CN102559590B

CN102559590B - 用两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法

Info

Publication number: CN102559590B
Application number: CN 201210011823
Authority: CN
Inventors: 余丽梅
Original assignee: Affiliated Hospital of Zunyi Medical University
Current assignee: Affiliated Hospital of Zunyi Medical University
Priority date: 2012-01-16
Filing date: 2012-01-16
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2032-01-16
Also published as: CN102559590A

Abstract

本发明公开了一种用两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法：采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离人脐带血单个核细胞，用DMEM/F12培养基原代培养人脐带血间充质干细胞，增加了细胞的贴壁，明显减少了破骨样细胞的生长，有利于hUCB-MSCs集落的形成，大大提高了hUCB-MSCs培养的成功率；继续用DMEM/F12传代培养至P2代，同时采用酶消化和差速贴壁法结合，明显有利于P1-P2代细胞的纯化；P3代以后改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基培养，保持了hUCB-MSCs的标志蛋白及良好的形态学特征和生长特性，并保持了hUCB-MSCs的多向分化潜能；另外，本发明所采用的培养基成本明显降低。

Description

用两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种用两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞（human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCB-MSCs）的方法，属于细胞工程及生物医药技术领域。

背景技术

人脐血(human umbilical cord blood，hUCB)是胎儿出生时脐带内及胎盘内近胎儿侧血管内的血液，含有丰富的干/祖细胞，研究较多的主要为造血干细胞和间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)。人脐带血间充质干细胞(hUCB-MSCs）是一种成纤维细胞样，具有无限增殖和多向分化潜能的干细胞，表达SH2、SH3、SH4、ASMA、MAB1470、CD13、CD29、CD44、CD166和CD73等细胞表面抗原，但不表达CD34、CD45、CD14等表面标志；与骨髓来源的MSCs具有相似生物学特性，但其培养成功率相对较低，据统计只有25-30%的脐血样本培养后出现MSCs，限制了其研究及应用价值的进一步发掘。不同的培养基、细胞因子、扩增体系及纯化方法，可直接影响hUCB-MSCs培养的成功与否、扩增的数量及其生物学特性的保持。但又因其具有来源丰富，易收集，不涉及明显的伦理及法律争议，被病毒、细菌污染机率小，且免疫原性低、增殖分化能力强等优点，已在神经元退行性疾病、组织损伤等疾病的治疗中显示出良好的临床应用前景，故而不断优化其培养体系一直备受关注。

hUCB-MSCs除可在适宜条件下分化为成骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、神经元细胞、心肌细胞、肝样细胞及胰岛细胞之外，还具有免疫调节作用和分泌功能；与造血干细胞一起移植，还可促进机体造血功能的恢复及长期造血功能的重建。但培养过程中，hUCB-MSCs数量少、获率低、周期长是制约其应用的瓶颈。脐带血中MSCs的比例较骨髓低得多（0.05-2.8/1×10⁶hUCB单个核细胞，2-5/1×10⁶骨髓单个核细胞）；加之hUCB-MSCs缺乏特异性标志，其分离方法相对粗糙，难以去除混杂的破骨样细胞，大部分脐血标本中破骨样细胞占优势，MSCs夹杂其间，很难生长达到融合，无法传代。目前常用的分离、纯化方法主要是采用Ficoll、Percoll等密度梯度离心法和差速贴壁法进行单个核细胞的分离及hUCB-MSCs的纯化。

以往的hUCB-MSCs培养通常使用单一的DMEM/F12、DMEM/MEM、DMEM/Ham、α-MEM和IMDM等，加以自体血清、脐带血血清，human platelet lysate替代FBS，或添加氢化可的松、粒单细胞集落刺激因子、胰岛素等；也可通过调整pH偏酸性的Mesencult^TM间充质专用培养基，结合差速贴壁，传代培养出了高纯度的hUCB-MSCs。但这些培养方法突出的问题在于hUCB-MSCs培养成功率较低，尤其是单一的DMEM/F12、DMEM/MEM等培养基传代培养3-5代后还出现明显的hUCB-MSCs生物学形态特征和功能改变，不适于细胞需求量较大的研究与应用。另外，许多市售专用培养基除存在经济成本较高外，在原代培养过程中破骨样细胞的生长常常比较旺盛，明显不利于差速贴壁、传代培养后纯化hUCB-MSCs，甚而极大地降低了hUCB-MSCs的培养成功率。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种用两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法。本发明选用不适于破骨样细胞生长的pH值偏酸的DMEM/F12培养基，在提高hUCB-MSCs集落形成和原代培养hUCB-MSCs成功率的同时，又发挥了后续使用Oricell人脐带间充质干细胞培养基能多次传代、较大量扩增hUCB-MSCs，并保持hUCB-MSCs良好生物学特性的优点，还大大降低了使用单一专用培养基的经济成本。

本发明的技术方案：用两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法：采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离人脐带血单个核细胞，然后用pH值偏酸（pH=6.5-6.8）的含10%FBS的DMEM/F12培养基原代培养人脐带血间充质干细胞，P0代细胞消化传代时，继续用含10%FBS的DMEM/F12培养基传代培养至P2代，同时通过换液和酶消化结合差速贴壁法进行P1-P2代细胞的纯化；从P3代细胞开始，改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基传代培养至P8代。

具体地说，前述方法包括以下两个步骤：（1）单个核细胞的分离：将无菌采集的肝素抗凝脐带血用D-PBS缓冲液稀释、混匀后，按1∶1体积比将稀释血加于淋巴细胞分离液上，离心后吸取中间白膜层，用含2mmol/L EDTA的D-PBS缓冲液洗涤后加入0.83%的氯化铵裂解红细胞，用含2%FBS的PBS缓冲液洗涤细胞，离心后沉淀用DMEM/F12培养基悬浮，0.4%台盼蓝染色，观察细胞活力；（2）培养：当细胞活力>95%时，用pH值偏酸（pH=6.5-6.8）的含10%FBS的DMEM/F12培养基进行原代培养；当生长21-28d，P0代细胞达到80%融合时，用含10%FBS的DMEM/F12培养基按1瓶细胞接种1瓶细胞进行传代培养；P1和P2代细胞继续用含10%FBS的DMEM/F12培养基按1瓶细胞接种2瓶细胞进行传代培养；从P3代细胞开始，改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基传代培养至P8代。

前述步骤（1）中所述D-PBS缓冲液的配制方法为：取KCl 0.20g、KH₂PO₄0.20g、NaCl 8.00g、Na₂HPO₄·7H₂O2.16g，加超纯水至1000ml，调pH至7.2～7.4，高压灭菌，冷却后置4℃冰箱保存即可。

前述步骤（1）中所述淋巴细胞分离液的密度为1.077g/ml。

前述步骤（2）中所述原代培养条件为：按细胞密度5×10⁶个/ml，将分离的单个核细胞接种于T25培养瓶，1份脐带血获得的细胞接种于2-3个T25培养瓶，用pH值偏酸（pH=6.5-6.8）的含10%FBS的DMEM/F12培养基于37℃、5%的CO₂饱和湿度下进行原代培养，P0代细胞5d后首次半量换液，以后每5d换液一次。

前述步骤（2）中所述P0-P2代细胞传代培养条件为：当形成人脐带血间充质干细胞集落的P0代细胞达到80%融合时，用0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合液消化细胞1-1.5min，用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化后，每25ml培养瓶（细胞数5×10⁵～1×10⁶个）细胞沉淀用含10%FBS的DMEM/F12培养基5ml重悬，1瓶传1瓶进行传代培养；P1、P2代细胞生长至细胞达80%融合时，用0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合液消化细胞1-1.5min，用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化后，每25ml培养瓶（细胞数1×10⁶～3×10⁶个）细胞沉淀用含10%FBS的DMEM/F12培养基10ml重悬，一瓶细胞均分为二瓶进行传代培养；每3-5d换液、传代一次。

前述步骤（2）中所述P3代以后细胞传代培养条件为：P3代细胞达到80%融合时，用0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合液消化细胞1-1.5min，用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化后，改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基传代培养，细胞接种密度1×10⁶个/ml，每3-5d换液、传代一次；当细胞生长达80%融合时，重复消化、终止消化以及Oricell人脐带间充质干细胞培养基培养步骤，传代培养至P8代。

前述含10%FBS的DMEM/F12培养基含2mmol/L的L-谷氨酰胺、100μg/ml的链霉素和100U/ml的青霉素。

为了验证本发明方法的可行性及效果，下面通过具体实验例来进一步说明。

一、材料和方法

1、目的：观察两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCB-MSCs)，及其对hUCB-MSCs基本生物学特性的影响。

设计：细胞培养和干细胞生物学特性检测。

2、材料：获得产妇及其家属知情同意后，采集妊娠36-40周剖宫产新生儿脐带血，肝素(200U/ml)抗凝，50～75ml/份，由遵义市妇幼保健院提供，产妇健康，HBsAg阴性、HIV阴性，未发现胎儿先天性疾病。脐血采集后4h内进行实验。

3、实验用主要试剂与仪器：

试剂与仪器	来源
		DMEM/F12培养基	美国HyClone公司
Oricell人脐带间充质干细胞培养基	中国Cyagen公司
		Mesencult^TM间充质专用培养	加拿大Stemcell technology公司
Oricell人脐带间充质干细胞成骨分化与成脂分化培养基	中国Cyagen公司
		胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）	美国Gibco公司
小鼠抗人CD29-PE、CD44-FITC、CD73-PE、CD45-FITC、CD34-FITC、CD166-PE抗体及其同型对照（小鼠抗人IgG2a-PE、IgG2b-FITC、IgG1-PE、IgG1-FITC抗体）	美国Becton Dickinson公司
		小鼠抗人波形蛋白单克隆抗体	美国Sigma公司
EnVision?? Detection Systems Peroxidase/DAB试剂盒	上海GENE公司
		人淋巴细胞分离液	美国Pharmacia公司
Centrifuge 5804R高速低温离心机	德国Eppendorf公司
		IX-71-S8F倒置相差显微镜	日本Olympus公司
3141I/R CO₂培养箱	美国Thermo Forma公司
		FACS calibur流式细胞仪	美国Becton Dickinson公司

4、实验方法

hUCB单个核细胞的分离：将无菌采集的肝素抗凝脐带血用D-PBS缓冲液稀释、混匀后，按1∶1体积比将稀释血小心的加于淋巴细胞分离液(密度为1.077g/ml)上，离心后吸取中间白膜层，用含EDTA(2mmol/L)的D-PBS缓冲液洗涤后加入0.83%的氯化铵裂解红细胞，用含2%FBS的PBS缓冲液洗涤细胞，离心后沉淀用DMEM/F12培养基悬浮，0.4%台盼蓝染色，观察细胞活力>95%。

hUCB-MSCs培养：按细胞密度5×10⁶个/ml，将分离的单个核细胞接种于T25培养瓶，用pH偏酸（pH=6.5-6.8）的含10%FBS的DMEM/F12培养基(含2mmol/L的L-谷氨酰胺、100μg/ml链霉素、100U/ml的青霉素)，37℃、5%的CO₂饱和湿度下进行原代培养，P0代细胞5d后首次半量换液，以后每5d换液一次；当生长21-28d，P0代细胞达到80%融合，用0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合液消化细胞1-1.5min，用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化后，每瓶细胞沉淀用含10%FBS的DMEM/F12培养基5ml重悬，1瓶传1瓶进行传代培养；P1、P2代细胞生长至细胞达80%融合时，用0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合液消化细胞1-1.5min，用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化后，每瓶细胞沉淀用含10%FBS的DMEM/F12培养基10ml重悬，一瓶细胞均分为二瓶进行传代培养；P3代以后改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基传代培养，P4至P8代hUCB-MSCs用于后续试验。

细胞免疫表型检测与免疫细胞化学染色：对数生长期P4和P6代hUCB-MSCs分别加入不同荧光标记的小鼠抗人CD29-PE、CD44-FITC、CD73-PE、CD166-PE、CD34-PE、CD45-FITC及其同型对照，用流式细胞仪检测，Cell Quest软件分析上述CD分子在hUCB-MSCs上的表达情况。P4-P6代hUCB-MSCs爬片，加入小鼠抗人波形蛋白单克隆抗体（1∶200），DBA显色，苏木素复染，显微镜下观察胞浆表达波形蛋白细胞数量。

生长曲线和细胞分化潜能：取P6代hUCB-MSCs，制成1×10⁴/ml的细胞悬液，接种于96孔培养板，采用MTT法，检测细胞培养12h至8d的光密度值(optical density value，OD)，重复4次。以时间为横坐标、平均OD值为纵坐标绘制hUCB-MSCs的生长曲线。计算细胞倍增时间（doubling time，Td）：Td=t×lg2/(lgNt-lgN0)，t为培养时间，N0及Nt为接种后及培养t小时测得的OD值。另一部分hUCB-MSCs，按Oricell人脐带间充质干细胞成骨和成脂诱导培养基说明书，37℃、5%CO₂饱和湿度条件下培养21d，分别进行茜素红染色和油红染色，鉴定成骨细胞和成脂细胞。

二、结果

1、hUCB-MSCs的形态学特征

含10%FBS的DMEM/F12培养基原代培养hUCB单个核细胞2～3d后部分细胞贴壁，多为圆形或不规则形，4～7d开始逐渐伸出突起，为散在分布的梭形、多角形细胞，大量破骨样细胞与MSCs混杂存在。MSCs主要为成纤维样的长梭形，多次换液培养21-28d后，MSCs可在局部形成集落（图1所示），MSCs迅速增长，破骨样细胞逐渐减少，MSCs在1周后可达80%～90%融合，即可传代。传至P3代后，破骨样细胞基本被去除，剩下形态较为单一的成纤维样细胞，即hUCB-MSCs，其增殖能力强，可见1～2个细胞核，呈漩涡样生长。P3代细胞开始改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基传代培养连续传至P8代，细胞增殖能力没有明显减缓，细胞形态也未见明显变化。

2、hUCB-MSCs的免疫表型与波形蛋白表达

流式细胞仪检测结果显示，P4～P6代hUCB-MSCs均一、稳定地表达间充质细胞相关的抗原标记CD29+、CD44+、CD73+、CD166+，其中表达后三个CD分子的细胞百分率大于90%，但均不表达造血干细胞特异性标志CD34和白细胞标志CD45（见表1和图2）。如图3所示，经免疫细胞化学染色和苏木精复染后，可见P4和P6代hUCB-MSCs胞浆内较强的棕色颗粒表达，即表达较高水平的间充质细胞标志波形蛋白，且均一性好，纯度大于95%。

表1 P4和P6代hUCB-MSCs表型分子表达百分率的变化（

±s，n=3-4）

Figure 2012100118235100002DEST_PATH_IMAGE002

*P<0.05,与P4代hUCB-MSCs比较。

3、两种培养基序贯应用

在多次重复实验中发现，使用10%FBS的DMEM/F12培养基进行hUCB-MSCs原代培养，hUCB单个核细胞接种后细胞贴壁较好，大多在20d左右形成hUCB-MSCs集落(24例中成功形成hUCB-MSCs集落16例，培养成功率为66.67%），而使用Mesencult^TM间充质专用培养基进行原代培养时，细胞贴壁时间延后1-3d，且破骨样细胞生长旺盛(如图4)，形成hUCB-MSCs集落的频率较低（5例中仅成功形成hUCB-MSCs集落1例，培养成功率仅为20%）。在一直使用DMEM/F12培养基培养过程中，发现4-5代细胞胞体明显增大，胞浆中颗粒样物质较多，细胞形态向多边形转变，细胞增殖缓慢，老化明显（如图4）；而P3代开始采用Oricell人脐带间充质干细胞培养基培养，既有利于利用差速贴壁法纯化细胞，又有利于保持hUCB-MSCs的良好生长特性和表面标志(见表1)，hUCB-MSCs传代培养至P8代，hUCB-MSCs仍能保持较好的细胞大小和梭形及漩涡状排列，且细胞增殖仍然较好，3-5d即可达80%融合率。

4、hUCB-MSCs生长曲线与分化潜能

P6代hUCB-MSCs培养至第3-5d进入指数增殖期，第6-7d进入增殖的平台期(图5)，其倍增时间为68.11h。P6代hUCB-MSCs分别经成骨和成脂细胞诱导培养基诱导培养21d后，茜素红染色可见形成的骨结节染成红色，油红则将胞浆内形成的脂滴染成红色，由图6可见，一定条件下，P6代hUCB-MSCs经诱导培养后，可分化为数量较多的成骨细胞与成脂细胞。

三、结论

本发明采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法成功分离hUCB单个核细胞，先采用10%FBS的DMEM/F12培养基进行原代培养，同时通过换液和酶消化结合差速贴壁法，进行P0-P2代hUCB-MSCs的纯化。P3代后hUCB-MSCs为典型旋涡状排列的成纤维样、长梭形细胞，表现出与其他文献报道相似的hUCB-MSCs形态特征；且胞浆均一性表达波形蛋白阳性的细胞纯度大于95%，波形蛋白为一种中胚层来源MSCs的标志蛋白，与骨髓、脐带和羊膜等来源的MSCs一样，hUCB-MSCs也高表达这一标志蛋白。

本发明采用pH值偏酸的DMEM/F12培养基进行原代培养，一方面增加了细胞的贴壁，另一方面与Mesencult^TM间充质专用培养基相比，明显减少了破骨样细胞的生长，有利于hUCB-MSCs集落的形成，hUCB-MSCs培养的成功率大大提高（由20%提高到66.67%）；同时采用酶消化和差速贴壁法结合，也明显有利于P1-P3代细胞的快速纯化。

实验还发现，用DMEM/F12培养基传代培养至P4-P5后，hUCB-MSCs胞体明显增大，胞浆中颗粒增多，细胞增殖速度明显降低。因此P3代hUCB-MSCs开始，改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基培养，保持了hUCB-MSCs良好的形态学特征和生长状态，P4和P6代hUCB-MSCs都均一地表达CD44、CD73、CD166和CD29阳性标志，不表达CD34和CD45，并表达间充质细胞标志波形蛋白，这与其他文献报道常用的鉴定MSCs的标志一致。生长曲线显示，第2-5d处于对数增殖期，6-7d进入生长的平台期，P6代hUCB-MSCs倍增时间为68.11h，培养P4-P8代hUCB-MSCs一般3-5d生长至80%融合，表明此两种培养基序贯培养保持了hUCB-MSCs的标志蛋白和良好生长特性。

经诱导分化培养后，hUCB-MSCs出现了明显的形态和结构改变，随着矿化作用的发生和脂滴的形成，出现了茜素红染色阳性的钙结节和油红O染色阳性、富含脂滴的脂肪细胞；成骨细胞和成脂细胞分别为中胚层和内胚层来源细胞的代表，这也表明DMEM/F12培养基与Oricell人脐带间充质干细胞培养基序贯培养保持了hUCB-MSCs的多向分化潜能。

综上所述，DMEM/F12培养基与Oricell人脐带间充质干细胞培养基序贯应用不失为hUCB-MSCs培养的一种良好方案。

与现有技术相比，本发明选用不适于破骨样细胞生长的pH值偏酸的含10%FBS的DMEM/F12培养基(500-600元/1000ml)进行原代培养，增加了细胞的贴壁，明显减少了破骨样细胞的生长，有利于hUCB-MSCs集落的形成，大大提高了hUCB-MSCs培养的成功率；继续用DMEM/F12传代培养hUCB-MSCs至第2代，同时采用酶消化和差速贴壁法结合，明显有利于P0-P2代细胞的纯化；P3代以后改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基培养，能多次传代、较大量扩增hUCB-MSCs，保持了hUCB-MSCs的标志蛋白及良好的形态学特征和生长特性，并保持了hUCB-MSCs的多向分化潜能。另外，与使用单一的市售专用培养基（1800-4000元/200-500ml）相比，本发明所采用的培养基成本明显降低（其中含10%FBS的DMEM/F12培养基为500-600元/1000ml，Oricell人脐带间充质干细胞培养基的成本为1800元/500ml），每份脐带血获得的单个核细胞P0-P2代hUCB-MSCs的培养成本至少可节约3000元以上。

附图说明

图1是原代培养的hUCB-MSCs（40×）以及传代培养第6代的hUCB-MSCs；其中a为原代培养hUCB-MSCs集落中央，b为原代培养hUCB-MSCs集落边缘，c为传代培养第6代的hUCB-MSCs(40×)，d为传代培养第6代的hUCB-MSCs(100×)。

图2是传代培养第6代hUCB-MSCs流式细胞术免疫表型分析直方图。

图3是传代培养第6代hUCB-MSCs免疫细胞化学染色后的波形蛋白表达图(100×)；a为波形表达，b为空白片。

图4是两种不同培养基中hUCB-MSCs的集落形成与细胞形态图；a为Mesencult^TM间充质专用培养基培养的细胞，其中没有hUCB-MSCs集落形成(40×）；b为DMEM/F12培养基第4代hUCB-MSCs形态(100×）。

图5是传代培养第6代hUCB-MSCs的生长曲线图。

图6是hUCB-MSCs被诱导分化为成骨细胞与成脂细胞的染色效果图；a为成骨细胞（红骨结节）（100×），b为成脂细胞（红色脂滴）（400×）。

具体实施方式

本发明的实施例1：两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法，包括以下两个步骤：

（1）单个核细胞的分离：将无菌采集的肝素抗凝脐带血用D-PBS缓冲液（取KCl 0.20g、KH₂PO₄0.20g、NaCl 8.00g、Na₂HPO₄·7H₂O2.16g，加超纯水至1000ml，调pH至7.2～7.4，高压灭菌，冷却后置4℃冰箱保存即可）稀释、混匀后，按1∶1体积比将稀释血加于淋巴细胞分离液（密度为1.077g/ml）（购于美国Pharmacia公司）上，离心后吸取中间白膜层，用含2mmol/L EDTA的D-PBS缓冲液洗涤后加入0.83%的氯化铵裂解红细胞，用含2%FBS的PBS缓冲液洗涤细胞，离心后沉淀用DMEM/F12培养基悬浮，0.4%台盼蓝染色，观察细胞活力。

（2）培养：当细胞活力>95%时，按细胞密度5×10⁶个/ml，将分离的单个核细胞接种于T25培养瓶，1份脐带血获得的细胞接种于2-3个T25培养瓶，用pH值6.5-6.8的含10%FBS的DMEM/F12培养基（含2mmol/L的L-谷氨酰胺、100μg/ml的链霉素、100U/ml的青霉素）于37℃、5%的CO₂饱和湿度下进行原代培养，P0代细胞5d后首次半量换液，以后每5d换液一次，观察细胞生长情况；当生长21-28d，形成hUCB-MSCs集落的P0代细胞达到80%融合时，用0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合液消化细胞1-1.5min，用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化后，每25ml培养瓶（细胞数5×10⁵个）细胞沉淀用含10%FBS的DMEM/F12培养基5ml重悬，1瓶传1瓶进行传代培养；P1、P2代细胞生长至细胞达80%融合时，用0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合液消化细胞1-1.5min，用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化后，每25ml培养瓶（细胞数1.5×10⁶个）细胞沉淀用含10%FBS的DMEM/F12培养基10ml重悬，一瓶细胞均分为二瓶进行传代培养；每3-5d换液、传代一次；P3代细胞达到80%融合时，用0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合液消化细胞1-1.5min，用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化后，改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基传代培养，细胞接种密度1×10⁶个/ml，每3-5d换液、传代一次；当细胞生长达80%融合时，重复消化、终止消化以及Oricell人脐带间充质干细胞培养基培养步骤，传代培养至P8代。

本发明的实施例2：两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法，包括以下两个步骤：

（1）单个核细胞的分离：将无菌采集的肝素抗凝脐带血用D-PBS缓冲液稀释、混匀后，按1∶1体积比将稀释血加于淋巴细胞分离液（密度为1.077g/ml）上，离心后吸取中间白膜层，用含2mmol/L EDTA的D-PBS缓冲液洗涤后加入0.83%的氯化铵裂解红细胞，用含2%FBS的PBS缓冲液洗涤细胞，离心后沉淀用DMEM/F12培养基悬浮，0.4%台盼蓝染色，观察细胞活力。

（2）培养：当细胞活力>95%，按细胞密度5×10⁶个/ml，将分离的单个核细胞接种于T25培养瓶，1份脐带血获得的细胞接种于2-3个T25培养瓶，用pH值6.5-6.8的含10%FBS的DMEM/F12培养基（含2mmol/L的L-谷氨酰胺、100μg/ml的链霉素、100U/ml的青霉素）于37℃、5%的CO₂饱和湿度下进行原代培养，P0代细胞5d后首次半量换液，以后每5d换液一次；当生长21-28d，P0代细胞达到80%融合时，用0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合液消化细胞1-1.5min，用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化后，每25ml培养瓶（细胞数6×10⁵个）细胞沉淀用含10%FBS的DMEM/F12培养基5ml重悬，1瓶传1瓶进行传代培养；P1、P2代细胞生长至细胞达80%融合时，用0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合液消化细胞1-1.5min，用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化后，每25ml培养瓶（细胞数1×10⁶个）细胞沉淀用含10%FBS的DMEM/F12培养基10ml重悬，一瓶细胞均分为二瓶进行传代培养；从P3代细胞开始，改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基传代培养至P8代。

实施例3：两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

（1）单个核细胞的分离：将无菌采集的肝素抗凝脐带血用D-PBS缓冲液稀释、混匀后，按1∶1体积比将稀释血加于淋巴细胞分离液上，离心后吸取中间白膜层，用含2mmol/L EDTA的D-PBS缓冲液洗涤后加入0.83%的氯化铵裂解红细胞，用含2%FBS的PBS缓冲液洗涤细胞，离心后沉淀用DMEM/F12培养基悬浮，0.4%台盼蓝染色，观察细胞活力。

（2）培养：当细胞活力>95%，用pH值6.5-6.8的含10%FBS的DMEM/F12培养基于37℃、5%的CO₂饱和湿度下进行原代培养，P0代细胞5d后首次半量换液，以后每5d换液一次；当生长21-28d，P0代细胞达到80%融合时，用0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合液消化细胞，用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化后，每25ml培养瓶（细胞数1×10⁶个）细胞沉淀用含10%FBS的DMEM/F12培养基5ml重悬，1瓶传1瓶进行传代培养；P1、P2代细胞生长至细胞达80%融合时，用0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合液消化细胞，用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化后，每25ml培养瓶（细胞数3×10⁶个）细胞沉淀用含10%FBS的DMEM/F12培养基10ml重悬，一瓶细胞均分为二瓶进行传代培养；每3-5d换液、传代一次；P3代细胞达到80%融合时，用0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合液消化细胞，用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化后，改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基传代培养连续传至P8代。

实施例4：两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

（2）培养：当细胞活力>95%，用pH值6.5-6.8的含10%FBS的DMEM/F12培养基于37℃、5%的CO₂饱和湿度下进行原代培养；当生长21-28d，P0代细胞达到80%融合时，用含10%FBS的DMEM/F12培养基按1瓶细胞接种1瓶细胞进行传代培养；P1、P2代细胞生长至细胞达80%融合时，用含10%FBS的DMEM/F12培养基按1瓶细胞接种2瓶细胞进行传代培养；P3代细胞达到80%融合时，改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基传代培养至P8代。

实施例5：两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法：采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离人脐带血单个核细胞，然后用pH值偏酸（6.5-6.8）的含10%FBS的DMEM/F12培养基原代培养人脐带血间充质干细胞，P0代细胞消化传代时，继续用含10%FBS的DMEM/F12培养基传代培养至P2代，同时通过换液和酶消化结合差速贴壁法进行P1-P2代细胞的纯化；从P3代细胞开始，改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基传代培养至P8代。

Claims

1.用两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法，其特征在于：采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离人脐带血单个核细胞，然后用pH值6.5-6.8的含10%FBS的DMEM/F12培养基原代培养分离得到的人脐带血单个核细胞，P0代细胞消化传代时，继续用含10%FBS的DMEM/F12培养基传代培养至P2代，同时通过换液和酶消化结合差速贴壁法进行P1-P2代细胞的纯化；从P3代细胞开始，改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基传代培养至P8代；所述含10%FBS的DMEM/F12培养基含2mmol/L的L-谷氨酰胺、100μg/ml的链霉素和100U/ml的青霉素。

2.根据权利要求1所述用两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）单个核细胞的分离：将无菌采集的肝素抗凝脐带血用D-PBS缓冲液稀释、混匀后，按1∶1体积比将稀释血加于淋巴细胞分离液上，离心后吸取中间白膜层，用含2mmol/L EDTA的D-PBS缓冲液洗涤后加入0.83%的氯化铵裂解红细胞，用含2%FBS的PBS缓冲液洗涤细胞，离心后沉淀用DMEM/F12培养基悬浮，0.4%台盼蓝染色，观察细胞活力；（2）培养：当细胞活力>95%时，用pH值6.5-6.8的含10%FBS的DMEM/F12培养基进行原代培养；当生长21-28d，P0代细胞达到80%融合时，用含10%FBS的DMEM/F12培养基按1瓶细胞接种1瓶细胞进行传代培养；P1和P2代细胞继续用含10%FBS的DMEM/F12培养基按1瓶细胞接种2瓶细胞进行传代培养；从P3代细胞开始，改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基传代培养至P8代。

3.根据权利要求2所述用两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤（1）中所述D-PBS缓冲液的配制方法为：取KCl 0.20g、KH₂PO₄0.20g、NaCl 8.00g、Na₂HPO₄·7H₂O2.16g，加超纯水至1000ml，调pH至7.2～7.4，高压灭菌，冷却后置4℃冰箱保存即可。

4.根据权利要求2所述用两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤（1）中所述淋巴细胞分离液的密度为1.077g/ml。

5.根据权利要求2所述用两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤（2）中所述原代培养条件为：按细胞密度5×10⁶个/ml，将分离的单个核细胞接种于T25培养瓶，1份脐带血获得的细胞接种于2-3个T25培养瓶，用pH值6.5-6.8的含10%FBS的DMEM/F12培养基于37℃、5%的CO₂饱和湿度下进行原代培养，P0代细胞5d后首次半量换液，以后每5d换液一次。

6.根据权利要求2所述用两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤（2）中所述P0-P2代细胞传代培养条件为：当形成人脐带血间充质干细胞集落的P0代细胞达到80%融合时，用0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合液消化细胞1-1.5min，用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化后，每25ml培养瓶细胞沉淀用含10%FBS的DMEM/F12培养基5ml重悬，1瓶传1瓶进行传代培养；P1、P2代细胞生长至细胞达80%融合时，用0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合液消化细胞1-1.5min，用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化后，每25ml培养瓶细胞沉淀用含10%FBS的DMEM/F12培养基10ml重悬，一瓶细胞均分为二瓶进行传代培养；每3-5d换液、传代一次。

7.根据权利要求2所述用两种培养基序贯培养人脐带血间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤（2）中所述P3代以后细胞传代培养条件为：P3代细胞达到80%融合时，用0.25%的胰酶与0.02%的EDTA混合液消化细胞1-1.5min，用含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化后，改用Oricell人脐带间充质干细胞培养基传代培养，细胞接种密度1×10⁶个/ml，每3-5d换液、传代一次；当细胞生长达80%融合时，重复消化、终止消化以及Oricell人脐带间充质干细胞培养基培养步骤，传代培养至P8代。