CN103820385B

CN103820385B - 使衰老间充质干细胞年轻化的活性基质胶及其制备方法

Info

Publication number: CN103820385B
Application number: CN201210468746.6A
Authority: CN
Inventors: 韩为东; 郝好杰; 付小兵; 刘杰杰; 赵亚力; 伍志强
Original assignee: Chinese PLA General Hospital
Current assignee: Chinese PLA General Hospital
Priority date: 2012-11-19
Filing date: 2012-11-19
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2032-11-19
Also published as: CN103820385A

Abstract

本发明提供一种使衰老间充质干细胞年轻化的活性基质胶，其是将切除的脐带置于保存液内，所述保存液为含100u的青霉素及100ug的链霉素的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，在4℃下保存直至处理；在无菌条件下用磷酸盐缓冲液冲洗脐带，以75%乙醇浸泡20秒，取出后分解成小段，去除血管及外膜，剪碎至呈0.5‑1.5mm³的小块；去除磷酸盐缓冲液，置于无菌的铺有多层锡箔纸的平皿中，加入液氮冻结组织，将组织以锡箔纸包裹后敲碎；加与敲碎的组织等体积的磷酸盐缓冲液，在冰浴下用玻璃匀浆器反复匀浆；以12000转离心30分钟，取上清，即得到所述活性基质胶成品。其用途为，将来源于动物或人体的、由机体的年龄或疾病引起衰老的间充质干细胞体外培养于所述活性基质胶，从而使其年轻化。

Description

使衰老间充质干细胞年轻化的活性基质胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于体外培养，可以使间充质干细胞（mesenchymal stemcells，MSCs）年轻化的活性基质胶。

背景技术

间充质干细胞MSCs是来源于中胚层的一类成体干细胞，可从骨髓、脐带、胎盘、肌肉、脂肪等多种组织中分离出来。MSCs具有自我更新以及多向分化的潜能，在体内整个生命周期、以及疾病与创伤条件下参与组织器官的更新与修复。间充质干细胞具有免疫调节特性及分泌丰富的营养因子，且具极低的免疫原性，因此具有广泛的临床应用研究的潜能，已被应用于缺血性心脏病、免疫系统疾病、神经系统疾病、糖尿病、GVHD等临床基础与应用研究。特别是自体间充质干细胞，由于不存在异体等的压力，更有应用潜能。但原始存在于骨髓、脂肪的MSCs的数目较少，难以满足临床治疗和研究方面的需求，因此需要在体外对间充质干细胞进行大量扩增。然而，成体间充质干细胞在体内受到年龄、疾病、环境是压力的影响而逐渐呈现衰老的状态，衰老的干细胞的自我更新能力也逐渐下降、多向分化的潜能也逐渐降低，使得人们很难获得既能满足数量上的需求又保持干细胞的特性的细胞，因此严重制约了间充质干细胞的应用研究。基于这样的需求，研究者在不断寻求解决方案。利用细胞外基质的主要成分胶原蛋白做基质培养在一定程度上改善了MSCs的体外培养的特性，但没有办法解决衰老的问题。利用年轻的骨髓MSCs培养后形成的细胞外基质，可以实现年老的骨髓MSCs的年轻化，但是由于MSCs在体外培养中，从开始就存在着进行性的复制性衰老，严重的限制了它的大量应用。因子寻求能稳定、大量的营造MSCs年轻环境的组分成为一种亟待解决的问题。

年老的MSCs在年轻的MSCs产生的细胞外基质能年轻化的结果提示我们，寻找年轻的生长环境，也许是解决衰老的MSCs体外培养、年轻化的可能的途径。而接近于胚胎状态的脐带MSCs的生存环境华通胶（Wharton's Jelly，WJE，为构成脐带的凝胶状物质，英国物理学家和解剖学家托马斯·华通于1656年最先在其书内描述这种组织，故取他的名字命名该组织）基质，其主要组成由胶原蛋白、聚多糖等细胞外基质成分与血小板样生长因子（IGF）、bFGF等细胞因子，这些成分构成的微环境正是MSCs保持自我更新能力与多向分化潜能所必须的。因此，如何采用适宜的提取手段，保留大多数成分，是本发明的关键。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种能在体外包被培养器皿的表面模拟体内微环境，使得衰老的MSCs年轻化的制品。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种使衰老间充质干细胞年轻化的活性基质胶，其特征在于，其是通过以下方法制得：

（1）将切除的脐带置于保存液内，所述保存液为含100u的青霉素及100ug的链霉素的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，在4℃下保存直至处理；

（2）在无菌条件下用磷酸盐缓冲液冲洗脐带，以75%乙醇浸泡20秒，取出后分解成小段，去除血管及外膜，剪碎至呈0.5-1.5mm³的小块；

（3）去除磷酸盐缓冲液，置于无菌的铺有多层锡箔纸的平皿中，加入液氮冻结组织，将组织以锡箔纸包裹后敲碎；

（4）加与敲碎的组织等体积的磷酸盐缓冲液，在冰浴下用玻璃匀浆器反复匀浆；

（5）以12000转离心30分钟，取上清，即得到所述活性基质胶成品。

如上所述的活性基质胶，优选地，步骤（1）中，所述脐带在4℃下保存不超过24h。

如上所述的活性基质胶，优选地，步骤（2）中，所述用磷酸盐缓冲液冲洗脐带为冲洗3次。

如上所述的活性基质胶在使衰老间充质干细胞年轻化中的用途，其特征性在于，所述的用途是将来源于动物或人体的、由机体的年龄或疾病引起衰老的间充质干细胞体外培养于所述活性基质胶，从而使其年轻化。

如上所述的用途，优选地，将所述活性基质胶以磷酸盐缓冲液稀释成0.05-10%g/mL的浓度，于培养容器中37℃下包被2小时，或4℃下包被16-24小时后，用于所述衰老间充质干细胞的体外培养。

6.一种使衰老间充质干细胞年轻化的活性基质胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤如下：

如上所述的制备方法，优选地，步骤（1）中，所述脐带在4℃下保存不超过24h。

如上所述的制备方法，优选地，步骤（2）中，所述用磷酸盐缓冲液冲洗脐带为冲洗3次。

本发明的有益效果为：

本发明采用剪碎、低温冻结粉碎、低温组织匀浆、高速离心等物理提取技术，最大程度保留了华通基质胶的成分。用飞行质谱技术分析包被于培养器皿上的混合物，包含了细胞外基质成分如胶原蛋白、多聚糖等，以及活性因子如IGF、bFGF等细胞因子。年老的骨髓MSCs培养在上述混合物包被的培养器皿中，其自我更新能力增强，成骨、成脂分化能力加强，衰老细胞的百分比明显加少，与衰老相关的信号通路p16蛋白的量明显降低。经过连续的培养，衰老的骨髓MSCs明显恢复了其固有的特性。实验结果证实，经过这样的培养，可以解决由于年龄、疾病引起的MSCs衰老而无法大量制备的难题。

下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。

附图说明

图1为扫描电镜下本发明活性基质胶在培养皿表面的形态特点，其中a为空白培养皿照片，b为本发明活性基质胶在培养皿表面的形态照片。

图2为电泳及质谱分析结果，其中a为电泳结果图，b为质谱结果图。

图3为长期培养的MSCs生长曲线。

图4为经本发明方法培养的MSCs的SA-β-gal染色的阳性率统计图。

图5为经本发明方法培养的MSCs的分化能力的变化示意图，其中a为成骨诱导的照片，b为成骨诱导定量分析的结果，c为成脂诱导的照片，d为成脂诱导定量分析的结果。

图6为经本发明方法培养的MSCs的衰老相关蛋白变化的电泳结果图。

具体实施方式

本发明根据脐带华通胶的成分组成特点，即包含了细胞外基质蛋白与有活性的细胞因子，部分细胞因子嵌合在基质蛋白中，经过优化组合，选取了去除脐带外膜、血管，剪碎后采用液氮冻结粉碎结合低温匀浆的物理方法，最后利用低温高速离心去除有形物质，制备了基质成分与细胞因子的超微颗粒的混合物。采用飞行质谱技术，分析提取物中既包含了细胞外基质的主要成分包括胶原蛋白、纤连蛋白等，也包含了丰富的包括bFGF、IGF等生长因子。利用制备的混合物，不同稀释后包被培养器皿，用于培养衰老的MSCs，经多向分化能力、自我更新能力分析，恢复至年轻状态即恢复干细胞原始特性。采用本发明的混合物用于年轻化或是恢复由于年龄、疾病引起的衰老的MSCs，为自体MSCs临床研究与治疗需要获得大量的自体干细胞提供新的生物材料与技术。

下面以具体实施例对本发明作进一步详细说明如下：

实施例1本发明活性基质胶的制备

本发明活性基质胶制备的材料来自脐带。脐带可以来自医院中新生儿的废弃脐带或从实验动物小型猪上切除的脐带。若处理来自医院中新生儿的废弃脐带时，在收取脐带前必须与新生儿父母签署知情同意书。

（1）将切除的脐带置于保存液内，所述保存液为含100u的青霉素及100ug的链霉素的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，4℃保存直至处理，一般不超过24小时。

（2）在无菌条件下用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液冲洗脐带三次，去除红细胞；75%乙醇浸泡20秒，取出，分解成小段，去除血管及外膜，用无菌剪刀剪碎至呈约1mm³的小块。

（3）去除磷酸盐缓冲液，用无菌的多层锡箔纸平皿中，加液氮迅速冻结组织，将组织以锡箔纸包裹后，以无菌小锤将其敲碎，反复几次。

（4）加入与敲碎的组织等体积的磷酸盐缓冲液，于冰浴下，用玻璃匀浆器反复匀浆，间或涂片观察至无大的组织。

（5）12000转下离心30分钟，取上清，即得到本发明活性基质胶成品，测定蛋白含量。

实施例2本发明活性基质胶的包被及形态特点

（1）以磷酸盐缓冲液稀释活性基质胶成品至0.1～10%g/mL，4℃过夜或37℃2小时包被培养皿。

（2）弃去多余的基质胶，用磷酸盐缓冲液浸洗2次，待用。

（3）将包被好的培养皿用2.5%多聚甲醛4℃固定24h后，用体积百分比70、75、80、85、90、95和100%的乙醇依次脱水，每个浓度脱水2次，每次15分钟，之后真空干燥。包被于培养皿表面的活性基质胶呈直径为2-5μm的颗粒状排列，其照片如图1b所示，并以如图1a所示的空白培养皿照片作为对比。

实施例3本发明活性基质胶的蛋白质谱分析鉴定

（1）本发明活性基质胶包被培养器皿后，以磷酸盐缓冲液洗两次。用裂解缓冲液（7mol/L尿素、2mol/L曲拉通、2%二甲基氨基-1-丙磺酸、50mmol/L DTT、40mmol/L Tris），包括37℃消化2-4小时。

（2）收集样品，经超声破碎，每次持续30秒，间隔2分钟，共破碎10次。

（3）样品用SDS-聚丙烯酰胺电泳分离，硝酸银染色，根据标准分子量的大小，切取相应的条带。

（4）用胰蛋白酶消化样品，后干燥样品。

（5）加入α-氰基-4-羟基肉桂酸，于MALDI-TOF-MS质谱仪上分析。

（6）结果通过肽指纹图谱用Mascot数据库进行分析，结果参见图2及表1。

表1用MALDI-TOF-MS方法鉴定的基质胶中的蛋白

对如图2a所示的电泳条带中的11条样品进行了分析，图2b为其中一个样品的肽指纹图谱，对这11个样品的图谱进行比对分析，结果证实其中不但包括了纤连蛋白、胶原蛋白等细胞外基质成分，还含有胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子等成分。

实施例4利用本发明活性基质胶进行大鼠骨髓MSCs分离、培养和扩增

（1）大鼠骨髓MSCs分离、培养和扩增

A.选取年老（约2岁）的雄性SD大鼠，采取骨髓，淋巴细胞分离液分离并收集骨髓MSCs。

B.将细胞加到含体积百分比10%胎牛血清的低糖的DMEM（DMEM-L）中，37℃接种培养。

C.细胞培养48小时换液，去除非贴壁细胞，继续培养，3天换液一次。

D.细胞达50～60%融合时，用0.25%g/mL胰蛋白酶-0.02%g/mL EDTA混合水溶液消化3分钟，收集细胞，按1：2传代培养，接种于脐带活性基质胶包被的培养瓶中。

E.细胞达到60～80%融合时，用同步骤D的方法消化收集细胞，按1×10⁴/mL传代，继续培养。

（2）MSCs的年轻化相关的监测指标

A.群体倍增指数（PDs）

MSCs从第一次传代开始定义为培养起始浓度，以2000/cm²密度接种T75培养瓶，融合度达70%传代并计数重复接种同样的细胞数，直到复制性衰老的迹象出现，细胞停止生长。计算PDs的公式为：

PDs=log2(D/D0)，其中D0=接种的细胞数，D=收获的细胞总数。

结果显示，本发明活性基质胶明显提高了细胞的增殖能力，如图3所示。

B.SA-β-gal活性

与衰老相关的β-gal活性直接显示细胞的状态。分别检测了MSCs在10PD、20PD、30PD时SA-β-gal活性，结果如图4所示，SA-β-gal阳性率明显在中晚期下降。

C.向脂肪细胞诱导分化

分别收集消化后的10PD、30PD的MSCs，按2×10⁴/cm²接种于6孔板，待细胞融合达50%以上后，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液，加入脂肪诱导体系（体系为：地塞米松1μmol/L、人胰岛素5mg/L、异丁基甲基黄嘌呤0.5mmol/L、消炎痛100μmol/L），每3天全量换液，维持3周。细胞经油红O染色，镜下观察细胞内脂肪小滴形成情况。采用异丙醇萃取染色的油红O，分光光度计520nm测定OD值定量分析。结果如图5a和b所示，在本发明活性基质胶中培养的MSCs分别在10PD与30PD时的脂肪小滴的形成能力明显比对照组丰富，对其定量结果也显示了明显增高的脂肪形成能力，特别是在30PD，成脂分化能力的提升尤其明显。

D.向成骨细胞诱导分化

分别收集消化后的10PD、30PD的MSCs，按2×10⁴/cm²接种于6孔板，待细胞融合达50%以上后，用含10%FCS的低糖DMEM培养液，加入成骨诱导体系（体系为：地塞米松0.1μmol/L、抗坏血酸50μmol/L、甘油磷酸酯10μmol/L），每3天全量换液，维持3周。细胞经茜素红染色，镜下观察细胞内染色情况。采用10%西吡氯铵萃取染色的茜素红，分光光度计560nm测定OD值定量分析。结果如图5c和d所示，在本发明活性基质胶中培养的MSCs分别在10PD与30PD时的骨的形成能力明显比对照组丰富，对其定量结果也显示了明显增高的能力，特别是在30PD，成骨分化能力的提升尤其明显。

E.免疫印迹检测衰老相关的分子变化

由于MSCs在衰老过程中，相关的信号通路分子也发生明显改变，我们分析了p53、pRb、p16的变化。分别收集10PD、30PD的MSCs，提取总蛋白，电泳后转移蛋白至硝酸纤维素膜上，应用抗体反应后，化学发光法显影特异条带，如图6所示。活体基质胶明显降低了p53、pRb、p16的表达，特别是p16的变化最明显。

Claims

1.一种使衰老间充质干细胞年轻化的活性基质胶，其特征在于，其是通过以下方法制得：

(1)将切除的脐带置于保存液内，所述保存液为含100u的青霉素及100μg的链霉素的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，在4℃下保存直至处理；

(2)在无菌条件下用磷酸盐缓冲液冲洗脐带，以75％乙醇浸泡20秒，取出后分解成小段，去除血管及外膜，剪碎至呈0.5-1.5mm³的小块；

(3)去除磷酸盐缓冲液，置于无菌的铺有多层锡箔纸的平皿中，加入液氮冻结组织，将组织以锡箔纸包裹后敲碎；

(4)加与敲碎的组织等体积的磷酸盐缓冲液，在冰浴下用玻璃匀浆器反复匀浆；

(5)以12000转离心30分钟，取上清，即得到所述活性基质胶成品；

其中，步骤(1)中，所述脐带在4℃下保存不超过24h。

2.如权利要求1所述的活性基质胶，其特征在于，步骤(2)中，所述用磷酸盐缓冲液冲洗脐带为冲洗3次。

3.如权利要求1或2所述的活性基质胶在使衰老间充质干细胞年轻化中的用途，其特征性在于，所述的用途是将来源于动物或人体的由机体的年龄或疾病引起衰老的间充质干细胞体外培养于所述活性基质胶，从而使其年轻化。

4.如权利要求3所述的活性基质胶在使衰老间充质干细胞年轻化中的用途，其特征在于，将所述活性基质胶以磷酸盐缓冲液稀释成0.05-10％g/mL的浓度，于培养容器中37℃下包被2小时，或4℃下包被16-24小时后，用于所述衰老间充质干细胞的体外培养。

5.一种使衰老间充质干细胞年轻化的活性基质胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤如下：

其中，步骤(1)中，所述脐带在4℃下保存不超过24h。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述用磷酸盐缓冲液冲洗脐带为冲洗3次。