JP2011529340A - ヒト幹細胞から高活性の幹細胞を分離する方法及びその方法により分離された高活性の幹細胞 - Google Patents
ヒト幹細胞から高活性の幹細胞を分離する方法及びその方法により分離された高活性の幹細胞 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011529340A JP2011529340A JP2011521015A JP2011521015A JP2011529340A JP 2011529340 A JP2011529340 A JP 2011529340A JP 2011521015 A JP2011521015 A JP 2011521015A JP 2011521015 A JP2011521015 A JP 2011521015A JP 2011529340 A JP2011529340 A JP 2011529340A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- stem cells
- cells
- cell
- highly active
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 95
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 17
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 claims description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 10
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 claims description 7
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 5
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 abstract description 10
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N (2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-1-[(2R)-2-amino-5-carbamimidamidopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-N-[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-amino-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]pentanediamide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000868152 Homo sapiens Son of sevenless homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102100024304 Protachykinin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101800003906 Substance P Proteins 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008975 immunomodulatory function Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明は、ヒト幹細胞から高活性幹細胞を分離する方法、該方法によって分離された高活性幹細胞、該幹細胞を含む細胞治療剤、及び特定のサイトカインを含む幹細胞から高活性幹細胞を分離するための培地に関するものである。
本発明によると、本発明の方法を用いる際、種々の起源の間葉系幹細胞から高活性幹細胞を分離するのに非常に有用であり、また他の条件で培養されている種々の起源の幹細胞においても適用可能であるため、高活性の細胞治療剤を開発する上で、非常に有用に用いられ得る。体外で種々の継代により増大する老化された幹細胞を効果的に分離することができるため、幹細胞の活性を回復する方法として提示され得る。
【選択図】図２
本発明によると、本発明の方法を用いる際、種々の起源の間葉系幹細胞から高活性幹細胞を分離するのに非常に有用であり、また他の条件で培養されている種々の起源の幹細胞においても適用可能であるため、高活性の細胞治療剤を開発する上で、非常に有用に用いられ得る。体外で種々の継代により増大する老化された幹細胞を効果的に分離することができるため、幹細胞の活性を回復する方法として提示され得る。
【選択図】図２
Description
本発明は、ヒト幹細胞から高活性の細胞を分離する方法、その方法によって分離された幹細胞、その幹細胞を含む細胞治療剤及び特定の培地に関する。
幹細胞(stem cell)は、生物の組織を構成する種々の細胞に分化できる細胞であり、胚、胎児及び成体の各組織から得られる分化する前の未分化細胞の総称である。幹細胞は、分化刺激(環境)によって特定の細胞に分化し、また、細胞分裂が停止した分化細胞とは異なり、細胞分裂によって自身と同一の細胞を産生することにより増殖(proliferation: expansion)できる特性があり、異なる環境又は異なる分化刺激によって異なる細胞にも分化でき、分化に柔軟性(plasticity)を有していることが特徴である。
幹細胞は、胚から得られ、全ての細胞種に分化され得る潜在力である多能性(pluripotency)を有する胚性幹細胞(embryonic stem cell, ES cell)と、各組織から得られる万能性(multipotency)を有する成体幹細胞(adult stem cell)とに大きく分けられる。胚盤胞期の初期胚の内部細胞塊(inner cell mss )は、将来胎児を形成する部分であり、内部細胞塊から形成された胚性幹細胞は、理論的に1つの個体を構成する全ての組織の細胞に分化され得る潜在力を有する。すなわち、胚性幹細胞は無制限に増殖可能な未分化細胞であり、全ての細胞種に分化することができ、成体幹細胞とは異なり胚細胞(germ cell)を生成することができて次世代に受け継がれ得る。
ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚盤胞(blastocyst)の形成時に、内部細胞塊のみを分離して培養することによって生成されるが、現在、全世界的に作られたヒト胚性幹細胞は、不妊治療後に余った冷凍胚から得られている。この細胞は、全ての細胞種に分化可能な潜在力を有していて、あらゆる組織の細胞にも分化でき、また、死滅せずに未分化状態で培養可能であり、胚細胞の生成も可能なため、次世代に受け継がれ得る特徴を有している(Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1998, Reubinoff et al., Nat. Biotechnol., 18: 399-404, 2000)。
種々の細胞への分化能を有するヒト胚性幹細胞を細胞治療剤として用いるための種々の試みは、未だ癌化及び免疫拒否反応の問題を完全に制御できない状況である。
近年、このような問題を克服するための代替案として、免疫調節機能を有していると報告されている間葉系幹細胞を用いることが提示されている。間葉系幹細胞は脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、神経細胞及び心筋細胞への分化が可能な多能性を有する細胞であり、免疫反応を調節する機能も有していると報告されている。それは種々の組織から分離及び培養が可能だが、各起源により能力は少しずつ異なり、細胞表面のマーカーも異なっており、現在、間葉系幹細胞は、骨細胞、軟骨細胞及び筋細胞に分化可能であり、螺旋状の形態であり、基本的な細胞表面マーカーの発現はSH2(+)、SH3(+)、CD34(-)及びCD45(-)であると定義されている。
細胞治療及び再生医学において、必要最小限の細胞の数は1×109個程度である。しかし、条件を定め基準を決める実験まで含むとその量はさらに増える。既存の種々の起源の間葉系幹細胞をこの程度の量だけ供給しようとすると、インビトロで最低10回以上の継代が必要となる。細胞は老化及び変形し、治療に適当でなくなる。これは、現在、間葉系幹細胞の培養システムが抱えている解決すべき問題の1つである。また、細胞によって条件及び基準を決めたとしても、治療に用いる際には、既にこの細胞を使い切り、他の起源の間葉系幹細胞を用いなければならない場合が生じ、この場合、他の細胞を用いるための付加的な実験を再び行わなければならない。既存の間葉系幹細胞を細胞治療剤として用いるためには、このような問題を解決できる新しい方法の提示が必要である。
韓国特許公開第2008-3418号には胚性幹細胞の膵臓細胞への誘導方法が提示され、韓国特許登録第10-593397号には間葉系幹細胞及び/又はサブスタンスPを含有する傷の治癒又は傷の治癒促進剤、又は細胞治療剤が提示されている。
本発明は、上記のような要求を満たすために、既存の生成されたヒト幹細胞の体外培養の制限を克服し、老化した細胞の再活性化を維持し、種々の遺伝的背景を有する幹細胞に有効である、細胞治療及び再生医学に必要な細胞を生成する方法を提供することを目的とする。
上記のような課題を解決するために、本発明は、ヒト幹細胞から高活性の幹細胞を分離する方法を提供する。
本発明は上記方法によって分離された幹細胞を提供する。
また、本発明は上記幹細胞を含む細胞治療剤を提供する。
さらに、本発明は幹細胞から高活性幹細胞を分離するための特定の培地を提供する。
本発明によると、細胞治療剤の最も良い材料である間葉系幹細胞として、既存の確立された間葉系幹細胞を用いることができ、また、本発明に係る方法は、一般に用いられる種々の条件により培養された種々の起源のヒトの間葉系幹細胞に適用できる。
上記の目的を達成するために、本発明は、ヒト幹細胞から細胞凝集体(sphere)を形成する工程を含むヒト幹細胞から高活性幹細胞の分離する方法を提供する。上記方法は、より具体的に、
ヒト幹細胞から細胞凝集体を形成する工程(a)と、
上記形成された細胞凝集体を、細胞凝集体に含まれていない細胞から分離する工程(b)とを含む。
ヒト幹細胞から細胞凝集体を形成する工程(a)と、
上記形成された細胞凝集体を、細胞凝集体に含まれていない細胞から分離する工程(b)とを含む。
本発明の方法により、上記工程(a)は、ウシ血清を含まない培地と低接着ペトリ皿とを用いることにより行われる。上記ウシ血清を含まない培地は、ウシ血清を含まないDMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)と20%の血清代替物（Serum Replacement, SR)とを含む培地であることが好ましい。低接着ペトリ皿は、接着型成長細胞を5%未満の効率で接着させるペトリ皿をいう。
好ましくは、上記工程(a)は、ヒト幹細胞をタンパク質分解酵素により処理した後、ウシ血清を含まないDMEMと20%のSRとを含む培地において20時間〜28時間の間、好ましくは24時間、低接着ペトリ皿に浮遊培養させることによって行われる。
上記タンパク質分解酵素は、トリプシンを例に挙げられるが、これに限定されない。
上記工程(b)は、上記形成された細胞凝集体を、ストレーナを用いて細胞凝集体を形成していない細胞から分離することができるが、これに限定されない。
上記幹細胞は、好ましくは間葉系幹細胞である。
本発明で用いられる用語である「幹細胞」は、組織及び器官の特殊化された細胞を形成するように非制限的に再生できるマスター細胞を称す。幹細胞は、万能性(multipotent)又は多能性(pluripotent)を有する細胞である。幹細胞は2個の娘幹細胞、又は1つの娘幹細胞と1つの移行細胞（transit cell）とに分裂し、その後に成熟し、完全な組織の細胞として増殖する。
本発明で用いられる用語である「間葉系幹細胞」は、骨細胞、軟骨細胞及び筋細胞等に分化が可能であり、渦巻き状の形態であり、基本的な細胞表面のマーカーの発現はSH2(+)、SH3(+)、CD34(-)及びCD45(-)である。
本発明の方法は、ヒト幹細胞の細胞凝集体の形成のために、ウシ血清を含まない培地と低接着ペトリ皿とを用いてヒト幹細胞を培養することを含む。この処理工程において、細胞凝集体の形成に用いられるウシ血清を含まない培地は、DMEM基本培地とSR等との組み合わせである。場合により、培地に種々のサイトカインを添加できることは、当業者に容易に認識され得る。
本発明の方法に用いられるSRは、動物由来の因子を除去するために、ウシ血清の代わりにヒト胚性幹細胞の培養に用いられる。本発明では、接着細胞の接着率を維持するウシ血清の代わりに、接着を促進しないSRを栄養分供給及び浮遊培養の2つの目的で用いる。
本発明は、本発明の方法によって分離された高活性幹細胞を提供する。分離された幹細胞は、サイトカインの分泌能が向上し、幹細胞の遺伝子発現率、細胞生存力及び細胞増殖率が向上している(図2乃至図4を参照。)。
上記方法を用いて分離された幹細胞は、それぞれ異なる起源の幹細胞においても同一の結果を示しており、これは蛍光細胞分析器(FACS)、抗原抗体反応(ELISA)及びリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(リアルタイムPCR)によって確認された。
本発明は、本発明の方法によって分離された幹細胞を含む細胞治療剤を提供する。具体的には、上記細胞治療剤は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、神経細胞及び心筋細胞の形成等に用いることができる。
本発明で用いられる用語である「細胞治療剤」は、ヒトからの分離、培養及び特殊な操作を用いて生成された細胞及び組織を含む治療、診断及び予防の目的で用いられる医薬品(米国FDA規定)であり、細胞又は組織の機能を回復させるために、自己、同種若しくは異種の細胞を体外で増殖若しくは選別すること、又は細胞の生物学的な特性を変化させることを含む方法により生成される、治療、診断及び予防の目的で用いられる医薬品を称す。細胞治療剤は、細胞の分化の程度によって大きく体細胞治療剤と幹細胞治療剤とに分類され、本発明は、特に幹細胞治療剤に関するものである。
本発明は、SR等を含む幹細胞から高活性幹細胞を分離するための培地を提供する。その培地は、好ましくはウシ血清を含まないDMEMと20%のSRとを含むことができる。上記幹細胞は、好ましくは間葉系幹細胞である。
上記培地には、幹細胞から高活性幹細胞を分離することを補助するための他の成分が含まれ得ることは、当業者は容易に認識することができる。
以下に実施例を挙げ、本発明の実施形態を具体的に説明するが、下記実施例は本発明を例示するのに過ぎず、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
細胞凝集体(sphere)の形成
体外で培養されていたヒト幹細胞をタンパク質分解酵素(0.25% trypsin/EDTA)で処理した後、ウシ血清培地を含まないDMEM(Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium, ウェルジン(WelGENE Inc.))+20%SR(ギブコ)培地において24時間、低接着ペトリ皿(SPL)を用いて浮遊培養させた。
体外で培養されていたヒト幹細胞をタンパク質分解酵素(0.25% trypsin/EDTA)で処理した後、ウシ血清培地を含まないDMEM(Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium, ウェルジン(WelGENE Inc.))+20%SR(ギブコ)培地において24時間、低接着ペトリ皿(SPL)を用いて浮遊培養させた。
細胞凝集体の分離
24時間浮遊培養して得られた細胞凝集体を、ストレーナを用いて細胞凝集体に含まれていない他の細胞から分離した。
24時間浮遊培養して得られた細胞凝集体を、ストレーナを用いて細胞凝集体に含まれていない他の細胞から分離した。
分離された細胞の特性分析
1.リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現の定量
分離された細胞のRNAから合成されたcDNAと、幹細胞に関連する遺伝子のプライマー(primer)を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。
1.リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現の定量
分離された細胞のRNAから合成されたcDNAと、幹細胞に関連する遺伝子のプライマー(primer)を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。
2.抗原抗体反応を用いたサイトカイン分泌能の確認
分離された細胞の培養液に対して、抗体を用いた分析を行い、種々のサイトカインの分泌能を確認した。
分離された細胞の培養液に対して、抗体を用いた分析を行い、種々のサイトカインの分泌能を確認した。
3.蛍光細胞分析器を用いた細胞周期の分析
分離された細胞の核染色を行い、細胞周期による変化を確認した。
分離された細胞の核染色を行い、細胞周期による変化を確認した。
実施例1:ヒト臍帯血由来の間葉系幹細胞から高活性幹細胞の分離
本発明の方法を用いて、ヒト臍帯血由来の間葉系幹細胞から高活性の間葉系幹細胞を分離した。体外培養によって培養されていた幹細胞をタンパク質分解酵素(0.25% trypsin/EDTA)で処理した後、ウシ血清を含まないDMEM+20%SR培地において、低接着ペトリ皿を用いて24時間浮遊培養させた。24時間浮遊培養して得られた細胞凝集体を、ストレーナを用いて細胞凝集体に含まれていない他の細胞から分離した。分離された細胞のRNAを用いてcDNAを合成した後、幹細胞関連の遺伝子のプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、幹細胞のマーカーに関連する遺伝子の発現量を確認した。種々のサイトカインの分泌能は、分離された細胞の培養液に対して抗体を用いて確認され、また、細胞の核染色により細胞周期の変化を確認した。細胞凝集体の形成後、幹細胞関連遺伝子の発現率は増大し、合成期であるS期が有意的に増大することを観察した。血管形成及び成長関連サイトカインも有意的に増大することを確認した。
本発明の方法を用いて、ヒト臍帯血由来の間葉系幹細胞から高活性の間葉系幹細胞を分離した。体外培養によって培養されていた幹細胞をタンパク質分解酵素(0.25% trypsin/EDTA)で処理した後、ウシ血清を含まないDMEM+20%SR培地において、低接着ペトリ皿を用いて24時間浮遊培養させた。24時間浮遊培養して得られた細胞凝集体を、ストレーナを用いて細胞凝集体に含まれていない他の細胞から分離した。分離された細胞のRNAを用いてcDNAを合成した後、幹細胞関連の遺伝子のプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、幹細胞のマーカーに関連する遺伝子の発現量を確認した。種々のサイトカインの分泌能は、分離された細胞の培養液に対して抗体を用いて確認され、また、細胞の核染色により細胞周期の変化を確認した。細胞凝集体の形成後、幹細胞関連遺伝子の発現率は増大し、合成期であるS期が有意的に増大することを観察した。血管形成及び成長関連サイトカインも有意的に増大することを確認した。
実施例2:ヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞から高活性幹細胞の分離
本発明の方法を用いて、ヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞から高活性の間葉系幹細胞を分離した。体外培養によって培養されていた幹細胞をタンパク質分化酵素(0.25% trypsin/EDTA)で処理した後、ウシ血清を含まないDMEM+20%SR培地において、低接着ペトリ皿を用いて24時間浮遊培養させた。24時間浮遊培養をして得られた細胞凝集体を、ストレーナを用いて細胞凝集体に含まれていない他の細胞から分離した。分離された細胞のRNAを用いてcDNAを合成した後、幹細胞関連の遺伝子のプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、幹細胞のマーカー関連する遺伝子の発現量を確認した。種々のサイトカインの分泌能は、分離された細胞の培養液に対して抗体を用いて確認され、また、細胞の核染色により細胞周期の変化を確認した。細胞凝集体の形成後、幹細胞関連遺伝子の発現率は増大し、合成期であるS期が有意的に増大することを観察した。血管形成及び成長関連サイトカインも有意的に増大することを確認した。
本発明の方法を用いて、ヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞から高活性の間葉系幹細胞を分離した。体外培養によって培養されていた幹細胞をタンパク質分化酵素(0.25% trypsin/EDTA)で処理した後、ウシ血清を含まないDMEM+20%SR培地において、低接着ペトリ皿を用いて24時間浮遊培養させた。24時間浮遊培養をして得られた細胞凝集体を、ストレーナを用いて細胞凝集体に含まれていない他の細胞から分離した。分離された細胞のRNAを用いてcDNAを合成した後、幹細胞関連の遺伝子のプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、幹細胞のマーカー関連する遺伝子の発現量を確認した。種々のサイトカインの分泌能は、分離された細胞の培養液に対して抗体を用いて確認され、また、細胞の核染色により細胞周期の変化を確認した。細胞凝集体の形成後、幹細胞関連遺伝子の発現率は増大し、合成期であるS期が有意的に増大することを観察した。血管形成及び成長関連サイトカインも有意的に増大することを確認した。
Claims (8)
- ヒト幹細胞を培養して細胞凝集体(sphere)を形成する工程(a)と、
上記細胞凝集体を、該細胞凝集体に含まれていない細胞から分離する工程(b)とを備えているヒト幹細胞から高活性幹細胞を分離する方法。 - 請求項１において、
上記工程(a)は、ウシ血清を含まない培地と低接着ペトリ皿とを用いて行われる方法。 - 請求項２において、
上記ウシ血清を含まない培地は、ウシ血清を含まないDMEM(Dulbecco’s Modified Eagel’s Medium)と20%の血清代替物(Serum Replacement, SR)とを含む培地である方法。 - 請求項１において、
上記工程(a)は、ヒト幹細胞をタンパク質分解酵素により処理した後、処理された細胞を、ウシ血清を含まないDMEMと20%の血清代替物とを含む培地において、20時間以上且つ28時間以下の間、低接着ペトリ皿を用いて浮遊培養させることによって行われる方法。 - 請求項１において、
上記幹細胞は、間葉系幹細胞である方法。 - 請求項１乃至５のいずれかの方法によって分離された高活性幹細胞。
- 請求項６の高活性幹細胞を含む脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、神経細胞又は心筋細胞形成に用いられる細胞治療剤。
- ウシ血清を含まないDMEMと20%の血清代替物とを含む、ヒト幹細胞から高活性幹細胞を分離するための培地。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2008-0073383 | 2008-07-28 | ||
| KR1020080073383A KR101175175B1 (ko) | 2008-07-28 | 2008-07-28 | 인간 줄기세포에서 고활성 줄기세포를 분리하는 방법 및상기 방법에 의해 분리된 고활성 줄기 세포 |
| PCT/KR2009/003954 WO2010013906A2 (ko) | 2008-07-28 | 2009-07-17 | 인간 줄기세포에서 고활성 줄기세포를 분리하는 방법 및 상기 방법에 의해 분리된 고활성 줄기 세포 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011529340A true JP2011529340A (ja) | 2011-12-08 |
Family
ID=41610818
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011521015A Withdrawn JP2011529340A (ja) | 2008-07-28 | 2009-07-17 | ヒト幹細胞から高活性の幹細胞を分離する方法及びその方法により分離された高活性の幹細胞 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20110142809A1 (ja) |
| EP (1) | EP2322602A4 (ja) |
| JP (1) | JP2011529340A (ja) |
| KR (1) | KR101175175B1 (ja) |
| CN (1) | CN102112599A (ja) |
| CA (1) | CA2732025A1 (ja) |
| MX (1) | MX2011000993A (ja) |
| WO (1) | WO2010013906A2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017188370A1 (ja) * | 2016-04-27 | 2017-11-02 | 株式会社Ｃｅｌｌｓ Ｐｏｗｅｒ | 活性化幹細胞製造方法 |
| JP2017200471A (ja) * | 2016-04-27 | 2017-11-09 | 株式会社Ｃｅｌｌｓ Ｐｏｗｅｒ | 活性化幹細胞製造方法 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011126264A2 (ko) * | 2010-04-05 | 2011-10-13 | 서울대학교병원 | 인간 줄기세포의 활성을 증가시키는 방법 |
| WO2011126177A1 (ko) * | 2010-04-05 | 2011-10-13 | 서울대학교병원 | 인간 줄기세포의 활성을 증가시키는 방법 |
| KR101677293B1 (ko) * | 2010-04-16 | 2016-11-17 | 서울대학교병원 | 줄기세포의 활성을 증가시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 고활성 줄기 세포 |
| CN111727374B (zh) | 2017-10-13 | 2024-02-20 | 纳米智能生物医学工程有限公司 | Grp78衍生肽用于鉴定高效干细胞 |
| EP3696546A4 (en) * | 2017-10-13 | 2021-06-09 | Nibec Co., Ltd. | HIGHLY EFFICIENT STEM CELL SELECTION PROCESS, USING A GRP78 PROTEIN MARKER |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7011828B2 (en) * | 2000-03-14 | 2006-03-14 | Es Cell International Pte. Ltd. | Implanting neural progenitor cells derived for human embryonic stem cells |
| JPWO2003027281A1 (ja) * | 2001-09-20 | 2005-01-06 | 協和醗酵工業株式会社 | 骨格筋間質由来多分化能幹細胞 |
| CA2558520C (en) * | 2004-03-05 | 2015-02-24 | John E. Davies | Serum-free suspension culture system for mesenchymal progenitor cells |
| KR100593397B1 (ko) | 2004-10-27 | 2006-06-28 | 한국원자력연구소 | 중배엽 줄기세포 및/또는 ｐ 물질을 함유하는 상처 치유또는 상처 치유 촉진제, 또는 세포 치료제 |
| CN100425694C (zh) | 2005-04-15 | 2008-10-15 | 北京大学 | 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法 |
| KR100679642B1 (ko) * | 2005-11-16 | 2007-02-06 | 주식회사 알앤엘바이오 | 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포 및 이를 함유하는세포치료제 |
| KR100871984B1 (ko) * | 2006-04-12 | 2008-12-05 | 주식회사 알앤엘바이오 | 태반 조직 유래 다능성 줄기세포 및 이를 함유하는세포치료제 |
| EP1845154A1 (en) * | 2006-04-12 | 2007-10-17 | RNL Bio Co., Ltd. | Multipotent stem cells derived from placenta tissue and cellular therapeutic agents comprising the same |
-
2008
- 2008-07-28 KR KR1020080073383A patent/KR101175175B1/ko active IP Right Grant
-
2009
- 2009-07-17 CA CA2732025A patent/CA2732025A1/en not_active Abandoned
- 2009-07-17 CN CN2009801297934A patent/CN102112599A/zh active Pending
- 2009-07-17 JP JP2011521015A patent/JP2011529340A/ja not_active Withdrawn
- 2009-07-17 US US13/056,279 patent/US20110142809A1/en not_active Abandoned
- 2009-07-17 MX MX2011000993A patent/MX2011000993A/es not_active Application Discontinuation
- 2009-07-17 WO PCT/KR2009/003954 patent/WO2010013906A2/ko active Application Filing
- 2009-07-17 EP EP09803111A patent/EP2322602A4/en not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017188370A1 (ja) * | 2016-04-27 | 2017-11-02 | 株式会社Ｃｅｌｌｓ Ｐｏｗｅｒ | 活性化幹細胞製造方法 |
| JP2017200471A (ja) * | 2016-04-27 | 2017-11-09 | 株式会社Ｃｅｌｌｓ Ｐｏｗｅｒ | 活性化幹細胞製造方法 |
| CN109072188A (zh) * | 2016-04-27 | 2018-12-21 | 金太郎细胞力量株式会社 | 活性化干细胞制造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2010013906A9 (ko) | 2010-07-15 |
| EP2322602A2 (en) | 2011-05-18 |
| KR20100012153A (ko) | 2010-02-08 |
| MX2011000993A (es) | 2011-06-06 |
| WO2010013906A3 (ko) | 2010-05-14 |
| CA2732025A1 (en) | 2010-02-04 |
| US20110142809A1 (en) | 2011-06-16 |
| WO2010013906A2 (ko) | 2010-02-04 |
| EP2322602A4 (en) | 2012-08-01 |
| CN102112599A (zh) | 2011-06-29 |
| KR101175175B1 (ko) | 2012-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6943937B2 (ja) | 幹細胞培養のためのマイクロキャリア | |
| Dwarshuis et al. | Cells as advanced therapeutics: State-of-the-art, challenges, and opportunities in large scale biomanufacturing of high-quality cells for adoptive immunotherapies | |
| JP5941454B2 (ja) | 対象の造血系を増強させるための医薬組成物 | |
| US9388384B2 (en) | Mesenchymal stem cells produced from human pluripotent stem cells | |
| EP1845154A1 (en) | Multipotent stem cells derived from placenta tissue and cellular therapeutic agents comprising the same | |
| US20040120932A1 (en) | In vitro-derived adult pluripotent stem cells and uses therefor | |
| US20110182866A1 (en) | Isolation of stem cell precursors and expansion in non-adherent conditions | |
| JP7002530B2 (ja) | 小型運動性幹細胞を使用した組成物および方法 | |
| KR100802011B1 (ko) | 층분리배양법을 이용한 골수에서의 중간엽 줄기세포분리방법 | |
| JP2011529340A (ja) | ヒト幹細胞から高活性の幹細胞を分離する方法及びその方法により分離された高活性の幹細胞 | |
| KR20150083440A (ko) | 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포 및 이를 포함하는 세포치료제 | |
| JP2007525979A (ja) | 間葉系前駆細胞無血清懸濁培養システム | |
| de Peppo et al. | Modulating the biochemical and biophysical culture environment to enhance osteogenic differentiation and maturation of human pluripotent stem cell-derived mesenchymal progenitors | |
| JP2023052609A (ja) | 細胞培養物の製造方法 | |
| KR101896803B1 (ko) | 인간 만능줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도 생산율을 증가시키는 방법 및 이에 의해 생성된 중간엽 줄기세포 | |
| WO2007122233A1 (en) | Preparation of mesenchymal progenitor cells, particularly osteogenic progenitor cells | |
| KR20120006386A (ko) | 1기 태반조직 유래 줄기세포 및 이를 함유하는 세포치료제 | |
| KR20110112164A (ko) | 인간 줄기세포의 활성을 증가시키는 방법 | |
| WO2011126264A2 (ko) | 인간 줄기세포의 활성을 증가시키는 방법 | |
| KR101677293B1 (ko) | 줄기세포의 활성을 증가시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 고활성 줄기 세포 | |
| KR20100007730A (ko) | 줄기세포의 외배엽성 세포로의 분화 방법 | |
| WO2018225703A1 (ja) | 分化誘導細胞の調製方法 | |
| CN118028229B (zh) | 一种从神经类器官获得间充质干细胞的制备方法 | |
| Carmelo | Optimizing the production of human mesenchymal stem/stromal cells in xeno-free microcarrier-based reactor systems | |
| JP2020043817A (ja) | 高機能組織幹細胞の選択的培養増殖法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120618 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20120618 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120719 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20120719 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20140109 |