CN105039244B - 一种低血清羊水细胞培养基 - Google Patents
一种低血清羊水细胞培养基 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105039244B CN105039244B CN201510569624.XA CN201510569624A CN105039244B CN 105039244 B CN105039244 B CN 105039244B CN 201510569624 A CN201510569624 A CN 201510569624A CN 105039244 B CN105039244 B CN 105039244B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- amniotic fluid
- culture medium
- fluid cells
- culture
- low serum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种低血清羊水细胞培养基，在基础培养基RPMI 1640/αMEM按1：1混合的基础上，添加包括以下组分：胰岛素(Insulin)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、牛血清白蛋白(BSA)、氢化可的松(hydrocortisone)、α生育酚(Alpha Tocopherol)、NaHCO3、柠檬酸铁、吐温80(Tween 80)、乙醇胺、油酸、亚油酸以及胎牛血清，其中，胎牛血清添加含量占低血清羊水细胞培养基总体积不超过1％。本发明羊水细胞培养基培养相比现有公开技术，不仅降低了血清含量和成本，而且效果有显著改进，克隆形成率和克隆生长速度明显增加，在较短的时间内，可以培养得到大量的处于分裂期的羊水细胞，能够满足临床诊断和科研的要求。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，尤其是涉及一种低血清羊水细胞培养基。
背景技术
产前诊断是优生学的重要组成部分，它是建立在遗传咨询基础上通过产前检测胎儿健康情况，对患有严重遗传病、先天畸形的患儿可以及早采取措施，减少人群中有害基因积累，以减少患儿出生，提高人口素质，因此具有十分重要的意义。产前诊断目前主要有孕早期绒毛组织取材、孕中期羊水和脐带血、孕妇外周血分离胎儿细胞及植入前诊断等方法，但孕中期羊水细胞检查仍是最主要的诊断方法。
羊水穿刺检查的合适对象为高龄(大于34岁)、不良接触史、既往畸胎弱智分娩史、既往染色体异常儿分娩史、夫妻之一核型异常、B超示畸型、家族性连锁遗传病史、近亲婚配等的孕妇。其中，高龄孕妇是主要检查对象。羊水细胞培养后通过染色体显带技术，能够辨别三体综合症、平衡易位、倒位以及性染色体异常等染色体方面的疾病。成功的羊水细胞培养，除需要严格的实验操作技术和经验外，培养基的组成也是非常关键的。羊水细胞可能是胎儿皮肤、消化道、呼吸道及泌尿生殖道脱落的细胞,其中只有小部分是有活力的细胞(约0.1％),而活力细胞又以贴壁型细胞为主。如何能促其在体外培养中贴壁增殖，是成功培养羊水细胞的关键因素。
传统的羊水培养基组成是：基础培养基(RPMI1640、DMEM或F12)+小牛血清(胎牛血清)。但这种培养基培养的成功率低,成功率低于30％，而且平均培养周期长,培养周期需要20天,且分裂相少，不能有效用于羊水细胞检查；为了缩短羊水细胞培养周期，提高成功率，已有了改良型的培养基的研究报道，基本上是在基础培养基的基础上添加含有生长因子的提取物组成。如Chang HC提供的配方如下：
在DMEM与F12按1：1混合的基础培养基(DMEM/F12)中添加10种促生长因子，分别为：转铁蛋白(transferrin)5mg/L、亚硒酸钠20nMol/L、胰岛素(insulin)10mg/L、三碘甲状腺氨酸(triiodothyronine)0.1nMol/L、胰高血糖素(glucagon)1mg/L、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)10ug/L、氢化可的松(hydrocortisone)1nMol/L、睾酮(testosterone)1nMol/L、雌二醇(estradiol)1nMol/L、孕酮(progesterone)1nMol/L。Chang HC把含此10种促生长因子配方的培养基称为H培养基，而将此10种促生长因子含量增倍后的培养基称为H-1培养基。生长因子加倍的H-1培养基的培养效果要明显好于H培养基，H-1在培养基添加较低含量的胎牛血清的情况下，依然能够显著增加羊水细胞的克隆形成率和克隆生长速度，使培养成功率达到99％以上。
按Chang HC配制的羊水细胞培养基在实际运用上依然存在克隆数目较低、克隆增殖较慢、收获的分裂相细胞仍较少等问题。当种植的羊水样品状况不佳时,无法在短期内生成足够的分裂相细胞，与临床检验单位的需求仍有一定差距。
中国专利申请CN 101705207 B公开了一种羊水细胞培养基，该专利申请通过在H-1培养基的基础上添加不同种类的抗氧化剂组合，从而能促进羊水细胞的增殖。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在低血清含量(1％)的羊水细胞培养基新配方，相比现有公开文献报道的配方配制的培养基，能更迅速有效地增加体外增殖的羊水细胞克隆数目和细胞增殖速度，缩短培养周期,获得更多的分裂相染色体数目且成本更低。
本发明的技术方案为：一种低血清羊水细胞培养基，在基础培养基RPMI1640/αMEM按1：1混合的基础上，添加包括以下组分：胰岛素(Insulin)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、牛血清白蛋白(BSA)、氢化可的松(hydrocortisone)、α生育酚(Alpha Tocopherol)、NaHCO3、柠檬酸铁、吐温80(Tween 80)、乙醇胺、油酸、亚油酸以及胎牛血清。
所述胎牛血清添加含量占低血清羊水细胞培养基总体积不超过1％。
优选地，所述低血清羊水细胞培养基各组分含量如下:
进一步地，本发明低血清羊水细胞培养基可用于产前诊断的贴壁型羊水细胞生长。
本发明的有益效果为：
1、本发明的多次试验改进羊水细胞培养基各组分及其含量最终配制而成，获得出乎意料的效果，相比现有公开技术，效果有显著改进，克隆形成率和克隆生长速度明显增加，在相同的培养时间内，可以培养得到比现有培养基多2～3倍数量的处于分裂期的羊水细胞，能够满足临床诊断和科研的要求，其次本发明各组分改进后大大降低了胎牛血清含量，进而可获得较高纯度的羊水细胞，提高临床诊断的准确性。
2、本发明提供的各组分确定的羊水细胞培养基相比现有公开技术，降低了胎牛血清含量，降低了成本，有利于规模化应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。
实施例：配制本发明低血清羊水细胞培养基(代号HN-1)：
取RPMI1640培养基干粉5.0g、αMEM培养基干粉5.1g，用950ml的超纯水溶解后，添加NaHCO3 2.0g、柠檬酸铁5mg、重组人胰岛素(Insulin)10mg、重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)30ug、重组人表皮细胞生长因子(EGF)10ug、牛血清白蛋白(BSA)2.0g、氢化可的松(hydrocortisone)2nMol、α生育酚(Alpha Tocopherol)1mg、乙醇胺1mg、油酸、亚油酸各1mg，其后加吐温80(Tween 80)0.5ml、胎牛血清(FBS)10ml，混匀后加超纯水定容至1000ml，即为HN-1羊水细胞完全培养基。无菌分过滤分装，-20℃贮存备用。
对比例：配制现有公开发明专利CN 101705207 B披露的羊水细胞培养基(代号为DF-J1)：
1L装量的DMEM/F12细胞培养基,用950ml的超纯水溶解后，添加NaHCO3 1.2g、15mMHEPES，添加10种生长因子，包括转铁蛋白(transferrin)10mg/L、亚硒酸纳40nMol、胰岛素(Insulin)20mg、三碘甲状腺氨酸(triiodothyronine)0.2nMol、胰高血糖素(glucagon)2mg、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)20ug、氢化可的松(hydrocortisone)2nMol、睾酮(testosterone)2nMol、雌二醇(estradiol)2nMol、孕酮(progesterone)2nMol，其后添加α生育酚10mg、L-抗坏血酸50mg，最后添加超纯水定容至1000ml。将配制好的1L基础培养基添加体积百分比为4％的胎牛血清，成为羊水细胞完全培养基。无菌分过滤分装，-20℃贮存备用。
比较HN-1羊水细胞培养基与DF-J1羊水细胞培养基的羊水细胞培养效果：
1、羊水细胞培养：收集羊水样品(为17-22周龄之间的羊水样品，每份约0.1-0.5ml，共4ml左右)，混合均匀，得到检测用羊水细胞收集样品I，比较不同培养基的培养效果。细胞培养、制片方法按以下步骤进行：
(1)在无菌条件下取羊水各2.0ml/管,共2管；
(2)以1500rpm/min室温离心10分钟；
(3)在无菌操作台上吸去上清液，每管约留0.5ml，吸管打散细胞。制成细胞悬液，再加入4.5ml培养基入管内，吸管轻混匀，移至25cm2方形一次性培养瓶中置含5％CO2的37℃温箱饱和湿度行开放式培养；
(4)6天后镜下观察，可见成纤维样或上皮细胞生长，当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细胞时，此时换相应新鲜的羊水培养基5ml，24-48小时后，如细胞生长状况好，加入秋水仙素0.04-0.08ug/ml,(20ug/ml，7号针头垂直竖加2滴)4-6h左右进行细胞学处理；
(5)收获细胞：倒出瓶中细胞液入10ml离心管，用0.85％NaCl溶液冲洗细胞壁两遍，0.25％胰酶消化3-5分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改变时即用吸管吹打下细胞453g(1500rpm/min)室温离心10分钟，去上清，约留0.5ml；
(6)低渗：加入37℃0.075M KCl 4-6ml，吸管吹打，37℃水浴3-5分钟；
(7)预固定：加入1.5ml甲醇：冰醋酸＝3:1固定剂，轻混匀37℃水浴5分钟453g(1500rpm/min)室温离心10分钟；去上清约留0.5ml；
(8)固定：加入3:1固定剂8ml，轻混匀，37℃水浴10分钟,453g(1500rpm/min,eppendorf 5810R)室温离心10分钟；去上清，约留0.5ml；
(9)重复固定：同上。453g(1500rpm/min)室温离心10分钟，去上清，视管底细胞量加入适当几滴固定剂；
(10)滴片、烤片：每片1-2滴，75℃烤箱烘烤3小时；
(11)培养结束染色体制片前统计细胞克隆总数，包括有分裂相的克隆总数，以及有效克隆的大小；制备染色体后统计分裂相细胞数目；
(12)羊水细胞收集样品I培养7天后收获，进行染色体制片。
2、培养结果见表1：
表1 现有配方和本发明配方培养基对羊水细胞的培养效果比较
(注：克隆大小判断标准为：在100倍倒置显微镜下判断观察，克隆≥1个视野判断为大克隆；克隆≤1/2个视野则判断为小克隆；介于两者之间的为中等克隆。总克隆数＝有分裂相的总克隆数+无分裂相的克隆数。)
从结果可以看出，在相同的培养时间内，与DF-JI相比，本发明HN-1培养基的培养效果无论从总克隆数、分裂相细胞数目都有了大幅度提高，总克隆数为HN-1培养基的2倍，其中有分裂相的克隆数为HN-1培养基的2～3倍。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同替换和改进，均应包含在本发明技术方案的保护范围内。
Claims (1)
1.一种低血清羊水细胞培养基，其特征在于，其包括如下含量的各组分：
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510569624.XA CN105039244B (zh) | 2015-09-09 | 2015-09-09 | 一种低血清羊水细胞培养基 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510569624.XA CN105039244B (zh) | 2015-09-09 | 2015-09-09 | 一种低血清羊水细胞培养基 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105039244A CN105039244A (zh) | 2015-11-11 |
| CN105039244B true CN105039244B (zh) | 2017-07-21 |
Family
ID=54446220
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510569624.XA Active CN105039244B (zh) | 2015-09-09 | 2015-09-09 | 一种低血清羊水细胞培养基 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105039244B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106047798A (zh) * | 2016-08-19 | 2016-10-26 | 上海逍鹏生物科技有限公司 | 一种适用于高密度细胞培养体系的羊水细胞培养基 |
| CN106834215A (zh) * | 2016-12-24 | 2017-06-13 | 严志海 | 一种羊水细胞培养基 |
| CN106434534A (zh) * | 2016-12-24 | 2017-02-22 | 叶宗耀 | 一种羊水细胞培养基及其制备方法 |
| US11590175B2 (en) * | 2017-08-23 | 2023-02-28 | Merakris Therapeutics Llc | Compositions containing amniotic components and methods for preparation and use thereof |
| CN108060118A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-05-22 | 深圳市龙岗区妇幼保健院 | 羊水细胞培养基、羊水细胞培养方法及培养基的应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100662706B1 (ko) * | 2006-01-13 | 2006-12-28 | 문신용 | 양수세포를 배양한 후 수거한 배양액을 이용한 인간배아 줄기세포의 배양방법 |
| CN101705207B (zh) * | 2009-11-10 | 2013-10-30 | 广州拜迪生物医药有限公司 | 一种羊水细胞培养基 |
| CN102618493A (zh) * | 2012-04-13 | 2012-08-01 | 惠州鸿雨科技有限公司 | 一种羊水与绒毛细胞培养基 |
-
2015
- 2015-09-09 CN CN201510569624.XA patent/CN105039244B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105039244A (zh) | 2015-11-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105039244B (zh) | 一种低血清羊水细胞培养基 | |
| CN101705207B (zh) | 一种羊水细胞培养基 | |
| Li et al. | Transplantation of placenta-derived mesenchymal stem cell-induced neural stem cells to treat spinal cord injury | |
| CN105267243B (zh) | 一种消除皮肤妊娠纹的干细胞提取物 | |
| CN104480062A (zh) | 一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法 | |
| CN108504628A (zh) | 人脐带间充质干细胞的培养方法 | |
| CN106635974B (zh) | 一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法 | |
| CN102618493A (zh) | 一种羊水与绒毛细胞培养基 | |
| CN110079501B (zh) | 小鼠乳腺癌循环肿瘤细胞系及其建立方法 | |
| CN106434534A (zh) | 一种羊水细胞培养基及其制备方法 | |
| CN106399235A (zh) | 一种人脐带间充质干细胞的分离方法 | |
| CN104450610B (zh) | 一种人羊膜间充质干细胞传代培养方法 | |
| CN110592001B (zh) | 一种输卵管上皮细胞的纯化培养体系 | |
| CN106834217A (zh) | 一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法及应用 | |
| WO2019128604A1 (zh) | 羊水细胞培养基、羊水细胞培养方法及培养基的应用 | |
| CN116064381A (zh) | 一种刀鲚原代肌细胞培养方法 | |
| CN111454990A (zh) | 人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株及其应用 | |
| WO2022056991A1 (zh) | 脐带来源的间充质干细胞及其制备方法和应用 | |
| CN106635964A (zh) | 一种培养羊水细胞的无血清培养基及其制备方法 | |
| CN112903395A (zh) | 一种绒毛组织原位载玻片培养法及染色体制备方法 | |
| Rubio et al. | Generation of mosaic mammary organoids by differential trypsinization | |
| CN106754660A (zh) | 一种毛囊干细胞体外分化为卵母细胞的方法 | |
| Wolf | Culture and preparation of cells from amniotic fluid | |
| CN104419676A (zh) | hTERT基因重组构建唐氏综合征细胞模型及其细胞库 | |
| EP3412767B1 (en) | Method for obtaining female reproductive stem cells from follicular extracts |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP02 | Change in the address of a patent holder | ||
| CP02 | Change in the address of a patent holder |
Address after: 510000 A unit 17, No. 17, Zhenxing street, Haizhuqu District, Guangzhou, Guangdong. Patentee after: Guangzhou and energy bio tech ltd Address before: 510000 self made 108B room in courtyard 189, don and road, Haizhuqu District, Guangzhou, Guangdong, China. Patentee before: Guangzhou and energy bio tech ltd |