CN105132367A - 间充质干细胞的三维共培养诱导方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种间充质干细胞的三维共培养诱导方法，包括以下步骤：分别获取间充质干细胞和目的细胞源；将间充质干细胞与含有磁性氧化物包裹于凝胶球A中；将目的细胞源包裹于凝胶球B中；用诱导剂对凝胶球A内的间充质干细胞和凝胶球B中的目的细胞源进行共培养至间充质干细胞转化为目的细胞，然后将凝胶球A和凝胶球B置于磁场中进行分离；其中，磁性氧化物颗粒的直径为1-100nm。本发明不仅能够达到简化分离共培养细胞的目的，而且利用海藻酸胶体的三维空间结构，扩大了间充质干细胞的生长空间，以及与培养液及细胞间的物质信号交流，促进间充质干细胞的生长分化，提高转化率，增强细胞活性。

Description

间充质干细胞的三维共培养诱导方法

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，特别涉及一种间充质干细胞的三维共培养诱导方法。

背景技术

间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，它能够定向诱导为胰岛样细胞、软骨细胞等多种细胞。且间充质细胞存在于人体多种组织中，尤其是脐带、胎盘、骨髓、脂肪组织来源的间充质干细胞，具有来源广泛、易于采集、无伦理问题等优势，可规模化诱导分化为临床治疗所需要的目的细胞，如软骨细胞、胰岛细胞等。但目前多采用静态二维共培养间充质干细胞和目的细胞的方式使间充质干细胞转化为目的细胞，虽然通过这种共培养方式，软骨细胞可以通过近分泌和旁分泌作用更加迅速地影响周边的间充质干细胞分化，但这种诱导方式很难有效辨别培养体系中目的细胞的来源，也无法有效分离两种细胞；并且诱导周期长，诱导转化率低，细胞活性低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中二维共培养间充质干细胞的诱导方式存在诱导周期长，诱导率低，细胞活性差，分离两种共培养细胞困难等缺陷，提供一种能够提高间充质干细胞的诱导转化率，增强细胞活性且易分离共培养细胞的间充质干细胞的三维共培养诱导方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

提供一种间充质干细胞的三维共培养诱导方法，包括以下步骤：

分别获取间充质干细胞和目的细胞源；

将间充质干细胞与含有磁性氧化物颗粒的可溶性的海藻酸盐A混合后，再与除镁离子以外的二价金属离子盐溶液A混合，至形成凝胶球A；

将目的细胞源与可溶性的海藻酸盐B混合后，再与除镁离子以外的二价金属离子盐溶液B混合，至形成凝胶球B；

用诱导剂凝胶球A内的间充质干细胞和凝胶球B中的目的细胞源进行共培养至间充质干细胞转化为目的细胞，然后将凝胶球A和凝胶球B置于磁场中进行分离；

其中，磁性氧化物颗粒的直径为1-100nm。

在本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法中，所述凝胶球A的形成过程为：将所述间充质干细胞与含有磁性氧化物颗粒的可溶性的海藻酸盐A混合后，匀速加入除镁离子以外的二价金属离子盐溶液中。

在本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法中，所述凝胶球A内的间充质干细胞与凝胶球B中的目的细胞源进行共培养之前，还包括采用培养液清洗凝胶球A和凝胶球B的步骤。

在本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法中，所述磁场的最大磁能积为35MGOe。

在本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法中，所述磁性氧化物颗粒为Fe₃0₄或Co₃O₄颗粒，且所述海藻酸盐A中，磁性氧化物的浓度为2-10mg/ml。

在本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法中，所述海藻酸盐A和海藻酸盐B均为海藻酸钠或海藻酸钙；与间充质干细胞混合后，海藻酸盐A的浓度为2％-10％W/V；与目的细胞源混合后，海藻酸盐B的浓度为2％-10％W/V。

在本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法中，所述二价金属离子盐溶液A和二价金属离子盐溶液B均为氯化钙溶液，且氯化钙的浓度均为1％-5％W/V。

在本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法中，所述目的细胞源为软骨细胞源；且对所述凝胶球A内的间充质干细胞和凝胶球B中的目的细胞源进行共培养的步骤中，所述间充质干细胞与所述软骨细胞源的浓度比为1:1-3:1。

在本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法中，所述诱导培养过程中所采用的诱导剂包括5-15ng/ml的TGF-β、7-10mmol/l地塞米松、50-100ug/ml抗坏血酸、5-15mmol/l甘油磷酸钠和50-150ng/ml的ITS+Premix。

在本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法中，对所述凝胶球A中的间充质干细胞和凝胶球B中的目的细胞源共培养的过程是在生物反应器中进行的。

实施本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，可以达到以下有益效果：通过海藻酸凝胶球A将磁性氧化物与间充质干细胞包裹在一起，并将软骨细胞包裹在海藻酸凝胶球B中，同时对凝胶球A中的间充质干细胞和凝胶球B中的软骨细胞进行共培养，使得软骨细胞的旁分泌和近分泌能够促进间充质干细胞向软骨细胞分化；待诱导培养结束，含有磁性氧化物的凝胶球A在外加磁场的作用下可聚集在一起，从而与凝胶球B分离；因此，本发明不仅为间充质干细胞提供一个模拟体内细胞生长的微环境，扩大了间充质干细胞的生长空间，以及与培养液及细胞间的物质信号交流，促进间充质干细胞的生长分化，提高转化率，增强细胞活性；同时，也使得分离两种共培养细胞更加方便。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明提供的检测实验三中，根据Chs标准样品工作液的浓度及其OD值所制作的标准曲线图。

具体实施方式

为解决现有技术中二维共培养间充质干细胞的诱导方式存在诱导周期长，转化率低，细胞活性差，分离两种共培养细胞困难等缺陷，本发明的创新点在于提供一种间充质干细胞三维共培养诱导方法，通过海藻酸凝胶球A将磁性氧化物与间充质干细胞包裹在一起，并将软骨细胞包裹在海藻酸凝胶球B中，同时对凝胶球A中的间充质干细胞和凝胶球B中的软骨细胞进行共培养，使得软骨细胞的旁分泌和近分泌能够促进间充质干细胞向软骨细胞分化；待诱导培养结束，含有磁性氧化物的凝胶球A在外加磁场的作用下可聚集在一起，从而与凝胶体B分离，解决了现有技术中分离细胞困难的目的；而海藻酸凝胶球的三维孔隙结构为间充质干细胞提供一个三维生长空间，磁性氧化物以模拟细胞在体内的生存环境，为间充质干细胞提供充足的生长空间，增加间充质干细胞与培养液的接触面积，从而实现了提高间充质干细胞的转化率，增强细胞活性，增加软骨细胞的数量，并缩短诱导周期。

本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，包括以下步骤：

一、分别获取间充质干细胞和目的细胞源；

二、将间充质干细胞与含有磁性氧化物颗粒的可溶性的海藻酸盐A混合后，加入除镁离子以外的二价金属离子盐溶液A中，至形成凝胶球A；

三、将目的细胞源与可溶性的海藻酸盐B混合后，加入除镁离子以外的二价金属离子盐溶液B中，至形成凝胶球B；

四、分别清洗凝胶球A和凝胶球B后，将凝胶球A内的间充质干细胞和凝胶球B中的软骨细胞置于细胞培养容器中进行共培养至间充质干细胞转化为软骨细胞，然后将凝胶球A和凝胶球B置于磁场中进行分离。

步骤一中，间充质干细胞可来源于脐带、胎盘、骨髓等，优选地，从骨髓中获取间充质干细胞；优选地，间充质干细胞的密度为5-15×10⁶个/ml。目的细胞源可根据具体需要进行获取，下以软骨细胞源为例进行具体说明。软骨细胞源来源于动物软骨，软骨细胞源与间充质干细胞的浓度比为1:1-3:1，优选地，软骨细胞源的密度为2.5-5×10⁶个/ml。

步骤二中，海藻酸盐高分子在除镁以外的二价金属离子的作用下交联而失去了流变性后，水分子的流动受到了抑制，进而产生了含水量极高且具有通孔的凝胶体，并且海藻酸盐的凝胶体不是热可逆的，具有很好的稳定性及生物相容性，因此，能够为间充质干细胞提供稳定的三维生长空间，模拟细胞在体内的生长环境，扩大了间充质干细胞的生长空间，并且增大了间充质干细胞与培养液的接触面积，有利于细胞的贴附、生长和分化。

其中，单价阳离子和Mg²⁺与海藻酸盐不能形成凝胶，而Ba²⁺和Sr²⁺所形成的凝胶比Ca²⁺形成的凝胶性能更强。其他多价阳离子，如Pb²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺和Mn²⁺等也可以形成海藻酸钠交联凝胶，但因具有毒性其应用受限；由于Ca²⁺来源较广，获取较易，优选地，二价金属离子为钙离子，且二价金属离子盐溶液为CaCl₂溶液,CaCl₂的浓度为1％-5％W/V，钙离子浓度越大，凝胶球直径越大，形成的孔隙结构越多，凝胶球的渗透能力也越强，越有利于细胞附着生长、分化；海藻酸盐为海藻酸钠或海藻酸钙等，优选为海藻酸钠溶液，且海藻酸钠的浓度为2％-10％W/V。本发明中单位W/V如无特别指出均为mg/ml。

需要注意的是，由于二价金属离子和海藻酸盐的反应迅速，可通过提高凝胶化温度，钙离子总量或降低海藻酸盐溶液浓度来加快胶化过程；而减慢固化速度、提高海藻酸盐溶液浓度、钙离子总量以及使用分子质量较高的海藻酸盐，可以增强其力学性能，更有利于间充质干细胞的分化。另外，海藻酸盐与金属离子盐溶液的滴加顺序及滴加速度会影响胶体的性质，滴加速度过快，产生的胶体是小片状凝胶和间断的凝胶结构，间充质干细胞分布不均匀；优选地，本发明采用将间充质干细胞与海藻酸盐混合后匀速滴入金属离子盐溶液中，以此形成的凝胶球大小较均匀，也不会影响间充质干细胞在凝胶球内的均匀分布。

在本发明中，先将磁性氧化物与海藻酸盐A混合均匀，再加入间充质干细胞，当加入二价金属离子盐溶液之后，可将磁性氧化物和间充质干细胞均匀包裹在海藻酸凝胶球A内磁性氧化物。优选地，磁性氧化物的颗粒直径为1-100nm纳米级，直径过大会影响海藻酸凝胶球的包覆，直径太小也会影响磁运动强度；磁性氧化物可以是Fe₃0₄或Co₃O₄。由于Fe₃0₄来源较广泛，成本低，因此优选选用Fe₃0₄，且Fe₃0₄的浓度为2-10mg/ml。

步骤三中，海藻酸盐B可与海藻酸盐A保持一致，优选为海藻酸钠，且海藻酸钠的浓度为2％-10％W/V；二价金属离子盐溶液B也可与二价金属离子盐溶液A保持一致，优选为CaCl₂溶液，且CaCl₂的浓度为1％-5％W/V。

步骤四中，待凝胶球A和凝胶球B形成之后，分别去除多余的二价金属离子盐溶液A和B，并用NaCl溶液反复清洗凝胶球A和凝胶球B，再分别用基础培养基清洗，避免二价金属离子在细胞培养过程中产生毒性作用。

然后，再将含有间充质干细胞和磁性氧化物的凝胶球A和含有软骨细胞的凝胶球B置于细胞培养容器中混合均匀进行共培养，待间充质干细胞转化为软骨细胞后，将凝胶球A和凝胶球B置于外加磁场中，含有磁性氧化物的凝胶球A在磁场的作用下聚集，并与凝胶球B分离，从而实现了分离两种共培养细胞的目的。优选地，外加磁场由强力磁铁提供，且强力磁铁的最大磁能积为35MGOe，当然磁场的实现方式也并不局限于此。

进一步地，细胞培养容器可以是静态的细胞培养板，也可以是生物反应器，既能实现动态培养，也可在不通电的情况下进行静态培养，生物反应器可以是转瓶系统，包括用于容纳两种共培养细胞悬液的转瓶和用于混合两种细胞悬液的转瓶机；也可以是摇瓶、灌注系统等。动态培养不仅可以实现大规模地培养细胞，获得足够量的细胞数量，而且还可以更加精确地控制反应条件，便于未来规模化生产，其次，动态培养可以提高培养过程中传质和传氧的效率，可以有效克服静态培养的传质极限，通过生物反应器结合三维培养系统，可以有效地提高间充质干细胞的增殖分化，并提高细胞的活性，生物反应器中动态培养条件剪切应力在某种程度上能够促进间充质干细胞形成软骨细胞，提高诱导转化率。

当然可以理解的是，也可在间充质干细胞与软骨细胞共培养的过程中，将细胞培养容器置于外加磁场中，使得含有磁性氧化物的凝胶球A能够在磁场中运动，从而形成了动态培养环境，使得间充质干细胞充分接触凝胶球B中软骨细胞的旁分泌，包括PDGF(血小板源性生长因子)、BMP(骨形态发生蛋白)、FGF(成纤维细胞生长因子)、TGF-β(转化生长因子-β)、IGF(胰岛素样生长因子)、CDMP(软骨源性形态发生蛋白)等，不仅可以调节软骨细胞自身的生长分化，而且可以调控影响间充质干细胞的分化；同时，磁场作用也能够促进间充质干细胞转化成软骨细胞。由于含有磁性氧化物的凝胶球A在磁场的作用下会聚集在一起，因此，优选地，磁场可间断外加于细胞培养容器，以避免连续外加磁场，凝胶球A聚集在一起，影响间充质干细胞分化过程中的呼吸作用，以及对培养基及诱导剂的吸收。

进一步地，共培养诱导过程中，本发明所采用的诱导剂中包括TGF-β、地塞米松、抗坏血酸、甘油磷酸钠和ITS+Premix。

其中，TGF-β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β转化生长因子-β)是一族广泛存在、结构相关、功能相似的多功能活性肽，具有多种功能的多肽生长因子，可以促进间充质干细胞的增殖与分化，促进细胞外基质的合成，促进胶原产生，刺激软骨细胞的合成与分泌细胞外基质蛋白，促进骨细胞的增殖。TGF-β有三种异构体，分别为TGF-β1、β2和β3，TGF-β2、β3较β1可更快速有效地促进间充质干细胞向软骨细胞分化，但TGF-β2、β3之间诱导干细胞的水平基本相同。由于TGF-β在骨生长中的生物学功能呈双向调节作用，既能刺激细胞的增殖分化作用，也能进行抑制作用，一般来说，低浓度TGF-β起刺激作用，促进细胞的增殖分化；高浓度起抑制作用，因此，优选地，TGF-β的浓度为5-15ng/ml。

地塞米松，购于Sigma公司，能够刺激碱性磷酸酶、骨钙素和Ⅰ型胶原等的表达，显著地增加碱性磷酸酶的活性，碱性磷酸酶是骨形成过程中必须的酶，碱性磷酸酶的表达情况代表着骨形成的状况，可以激活位于间充质干细胞表面的糖皮质激素受体，促进间充质干细胞向软骨细胞分化，同时，提高间充质干细胞向软骨细胞的分化率；优选地，地塞米松的浓度为7-10mmol/ml。

抗坏血酸又称维生素C，是水溶性维生素的一种，参与氧化还原过程，在生物的氧化和还原过程以及细胞呼吸作用中扮演重要角色，同时，抗坏血酸是胶原合成所必需的，还可调节ATP酶与ALP活性及非胶原基质蛋白质的合成；抗坏血酸对软骨细胞分化的促进作用，主要是通过增加胶原的累积，然后增加碱性磷酸酶在软骨细胞中的表达；此外，作为一种抗氧化剂还可抑制或减少诱导过程中细胞凋亡的产生。优选地，抗坏血酸的浓度为50-100ug/ml。

甘油磷酸钠可以为软骨细胞提供磷酸离子，同时促进生理性钙盐的沉积和钙化，是骨髓基质间充质干细胞产生矿化结节的必要条件；优选地，甘油磷酸钠的浓度为5-15mmol/ml。

ITS+Premix作为一种生长因子加进基础培养基，购于BD公司；其成份包含有牛血清白蛋白和亚油酸等，能够促进细胞的增殖生长；优选地，ITS+Premix的浓度为50-150ng/ml。

进一步地，本发明提供的诱导液还包括胰岛素和转铁蛋白；胰岛素可降低蛋白质降解，增加氨基酸和葡萄糖的摄入，为细胞生长和分化提供能量，促使间充质干细胞处于低糖环境，保持细胞活性，有利于间充质干细胞向软骨细胞的分化，优选地，胰岛素的浓度范围为5-10mg/ml；而转铁蛋白能够干预软骨细胞内离子代谢，促进软骨细胞的生成，优选地，转铁蛋白的浓度范围为5-10mg/ml。

更进一步地，本发明提供的诱导液还包括谷氨酰胺，谷氨酰胺参与蛋白质的合成和核酸代谢，可作为诱导液中的能量来源，另外，谷氨酰胺通过细胞增容作用，也可促进细胞的生长和分化；优选地，谷氨酰胺的浓度范围为1-10mmol/l。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，包括以下步骤：

1、间充质干细胞和软骨细胞源的分离；

将空气注入新西兰大白兔耳缘静脉，使其死亡。用75％的酒精涂抹大白兔的四肢，消毒并减少兔毛的污染。

1)间充质干细胞的分离；

无菌条件下，剪下兔四肢的股骨和腔骨，除去皮肤组织保留关节处的肌肉结缔组织，其余部位的肌肉组织剪去。将处理过的组织浸泡在75％的酒精，30min之后取出，用无菌PBS清洗，放置在超净台中。用无菌手术刀切掉关节处的肌肉，使关节暴露。用骨剪剪开关节，使骨腔暴露。使用一次性注射器吸取无菌PBS，反复冲洗骨腔，使骨腔内的骨髓都冲洗到一次性平皿中。将液体转移至无菌的200目的筛网上，过滤除去大组织，获得悬浮液。将悬浮液缓慢加入到事先装有15ml的Ficoll淋巴分离液的50ml离心管，2790rpm离心30min。离心结束后，用尖吸管吸取液体中间白色雾状层细胞，将细胞转移至T150大方瓶后，加入50ml间充质干细胞生长培养基，3天后换液。待细胞融合度达到90％后传代，胰酶消化3-5min，吸取悬浮液转移至新的方瓶中培养，此细胞记为P2细胞，部分冷冻保存，其余部分继续传代。

2)软骨细胞源的分离；

切取兔双侧膝关节软骨，放入培养皿，浸入灭菌1×PBS中漂洗3次，去除关节软骨周围的软组织及骨组织，1×PBS再次漂洗。剪碎软骨组织，大小约1～2mm³，肉眼可见成乳糜状，移入10ml刻度离心管，1ml0.25％胰蛋白酶震荡消化3min后，静置2min，吸去上层悬浊液，1×PBS漂洗，500转/分离心2分钟，弃上清，加入0.1％Ⅱ型胶原酶1ml消化，消化过程中不断用吸管轻轻吹打，每30分钟取上层悬浊液，转移入另外的离心管中，加入含血清的培养基终止其消化。原离心管中加入0.1％Ⅱ型胶原酶1ml继续消化，最后把收集到的上层悬浊液集中入一个离心管中1000rpm，离心8min，弃上清液，即获得软骨细胞。

2、间充质干细胞的传代培养，获取P3代间充质干细胞；

当步骤1)中的间充质干细胞融合度达到90％左右时即可消化传代。吸出培养基，用无菌PBS清洗细胞表面,洗去残留的培养基。加入5ml胰酶，静置5min，显微镜观察多数细胞变为球形，可以浮动时，加入含有FBS的培养基终止消化。吸出细胞悬液，血球计数板计数，再以1.0×10⁴个/cm²的密度接种于T150方瓶。将方瓶置于37℃，5％CO₂动物细胞培养箱中培养，待细胞融合度达到90％即可再次消化传代；本实施例中采用P3代间充质干细胞。

3、包埋P3代间充质干细胞；

1)含有Fe₃0₄颗粒的海藻酸钠溶液A的制备

取直径为20nm的磁性纳米粒子Fe₃0₄与海藻酸钠在50ml离心管内混合，初始的Fe₃0₄浓度为4mg/ml，将混合之后的溶液在超声波清洗仪中震荡30min，之后105℃灭菌20min，现配现用。

2)包埋

取步骤2中的P3代间充质干细胞，并重悬调整细胞密度为5×10⁶个/ml，使用注射器吸取步骤1)中制备的等体积的含有Fe₃0₄颗粒的无菌4％W/V海藻酸钠溶液，与P3代间充质干细胞悬液均匀混合，此时细胞密度为2.5×10⁶个/ml，海藻酸钠终浓度为2％W/V，Fe₃0₄的浓度为2mg/ml。使用注射器吸取P3代间充质干细胞和Fe₃0₄颗粒以及海藻酸钠混合液，装上无菌的针头，排除注射器内的空气。之后缓慢推动注射器，将P3代间充质干细胞和Fe₃0₄颗粒以及海藻酸钠混合液匀速滴入装有100ml的1％W/VCaCl₂溶液的烧杯中。尽量保证针头位置始终与烧杯杯口持平，匀速滴入P3代间充质干细胞和Fe₃0₄颗粒以及海藻酸钠混合液，反应10min至含P3代间充质干细胞和Fe₃0₄颗粒的海藻酸钠交联形成凝胶球A。

4、包埋软骨细胞源；

取步骤1中获取的软骨细胞源，并重悬调整细胞密度为5×10⁶个/ml，使用注射器吸取等体积的无菌4％W/V海藻酸钠溶液B(由海藻酸钠溶于氯化钠溶液制成的)，与软骨细胞源悬液均匀混合，此时细胞密度为2.5×10⁶个/ml，海藻酸钠终浓度为2％W/V。使用注射器吸取软骨细胞源以及海藻酸钠的混合液，装上无菌针头，排除注射器内的空气。之后缓慢推动注射器，将软骨细胞源和海藻酸钠的混合液匀速滴入装有100ml的1％W/VCaCl₂溶液的烧杯中。尽量保证针头位置始终与烧杯杯口持平，匀速滴入软骨细胞源和海藻酸钠的混合液，反应10min至含软骨细胞源的海藻酸钠交联形成凝胶球B。

5、清洗凝胶球A和凝胶球B，并对凝胶球A中的间充质干细胞和凝胶球B中的软骨细胞进行共培养；

对步骤4和步骤5中的凝胶球A和凝胶球B分别继续执行以下操作：

吸出CaCl₂溶液，用10ml无菌0.9％NaCl溶液洗涤凝胶球，再用10ml不含FBS的α-MEM洗涤两次；

将清洗后的凝胶球A和凝胶球B装入同一转瓶内，并添加50ml软骨诱导培养基，然后将转瓶放入转瓶机上，转速为50rpm每周全量换液3次，半量换液1次，置于37℃，5％CO₂动物细胞培养箱中进行共培养28天。

其中，软骨诱导培养基中含有诱导液，诱导液成份为：10ng/ml的TGF-β、10mmol/l地塞米松、70ug/ml抗坏血酸、10mmol/l甘油磷酸钠和100ng/ml的ITS+Premix。

6、分离共培养细胞

将诱导后的凝胶球A和凝胶球B分别置于最大磁能积为35MGOe的强力磁铁的磁场中，含有磁性Fe₃0₄颗粒的凝胶球A在磁场的作用下聚集，并与凝胶球B分离，从而将凝胶球A中诱导后的软骨细胞与凝胶球B中的软骨细胞源分离开来。

实施例2

与实施例1的不同之处在于，该实施例2中的步骤3为：

1)含有Fe₃0₄颗粒的海藻酸钠溶液A的制备

取直径为20nm的磁性纳米粒子Fe₃0₄与海藻酸钠在50ml离心管内混合，初始的Fe₃0₄浓度为10mg/ml，将混合之后的溶液在超声波清洗仪中震荡30min，之后105℃灭菌20min，现配现用。

2)包埋

取步骤2中的P3代间充质干细胞，并重悬调整细胞密度为2×10⁷个/ml，使用注射器吸取步骤1)中制备的等体积的含有Fe₃0₄颗粒的无菌20％W/V海藻酸钠，与P3代间充质干细胞悬液均匀混合，此时细胞密度为1×10⁷个/ml，海藻酸钠终浓度为10％W/V，Fe₃0₄的浓度为5mg/ml。使用注射器吸取P3代间充质干细胞和海藻酸钠混合液，装上无菌的针头,排除注射器内的空气。之后缓慢推动注射器，将P3代间充质干细胞和Fe₃0₄颗粒以及海藻酸钠混合液匀速滴入装有100ml的5％W/VCaCl₂溶液的烧杯中。尽量保证针头位置始终与烧杯杯口持平，匀速滴入P3代间充质干细胞和Fe₃0₄颗粒以及海藻酸钠混合液。反应10min至含P3代间充质干细胞和Fe₃0₄颗粒的海藻酸钠交联形成凝胶球A。

步骤4包埋软骨细胞

取实施例1步骤1中获取的软骨细胞源，并重悬调整细胞密度为1×10⁷个/ml，使用注射器吸取等体积的无菌4％W/V海藻酸钠溶液B，与软骨细胞源悬液均匀混合，此时细胞密度为5×10⁶个/ml，海藻酸钠终浓度为2％W/V。使用注射器吸取软骨细胞源以及海藻酸钠的混合液，装上无菌针头，排除注射器内的空气。之后缓慢推动注射器，将软骨细胞源和海藻酸钠的混合液匀速滴入装有100ml的1％W/VCaCl₂溶液的烧杯中。尽量保证针头位置始终与烧杯杯口持平，匀速滴入软骨细胞源和海藻酸钠的混合液。反应10min至含软骨细胞源的海藻酸钠交联形成凝胶球B。

实施例3

与实施例1的不同之处在于，该实施例中步骤3为：

1)含有Fe₃0₄颗粒的海藻酸钠溶液A的制备

取直径为20nm的磁性纳米粒子Fe₃0₄与海藻酸钠在50ml离心管内混合，初始的Fe₃0₄浓度为4mg/ml，将混合之后的溶液在超声波清洗仪中震荡30min，之后105℃灭菌20min，现配现用。

2)包埋

取步骤2中的P3代间充质干细胞，并重悬调整细胞密度为1×10⁷个/ml，使用注射器吸取步骤1)中制备的等体积的含有Fe₃0₄颗粒的无菌8％W/V海藻酸钠，与P3代间充质干细胞悬液均勾混合，此时细胞密度为5×10⁶个/ml，海藻酸钠终浓度为4％W/V，Fe₃0₄的浓度为2mg/ml。使用注射器吸取P3代间充质干细胞和海藻酸钠混合液，装上无菌的针头，排除注射器内的空气。之后缓慢推动注射器，将P3代间充质干细胞和Fe₃0₄颗粒以及海藻酸钠混合液匀速滴入装有100ml的5％W/VCaCl₂溶液的烧杯中。尽量保证针头位置始终与烧杯杯口持平，匀速滴入间充质干细胞和Fe₃0₄颗粒以及海藻酸钠混合液。反应10min至含间充质干细胞和Fe₃0₄颗粒的海藻酸钠己经交联形成了凝胶球A。

步骤4包埋软骨细胞源

取实施例1步骤1中获取的软骨细胞源，并重悬调整细胞密度为1×10⁷个/ml，使用注射器吸取等体积的无菌4％W/V海藻酸钠溶液B，与软骨细胞源悬液均匀混合，此时细胞密度为5×10⁶个/ml,海藻酸钠终浓度为2％W/V。使用注射器吸取软骨细胞源以及海藻酸钠的混合液，装上无菌针头，排除注射器内的空气。之后缓慢推动注射器，将软骨细胞源和海藻酸钠的混合液匀速滴入装有100ml的1％W/VCaCl₂溶液的烧杯中。尽量保证针头位置始终与烧杯杯口持平,匀速滴入软骨细胞源和海藻酸钠的混合液。反应10min至含软骨细胞源的海藻酸钠交联形成凝胶球B。

实施例4

与步骤1的不同之处在于，在该实施例中步骤5所采用的诱导液成份为：

TGF-β的浓度为10ng/ml，地塞米松的浓度为10mmol/l，抗坏血酸的浓度为70ug/ml，甘油磷酸钠的浓度为10mmol/l，ITS+Premix的浓度为100ng/ml，胰岛素的浓度为6.25mg/ml，转铁蛋白的浓度为6.25mg/ml。

实施例5

与步骤2的不同之处在于，在该实施例中步骤5所采用的诱导液成份为：

TGF-β的浓度为5ng/ml，地塞米松的浓度为7mmol/l，抗坏血酸的浓度为50ug/ml，甘油磷酸钠的浓度为5mmol/l，ITS+Premix的浓度为50ng/ml，胰岛素的浓度为5mg/ml，转铁蛋白的浓度为5mg/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/l。

为进一步验证本发明提供的干细胞的三维培养方法的显著效果，通过以下实验及实验数据进行具体说明。

检测实验一、死活荧光染色

检测对象：实施例1-5

在0、35天时，从转瓶内取凝胶球，放置于EP管(离心管)中，每管1个凝胶球，用0.9％NaCl洗涤。预先配制工作染液:将2μL的1mg/mlPI和1mg/mlCAM荧光染料加入到1ml0.9％NaCl中混匀。每管加入150-200μL工作液，轻轻吹打，使凝胶球悬浮于染液中。将EP管置于37℃，5％CO₂动物细胞培养箱，避光孵育30min。取出EP管，吸出染液，0.9％NaCl洗涤凝胶球两次。将凝胶球置于载玻片上，荧光显微镜观察。死细胞在绿色荧光照射下激发呈红色，活细胞在蓝色荧光照射下激发呈绿色，观察拍照。

结果：包裹过程中，CaCl₂等化学物质会导致部分细胞死亡。在35天时,荧光显微镜下均可观察到明亮的绿色，而无红色，由此说明该方法的凝胶球内很少有死亡细胞。

检测实验二、MTT(噻唑蓝)检测

检测对象：

检测组—本发明实施例1-5获得的软骨细胞；

对照组—现有技术中，静态二维诱导共培养间充质干细胞获得的软骨细胞。

活细胞的线粒体可以产生琥珀酸脱氢酶，该酶可以使MTT还原为不溶于水，却溶于DMSO(二甲基亚砜)的甲簪，死细胞则不能。分别对实验组和对照组执行以下操作：取0、7、14、21、28及35天的3个凝胶球，分别分装在3个EP管中(n＝3)，加入40μL5mg/ml的MTT和200μL新鲜的培养基，并轻轻吹打，使凝胶球悬浮于染液中。避光于37℃，5％CO₂动物细胞培养箱中孵育4h反应结束后，去上清，将凝胶球砸碎，加入300μL的DMSO，振荡，10000rpm高速离心5min。吸取200μL上清，转移至96孔板，使用酶标仪在490nm处测吸光值(OD值)。

表1：

OD值

0d

7d

14d

21d

28d

35d

实施例1

0.53±0.12

0.54±0.11

0.53±0.15

0.52±0.11

0.51±0.17

0.50±0.10

实施例2

0.77±0.10

0.76±0.15

0.75±0.15

0.76±0.18

0.74±0.11

0.72±0.10

实施例3

0.61±0.11

0.61±0.10

0.61±0.12

0.60±0.13

0.58±0.19

0.57±0.10

实施例4

0.61±0.11

0.61±0.10

0.61±0.12

0.60±0.13

0.58±0.19

0.57±0.10

实施例5

0.83±0.13

0.87±0.12

0.85±0.11

0.84±0.10

0.82±0.17

0.80±0.10

对照组

0.61±0.11

0.56±0.14

0.54±0.12

0.47±0.15

0.42±0.13

0.40±0.16

检测结果：OD值越大，代表溶液中甲簪的含量越高，同时也说明，促使MTT酶解为甲簪的琥珀酸脱氢酶越多，分泌琥珀酸脱氢酶活细胞的数量较多。由表1中数据可知，本发明实施例1-5中，OD值均大于对照组，由此说明，本发明提供的干细胞的三维培养方法所获得细胞活性较强，数量较多。

检测实验三、GAG(葡萄糖胺聚糖)含量测定

检测对象：

实验组—实施例1-5获得的软骨细胞；

对照组—现有技术中，静态二维共培养诱导间充质干细胞所获得的软骨细胞。

分别对实验组和对照组中的软骨细胞执行以下操作：

1)、样品处理:取0、7、14、21、28及35天的凝胶球各9个，平均分成3组置于EP管内(n＝3)。加入300μL木瓜蛋白酶，60℃水浴过夜，-20℃冷冻保存。使用时，取出样品，室温融化，振荡，4000rpm离心5min，取上清转移至新EP管。

2)、取Chs(硫酸软骨素，共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖，广泛存在于动物软骨组织中)标准样品工作液制作标准曲线。

制作方法：

精密称量硫酸软骨素标准品适量，制成0.5mg/ml水溶液，取六只比色管一次编号，0号为空白，加0.5ml蒸馏水，1-5号管分别吸取上液0.10，0.20，0.30，0.40，0.50ml置于50ml比色管中，用蒸馏水补至0.5ml，分别加入硫酸：水(2：1)的硫酸液各6ml，边加边摇动，然后置于95℃水中加热60min,取出冷至室温后，测量OD值，如下表2所示和图1所示，图1中，纵坐标为OD值，横坐标为硫酸软骨素标准品浓度。

表2：

3)、取50μL样品加入到2ml的DMMB(1,9-二甲基甲叉基蓝)溶液，混匀，防止产生气泡。使用紫外分光光度计在525nm处测0D值，代入标准曲线方程y＝0.9930x+0.0041，标准偏差R＾2＝0.9991，算出GAG含量(μg/珠)。

表3：

检测对象

0d

7d

14d

21d

28d

35d

实施例1

6.1±0.4

7.5±0.3

8.8±0.6

9.7±0.6

10.8±0.6

9.6±0.6

实施例2

7.9±0.8

9.8±0.2

11.3±0.6

13.2±0.9

14.9±0.9

13.7±0.5

实施例3

7.3±0.7

8.9±0.3

9.4±0.7

9.9±0.5

11.4±0.6

10.8±0.4

实施例4

6.1±0.5

7.1±0.3

8.4±0.7

8.9±0.5

10.4±0.5

9.8±0.4

实施例5

8.7±0.6

9.8±0.1

10.4±0.7

11.6±0.3

12.9±0.5

11.6±0.3

对照组

7.3±0.7

7.6±0.8

7.9±0.7

8.2±0.5

7.8±0.4

7.3±0.2

由表3可知，本发明提供的实施例1-5中的OD值均大于对照组，由此说明，本发明中软骨细胞中所含有的GAG较多，软骨细胞数量较多，活性较强。

综上所述，本发明提供的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，通过利用海藻酸凝胶球A包裹磁性氧化物和间充质干细胞，并用海藻酸凝胶球B包裹软骨细胞，同时对凝胶球A中的间充质干细胞和凝胶球B中的软骨细胞进行共培养，并诱导培养结束后，将培养体系置于磁场中，还有磁性氧化物的凝胶球A在外加磁场的作用下聚集，并与凝胶球B分离，从而简化了分离两种共培养细胞的过程；同时，凝胶球为间充质干细胞和软骨细胞提供一个三维动态生长空间，以模拟细胞在体内的生长微环境，扩大了间充质干细胞的生长空间，以及与培养液及细胞间的物质信号交流，促进间充质干细胞的生长分化，提高转化率，增强细胞活性；另外，也能够缩短间充质干细胞的诱导培养时间，所获得软骨细胞活性较强，数量较多。

以上结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞的三维共培养诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：

分别获取间充质干细胞和目的细胞源；

将间充质干细胞与含有磁性氧化物颗粒的可溶性的海藻酸盐A混合后，再与除镁离子以外的二价金属离子盐溶液A混合，至形成凝胶球A；

将目的细胞源与可溶性的海藻酸盐B混合后，再与除镁离子以外的二价金属离子盐溶液B混合，至形成凝胶球B；

用诱导剂对所述凝胶球A内的间充质干细胞和凝胶球B中的目的细胞源进行共培养至间充质干细胞转化为目的细胞，然后将凝胶球A和凝胶球B置于磁场中进行分离；

其中，磁性氧化物颗粒的直径为1-100nm。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，其特征在于，所述凝胶球A的形成过程为：将所述间充质干细胞与含有磁性氧化物颗粒的可溶性的海藻酸盐A混合后，匀速加入除镁离子以外的二价金属离子盐溶液中。

3.根据权利要求1所述的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，其特征在于，所述凝胶球A内的间充质干细胞与凝胶球B中的目的细胞源进行共培养之前，还包括采用培养液清洗凝胶球A和凝胶球B的步骤。

4.根据权利要求1所述的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，其特征在于，所述磁场的最大磁能积为35MGOe。

5.根据权利要求1所述的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，其特征在于，所述磁性氧化物颗粒为Fe₃O₄或Co₃O₄颗粒；且所述海藻酸盐A中，磁性氧化物的浓度为2-10mg/ml。

6.根据权利要求1所述的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，其特征在于，所述海藻酸盐A和海藻酸盐B均为海藻酸钠或海藻酸钙；与间充质干细胞混合后，海藻酸盐A的浓度为2％-10％W/V；与目的细胞源混合后，海藻酸盐B的浓度为2％-10％W/V。

7.根据权利要求1所述的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，其特征在于，所述二价金属离子盐溶液A和二价金属离子盐溶液B均为氯化钙溶液，且氯化钙的浓度均为1％-5％W/V。

8.根据权利要求1所述的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，其特征在于，所述目的细胞源为软骨细胞源；且对所述凝胶球A内的间充质干细胞和凝胶球B中的目的细胞源进行共培养的步骤中，所述间充质干细胞与所述软骨细胞源的浓度比为1:1-3:1。

9.根据权利要求7所述的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，其特征在于，所述诱导剂包括5-15ng/ml的TGF-β、7-10mmol/l地塞米松、50-100ug/ml抗坏血酸、5-15mmol/l甘油磷酸钠和50-150ng/ml的ITS+Premix。

10.根据权利要求1所述的间充质干细胞的三维共培养诱导方法，其特征在于，对所述凝胶球A中的间充质干细胞和凝胶球B中的目的细胞源共培养的过程是在生物反应器中进行的。