CN104694474B - 一种细胞培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种新的细胞培养方法，适用于各种细胞，特别适用于对培养条件敏感的干细胞。本发明涉及一种动静态交替的细胞培养方法，在细胞培养过程中，在同一个培养容器进行的细胞培养至少包括静态培养的过程、载体运动的过程、培养容器两端对调的过程和细胞分布的过程。在同一细胞培养容器中构建了一种动静态交替培养的理想反应器，可以尽可能减小剪切力，避免细胞生长时聚集成团，在培养时使细胞均匀分布，并进一步避免载体在培养容器对调过程中产生横向移动，为细胞培养提供一个理想的生长代谢的环境。

Description

一种细胞培养方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种新的细胞培养方法，适用于各种细胞，特别适用于对培养条件敏感的干细胞。本发明涉及一种动静态交替的细胞培养方法，在细胞培养过程中，在同一个培养容器进行的细胞培养至少包括静态培养的过程、载体运动的过程、培养容器两端对调的过程和细胞分布的过程。在同一细胞培养容器中构建了一种动静态交替培养的理想反应器，可以尽可能减小剪切力，避免细胞生长时聚集成团，在培养时使细胞均匀分布，并进一步避免载体在培养容器对调过程中产生横向移动，为细胞培养提供一个理想的生长代谢的环境。

背景技术

近年来，随着生物技术的发展，细胞治疗的技术越来越受到广泛应用，陆续有多种细胞制剂获得各国食品药品监管部门批准上市。2010年美国FDA批准细胞免疫治疗晚期前列腺癌制剂Provenge上市，2011年美国FDA批准Laviv成纤维细胞治疗鼻唇沟和脐带血干细胞产品HEMACORD，期间韩国KFDA也陆续批准多个间充质干细胞产品，预示细胞个体化治疗的新时代到来。如此情形下，迫切需要大规模培养患者自体细胞，以便获得大量有用的细胞或细胞表达产物。传统的玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，早已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。至今，已经发展出多种类生物反应器，滚瓶式生物反应器、搅动悬浮培养生物反应器、摇袋式生物反应器、旋转壁式生物反应器、平板型生物反应器、固定流化床式生物反应器。

动物细胞的大规模培养需要特殊的生物反应器，与微生物和植物细胞不同，动物细胞的外层是质膜，许多种类的细胞，特别是造血干细胞和免疫细胞，在培养时对剪切力十分敏感。比如，剪切力可以在干细胞培养中产生非特异性分化，细胞凋亡增加，极大地降低干细胞扩增和定向分化的效率。较高的剪切力还可能在蛋白表达中释放出更多的非特异性蛋白，需要的特异性蛋白在培养中比例减小，蛋白纯化难度大大增加。静置培养的剪切力虽然最小，但静置培养的细胞通常在培养容器的底部，那么如果细胞聚集成团，一些细胞无法获得足够的营养，因此不适合用于大规模的细胞扩增。一些生物反应器虽然能够降低剪切力，但是，这些生物反应器，必须通过不断地运动、搅拌和/或搅动细胞使细胞保持悬浮。一旦生物反应器停止运转，细胞将累积在底部某个位置或者培养容器的某个部位，而且是不均匀地分布，不利于绝大多数细胞生长，至少不利于细胞有效增长。因此，即使这样的生物反应器作了减少剪切力处理，但是当生物反应器运转时，仍有剪切力连续作用于培养的细胞上。在我们当前的发明中，当生物反应器处于静置状态时，细胞可以均匀地分布于培养室的底部或载体的表面。无疑，一个间歇性的搅拌，或者适当的动静态交替培养，不仅会是剪切力最小化，而且能为细胞提供一个理性的代谢环境。然而因为运动的细胞的惯性作用，在动静态交替培养细胞时通常也很难使细胞均匀分布。当细胞分布不均匀时(例如细胞局部堆积或者聚集)将对细胞生长很有害。我们现在发明一种能使细胞均匀分布的动静态交替生长的方法，以便动态和静态以及动静态交替都可以使用在目前公开的生物反应器上。

本发明所述的ZXY生物反应器是仪器自动化培养，动态静态两个状态都在同一个细胞培养容器中进行，在状态转变的过程中不需要转换培养容器，当细胞从动态转换成静态时，细胞可以均匀分布在细胞培养容器的底部或者分布在搅拌材料的表面。而有些生物反应器在动静转变时需要换容器。因此，我们的发明为细胞生长的悬浮状态以及静置状态提供了最佳的状态，并且两种状态可以任意转换。

许多培养的动物细胞都是贴壁依赖型细胞，所以大规模动物细胞培养中都使用微载体、理想的微载体应有利于细胞的快速附着和扩展，有利于细胞高密度生长，不干涉代谢产物合成和分泌。球形微载体因制造容易而普遍使用，近年来开始使用的多孔微载体可提供大的表面积/体积比率和最大的细胞密度，多孔微载体的研制替代了容易使细胞受机械搅拌与喷气损伤的常规载体，对于有些细胞株尽可能贴在微载体内，但移动性很差，因此需要开发更好的培养方式，改善细胞的移动性。我们的发明中，细胞生长的空间在细胞吸附的载体和载体构成的间隙中，随着细胞培养过程中细胞载体的运动，细胞所处的微环境随之而改变。许多微载体处于运动的状态使细胞载体处于稳定的状态，比如采用NASA技术的RWV生物反应器，反应容器处于不断的旋转过程，使载体悬浮在培养基中，假如旋转速度不一致，载体的位置就会改变不受控制。在我们的专利中，优化了细胞培养过程中的参数，保证在培养的动态以及静态过程中载体在固定位置不改变。

传统的细胞培养是在培养瓶、培养皿或者培养板中细胞以一个静止的状态生长，随着细胞的增长，培养容器中生长的空间随着细胞的扩增逐渐减少，细胞生长所需的CO₂、O₂、pH，都无法满足所有细胞的生长，会造成不必要的损失。

在先专利(专利申请号为201280001774.5)中，介绍了一种细胞培养的生物反应器，虽然能实现动静态交替培养，但在细胞生长过程中，存在载体和细胞往一侧聚集，导致静态培养时细胞分布不均匀的现象；另外，该专利虽然通过采用较大的载体来避免细胞生长聚集成团的问题，但是效果仍有待进一步改进。

另外，培养容器中的载体以及载体之间的空隙构成细胞生长的微环境，载体的微小移动会对载体之间空隙进行重新排列，使得细胞生长的微环境随之改变，另外，载体的细微移动都会产生细胞运动，造成细胞挤压，造成细胞损伤。许多生物反应器在培养细胞时随着细胞的增长，培养容器中的细胞密度逐渐增加，一般的细胞密度比较小时，细胞的生长就会比较缓慢，随着细胞的增殖，培养密度逐渐增加，在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。在我们的发明中，一般容器为立体的形状，可为多面体，如为长方体，培养容器则有六个面，有三种不同大小的侧面，每个面都可以供细胞生长，在细胞接种时，未开始扩增，细胞的培养密度比较低，程序控制载体和细胞生长时落在横截面积较小的一面，相对的增加细胞的堆积密度，随着细胞的生长，较小的截面积上的细胞越长越多，细胞密度太大时，细胞生长逐渐变缓慢，并且较大的细胞密度时周围培养基的养料无法及时补充满足细胞增长，当细胞达到一定密度时，程序控制培养容器进行翻转，经过培养程序动态对调后，进入静态培养过程，此时程序调节载体和细胞落在培养容器中横截面积更大的一面，控制堆积的细胞密度在比较合适的生长范围内。本发明的细胞培养方法中，通过调节细胞在不同的平面上生长，变换细胞生长时的增殖密度，使细胞始终在最优的环境中生长。

发明内容

为了解决如何实现在同一个反应器中包含动静态两种状态；如何使动态培养结束后细胞均匀分布；如何减少载体的横向位移，对细胞造成的聚集和损伤的问题；本发明提供了一种细胞培养方法，能有效地解决现有技术存在的问题。

本发明所述的细胞培养方法如图1、图2，是通过培养容器和载体的协同运动达到细胞动静态交替运动的过程。一般的，细胞的生长在静态中进行，培养一段时间后，将细胞进行重新分布，本发明中的静态和动态过程在同一个培养容器中进行，准确的说，在同一个培养容器进行的细胞培养至少包括静态培养的过程、载体运动的过程、培养容器两端对调的过程和细胞分布的过程；培养容器中具有载体；静态培养的过程中，载体分布于培养容器的一端，细胞分布在载体的表面、载体之间的空隙中或培养容器的底部，与培养容器保持相对静止；载体运动的过程中，载体由培养容器的一端向另一端运动；培养容器对调的过程中，载体固定在培养容器的一端，培养容器的两端发生对调，载体以相对于培养容器静止的方式，跟随培养容器对调；细胞分布的过程中，载体重新位于培养容器的一端，细胞由混悬状态分布在载体的表面、载体之间的空隙或培养容器中。

本发明提供新的细胞培养方法，该方法是一种动静态结合的细胞培养过程，本发明所说的过程是在同一个培养容器进行的细胞培养至少包括静态培养的过程、载体运动的过程、培养容器两端对调的过程和细胞分布的过程。本发明所述的动静态结合的细胞培养方法是动态与静态交替进行，间歇的搅拌方式，可以使细胞生长的更好。在我们的发明中，动静两态都在同一个细胞培养容器中进行，在状态转变的过程中不需要转换培养容器，当细胞从动态转换成静态时，细胞可以均匀分布在细胞培养容器的一端或者吸附在搅拌材料的表面。

本发明所述的细胞培养方法，在动态结束达到的静态过程时，能使细胞均匀的分布在细胞容器中或者吸附在载体的表面。

本发明所述的静态过程，是细胞与培养容器的相对不运动状态。

本发明所述的动态过程，包含载体在培养容器中的沉降或上浮和/或受到外力作用在培养容器中移动并带动细胞移动使之悬浮的过程。在进行一段时间的静止培养后，根据细胞增长速度和数量，决定动态的过程频率和持续时间。

细胞均匀分布的实现，可以通过载体在培养容器中的搅拌，采用温和的移动。

在我们的发明中，培养容器的每个侧面都可以供细胞生长，在细胞接种时，未开始扩增，细胞的培养密度比较低，细胞和载体落在横截面积较小的一面，随着细胞的生长，较小的截面积上堆积太多的细胞会妨碍细胞生长，这个情况下，经过培养程序动态对调后，自动调节载体和细胞落在培养容器上横截面积比较大的侧面，控制细胞生长密度在比较合适的范围内。

在一个实例中，培养载体中包含可磁化材料，例如硅钢、Fe₃O₄或任何其它适合的材料。可磁化材料意味着，载体(例如磁珠)在有磁场时有磁性，但一旦远离磁场，或者是磁场离开载体附近，便不再有磁性。在这个实施例中，载体与培养容器的固定可以通过磁场控制，根据载体的重力、在培养液中所受的浮力，我们发现磁场强度需要在26mT之上，如果低于这个值，无法保证载体在培养容器运动时固定在同一个位置。

培养容器对调的过程时，由于惯性，细胞及载体会有一定的移动，为了控制最小的移动，将载体固定在培养容器的一端，减少对细胞的挤压，并且可以避免在旋转或者翻转过程的载体贴壁运动，减少对细胞的挤压。

在我们对不同密度的载体研究中，使用过各种密度的载体，从0.2-8g/cm³的载体，用空心的塑料珠子添加不同重量的金属制作成不同密度的载体，在装有细胞的培养容器中进行尝试，根据载体在培养液中的运动速度评价搅拌对细胞产生的剪切力大小，根据搅拌后达到的均匀程度评价其搅拌的效率，在培养容器两端对调过程中观察载体是否会因为惯性产生横向移动来评价载体的适合的密度。

在一个实施例，生物反应器系统中使用磁场强度为70mT的永磁铁作为磁场发生器，培养容器对调过程中，载体的运动长度为200mm，使用密度小于培养基的载体时，在没有外力的条件下载体能自由上升至培养容器的上部。载体加入培养容器，不完全铺满对调的两端，在培养容器两端对调前，永磁铁移动至靠近培养容器的一端，对调后，磁铁远离，载体迅速上升。培养容器两端对调前磁铁吸引住载体，需要保证能培养容器外的磁铁能牢固的吸引住载体，载体密度为0.6g/cm³时，培养容器与载体的密度差比较大，在对调过程中会产生微小的位移，随着密度的增大，载体更容易被磁铁吸引，在对调过程中不产生横向移动。随着载体密度增加，与培养基的密度差逐渐减小，载体在容器中从一端上升至另一端的时间变长，移动逐渐变得温和，但是在载体密度为1g/cm³时，载体与培养基的密度相同时，撤去磁场载体在培养容器中几乎不移动。兼顾载体能吸附在培养容器上以及比较温和的移动状态，在载体密度为0.6-0.98g/cm³之间更合适。

在一个实施例，生物反应器系统中使用磁场强度为70mT的永磁铁作为磁场发生器，培养容器对调过程中，载体的运动长度为200mm，将不同质量的金属填充到空心塑料载体中，模拟不同密度的密度比培养基大的载体，培养容器两端对调前，先将磁场靠近培养容器，将载体吸附在培养容器的底部，执行培养容器两端对调的程序，载体对调至培养容器的顶端，将磁场远离，载体自由下落，在载体密度为1g/cm³时，与培养液密度相同，磁场远离培养容器，载体不受磁场作用的时候，载体几乎不动，下落时间很长，随着密度增大，载体与培养液的密度差变大，载体从一端移动到另一端的速度变快，载体运动对细胞的剪切力增大，更易使细胞损伤。在培养容器两端对调过程时，磁场作用于载体时，需要载体牢固的吸附在培养容器一端，载体与培养液的密度差增大时，对调时需要载体有更大的作用力，才能保证载体不产生移动，实验中，看到在载体密度为1.4g/cm³时，培养容器对调时，载体产生细微的移动。兼顾载体能吸附在培养容器上以及比较温和的移动状态，在载体密度为1.02-1.4g/cm³之间更合适。

两种不同载体的运动方式的方案：

1、使用密度小于培养基密度的细胞载体，一个动静交替的过程如图1所示，初始时为细胞培养状态，如图1-a，培养容器的A端在下，B端在上；通过一定的外力将细胞载体2固定在培养容器1底部(此时A端位于底部)，在进行翻转周期时，见图1-b，先通过改变作用在载体2上的外力(如关闭A端的磁场3)，使载体2由培养容器1的底部移至培养容器1的顶部(此时B端位于顶部)，打开培养容器B端的磁场4，使载体2固定在B端，如图1-c，随后，培养容器两端位置对调，使A端在上，B端在下，载体2跟随着培养容器的两端位置变化转至容器底部，如图1-d至1-e，改变作用在载体2的外力(如关闭B端的磁场4)，如图1-f，重复图1-b至1-e的上述步骤，重复4-20次，使细胞均匀分布。

2、使用密度大于培养基密度的细胞载体，一个动静交替的过程如图2所示，初始时为细胞培养状态，如图2-a，培养容器的A端在下，B端在上；细胞载体2位于在培养容器1底部(此时A端位于底部)，改变作用在载体2上的外力(如打开A端的磁场3)，使载体2固定在培养容器A端上，此时，进行培养容器1的A、B两端对调，使A端在上，B端在下，，由于培养容器1的对调，载体2的相对位置变为容器顶端(此时A端位于顶端)，如图2-b至2-c，接着，关闭A端的磁场3，载体2向下移动，如图2-d，此时载体2又到达容器底部(此时B端位于底端)，如图2-e，打开B端的磁场4，进行培养容器1两端对调，见图2-f，重复图2-b至2-e上述步骤，进行4-20次，使细胞在容器1中均匀分布。

在我们在对细胞生长载体与成簇关系的研究中，清楚地显示，小体积载体引起粘附细胞的聚集更早更严重。如下表1。

表1：球粒规格对有贴壁细胞的载体结块的影响

表2；悬浮球规格对有载体的悬浮细胞结块的影响

表1和表2明确表示，载体越小，尤其是直径小于1毫米，贴壁细胞培养和悬浮细胞培养过程中的载体结块或细胞结块速度就越快。这与用载体培养组织观察到的情况一致，即：载体越小，越有利于形成组织状细胞块。从上表显示的结果也可以看出，载体规格增大可以有效减少贴壁细胞培养和悬浮细胞培养时的结块，因此，载体理想的直径应该是5毫米以上，至少要大于1毫米。由于结块不仅影响细胞培养，还影响基于细胞分离的细胞分选，因此，本发明首选的载体直径(如果是球体)大约5毫米。在另一项研究中，我们还发现，载体的质量差越大，越有利于减少结块。可以认为，质量差较大的载体作为搅拌器运动上下移动时运动不均匀，因此，当搅拌器或细胞受到来自外部的相同力驱动时，它们结块的机会减少。所以，载体越小则结块越多的一个原因是小物体之间不可能拥有大质量差。这意味着规格较大的载体更适合相结合的用作细胞培养，使细胞在动态培养之后的静态培养分布更均匀。

培养容器两端对调时，由于惯性，会造成一定程度的细胞位移，为了减少细胞移动，进行实验，速度太快时，惯性变大，没有吸附在载体上的细胞随着容器对调堆积到角落，造成细胞的挤压，对生长的细胞造成伤害。培养容器对调时，载体由外力吸附在容器的固定位置，在一个实施例中，我们采用打开电磁铁使可磁化的载体吸附在培养容器的一端，对调速度变大时，载体受到的力变大，需要更大的磁力，才能将载体吸附住，在经过反复实验，数据显示，在细胞培养容器对调过程，两端对调时间不低于0.5s，载体能牢牢的固定在培养容器中，不产生位移。对调时间越长，对调速度降低时，载体产生位移的可能变小，对细胞的影响越小。让细胞不论在悬浮状态还是静置状态，都处在最好的生长条件下，从而可以实现悬浮培养和静态培养交替进行，将剪切力最大限度地减低。

培养容器的运动可分为转动、翻转、滚动等各种方式，使培养容器实现一端与另一端的对调，一般的，是将培养容器的顶端对调至底端和/或从底端对调至顶端。培养容器的两端对调，可以使细胞载体在容器中运动。当培养容器转动至目标位置后，载体由于自身的重力和/或浮力进行运动。我们所述的细胞载体按照密度可以分为两种，一种是密度比较小的，在培养液中可以悬浮在其中，在不受外力作用时，载体自由移动至培养容器的顶端，另一种密度大于一般所用的培养液，在不受外力作用时，一般沉在容器底部。

本发明所述的培养容器有一系列的尺寸，通过改变培养容器的长度，改变载体移动的长度，可以增加搅拌的效率，一般的，容器长度增加，相应的增加培养容器两端对调一次所用的时间，在实施例中，培养容器翻转的线速度v(mm/s)与培养容器的长度L(mm)之间符合公式0.03π·L≤v≤10π·L。

在载体上升或者下沉的过程时，最优状态是从培养容器的一端移动至另一端，一方面载体移动距离最长时，搅拌的效率达到最高，另一方面，载体移动至培养容器壁上时，落在磁场的作用范围，可以更好的控制载体在培养容器对调过程时不产生位移。

细胞载体在设计上，能够保证它们在聚集在一处时，载体之间可以形成一个或多个微环境供细胞生长。一些实例中，这些微环境可以促进里面靶细胞的生长。在一个实例中，如果载体实质为球形，每个载体的直径可以介于1-10毫米，可以形成适合的小生态环境。但是，最好能让载体可以做任何适合的规格和/或形状，以方便在这些载体叠加在一处时，当中形成一个或多个适合的小生态环境。另外，最好还能在一些载体与培养室的一面或多面内壁之间形成至少若干小生态环境。

载体的数量：为了达到最佳搅拌效率，装入载体后，不能占据整个容器，培养容器中应当留有适当的空间供载体移动，同时，细胞载体过少时，特别当载体不能铺满培养容器的一个截面时，一次翻转，不能完全搅拌到所有培养液，造成搅拌效率的降低。在一个实施例中，我们在培养容器两端外加磁场固定载体，在载体体积占据培养容器的半数以上时，一侧的磁铁无法全部控制住全部载体，造成载体的分布杂乱，对细胞搅拌无法按照设定程序进行；在细胞数量太少时，对其施加磁场，载体周围存在过大的活动空间，易造成磁场强的位置载体聚集，磁场弱的地方载体稀疏，在打开磁场的时候，载体在培养容器的一侧由于场强不易形成位移。因此，载体在培养容器中的数量至少能填满面积最小的侧壁的一层。

本发明所述的动静态交替的细胞培养方法，目的在于保证细胞培养时能够保持比较均匀的分布，使得细胞能在最适宜的环境中生长。培养容器两端对调时，载体一定要固定在培养容器的一端，随着培养容器翻转不发生位移。培养容器对调的速度越快，载体产生位移的可能越大，载体在培养容器中通过两端施加的磁场越强，经过研究，对数据分析，培养容器的两端完成1次对调的时间T(s)与磁场强度B(mT)之间符合公式T≥10⁵·B^-3。

使用能铺满一层培养容器的载体，设定一系列的翻转的频率，通过实验观察载体对培养基的搅拌效率，记录如表3：

表3：翻转次数与翻转频率对翻转效果的影响

固定翻转速度调节电磁铁两端的电压改变磁铁的磁力，观察磁珠横向位移情况。

调节电压大小控制磁场大小；将稳压电源直接接到继电器电路板控制磁铁电压j3的两端，通过直接调节电压大小控制磁铁磁力大小。在培养盒子加入4粒浮力型磁珠，在培养盒子中不足以铺满一层使磁珠有足够空间横向移动。分别调节稳压电源20V，25V，30V，记录观察磁铁磁力大小和磁珠移动情况。将48V电源加在j3两端，观察磁铁磁力大小和磁珠移动情况。

表4：翻转时不同速度对载体横向移动的影响。

序号	翻转速度	溶液密度	磁珠在翻转最初3s移动情况
				1	0.4s转180°	1g/cm3	移动
2	0.5s转180°	1g/cm3	略微移动
				3	1s转180°	1g/cm3	不移动
4	2s转180°	1g/cm3	不移动
				5	4s转180°	1g/cm3	不移动
6	8s转180°	1g/cm3	不移动

表5：培养容器翻转时不同磁力大小对载体横向移动的影响。

26mT以上横向移动，翻转速度越快，横移趋势越小。

根据下表实验数据，模拟曲线的到公式培养容器的两端完成1次对调的时间T(s)与磁场强度B(mT)之间符合公式T≥10⁵·B^-3

表6不同磁场强度及培养容器两端对调时间下载体横移情况

磁场强度B(mT)	21	26	34	50	100
						一次对调时间T(s)	10	6	3	1	0.1
载体是否移动	否	否	否	否	否

对各点进行拟合如图5，获得公式T≥10⁵·B^-3。保持培养容器两端对调时载体不发生横向位移。

本发明的有益效果体现在以下几个方面：

一些生物反应器使用由磁性叶轮控制的磁性元件(尤其叶片或翼片)，用于搅拌培养基，保持细胞运动状态悬浮。这种生物反应器专门增加剪切力，用于满足某些细胞的培养要求，细胞的分布随着培养基搅拌停止时叶轮的方向而定。较大的剪切力和静态时不均匀的分布与我们的发明有明显的不同。除了应用差别以外，我们发明的生物反应器，不使用叶片或翼片作为磁性元件，我们发明中的细胞载体如果不在磁场中实际上没有磁性，只有将它们放入磁场，它们才有磁性。我们发明中的载体不由叶轮控制，而是由磁场强度变化控制载体运动。

一些其他生物反应器，其中动态和静态培养是在不同的两个或者多个细胞培养容器中进行的，由传递细胞从一个培养状态传递到另一个培养容器的另一种状态，在培养容器的传递过程中，不可避免造成细胞损失和损伤。在我们现在的发明中，动态和静态都在同一个细胞培养容器中进行，在状态转变的过程中不需要转换培养容器，当细胞从动态转换成静态时，细胞可以均匀分布在细胞腔的底部或者吸附在搅拌材料的表面。在培养进行过程中，载体在随着培养容器运动，本发明将控制培养过程中的各个参数，达到在培养过程中达到载体和培养容器的最佳协同方式。

本发明所述的动静态结合的细胞培养方法是动态与静态交替进行，间歇的搅拌方式，可以使细胞生长的更好。在我们的发明中，动静两态都在同一个细胞培养容器中进行，在状态转变的过程中不需要转换培养容器，当细胞从动态转换成静态时，细胞可以均匀分布在细胞培养容器的一端或者吸附在搅拌材料的表面。

一般细胞的生长周期是在较小的密度时生长缓慢，随着细胞的增殖，培养密度逐渐增加，增殖速度变快，在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。在我们的发明中，培养容器的每个面都可以供细胞生长，在细胞生长的初期阶段，细胞的培养密度比较低，生长时，程序的控制载体和细胞落在横截面积较小的一面，增加其生长时的堆积密度，随着细胞的生长，细胞增多，初始的培养面上堆积太多的细胞无法提供细胞增长所需的空间养分，这个情况下，经过培养程序动态对调后，自动调节载体和细胞落在较大的横截面积的一面，控制细胞密度在比较合适的范围内，更有利于细胞增长。

在构建悬浮微环境的生物反应器中，在国际上比较认可的为采用美国宇航局(NASA)技术的微重力生物反应器。该生物反应器在培养过程中，为保持细胞悬浮状态，需要使圆形培养容器持续旋转，一旦培养容器停止旋转，细胞和载体将迅速沉降，聚集在圆形培养容器的底部凹处。我们采用本发明ZYX生物反应器与该微重力生物反应器对比，在造血干细胞的体外扩增效率及小鼠造血重建实验中获得更好的实验结果，详细数据见下文。在此基础上，进一步对免疫细胞的扩增做针对性的优化，对接“21世纪是细胞治疗的世纪”，满足科研上和临床上对免疫细胞的扩增需求。

而且，目前国际上没有整合细胞扩增和分选功能的生物反应器，ZYX生物反应器上市后将实现这两项功能的无缝连接，更方便科研和医疗工作者，减少人力，方便操作。ZYX生物反应器集成了全自动的细胞分选、细胞密度检测反馈等功能，可以让细胞分选与细胞扩增两种程序在一个培养器内完成，操作简便易行，最大限度地减少了污染和靶细胞损伤、死亡的风险，极大地提高了操作效率。

实验一，分别用对照的微重力生物反应器和ZYX生物反应器扩增人外周血造血干细胞，初始浓度为0.2x10⁶/ml，扩增6天，然后计算扩增获得的CD34⁺细胞数量。从图6中的结果中可以看出，ZYX生物反应器对造血干细胞的扩增效率超过对照的生物反应器。

实验二，分别将对照的微重力生物反应器和ZYX生物反应器扩增获得的人外周血造血干细胞，按移植细胞数量1.8x10⁶输入经辐照的NOD/SCID小鼠，对小鼠进行造血重建。在第6周，观察小鼠骨髓中细胞的情况。从图7中的结果中可以看出，采用ZYX生物反应器扩增的造血干细胞中CD45⁺细胞占骨髓细胞的比例超过1％，说明移植成功，即扩增后的造血干细胞保持了干细胞的特性，能够自我更新，大量增殖。而对照的生物反应器扩增的造血干细胞造血重建失败，说明干细胞的活性在扩增中可能受到影响。

从上述实验结果可以看出，ZYX生物反应器能够高效扩增造血干细胞(最难扩增的细胞之一)，同时能够保证扩增后的细胞活性，为科学研究提供了更好的扩增技术平台，为细胞治疗技术的应用提供了更简便高效的技术手段。

附图说明

图1是轻珠子一个对调过程示意图。

图2是重珠子一个对调过程示意图。

图3是一个翻转带一个培养容器示意图

图4是一个翻转带多个培养容器示意图。

图5是不同磁场强度及培养容器两端对调时间的拟合曲线。

图6是不同生物反应器对CD34⁺细胞扩增倍数的影响。

图7是不同生物反应器扩增CD34⁺细胞的移植疗效。

图8是造血干细胞培养时容器分布状况。

具体实施方式

本发明所述的细胞培养方法为细胞生长的运动状态以及静置状态提供了最佳的状态，本质上说是一种间歇性动静态交替的培养方式，动态和静态两种状态之间可以在同一个培养容器中任意转换，其中细胞的静态分布出现在动态分布的运动之后，并且保证在动态之后的静态，细胞能够均匀分布。一般的，在细胞培养过程中静态、动态、或者动静态交替状态交替出现，动态培养后紧接着是保持细胞均匀分布的静态培养，静态培养一段时间后为维持细胞均匀的动静交替的状态和/或温和的运动状态。这样，细胞不论在运动状态还是静置状态，都处在最好的生长环境下，从而可以实现动态培养和静态培养交替进行，将剪切力最大限度地减低。

现在发明的生物反应系统可以是细胞在三种状态生长，特别是动静交替的状态，但是这个系统也可以单独用于动态或者静态。在动态培养细胞时，细胞可以用任意方式再悬浮，包括但不限于磁力搅拌和培养容器翻转。

载体在培养容器中有静态和动态两种状态，静态过程为载体与培养容器的相对位置不发生改变，动态过程为载体在培养容器中相对位置改变。静态方式的实现，包括载体不受外力作用沉在培养容器底端或者浮在培养容器的顶端和/或受外力的作用固定在培养容器的固定位置。动态方式的实现，包括载体与培养液的密度差在容器中的沉降或上浮和/或受到外力作用在培养容器中移动。

运动可分为转动、翻转、滚动等各种方式，使培养容器实现一端与另一端的对调，一般的，是将培养容器的顶端对调至底端和/或从底端对调至顶端。培养容器的两端对调，可以使细胞载体在容器中运动。当培养容器转动至目标位置后，载体由于自身的重力和/或浮力进行运动。我们所述的细胞载体按照密度可以分为两种，一种是密度比较小的，在培养液中可以悬浮在其中，在不受外力作用时，载体移动自由移动至培养容器的顶端，另一种密度大于一般所用的培养液，在不受外力作用时，一般沉在容器底部。

实施例1：一个翻转系统带一个培养容器(图3)

以一个电机控制翻转系统，一个翻转上装载一个培养容器1，培养容器1的两端设置电磁铁3、4，能吸引和/或释放载体2。通过程序控制电机，达到培养容器1的两端对调。

实施例2：一个翻转系统带几个培养容器(图4)

以一个电机控制一系列的培养容器1，将培养容器1分别安在电机控制的圆形装置上，通过该装置的转动，带动上面装载的培养容器1的上下对调，可以在培养容器两端设置磁场3、4，分别控制每个培养容器中的载体2的运动，也可以在圆形装置上设置磁铁3、4，统一控制每个培养容器中的载体2运动

实施例3：电磁铁作为磁场发射器使用密度比培养基小的载体。

使用10×30×60mm的培养容器，培养容器两端各放一个可程序调节的电磁铁，作为磁场发生器，磁场强度范围为26-50mT，用伺服电机控制培养容器两端对调。使用直径为6mm的圆形载体，密度为0.9g/cm³。加入细胞后，先使均匀分布，进行一个设定的动态对调周期，参照图1，进行翻转周期时，先关闭A端电磁铁3，使仪器不带有磁场，释放培养容器中的载体2，此时载体2自由转至培养容器B端，打开B端磁场4，将载体2固定在培养容器的B端，此时，程序自动打开，电机控制培养容器A、B端对调，载体2维持在容器1的B端，关闭B端磁场4，释放载体2，使载体2在培养容器中搅拌培养基，设定培养容器两端对调的时间为3.5s，对调的间歇时间为1.5s，重复上述步骤，即图1步骤，在使细胞均匀的过程，重复此过程4-20次，进行最后一次对调时，不再释放载体，细胞和载体均匀的分布在培养容器底部，此时进入静态培养的过程。经过数次动静态交替后，收获细胞。

实施例4：电磁铁作为磁场发射器使用密度比培养基大的载体。

使用10×30×60mm的培养容器，培养容器两端各放一个可程序调节的电磁铁，作为磁场发生器，磁场范围为26-50mT，用伺服电机控制培养容器两端对调。所用的载体为直径6mm，密度为1.1g/cm³。加入细胞后，先使其均匀分布，进行一个动态对调周期，参见图2，细胞载体2自由的分布在培养容器A端，打开A端磁场3，使载体2固定在培养容器的A端，此时，用程序进行培养容器A、B端对调，由于培养容器的对调，容器的A端变为顶端，接着，关闭电磁铁3，载体2释放自由下落，此时载体2又到达容器B端，打开磁场4，进行培养容器两端对调，即完成图2步骤，设定培养容器两端对调的时间为3.5s，对调的间歇时间为1.5s，重复上述步骤，进行4-20次，使细胞在容器中均匀分布。进行最后一次对调时，当载体到培养容器底部时，不再进行对调，细胞和载体均匀的分布在培养容器底部，此时进入静态培养的过程。经过数次动静态交替后，收获细胞。

实施例5：永磁铁作为磁场发射器，使用密度比培养基小的载体。

使用40×150×200mm的培养容器，以200mm的长为载体运动的长度，使用载体为直径6mm，密度为1.1g/cm³。培养容器两端各放一个磁场强度为70mT的永磁铁，可通过程序控制永磁铁距离培养容器的远近，作为磁场发射器，用伺服电机控制培养容器A、B对调。加入细胞后，先使均匀分布，进行一个动态对调周期，参见图1，进行翻转周期时，先使培养容器A端磁铁3远离，使培养容器中的载体2不在磁场范围内，释放培养容器1中的载体2，此时载体2转至培养容器B端，使B端的磁铁4靠近培养容器1，将载体2固定在培养容器的B端，此时，程序自动打开，电机控制培养容器两端对调，载体2跟随着容器的B端对调至底端，此时释放载体2，使载体2在培养容器1中搅拌培养基，设定培养容器两端对调的时间为3.5s，对调的间歇时间为1.5s，重复上述步骤，在使细胞均匀的过程，重复此过程4-20次，进行最后一次对调时，不再释放载体，细胞和载体均匀的分布在培养容器底部，此时进入静态培养的过程。经过数次动静态交替后，收获细胞。

实施例6：培养造血干细胞(HSC)。

从巴菲层细胞中分选造血干细胞，然后进行细胞培养。软层细胞可以从脐带血、骨髓、周围血液或其它组织中。在培育期间，将生物反应器的操作系统接入二氧化碳培养箱，连接控制箱所有接线。培养前，细胞放入含有载体的10×30×60的培养容器，载体的直径为6mm，密度为0.90g/cm³。该培养容器中载体实际运动路程为55mm，设定培养容器两端对调时间为1s，每次对调间隔为3.5s，开始翻转细胞培养室数次(5-8)，让载体充分搅拌细胞。在翻转的最后，载体的位置位于底部，细胞均匀的分布在载体之间形成小空间以及细胞培养容器内。经过一段时间培养后，细胞数量增多，之后进行数个动静态交替，使细胞再次均匀分布，培养数天后，可以收获所有细胞，或者是将细胞倒入另一个容器。

实施例7：成纤维细胞培养。成纤维细胞为一种典型的粘附细胞。

培养粘附细胞时使用的经处理的可吸附细胞的载体。在胰蛋白酶消化和清洗后，成纤维细胞被悬浮于合适的培养基，重新悬浮为10000-40000/ml。细胞放入含有载体的培养容器，载体的直径为6mm，密度为0.90g/cm³，将培养容器装到二氧化碳培养箱翻转臂。启动标准粘附细胞的培养程序。在这个程序，细胞培养室保持缓慢翻动24-72小时，让细胞粘附到载体上，细胞黏附率可由悬浮细胞减少的速率来估算。在第二天，包含未粘附细胞的培养基排入废料容器或注射器，然后再加入新鲜培养基。设定培养容器两端对调时间为1s，每次对调间隔为3.5s，待培养数天后，收集分离的细胞。要捕获所有分离的细胞，可能需要再清洗两或三次。

实施例8：造血干细胞培养过程(图8)

在一个具体的实施例中，造血干细胞培养的周期为6天。在培养造血干细胞培养初期，如第1天至第4天，细胞密度在比较低的数值时，在动态培养之后的静态培养时，载体和细胞落在培养容器上横截面积最小的一侧，使细胞在一个较大的生长的浓度下进行增殖。培养第5天后，细胞浓度达到一定的水平时，小的侧面堆积的细胞在一个较大的密度，细胞已到达生长的最高峰，并且随着细胞的增殖密度急剧增大，过大的细胞密度会阻碍正常的生长速度，此时，细胞再次进入动态翻转，翻转停止时，载体和细胞程序控制落在横截面积大的一面，使细胞能够在一个合适的密度下继续增殖。

Claims (5)

1.一种细胞培养的方法，其特征在于

A.在同一个培养容器进行的细胞培养至少包括静态培养的过程、载体运动的过程、培养容器两端对调的过程和细胞分布的过程；

B.培养容器中具有载体；

C.静态培养的过程中，载体分布于培养容器的一端，细胞分布在载体的表面、载体之间的空隙或培养容器内的任何部分中，与培养容器保持相对静止；

D.载体运动的过程中，载体由培养容器的一端向另一端运动；

E.培养容器对调的过程中，载体固定在培养容器的一端，并随培养容器的两端位置变化发生对调；

F.细胞分布的过程中，载体重新位于培养容器的一端，细胞由混悬状态分布在载体的表面、载体之间的空隙或培养容器内的任何部分中；

其中，所述的细胞培养过程中所用的各载体质量、体积或密度不均一；载体的直径大于1mm；载体的密度不超过8g/cm³；载体密度比培养基密度±0.02‐0.4g/cm³；载体由培养容器的一端向另一端运动，运动的速率不高于1m/s；静态培养之间的动态培养由载体运动和培养容器两端对调循环重复进行4‐20次来实现；培养容器的两端完成1次对调的时间T(s)与磁场强度B(mT)之间符合公式T≥10⁵·B^‐3；培养容器的两端完成1次对调的时间T不低于0.5s；将载体固定在培养容器一端的磁场强度不低于26mT。

2.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于所述的载体可磁化，在磁场下具备磁性，在远离磁场下磁性快速消失；培养容器对调的过程中，载体在磁场的作用下固定在培养容器的一端。

3.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于培养容器的对调采用围绕轴翻转的方式。

4.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于培养过程中的静态培养时，载体位于培养容器的底端，培养容器为可旋转和/或翻转的结构，当培养容器的任意侧壁位于下方时，该侧壁为培养器的底端。

5.根据权利要求4所述的细胞培养方法，其特征在于细胞生长所位于的培养容器的底部由培养容器的不同侧壁在培养过程中交替构成。