CN101948798B - 一种羊水来源的间充质干细胞的分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种源于产前诊断羊水培养物废弃上清的羊水间充质干细胞的分离纯化方法。所述细胞经过特定培养基下经过极低密度种植而成的成纤维样羊水间充质干细胞，该细胞具有多向分化能力，与成体细胞相比还具有良好的扩增能力，可传代至15以上而保持原来的特性。本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明的原料获取方便、不存在伦理问题，具备极强的使用价值；(2)本发明所获得细胞具有良好的扩增能力，可传至15代而保持特性，并具有多向分化能力；(3)本发明所获得细胞获得方法简单、效率高、无需流式，磁珠等分离纯化方法，大大降低了获得高纯度人羊水干细胞的成本；(4)本发明细胞适合于胎儿组织工程、细胞治疗、药物筛选和作为组织工程的种子细胞。

Description

一种羊水来源的间充质干细胞的分离纯化方法
(一)技术领域
本发明涉及一种羊水来源的间充质干细胞的分离纯化方法，具体涉及一种源于产前诊断羊水培养物废弃上清的羊水间充质干细胞的分离纯化方法。
(二)背景技术
羊水间充质干细胞(Human amniotic fluid-derived mesenchymal stemcells，人羊水干细胞)是一类胎儿间充质干细胞，除具有成体干细胞无致瘤性、相对容易培养等优点外，还具有以下一些特点：1、来源丰富，容易获取；2、增殖能力和分化能力远强于骨髓来源的成体干细胞，在分化能力上更接近于胚胎干细胞。3、低免疫原性、具有可应用于母婴相关疾病的研究和先天性疾病的治疗的特殊应用前景。自从In’t Anker等从孕中期(17～22周)羊水中分离培养出胎儿间充质干细胞以来，人羊水干细胞成为干细胞研究的新热点，在胎儿组织工程、细胞治疗、药物筛选等研究领域展现了广阔的应用前景。
羊水培养细胞是多种类型的混合物，包含了3类形态和生长特点的不同的细胞：上皮样-E型细胞、羊水特有-AF型细胞、成纤维样-F型细胞。羊水细胞通常的贴壁时间为5～7天，最早贴壁的是上皮样-E型细胞和羊水特有-AF型细胞，而来自间充质组织的、被认为是人羊水干细胞来源的F型细胞却通常出现在培养的后期。产前诊断多在羊水培养的第5～6天收集贴壁细胞进行核型分析，羊水培养物上清液及存留的尚未贴壁的有活力的细胞则一并予以废弃。
传统的人羊水干细胞分离纯化需要经过羊水穿刺、细胞贴壁培养，后续进行流式细胞或免疫磁珠分选等步骤，操作复杂，成本昂贵。
(三)发明内容
本发明的目的是探索产前诊断羊水培养物体废弃上清中胎儿间充质干细胞的体外分离、纯化和扩增条件，不干扰产前诊断的程序，也无需额外的穿刺羊水，为节俭高效地进行胎儿组织工程种子细胞库的建立和干细胞的临床治疗奠定了基础。
本发明采用技术方案是：
一种羊水来源的间充质干细胞的分离纯化方法，所述方法包括如下顺序步骤：
(1)取产前诊断羊水培养物的废弃上清(即进行产前诊断时羊水培养物收集贴壁细胞后的剩余上清)，以500～1000cell/cm2密度种植到培养瓶，培养至出现梭形类成纤维细胞样的间充质干细胞集落，去除非贴壁细胞，加入细胞培养液I继续培养4～7天，每2～3天换新鲜培养液；所述细胞培养基I终浓度组成如下：
15％FBS+4～8ng/ml bFGF+100U/ml青霉素+100U/ml链霉素，溶剂为低糖DMEM培养液；
(2)取步骤(1)培养获得的细胞以5～10cell/cm2密度种植于培养皿上，加入细胞培养液II培养直至单克隆细胞长出(约7～12天)，即得所述羊水来源的间充质干细胞；所述细胞培养液II终浓度组成如下：20％FBS+4～8ng/ml bFGF+100U/ml青霉素+100U/ml链霉素，溶剂为低糖DMEM培养液。
具体的，所述废弃上清由如下方法获得：取用于产前诊断的中期(17～22周)无菌羊水样本，1500rpm离心10min，取上清(一般1～2mL即可)加等体积细胞培养液II，重悬细胞沉淀，移至T25培养瓶中培养7天后，收获贴壁细胞进行产前诊断，收集废弃上清备用；所述细胞培养液II终浓度组成如下：20％(v/v)FBS+4～8ng/ml bFGF+100U/ml青霉素+100U/ml链霉素，溶剂为低糖DMEM培养液。
所述细胞经过特定培养基下经过极低密度种植而成的成纤维样细胞，具有多向分化能力，与成体细胞相比还具有良好的扩增能力，可传代至15代以上而保持原来的特性。
所述羊水来源的间充质干细胞鉴定：1)细胞形态观察，经过极低密度种植，单克隆细胞筛选后成纤维样细胞比例大于95％；2)细胞增值能力，P5、P8代细胞的群体倍增时间分别为28h、29.8h；3)细胞表型鉴定，全能干细胞特异表型阳性(OCT-4，SSEA-4)间充质表型阳性(CD29，CD105)，造血系表型阴性(CD34)，间充质干细胞占到95％以上；4)免疫原性检测，HLA-II抗原阴性(HLA-DR流式检测结果为0.6％)；5)多向分化能力，具有成骨和成脂分化能力；6)无致瘤性。
本发明在以前的研究基础上进一步提高，利用简单的培养方法，使用梯度血清干细胞筛选培养基及单克隆培养的纯化方法，得到高纯度人羊水干细胞，使人羊水干细胞含量在95％以上，可传至15代而保持特性，获得109以上人羊水干细胞，从而获得足够的种子细胞，此技术将促进人羊水干细胞在胎儿组织工程、细胞治疗、药物筛选等研究领域的广泛应用。
本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明的原料获取方便、不存在伦理间题，具备极强的使用价值；(2)本发明所获得细胞具有良好的扩增能力，可传至15代而保持特性，并具有多向分化能力；(3)本发明所获得细胞获得方法简单、效率高、无需流式，磁珠等分离纯化方法，大大降低了获得高纯度人羊水干细胞的成本；(4)本发明细胞适合于胎儿组织工程、细胞治疗、药物筛选和作为组织工程的种子细胞。
(四)附图说明
图1为人羊水干细胞在各代的生长情况，形态高度均一，呈典型的螺旋形生长；
图2为人羊水干细胞典型的间充质干细胞表型和免疫原性检测；a：CD29；b：CD105；c：CD34；d：HLA-DR；
图3为人羊水干细胞表达全能干细胞标志物OCT-4(a)和SSEA-4(b)；
图4为成脂鉴定结果(油红O染色，标尺：第1列100um、第2列50um、第3列20um)；a：人羊水干细胞普通培养14d对照组；b：人羊水干细胞脂肪诱导14d实验组；
图5为成骨鉴定结果(a、b采用钙钴法染色，c、d采用Von Kossa染色，e、f采用茜素红染色)；a：人羊水干细胞普通培养15d对照组；b：人羊水干细胞成骨诱导15d实验组；c：人羊水干细胞普通培养15d对照组；d：人羊水干细胞成骨诱导15d实验组；e：人羊水干细胞普通培养15d对照组；f：人羊水干细胞成骨诱导15d实验组；
图6为接种不同细胞含量的人羊水干细胞/PLGA支架复合物，经过动态灌流系统培养8天后支架复合物内细胞生长状态；其中以4×105个/支架的细胞量接种，8天后支架复合物内细胞含量最多，活性最强；A：4×105个/支架接种组；B：8×105个/支架接种组；C：2×105个/支架接种组。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此(本发明中试剂除特殊说明均购自Invitrogen公司)：
实施例1：产前诊断羊水培养物废弃上清中人羊水干细胞的分离、纯化和扩增
(1)无菌操作取中期羊水样本，羊水来自浙江大学附属妇产科医院产前诊断门诊患者，经本人同意将其废弃上清用于相关研究，12ml中期羊水样本1500rpm离心10min；留1ml上清，加1m细胞培养液II，重悬细胞沉淀，移至T25培养瓶中培养。7天后，收获贴壁细胞，进行产前诊断，同时收集废弃上清备用；所述细胞培养液II终浓度组成如下：80％(v/v)低糖DMEM+20％(v/v)FBS+4ng/ml bFGF+100U/ml青霉素+100U/ml链霉素。
(2)步骤(1)废弃上清以500～1000cell/em2密度种植到新的培养瓶，继续培养至出现梭形类成纤维细胞样的间充质干细胞集落，去除非贴壁细胞，加入培养液I继续培养4～7天，每2～3天换液。所述细胞培养基I终浓度组成如下：85％(v/v)低糖DMEM+15％(v/v)FBS+4ng/ml bFGF+100U/ml青霉素和链霉素；
(3)步骤(2)培养获得的第三代细胞再以5～10cell/em2密度种植于培养皿上，于培养基II中培养直至单克隆细胞长出，即得所述羊水来源的间充质干细胞。所述细胞培养液II终浓度组成如下：80％(v/v)低糖DMEM+20％(v/v)FBS+4ng/ml bFGF+100U/ml青霉素+100U/ml链霉素；见细胞呈均一的成纤维样细胞(图1)。
实施例2：表面抗原特性、免疫原性和全能干细胞标志物检测
具体分析方法如下：
1、抗原特性及免疫原性检测
(1)胰酶消化实施例1获得的细胞，加入等量培养液III，终止消化。所述细胞培养基III终浓度组成如下：85％(v/v)低糖DMEM+10％(v/v)FBS+100U/ml青霉素+100U/ml链霉素；
(2)PBS 10ml洗涤1次后，重悬于1.2ml含有1％(v/v)FBS的PBS中，制备成细胞悬液，按照每管100μL的量分装8支，每支细胞量控制在5×105～1×106个；
(3)各管依次添加CD29及其同型对照、CD34及其同型对照、CD105及其同型对照、HLA-DR及其同型对照各20μL，避光4℃孵育30～45分钟；
(4)1500rpm离心5min去除抗体，添加PBS2～3ml洗涤2次；
(5)添加1ml PBS重悬后上流式细胞仪检测，对于每个样本至少计数1×104个。
结果：该细胞表达间充质表型CD29、CD105、不表达造血系表型CD34和HLA-II抗原HLA-DR(图2)。
2、全能干细胞标志物检测
(1)胰酶消化实施例1获得的细胞，加入等量培养液III，终止消化，用1～3％(w/w)的多聚甲醛固定30分钟(也可4℃保存过夜)。所述细胞培养基III终浓度组成如下：85％(v/v)低糖DMEM+15％(v/v)FBS+100U/ml青霉素+100U/ml链霉素；
(2)用PBS洗2次；重悬于0.4ml含有1％(v/v)FBS的PBS中，制备成细胞悬液，按照每管100μL的量分装4支，每支细胞量控制在5×105～1×106个；
(3)其中2支加入SSEA-4及同型对照各20μL；另2支进行细胞膜打孔，加入0.1％(w/w)Triton-X-100，室温10分钟，用PBS洗涤2次，加入OCT-4及同型对照各20μL。避光4℃孵育30～45分钟；
(4)1500rpm离心5min去除抗体，添加PBS2～3ml洗涤2次；
(5)添加1ml PBS重悬后上流式细胞仪检测，对于每个样本至少计数1×104个。
结果：表达全能干细胞特异标记SSEA-4和OCT-4。(图3)
实施例3：多向分化潜能鉴定
1、向脂肪细胞的诱导分化
诱导培养基成分：低糖DMEM+15％(v/v)FBS+脂肪添加剂(1umol/L地塞米松+10mg/L胰岛素+0.5mmol/L异丁基甲基黄嘌呤+200umol/L吲哚美辛)
诱导方法：实施例1中所得人羊水干细胞以3～5×103个/cm2细胞密度接种于24孔板，达90％汇合时换为脂肪诱导培养液。每3～4天换液，诱导2周后，通过油红O染色观察到了染色阳性的脂肪颗粒(图4)，同时通过RT-PCR(检测引物Forward：5′-GCCATCCGCATCTTTCGA-3′，Reverse：5′-AGGACTCAGGGTGGTTCA-3′)可检测到脂肪组织中高水平表达的转录因子过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)的表达，说明人羊水干细胞在特定条件下能够向脂肪细胞分化。
2、成骨样细胞的分化
成骨细胞诱导培养液：85％(v/v)低糖DMEM+15％(v/v)FBS+成骨添加剂(100nM地塞米松+10mMβ-甘油磷酸钠+0.05mM维生素C)
诱导方法：实施例1中所得人羊水干细胞以3～5×103/cm2细胞密度接种于24孔板，达40％汇合时换为成骨诱导培养液。每3～4天换液，诱导12天后，通过RT-PCR检测到了骨细胞特异转录因子Runt相关转录因子-2(Runx2)和碱性磷酸酶(ALP)的表达，说明人羊水干细胞在诱导条件下能向成骨方向分化；诱导15天后，肉眼可以观察到24孔板中有少量白色结节，碱性磷酸酶(ALP)、钙结节Von Kossa和茜素红染色呈阳性(图5)。说明此时细胞已产生少量矿化结节，有了一定的成骨功能。
实施例4：致瘤实验
将实施例1获得的人羊水干细胞接种于裸鼠皮下，接种细胞数量为1×107个细胞，结果2个月后仍无肿瘤形成，表面此方法得到的人羊水干细胞没有明确的致瘤性，临床治疗应用安全可靠。
实施例5：组织工程应用I
(1)收集实施例1中所得的人羊水干细胞，用细胞培养液IV调节细胞密度至3×106cell/ml，以制备细胞悬液，备用。所述细胞培养液IV终浓度组成如下：95％(v/v)低糖DMEM+5％(v/v)FBS+10Mm L-谷氨酰胺+100U/ml青霉素和链霉素；
(2)取经过24小时75％(v/v)酒精消毒的聚乳酸-乙醇酸复合物(PLGA)支架，用无菌纱布吸干后，在超净工作台中慢速风机吹干，取样品槽下槽架，将吹干的PLGA支架放入样品槽下槽架中，使用硅胶软管连接样品槽下槽架的下端出口和无菌注射器，吸取上述约250μl的细胞悬液均匀滴至支架上表面，然后以0.05ml/min的流速轻轻抽取注射器使悬液均匀进入支架内部达到将人羊水干细胞在PLGA支架上接种的目的。所述聚乳酸-乙醇酸复合物(PLGA)支架基本情况：直径10mm，厚度3mm，孔隙率94.5％～98.0％，孔径280～450μm；
(3)接种完毕后取出支架放于细胞培养板(六孔板)中静止2小时，然后每孔加入3ml培养基II，静态培养24小时，获得干细胞/支架复合物。所述细胞培养液II终浓度组成如下：80％(v/v)低糖DMEM+20％(v/v)FBS+4ng/ml bFGF+100U/ml青霉素+100U/ml链霉素。
实施例6：组织工程应用II
(1)取实施例5静态培养24小时后获得的细胞/支架复合物，移入灌流培养装置(7524-55，Cole-Parmer公司，上海)的样品槽下槽架内，然后上、下槽架旋转衔接密封样品槽，联通灌流培养系统，设定流速0.2ml/min进行灌流培养，每隔三天换液。选用培养液流速为0.2ml/min，为达到低速给液以保证支架内部羊水间充质干细胞良好粘附、均匀分布和高增殖效率的目的。上述灌流培养7天后，增加灌流流速至3.0ml/min进行灌流培养到14天，每隔三天半量换液。选用培养液流速为3.0ml/min，为达到高流速给液促进羊水间充质干细胞向成骨细胞定向分化的目的。
取出上述细胞/支架复合物，用PBS洗1次后，从中间切开，加荧光素二乙酯(FDA，Merck公司，上海)染色液，37℃下孵育5分钟，PBS洗去多余染色液，倒置荧光显微镜观察拍照，分析羊水间充质干细胞在支架内的分布。
结果：荧光染色可见人羊水干细胞在PLGA支架内分布均匀，并有较强的活性(图6)。
总结：
(1)本发明使用的原料：产前诊断羊水培养物废弃上清极易获取、不存在伦理问题；
(2)本发明所获得细胞获得方法简单、效率高、无需流式，磁珠等分离纯化方法，大大降低了获得高纯度人羊水干细胞的成本，所获得细胞具有良好的扩增能力，可传至15代而保持特性，能够得到109以上人羊水干细胞，从而获得足够的种子细胞；
(3)本发明所获人羊水干细胞表达间充质干细胞的特异性表面标志，同时表达全能干细胞标志；
(4)本发明所获人羊水干细胞具有多向分化能力；
(5)本发明所获人羊水干细胞适合于胎儿组织工程、细胞治疗、药物筛选和作为组织工程的种子细胞，与组织工程材料具有良好的相容性。
综上所述，本方法利用产前诊断羊水培养物废弃上清液经过梯度血清干细胞筛选培养基及单克隆培养的纯化方法，得到高纯度、扩增能力强、具备三系分化潜能的人羊水干细胞，在胎儿组织工程、细胞治疗、药物筛选等研究领域展现了广阔的应用前景，将会给干细胞的应用带来极大的发展。

Claims (1)

1.一种羊水来源的间充质干细胞的分离纯化方法，所述方法包括如下顺序步骤：
收集产前诊断羊水培养物的废弃上清：取用于产前诊断的中期无菌羊水样本，1500rpm离心10min，取上清加等体积细胞培养液II，重悬细胞沉淀，移至T25培养瓶中培养7天后，收获贴壁细胞进行产前诊断，收集废弃上清备用；
(1)取产前诊断羊水培养物的废弃上清，以500～1000cell/cm2密度种植到培养瓶，培养至出现梭形类成纤维细胞样的间充质干细胞集落，去除非贴壁细胞，加入细胞培养液I继续培养4～7天，每2～3天换新鲜培养液；所述细胞培养液I的终浓度组成如下：
15％FBS+4～8ng/ml bFGF+100U/ml青霉素+100U/ml链霉素，溶剂为低糖DMEM培养液；
(2)取步骤(1)培养获得的细胞以5～10 cell/cm2密度种植于培养皿上，加入细胞培养液II培养直至单克隆细胞长出，即得所述羊水来源的间充质干细胞；所述细胞培养液II终浓度组成如下：20％FBS+4～8ng/ml bFGF+100U/ml青霉素+100U/ml链霉素，溶剂为低糖DMEM培养液。
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