CN106434534A - 一种羊水细胞培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞培养基技术领域，具体涉及一种羊水细胞培养基及其制备方法。本发明提供的羊水细胞培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：亚油酸10‑15μM，β‑胡萝卜素15‑18μg/mL，棕榈酸3‑6μM，L‑谷氨酰胺3‑5μM，聚乳酸‑乙醇酸共聚物3‑7mg/mL，β‑巯基乙醇0.001‑0.003μg/mL，人血白蛋白2‑5mg/mL，维生素B 22‑27μg/mL，表皮生长因子18‑25ng/mL和胰岛素0.7‑1.1μg/mL。本发明羊水细胞培养基不含血清，能更迅速有效地增加体外增殖的羊水细胞克隆数目和细胞增殖速度。

Description

一种羊水细胞培养基及其制备方法
技术领域
本发明属于细胞培养基技术领域，具体涉及一种羊水细胞培养基及其制备方法。
背景技术
产前诊断是优生学的重要组成部分，它是建立在遗传咨询基础上通过产前检测胎儿健康情况，对患有严重遗传病、先天畸形的患儿可以及早采取措施，减少人群中有害基因积累，以减少患儿出生，提高人口素质，因此，具有十分重要的意义。产前诊断目前主要有孕早期绒毛组织取材、孕中期羊水和脐带血、孕妇外周血分离胎儿细胞及植入前诊断等方法，但孕中期羊水细胞检查仍是最主要的诊断方法。
羊水穿刺检查的合适对象为高龄(大于34岁)、不良接触史、既往畸胎弱智分娩史、既往染色体异常儿分娩史、夫妻之一核型异常、B超示畸型、家族性连锁遗传病史、近亲婚配等的孕妇。其中，高龄孕妇是主要检查对象。羊水细胞培养后通过染色体显带技术，能够辨别三体综合症、平衡易位、倒位以及性染色体异常等染色体方面的疾病。成功的羊水细胞培养，除需要严格的实验操作技术和经验外，培养基的组成也是非常关键的。羊水细胞可能是胎儿皮肤、消化道、呼吸道及泌尿生殖道脱落的细胞，其中只有小部分是有活力的细胞(约0.1％),而活力细胞又以贴壁型细胞为主。如何能促其在体外培养中贴壁增殖，是成功培养羊水细胞的关键因素。
中国专利申请CN105039244A公开了一种低血清羊水细胞培养基，在基础培养基RPMI1640/α MEM按1：1混合的基础上，添加包括以下组分：胰岛素、碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、牛血清白蛋白、氢化可的松、α生育酚、NaHCO3、柠檬酸铁、吐温80、乙醇胺、油酸、亚油酸以及胎牛血清，其中，胎牛血清添加含量占低血清羊水细胞培养基总体积不超过1％。中国专利申请CN102618493A公开了一种羊水与绒毛细胞培养基，包含下列组分：基础培养基，胎牛血清，生长因子，抗氧化剂、抗生素和缓冲系统。
目前，对于羊水细胞的体外培养有的含有血清，含有血清的培养基无法规避动物血清中的异源体，如果使用动物血清培养基培育出来的细胞，会存在人体异源体排斥和冲突。有的培养基虽然不含有血清，但是存在培养成功率低，培养周期长等问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种羊水细胞培养基及其制备方法。本发明提供的羊水细胞培养基不含血清，避免了使用血清导致的异种成分引起的排斥现象，能更迅速有效地增加体外增殖的羊水细胞克隆数目和细胞增殖速度，大大缩短了羊水细胞培养周期，获得更多的分裂相染色体数目。
本发明的技术方案是：
一种羊水细胞培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：亚油酸10-15μM，β-胡萝卜素15-18μg/mL，棕榈酸3-6μM，L-谷氨酰胺3-5μM，聚乳酸-乙醇酸共聚物3-7mg/mL，β-巯基乙醇0.001-0.003μg/mL，人血白蛋白2-5mg/mL，维生素B 22-27μg/mL，表皮生长因子18-25ng/mL和胰岛素0.7-1.1μg/mL。
进一步地，所述羊水细胞培养基包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：亚油酸12μM，β-胡萝卜素16μg/mL，棕榈酸5μM，L-谷氨酰胺4μM，聚乳酸-乙醇酸共聚物5mg/mL，β-巯基乙醇0.002μg/mL，人血白蛋白3mg/mL，维生素B 24μg/mL，表皮生长因子21ng/mL和胰岛素0.9μg/mL。
进一步地，所述基础培养基为M199或DMEM培养基。
另外，本发明还提供了所述羊水细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：
S1向基础培养基中加入聚乳酸-乙醇酸共聚物，搅拌均匀，静置30-60分钟，加入亚油酸、β-胡萝卜素、棕榈酸、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、人血白蛋白、维生素B、表皮生长因子和胰岛素，混合均匀，得混合物；
S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为6-9％的氢氧化钠溶液，调节培养基的pH至7.2-7.6，用0.2微米滤膜过滤除菌，即得。
优选地，所述步骤S1静置45分钟。
优选地，所述步骤S2加入质量分数为8％的氢氧化钠溶液。
优选地，所述步骤S2调节培养基的pH至7.4。
本发明羊水细胞培养基包括基础培养基和添加剂，加入的添加剂包括：亚油酸、β-胡萝卜素、棕榈酸、L-谷氨酰胺和聚乳酸-乙醇酸共聚物等。在本发明的各种培养基的成分中，基础培养基能够提供羊水细胞的生存和最低的生理活动。在本发明中，亚油酸能够提供细胞膜合成所需的脂质。在本发明中，棕榈酸与本发明中的其他原料协同作用，能够促进细胞增殖。在本发明培养基中使用的L-谷氨酰胺，能够参与蛋白质的合成和核酸代谢。在本发明中，β-巯基乙醇能够提供羊水细胞所需小分子物质。在本发明中，人血白蛋白主要用作渗透压调节剂、生长因子的运载体、稳定剂和自由基清除剂以及营养剂等。在本发明中，维生素B主要以辅酶的形式参与细胞代谢。在本发明中，表皮生长因子主要作为维持羊水细胞体外培养生存、增殖和分化所需的补充因子。在本发明中，胰岛素能够促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡。
研究发现，培养基中加入聚乳酸-乙醇酸共聚物，能够促进羊水细胞的粘附，提高羊水细胞的增殖速度。在培养基中加入β-胡萝卜素，能够与培养基中的其他成分间协同作用，进一步促进羊水细胞的生长增殖，另外，本发明中β-胡萝卜素还作为抗氧化剂。本发明羊水细胞培养基搭配合理，各成分间相互协调，共同作用，能够更迅速有效地增加体外增殖的羊水细胞克隆数目和细胞增殖速度，大大缩短了羊水细胞培养周期，获得更多的分裂相染色体数目。
与现有技术相比，本发明提供的羊水细胞培养基具有以下优势：
(1)本发明提供的是一种无动物源性成分、成分确定的羊水细胞培养基，可以有效保证产品批次的质量稳定性，有利于产品标准化。
(2)本发明提供的羊水细胞培养基，能更迅速有效地增加体外增殖的羊水细胞克隆数目和细胞增殖速度，大大缩短了羊水细胞培养周期。
(3)本发明提供的羊水细胞培养基不含血清，避免了使用血清导致的异种成分引起的排斥现象。
(4)本发明提供的羊水细胞培养基能够在较短的时间内，获得更多的分裂相染色体数，能够满足临床检测的要求。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明所用DMEM培养基可购自Gibco公司，M199培养基可购自Gibco公司，聚乳酸-乙醇酸共聚物可购自上海纳顿化工科技有限公司，型号LH050，β-胡萝卜素可购自河南安锐生物科技有限公司。
实施例1、一种羊水细胞培养基
所述羊水细胞培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述基础培养基为M199培养基，所述添加剂的成分以终浓度计，如表1所示。
表1：添加在基础培养基中的添加剂的终浓度
添加剂 终浓度
亚油酸 10μM
β-胡萝卜素 15μg/mL
棕榈酸 3μM
L-谷氨酰胺 3μM
聚乳酸-乙醇酸共聚物 3mg/mL
β-巯基乙醇 0.001μg/mL
人血白蛋白 2mg/mL
维生素B 22μg/mL
表皮生长因子 18ng/mL
胰岛素 0.7μg/mL
制备方法：
S1向基础培养基中加入聚乳酸-乙醇酸共聚物，搅拌均匀，静置30分钟，加入亚油酸、β-胡萝卜素、棕榈酸、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、人血白蛋白、维生素B、表皮生长因子和胰岛素，混合均匀，得混合物；
S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为6％的氢氧化钠溶液，调节培养基的pH至7.2，用0.2微米滤膜过滤除菌，即得。
实施例2、一种羊水细胞培养基
所述羊水细胞培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述基础培养基为DMEM培养基，所述添加剂的成分以终浓度计，如表2所示。
表2：添加在基础培养基中的添加剂的终浓度
添加剂 终浓度
亚油酸 15μM
β-胡萝卜素 18μg/mL
棕榈酸 6μM
L-谷氨酰胺 5μM
聚乳酸-乙醇酸共聚物 7mg/mL
β-巯基乙醇 0.003μg/mL
人血白蛋白 5mg/mL
维生素B 27μg/mL
表皮生长因子 25ng/mL
胰岛素 1.1μg/mL
制备方法：
S1向基础培养基中加入聚乳酸-乙醇酸共聚物，搅拌均匀，静置60分钟，加入亚油酸、β-胡萝卜素、棕榈酸、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、人血白蛋白、维生素B、表皮生长因子和胰岛素，混合均匀，得混合物；
S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为9％的氢氧化钠溶液，调节培养基的pH至7.6，用0.2微米滤膜过滤除菌，即得。
实施例3、一种羊水细胞培养基
所述羊水细胞培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述基础培养基为DMEM培养基，所述添加剂的成分以终浓度计，如表3所示。
表3：添加在基础培养基中的添加剂的终浓度
添加剂 终浓度
亚油酸 12μM
β-胡萝卜素 16μg/mL
棕榈酸 5μM
L-谷氨酰胺 4μM
聚乳酸-乙醇酸共聚物 5mg/mL
β-巯基乙醇 0.002μg/mL
人血白蛋白 3mg/mL
维生素B 24μg/mL
表皮生长因子 21ng/mL
胰岛素 0.9μg/mL
制备方法：
S1向基础培养基中加入聚乳酸-乙醇酸共聚物，搅拌均匀，静置45分钟，加入亚油酸、β-胡萝卜素、棕榈酸、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、人血白蛋白、维生素B、表皮生长因子和胰岛素，混合均匀，得混合物；
S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为8％的氢氧化钠溶液，调节培养基的pH至7.4，用0.2微米滤膜过滤除菌，即得。
对比例1、一种羊水细胞培养基
所述羊水细胞培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述基础培养基为DMEM培养基，所述添加剂的成分以终浓度计，如表4所示。
表4：添加在基础培养基中的添加剂的终浓度
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，将聚乳酸-乙醇酸共聚物替换为聚乙烯醇。
对比例2、一种羊水细胞培养基
所述羊水细胞培养基，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述基础培养基为DMEM培养基，所述添加剂的成分以终浓度计，如表4所示。
表4：添加在基础培养基中的添加剂的终浓度
添加剂 终浓度
亚油酸 12μM
银耳多糖 16μg/mL
棕榈酸 5μM
L-谷氨酰胺 4μM
聚乳酸-乙醇酸共聚物 5mg/mL
β-巯基乙醇 0.002μg/mL
人血白蛋白 3mg/mL
维生素B 24μg/mL
表皮生长因子 21ng/mL
胰岛素 0.9μg/mL
制备方法与实施例3类似。
与实施例3的区别在于，将β-胡萝卜素替换为银耳多糖。
试验例一、本发明羊水细胞培养基对羊水细胞的培养效果
1、试验对象：本发明实施例1-3所得羊水细胞培养基，以及对比例1和对比例2所得羊水细胞培养基。
2、试验方法：
羊水细胞培养：收集羊水样品(为17-22周龄之间的羊水样品，每份0.5mL，共10mL)，混合均匀，得到检测用羊水细胞收集样品Ⅰ，比较不同培养基的培养效果。细胞培养、制片方法按以下步骤进行：
(1)在无菌条件下取羊水各2.0mL/管，共5管；
(2)以1500r/min室温离心10分钟；
(3)在无菌操作台上吸去上清液，每管留0.5mL，吸管打散细胞。制成细胞悬液，再加入4.5mL培养基入管内，吸管轻混匀，移至25cm2方形一次性培养瓶中置含5％CO2的37℃温箱饱和湿度行开放式培养；
(4)6天后镜下观察，可见成纤维样或上皮细胞生长，当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细胞时，此时换相应新鲜的羊水培养基5mL，48小时后，如细胞生长状况好，加入秋水仙素0.05ug/mL,(20ug/mL，7号针头垂直竖加2滴)5h，进行细胞学处理；
(5)收获细胞：倒出瓶中细胞液入10mL离心管，用0.85％NaCl溶液冲洗细胞壁两遍，0.25％胰酶消化5分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改变时即用吸管吹打下细胞，1500r/min室温离心10分钟，去上清，约留0.5mL；
(6)低渗：加入37℃0.075M KCl 5mL，吸管吹打，37℃水浴5分钟；
(7)预固定：加入1.5mL甲醇∶冰醋酸＝3∶1固定剂，轻混匀，37℃水浴5分钟，1500r/min室温离心10分钟；去上清留0.5mL；
(8)固定：加入3∶1固定剂8mL，轻混匀，37℃水浴10分钟，1500r/min室温离心10分钟；去上清，留0.5mL；
(9)重复固定：同上。1500r/min室温离心10分钟，去上清，视管底细胞量滴入固定剂；
(10)滴片、烤片：每片2滴，75℃烤箱烘烤3小时；
(11)培养结束，染色体制片前统计细胞克隆总数，包括有分裂相的克隆总数，以及有效克隆的大小；制备染色体后统计分裂相细胞数目；
(12)羊水细胞收集样品Ⅰ培养7天后收获，进行染色体制片。
3、实验结果
本发明实施例1-3所得羊水细胞培养基，以及对比例1和对比例2所得羊水细胞培养基对羊水细胞的培养效果如表6所示。
表6：不同培养基对羊水细胞的培养效果比较
注：克隆大小判断标准为：在100倍倒置显微镜下判断观察，克隆≥1个视野判断为大克隆；克隆≤1/2个视野则判断为小克隆；介于两者之间的为中等克隆。
总克隆数＝有分裂相的总克隆数+无分裂相的克隆数。
从表6可以看出，在相同的培养时间内，与对比例1和对比例2所得培养基相比，本发明实施例1-3所得培养基对羊水细胞的培养效果无论从总克隆数，还是分裂相细胞数目都有了大幅度提高。

Claims (7)

1.一种羊水细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：亚油酸10-15μM，β-胡萝卜素15-18μg/mL，棕榈酸3-6μM，L-谷氨酰胺3-5μM，聚乳酸-乙醇酸共聚物3-7mg/mL，β-巯基乙醇0.001-0.003μg/mL，人血白蛋白2-5mg/mL，维生素B 22-27μg/mL，表皮生长因子18-25ng/mL和胰岛素0.7-1.1μg/mL。
2.如权利要求1所述的羊水细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加在所述基础培养基中的添加剂，所述添加剂的成分以终浓度计，包括：亚油酸12μM，β-胡萝卜素16μg/mL，棕榈酸5μM，L-谷氨酰胺4μM，聚乳酸-乙醇酸共聚物5mg/mL，β-巯基乙醇0.002μg/mL，人血白蛋白3mg/mL，维生素B 24μg/mL，表皮生长因子21ng/mL和胰岛素0.9μg/mL。
3.如权利要求1或2所述的羊水细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为M199或DMEM培养基。
4.如权利要求1-3任一所述的羊水细胞培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1向基础培养基中加入聚乳酸-乙醇酸共聚物，搅拌均匀，静置30-60分钟，加入亚油酸、β-胡萝卜素、棕榈酸、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、人血白蛋白、维生素B、表皮生长因子和胰岛素，混合均匀，得混合物；
S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为6-9％的氢氧化钠溶液，调节培养基的pH至7.2-7.6，用0.2微米滤膜过滤除菌，即得。
5.如权利要求4所述的羊水细胞培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤S1静置45分钟。
6.如权利要求4所述的羊水细胞培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤S2向步骤S1所得混合物中加入质量分数为8％的氢氧化钠溶液。
7.如权利要求4所述的羊水细胞培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤S2调节培养基的pH至7.4。
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