно настоящему изобретению, в зависимости от типа плюрипотентных стволовых клеток, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) культивировали в среде без фидерных клеток, чужеродных компонентов и сыворотки.

Таким же образом, как в примере 1-1, сосуд для культивирования тканей покрывали человеческим витронектином, который является компонентом внеклеточного матрикса человека, до конечной концентрации 10 мкг/мл, и затем недифференцированные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки культивировали с использованием среды TeSR-2, которая представляет собой среду без чужеродных компонентов и сыворотки (фиг. 11В).

В результате подтверждения экспрессии ОСТ-4 и SSEA-4, которые являются маркерами плюрипотентности стволовых клеток, посредством иммунофлуоресцентного окрашивания, для того чтобы подтвердить плюрипотентность плюрипотентных стволовых клеток, культивируемых в среде без фидерных клеток, чужеродных компонентов и сыворотки, ОСТ-4 и SSEA-4, демонстрирующие плюрипотентность, экспрессировали в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках. Таким образом, можно было видеть, что культивируемые индуцированные плюрипотентные стволовые клетки сохраняли плюрипотентность (фиг. 12В).

Кроме того, для того чтобы индуцировать дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток из культивируемых индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, получали зрелые эмбриоидные тельца таким же образом, как и в примере 1-2, и зрелые эмбриоидные тельца, культивированные таким образом в течение 14 дней, дифференцировали в мезенхимальные стволовые клетки таким же образом, как и в примере 1-3. Затем подтверждали, что мезенхимальные стволовые клетки, дифференцировавшиеся из прикрепленных зрелых эмбриоидных телец, в достаточной степени пролиферируют под микроскопом, мезенхимальные стволовые клетки пересевали и культивировали в инкубаторе при 37°С и 5% СО₂ с использованием среды без чужеродных компонентов StemPro MSC SFM для дифференцировки и пролиферации в среде без чужеродных компонентов и сыворотки (фиг. 11В).

Таким образом, можно считать подтвержденным, что мезенхимальные стволовые клетки, получаемые с помощью способа согласно настоящему изобретению, не различаются в зависимости от типа плюрипотентных стволовых клеток.

Хотя конкретные части настоящего изобретения были подробно описаны, специалистам в данной области техники будет очевидно, что такое конкретное описание представляет собой только предпочтительный вариант осуществления, и объем настоящего изобретения им не ограничен. Таким образом, действительный объем настоящего изобретения будет определяться прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

Промышленная применимость

В способе получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека в соответствии с настоящим изобретением для решения проблемы загрязнения посторонним материалом животного происхождения применяют культуральную среду без фидерных клеток, чужеродных компонентов и сыворотки, причем в данном способе применяют сфероидальные эмбриоидные тельца для получения зрелых эмбриоидных телец, однородных по форме и размеру, и, таким образом, даже после продолжительного пересева в большом количестве могут быть получены мезенхимальные стволовые клетки с неизменными характеристиками. Таким образом, настоящее изобретение эффективно для налаживания производства клеточных терапевтических средств с превосходной безопасностью и эффективностью.

Claims

1. Способ получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека, причем данный способ предусматривает следующие стадии:

(b) образование одиночных сфероидальных эмбриоидных телец путем суспендирования выделенных плюрипотентных стволовых клеток в среде для образования эмбриоидных телец и последующего культивирования выделенных плюрипотентных стволовых клеток таким образом, чтобы плюрипотентные стволовые клетки агрегировали, путем культивирования в висячей капле или культивирования с помощью V-образной пробирки, 96-луночного планшета круглой формы или конической пробирки;

(e) пролиферация и культивирование дифференцировавшихся мезенхимальных стволовых клеток в культуральной среде для мезенхимальных стволовых клеток без чужеродных компонентов и сыворотки при сохранении идентичности мезенхимальных стволовых клеток.

2. Способ по п. 1, в котором плюрипотентные стволовые клетки человека представляют собой эмбриональные стволовые клетки или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.

3. Способ по п. 1, в котором плюрипотентные стволовые клетки человека находятся в недифференцированном состоянии.

4. Способ по п. 1, в котором плюрипотентные стволовые клетки человека на стадии (а) культивируют в сосуде для культивирования, покрытом материалом, выбранным из группы, состоящей из витронектина, коллагена, ламинина, Matrigel и гепарансульфатпротеогликана.

5. Способ по п. 1, в котором бессывороточная среда для культивирования плюрипотентных стволовых клеток человека на стадии (а) представляет собой среду TeSR-Essential 8 (TeSR-E8), среду TeSR-2 или среду «StemMACS iPS-Brew XF, human».

6. Способ по п. 1, в котором среда для образования эмбриоидных телец на стадии (b) представляет собой среду для образования ЕВ Aggrewell, среду Gibco Essential 6, среду CTS Essential 6 или среду TeSR-Е6.

7. Способ по п. 1, в котором культивирование на стадии (b) проводят в течение от 18 до 30 часов.

8. Способ по п. 1, в котором среда для созревания эмбриоидных телец на стадии (с) представляет собой основную среду, содержащую нокаутный заменитель сыворотки (KSR), не незаменимые аминокислоты (NEAA) и β-меркаптоэтанол.

9. Способ по п. 8, в котором основная среда на стадии (с) представляет собой среды DMEM/F12, альфа-MEM, Хэма F12 или DMEM.

10. Способ по п. 1, в котором суспензионное культивирование на стадии (с) проводят в течение 10-18 дней.

11. Способ по п. 1, в котором зрелые эмбриоидные тельца, которые получают на стадии (с), характеризуются средним размером 350-450 мкм.

12. Способ по п. 1, в котором культуральная среда для мезенхимальных стволовых клеток на стадиях (d) и (е) представляет собой среду без чужеродных компонентов и сыворотки, содержащую L-глутамин.

13. Способ по п. 12, в котором среда без чужеродных компонентов и сыворотки представляет собой среду «Stempro MSC SFM XenoFree», среду «PRIME-XV MSC Expansion XSFM», среду «Human Mesenchymal-XF Expansion», среду «MSC Nutristem XF», среду «StemMACS MSC Expansion Media Kit XF, human».

14. Способ по п. 1, в котором индуцирование дифференцировки в мезенхимальные стволовые клетки на стадии (d) проводят в течение 12-20 дней.

15. Способ по п. 1, в котором мезенхимальные стволовые клетки на стадии (е) представляют собой мезенхимальные стволовые клетки, обладающие мультипотентностью, способные дифференцироваться в клетки, выбранные из группы, состоящей из адипоцитов, остеоцитов, хондроцитов, миоцитов, нервных клеток и кардиомиоцитов.

16. Способ по п. 1, в котором мезенхимальные стволовые клетки, которые получают на стадии (е), представляют собой мезенхимальные стволовые клетки, экспрессирующие маркеры клеточной поверхности CD29(+), CD44(+), CD73(+) и CD105(+).

17. Способ по п. 16, в котором экспрессия маркеров клеточной поверхности сохраняется на уровне 90% или более в мезенхимальных стволовых клетках после 20 или более пассажей.

18. Способ по п. 1, в котором мезенхимальные стволовые клетки, которые получают на стадии (е), представляют собой мезенхимальные стволовые клетки CD34(-), CD45(-), HLA-DR(-), TRA-1-60(-) и TRA-1-81(-).