CN103849593B - 一种磁分离式细胞三维共培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及再生医学领域，是一种磁分离式细胞三维共培养方法。本发明将诱导细胞以及磁介质微粒共同包埋在海藻酸钠微胶囊中，该微胶囊再与包埋有干细胞的海藻酸钙微胶珠在同一体系中进行非接触式三维共培养，利用微胶囊内诱导细胞分泌的可溶性因子对干细胞的定向分化进行调控，在共培养结束后，采用磁场对微胶囊与微胶珠进行分离，并且利用柠檬酸钠溶液可溶解微胶珠，进一步收获纯净的分化细胞。本发明操作简单，成本低，微胶囊和微胶珠可为细胞提供近似体内的三维生长环境，微胶囊膜可使诱导细胞分泌的诱导因子透过微胶囊作用于干细胞，并同时实现不同类型细胞的免疫隔离，磁介质微粒和磁分离装置则有利于诱导细胞和分化后细胞的分离和收获。

Description

一种磁分离式细胞三维共培养方法

技术领域

本发明涉及再生医学领域，是一种磁分离式细胞三维共培养方法。

背景技术

人体内各种组织、器官均由多种细胞构成，不同类型细胞之间存在复杂的相互作用，这种相互作用维持了组织、器官，乃至整个人体的正常生理功能。细胞共培养技术利用特殊手段，将不同类型的细胞在体外进行共培养，便于观察不同类型细胞之间的相互作用，尤其能够根据具体需要，构建近似于体内特异组织的分化微环境，即利用诱导细胞实现对干细胞定向分化的调控，在再生医学领域具有重要的研究与应用前景。

非接触式细胞共培养体系由于克服了直接接触共培养体系存在的多种细胞相互污染的问题，因此具有临床应用潜力，目前使用较多的非接触式细胞共培养体系为transwell，它使用聚碳酸酯等多孔薄膜将两种以二维方式生长的细胞分隔开进行共培养，多孔膜允许细胞分泌的因子自由通过，而细胞不能发生混合。然而，以transwell为代表的二维细胞共培养体系存在着明显的缺陷：1）细胞以二维方式生长，使得细胞丢失了其在体内时的正常生理功能；2）不能有选择地调控能够透过多孔膜的因子类型；3）传质效率低，存在严重物质浓度梯度；4）基于24孔板或6孔板，不适合动态共培养，不能实现规模化放大；5）价格昂贵，实验成本增加。

由于现有细胞二维共培养体系存在上述主要缺陷，严重限制了细胞共培养技术的进一步发展，因此急需研发便捷实用的体外细胞三维共培养新方法，以满足细胞三维方式生长、多孔膜截留分子量可控、传质效率高、可动态规模化共培养以及可实现不同类型细胞之间彻底分离等具体要求，进一步提高干细胞体外定向分化效率，促进细胞共培养技术在再生医学领域的广泛应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种磁分离式细胞三维共培养方法，其能实现诱导细胞和干细胞在三维条件下共培养，利用诱导细胞分泌的可溶性因子对干细胞的定向分化进行调控，同时也实现了不同类型细胞之间的分离，可获得纯净的分化后细胞。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

将诱导细胞以及磁介质微粒共同包埋在海藻酸钠微胶囊中，该微胶囊再与包埋有干细胞的海藻酸钙微胶珠在同一体系中进行非接触式三维共培养，利用微胶囊内诱导细胞分泌的可溶性因子对干细胞的定向分化进行调控，在共培养结束后，采用磁场对微胶囊与微胶珠进行分离，并且利用柠檬酸钠溶液可溶解微胶珠，进一步收获纯净的分化细胞。

所述干细胞包括胚胎干细胞、iPS细胞、或间充质干细胞，诱导细胞包括体细胞或细胞系；

干细胞和诱导细胞可以是同源同种细胞、同源异种细胞、异源异种细胞；

调控干细胞向神经细胞分化的诱导细胞包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、髓鞘细胞、或神经组织来源的肿瘤细胞系；

调控干细胞向心肌细胞分化的诱导细胞包括；原代心肌细胞或心肌细胞系；

调控干细胞向肝细胞分化的诱导细胞包括原代肝实质细胞、原代内皮细胞、内皮细胞系、肝星状细胞、成纤维细胞、3T3细胞系、或肝组织来源的肿瘤细胞系；

调控干细胞向胰岛细胞分化的诱导细胞包括原代胰岛或β-胰岛细胞；

调控干细胞向成骨细胞分化的诱导细胞包括原代成骨细胞或骨组织来源的肿瘤细胞系；

调控干细胞向软骨细胞分化的诱导细胞包括原代软骨细胞或软骨细胞系；

调控干细胞向脂肪细胞分化的诱导细胞为原代脂肪细胞。

所述定向分化包括干细胞向神经、心肌、肝、胰岛、成骨、软骨、或脂肪组织的细胞定向分化。

所述的磁介质微粒，其粒径在10nm~100μm，磁介质微粒包括铁磁性物质和顺磁性物质；

铁磁性物质为铁、镍、钴、或包含铁、镍、钴元素中一种或二种以上的合金；

顺磁性物质为铁氧化合物或锰。

海藻酸钠微胶囊中磁介质微粒含量为0.01-5mg/ml胶囊。

所述海藻酸钠微胶囊为海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊或海藻酸钠/壳聚糖微胶囊，直径范围为200-2000微米；

所述海藻酸钙微胶珠由海藻酸钠和钙离子反应形成，直径范围200-2000微米；

海藻酸钠的分子量为100-1000kDa，G/M比范围为0.2-3，且海藻酸钠为未修饰海藻酸钠、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸（RGD）修饰海藻酸钠、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸（IKVAV）修饰海藻酸钠、酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸（YIGSR）修饰海藻酸钠中一种或二种以上的海藻酸钠；

海藻酸钠微胶囊以及海藻酸钙微胶珠含有胶原、硫酸软骨素、或透明质酸，其中海藻酸钠所占的质量比例为40%-100%；

所述非接触式三维共培养的培养容器为静态培养或生物反应器；

静态培养指在培养瓶、培养板、培养皿、或培养袋中培养；

生物反应器包括旋转式反应器、灌注式反应器、搅拌式反应器、或气升式反应器。

所述采用磁场对微胶囊与微胶珠进行分离设备为磁分离装置，磁分离装置的磁场可使得含有磁介质微粒和诱导细胞的微胶囊发生偏转，磁分离装置包括磁场装置、管道以及收集装置；收集装置包括两个收集器皿；

共培养结束后，微胶囊与微胶珠的混合悬液被加入到磁分离装置的物料进口管路，进口管路下方连接一存储容器，存储容器下方连接有一物料出口管路，物料出口管路的另一端与一个收集器皿相连；

于物料出口管路上设有一分支管路，于物料出口管路与分支管路的连接处设有一磁场装置，由磁场装置提供一从连接处至分支管路方向的磁场；分支管路与另一个收集器皿相连；

磁场装置为永磁体、电磁线圈或电磁铁。

本发明具有如下优点：

1．操作简单，成本低。本发明利用海藻酸钠微胶囊和海藻酸钙微胶珠作为细胞三维培养载体，利用磁介质微粒以及磁分离装置来去除含有诱导细胞的微胶囊，制备简单，避免使用昂贵材料和工艺；

2.能够很好地模拟体内特异组织三维分化微环境，提高干细胞分化效率。一方面，微胶囊和微胶珠可为细胞提供近似体内的三维生长微环境，实现细胞高活性、高功能生长；另一方面，诱导细胞和干细胞的共培养方式进一步模拟了体内组织成熟细胞和干细胞之间的相互作用，从而本发明实现干细胞在近似体内组织环境中的定向分化，除了分化效果的提高，还避免了有毒性化学诱导剂以及昂贵生长因子组合的使用；

3．能够实现诱导细胞和分化细胞的分离和收获，保证应用的安全性。微胶囊膜能够将诱导细胞和干细胞进行免疫隔离，避免了两者的直接接触和免疫反应，且共培养结束后，磁分离装置的磁场使得含有磁性介质微粒的微胶囊发生偏转，集中收集到收集器中，从而实现微胶囊与微胶珠的彻底分离，此外使用柠檬酸钠盐溶液可溶解海藻酸钙微胶珠，通过离心可在生理条件下收获分化细胞；

4．可实现动态规模化细胞三维共培养。由于微胶囊和微胶珠体积小，密度低，表面积大，容易悬浮，因此尤其适合在生物反应器中进行动态三维共培养，加强调控因子的质量传递，进一步提高共培养效果；

5．应用范围广。由于微胶囊的免疫隔离特性，本发明方法可使用异体、异种的诱导细胞进行共培养；可促进干细胞向神经、心肌、肝、胰岛、成骨、软骨、或脂肪组织细胞分化，具有广泛的临床应用前景。

附图说明

图1为磁分离式细胞三维共培养体系示意图：培养容器1，海藻酸钠微胶囊2，诱导细胞3，磁介质微粒4，海藻酸钙微胶珠5，干细胞6；

图2为磁分离装置示意图：物料进口管路7，存储容器8，物料出口管路9，收集器皿10，分支管路11，磁场装置12，收集器皿13；

图3为细胞三维共培养促进干细胞向神经前体细胞定向分化照片：图3A为含有人神经母细胞瘤细胞、Fe₃O₄磁性颗粒的微胶囊与包埋干细胞的微胶珠共培养时照片；图3B为共培养结束后经磁分离装置收集的含有神经前体细胞的微胶珠；

图4为三维动态共培养、三维静态共培养以及二维静态共培养体系中分化细胞的Nestin基因表达情况；

图5为三维动态共培养、三维静态共培养以及二维静态共培养体系中Nestin阳性细胞百分比；

图6为三维共培养、二维共培养体系中肝细胞的白蛋白基因表达；

图7为三维共培养、二维共培养体系中肝细胞的白蛋白分泌能力对比。

具体实施方式

所述采用磁场对微胶囊与微胶珠进行分离设备为磁分离装置，磁分离装置的磁场可使得含有磁介质微粒和诱导细胞的微胶囊发生偏转，磁分离装置包括磁场装置、管道以及收集装置；收集装置包括两个收集器皿；

共培养结束后，微胶囊与微胶珠的混合悬液被加入到磁分离装置的物料进口管路，进口管路下方连接一存储容器，存储容器下方连接有一物料出口管路，物料出口管路的另一端与一个收集器皿相连；

于物料出口管路上设有一分支管路，于物料出口管路与分支管路的连接处设有一磁场装置，由磁场装置提供一从连接处至分支管路方向的磁场；分支管路与另一个收集器皿相连；

磁场装置为永磁体、电磁线圈或电磁铁。

实施例1：磁分离式细胞三维共培养体系诱导干细胞定向分化为神经前体细胞

制备精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)、酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR)多肽修饰的海藻酸钠。将海藻酸钠(分子量430kDa，古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比1.5)溶解于含有0.5M NaCl的0.1M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中(pH值6.5)，得到1%(W/V)海藻酸钠溶液。再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)和单一种类的多肽，室温搅拌反应24小时。EDC和海藻酸钠摩尔比为1:20，EDC和sulfo-NHS摩尔比为2:1，多肽和海藻酸钠质量比为1:1000。然后进行透析并冷冻干燥，从而得到不同种类多肽修饰的海藻酸钠。之后，将上述三种多肽修饰的海藻酸钠粉末分别溶解于生理盐水中，溶液浓度均为1.5%(W/V)，并配置体积比为1:1:1的三种多肽修饰海藻酸钠的混合溶液，混合溶液终浓度仍为1.5%(W/V)。

将人神经母细胞瘤细胞、Fe₃O₄磁性颗粒与1.5%(W/V)的RGD单独修饰海藻酸钠溶液混合，调整细胞密度为2×10⁶cells·mL^-1，磁性颗粒质量浓度为2mg·mL^-1，将该悬液经过注射器泵滴入100mmol·L^-1CaCl₂溶液中钙化20min，得到海藻酸钙微胶珠。将海藻酸钙微胶珠与0.05%(W/V)的聚赖氨酸反应成膜10min，形成非液化的海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊，再与0.15%(W/V)海藻酸钠溶液反应5min，最后用55mmol·L^-1柠檬酸钠液化5min，就得到了包埋有人神经母细胞瘤细胞以及磁性介质微粒的海藻酸钠/聚赖氨酸/海藻酸钠微胶囊。将此微胶囊使用DMEM/F12培养基洗涤3次，之后按1:10的体积比(微胶囊:培养液)加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于培养箱培养3天。

将第6代人脐带间充质干细胞与上述1.5%(W/V)含有RGD、IKVAV以及YIGSR三种多肽修饰海藻酸钠混合溶液进行混合，调整细胞密度为4×10⁶cells·mL^-1，将该细胞悬液经过注射器泵滴入100mmol·L^-1CaCl₂溶液中钙化20min，得到含有干细胞的海藻酸钙微胶珠，使用DMEM/F12培养基洗涤3次，再加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于培养箱培养3天。

将含有干细胞的微胶珠以及包埋基质细胞和磁性颗粒的微胶囊混合接种在培养瓶或搅拌式生物反应器中，分别进行三维静态以及动态共培养。反应器内工作体积为50ml，干细胞起始接种密度为2×10⁵cells·mL^-1培养液，两种细胞初始接种数量之比为1:1，搅拌速度50rpm，培养瓶初始细胞接种密度与反应器相同，培养体积15ml，两种体系均置于培养箱内培养，培养液为含有10%胎牛血清的DMEM/F12，每三天换液，共培养6天。另外，将相同接种密度的干细胞以及基质细胞接种到Transwell体系中，作为细胞二维共培养对照组。

共培养6天之后，使用培养液将培养瓶与反应器内含有微囊与胶珠的混合液冲洗出来，分别收集在50ml离心管中，将此混合液加入到磁分离装置中，依靠磁场将含有磁性颗粒的微胶囊与微胶珠收集到下方不同的收集器皿中，从而实现两种载体的彻底分离。之后，使用培养液将含有分化细胞的微胶珠洗涤3次，加入微胶珠体积10倍的55mmol·L^-1柠檬酸钠溶液处理10min，以溶解微胶珠，之后离心收获分化细胞；利用胰酶收集Transwell体系中的干细胞。然后，利用real-time PCR分析细胞二维共培养、三维静态以及动态共培养体系所获得分化细胞的神经前体细胞标志Nestin基因表达以及Nestin阳性细胞的百分比。实验结果见图3-5，结果显示，三维静态共培养体系优于二维静态共培养体系，其Nestin阳性细胞百分比约为40%；三维动态共培养获得的分化细胞与三维静态共培养相比，其Nestin的基因表达与阳性细胞百分比进一步升高，Nestin阳性细胞百分比约为50%，这说明细胞三维共培养体系与传统二维共培养体系相比显著促进了干细胞向神经前体细胞分化，动态培养条件的使用则强化了这一分化过程。

实施例2：磁分离式细胞三维共培养体系诱导干细胞定向分化为肝细胞

RGD修饰海藻酸钠的制备方法同上述实施例1。

将人内皮细胞、Fe₃O₄磁性颗粒包埋于使用RGD修饰海藻酸钠所制备的微胶囊中，具体制备与培养方法同实施例1，培养液为含有10%胎牛血清的DMEM。

将第5代人脐带间充质干细胞包埋于RGD修饰的微胶珠中，制备与培养方法同实施例1，培养液为含有10%胎牛血清的DMEM。

将含有干细胞的微胶珠以及包埋内皮细胞和磁性颗粒的微胶囊混合接种在培养瓶中，进行三维静态共培养，干细胞起始接种密度为2×10⁵cells·mL^-1培养液，两种细胞初始接种数量之比为1:1，培养体积15ml，置于培养箱内培养，培养液为含有10%胎牛血清的DMEM，每三天换液，共培养7天。另外，将普通二维生长的干细胞以及相同细胞接种密度的Transwell二维共培养体系作为两个对照组。

共培养7天之后，三维共培养组中内皮细胞的去除以及目的细胞的收集方法同实施例1，普通二维生长的干细胞以及二维共培养对照组则利用胰酶消化收集细胞，分析细胞三维共培养、二维共培养以及普通二维培养条件下细胞白蛋白基因表达和外泌水平。实验结果见图6和7，结果显示，在肝细胞白蛋白的基因以及分泌功能上，三维共培养体系优于二维共培养体系，这说明细胞三维共培养体系促进了干细胞向肝细胞的体外定向分化，提高了相关功能表达。

Claims (7)

1.一种磁分离式细胞三维共培养方法，其特征在于：将诱导细胞以及磁介质微粒共同包埋在海藻酸钠微胶囊中，该微胶囊再与包埋有干细胞的海藻酸钙微胶珠在同一体系中进行非接触式三维共培养，利用微胶囊内诱导细胞分泌的可溶性因子对干细胞的定向分化进行调控，在共培养结束后，采用磁场对微胶囊与微胶珠进行分离，并且利用柠檬酸钠溶液溶解微胶珠，进一步收获纯净的分化细胞；

所述采用磁场对微胶囊与微胶珠进行分离设备为磁分离装置，磁分离装置的磁场可使得含有磁介质微粒和诱导细胞的微胶囊发生偏转，磁分离装置包括磁场装置、管道以及收集装置；收集装置包括两个收集器皿；

共培养结束后，微胶囊与微胶珠的混合悬液被加入到磁分离装置的物料进口管路(7)，进口管路下方连接一存储容器(8)，存储容器下方连接有一物料出口管路(9)，物料出口管路的另一端与一个收集器皿(10)相连；

于物料出口管路上设有一分支管路(11)，于物料出口管路与分支管路的连接处设有一磁场装置(12)，由磁场装置提供一从连接处至分支管路方向的磁场；分支管路与另一个收集器皿(13)相连；

磁场装置为永磁体、电磁线圈或电磁铁。

2.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于：

所述干细胞包括iPS细胞、或间充质干细胞，诱导细胞包括体细胞或细胞系；

干细胞和诱导细胞可以是同源同种细胞、同源异种细胞、异源异种细胞；

调控干细胞向神经细胞分化的诱导细胞包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、髓鞘细胞、或神经组织来源的肿瘤细胞系；

调控干细胞向心肌细胞分化的诱导细胞包括原代心肌细胞或心肌细胞系；

调控干细胞向肝细胞分化的诱导细胞包括原代肝实质细胞、原代内皮细胞、内皮细胞系、肝星状细胞、成纤维细胞、3T3细胞系、或肝组织来源的肿瘤细胞系；

调控干细胞向胰岛细胞分化的诱导细胞包括原代胰岛或β-胰岛细胞；

调控干细胞向成骨细胞分化的诱导细胞包括原代成骨细胞或骨组织来源的肿瘤细胞系；

调控干细胞向软骨细胞分化的诱导细胞包括原代软骨细胞或软骨细胞系；

调控干细胞向脂肪细胞分化的诱导细胞为原代脂肪细胞。

3.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于：

所述定向分化包括干细胞向神经、心肌、肝、胰岛、成骨、软骨、或脂肪组织的细胞定向分化。

4.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于：

所述的磁介质微粒，其粒径在10nm～100μm，磁介质微粒包括铁磁性物质和顺磁性物质；

铁磁性物质为铁、镍、钴、或包含铁、镍、钴元素中一种或二种以上的合金；

顺磁性物质为铁氧化合物或锰。

5.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于：

海藻酸钠微胶囊中磁介质微粒含量为0.01-5mg/ml胶囊。

6.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于：

所述海藻酸钠微胶囊为海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊或海藻酸钠/壳聚糖微胶囊，直径范围为200-2000微米；

所述海藻酸钙微胶珠由海藻酸钠和钙离子反应形成，直径范围200-2000微米；

海藻酸钠的分子量为100-1000kDa，G/M比范围为0.2-3，且海藻酸钠为未修饰海藻酸钠、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修饰海藻酸钠、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)修饰海藻酸钠、酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR)修饰海藻酸钠中一种或二种以上的海藻酸钠；

海藻酸钠微胶囊以及海藻酸钙微胶珠含有胶原、硫酸软骨素、或透明质酸，其中海藻酸钠所占的质量比例为40％-100％。

7.按照权利要求1所述的培养方法，其特征在于：

所述非接触式三维共培养的培养容器为静态培养或生物反应器；

静态培养指在培养瓶、培养板、培养皿、或培养袋中培养；

生物反应器包括旋转式反应器、灌注式反应器、搅拌式反应器、或气升式反应器。