BR112020020092A2

BR112020020092A2 - método de induzir ou melhorar propriedades de cicatrização de feridas de células tronco mesenquimais

Info

Publication number: BR112020020092A2
Application number: BR112020020092-1A
Authority: BR
Inventors: Toan Thang Phan; Gavin TAN
Original assignee: Cellresearch Corporation Pte. Ltd.
Priority date: 2018-04-12
Filing date: 2019-04-12
Publication date: 2021-02-17
Also published as: EP3775163A4; JP2021526125A; JP2024069365A; WO2019199234A1; KR20200143399A; EP3775163A1; SG11202009687PA; AU2019250653A1; CA3095490A1; TW202012618A; PH12020551658A1; ZA202005967B; CN112262211A

Abstract

A presente invenção refere-se a um método para induzir ou melhorar as propriedades de cicatrização de feridas de uma população de célu-la-tronco mesenquimal, o método compreendendo a cultura da popula-ção de célula-tronco mesenquimal em um meio de cultura que com-preende DMEM (meio de Eagle modificado de Dulbecco), F12 (Meio F12 de Ham), M171 (meio 171) e FBS (Soro Bovino Fetal). A invenção também se refere a uma população-tronco mesenquimal, em que pelo menos cerca de 90 % ou mais células da população de célula-tronco expressam cada um dos seguintes marcadores: CD73, CD90 e CD105 e não apresentam expressão dos seguintes marcadores: CD34, CD45 e HLA- DR. A invenção também se refere a uma composição farma-cêutica desta população-tronco mesenquimal.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO- DO DE INDUZIR OU MELHORAR PROPRIEDADES DE CICATRI- ZAÇÃO DE FERIDAS DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS".

CAMPO DE INVENÇÃO

[0001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório Norte-americano Nº 62/656.531 depositado em 12 de abril de 2018, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência em sua totalidade para todos os fins.

[0002] A presente invenção refere-se a um método para induzir ou melhorar as propriedades de cicatrização de feridas de uma população de célula-tronco mesenquimal. A invenção também é direcionada a um meio de cultura de células adequado para induzir ou melhorar as pro- priedades de cicatrização de feridas de células-tronco mesenquimais e/ou adequado para isolar uma população de célula-tronco mesenqui- mal. A invenção também é direcionada a uma composição farmacêuti- ca e usos da população de célula-tronco mesenquimal isolada. A in- venção também é direcionada a métodos de tratamento de uma doen- ça ou distúrbio compreendendo a administração de uma população de célula-tronco mesenquimal ou uma composição farmacêutica contendo essa população de célula-tronco mesenquimal da invenção a um indi- víduo em necessidade. A invenção também se refere a uma população de célula-tronco mesenquimal extremamente homogênea e bem defi- nida, por exemplo, do cordão umbilical ou da placenta.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] As células-tronco mesenquimais isoladas da membrana amniótica do cordão umbilical foram relatadas pela primeira vez no pedido de patente Norte-americana 2006/0078993 (levando às paten- tes Norte-americanas 9.085.755, 9.737.568 e 9.844.571) e o pedido de patente internacional correspondente WO2006/019357. Desde então, o tecido do cordão umbilical ganhou atenção como fonte de células multipotentes; devido à sua ampla disponibilidade, o cordão umbilical e, em particular, as células-tronco isoladas da membrana amniótica do cordão umbilical (também chamadas de "células-tronco de revestimen- to do cordão") têm sido consideradas uma excelente fonte alternativa de células para a medicina regenerativa. Veja, Jeschke et al. Umbilical Cord Lining Membrane and Geleia de Wharton-Derived Mesenchymal Stem Cells: the Similarities and Differences; The Open Tissue Engi- neering and Regenerative Medicine Journal, 2011, 4, 21-27.

[0004] Um estudo subsequente comparou o fenótipo, taxa de proli- feração, migração, imunogenicidade e capacidades imunomodulado- ras de células-tronco mesenquimais humanas (MSCs) derivadas da membrana amniótica do cordão umbilical (revestimento do cordão um- bilical (CL-MSCs), sangue do cordão umbilical (CB- MSCs), placenta (P-MSCs) e geléia de Wharton (WJ-MSCs) (Stubbendorf et al, Immu- nological Properties of Extraembryonic Human Mesenchymal Stromal Cells Derived from Gestational Tissue, STEM CELLS AND DEVE- LOPMENT Volume 22, Number 19, 2013, 2619- 2629). Stubbendorf et al concluíram que as populações de MSC derivadas de tecido gestaci- onal extraembrionário apresentam um potencial variado para evitar respostas imunes, bem como exercer efeitos imunomoduladores. Os autores também descobriram que CL-MSCs mostraram o potencial mais promissor para uma terapia baseada em células, pois as células mostraram baixa imunogenicidade, mas também mostraram potencial proliferativo e migratório aumentado, de modo que pesquisas futuras devem se concentrar nos melhores modelos de doença em que C L- MSCs podem ser administrados.

[0005] Embora as células-tronco mesenquimais da membrana amniótica possam ser facilmente obtidas usando o protocolo descrito no pedido de patente Norte-americana 2006/0078993 e no pedido de patente internacional WO2006/019357, seria uma vantagem para os ensaios clínicos com essas MSC de revestimento de cordão ter em mãos um método que permite isolar uma população dessas MSC de revestimento de cordão que é altamente homogênea e pode, portanto, ser usada para ensaios clínicos. Além disso, seria uma vantagem ter em mãos um método que induz ou melhora as propriedades de cicatri- zação de uma população de célula-tronco mesenquimal em geral.

[0006] Consequentemente, é um objetivo da invenção fornecer um método para induzir ou melhorar as propriedades de cicatrização de feridas de uma população de célula-tronco mesenquimal. É também objetivo isolar uma população de célula-tronco mesenquimal da mem- brana amniótica do cordão umbilical que atenda a essa necessidade. É, portanto, também um objetivo da invenção fornecer uma população altamente homogênea de células-tronco mesenquimais.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[0007] Este objetivo é alcançado pelos métodos, a população- tronco mesenquimal, a respectiva composição farmacêutica e meio de cultura de células tendo as características das reivindicações indepen- dentes.

[0008] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece um método para induzir ou melhorar as propriedades de cicatrização de feridas de uma população de célula-tronco mesenquimal, método compreenden- do a cultura da população de célula-tronco mesenquimal em um meio de cultura que compreende DMEM (meio de Eagle modificado de Dul- becco), F12 (Meio F12 de Ham), M171 (meio 171) e FBS (Soro Bovino Fetal). A população de célula-tronco mesenquimal pode ser uma popu- lação de célula-tronco mesenquimal do cordão umbilical, uma popula- ção de célula-tronco mesenquimal da placenta, uma população de cé- lula-tronco mesenquimal do sangue do cordão, uma população de cé- lula-tronco mesenquimal da medula óssea ou um tecido adiposo deri- vado população de célula-tronco mesenquimal.

[0009] Em um segundo aspecto, a invenção fornece uma popula- ção-tronco mesenquimal isolada, em que pelo menos cerca de 90 % ou mais células da população de célula-tronco expressam cada um dos seguintes marcadores: CD73, CD90 e CD105. De preferência, a população-tronco mesenquimal isolada carece de expressão dos se- guintes marcadores: CD34, CD45 e HLA-DR. Em modalidades deste segundo aspecto, pelo menos cerca de 91 % ou mais, cerca de 92 % ou mais, cerca de 93 % ou mais, cerca de 94 % ou mais, cerca de 95 % ou mais, cerca de 96 % ou mais, cerca de 97 % ou mais, cerca de 98 % ou mais cerca de 99 % ou mais células da população de célula- tronco mesenquimal isolada expressam cada uma dentre CD73, CD90 e CD105. Além disso, nessas modalidades do segundo aspecto, pelo menos cerca de 91 % ou mais, cerca de 92 % ou mais, cerca de 93 % ou mais, cerca de 94 % ou mais, cerca de 95 % ou mais, cerca de 96 % ou mais, cerca de 97 % ou mais, cerca de 98 % ou mais cerca de 99 % ou mais células da população de célula-tronco mesenquimal iso- lada, de preferência, não apresentam expressão dos marcadores CD34, CD45 e HLA-DR. A população de célula-tronco mesenquimal pode ser obtida por um método de indução ou melhoria das proprieda- des de cicatrização de feridas do primeiro aspecto. Assim, o método do primeiro aspecto também pode ser um método de isolamento de uma população de célula-tronco mesenquimal.

[0010] Em um terceiro aspecto, a invenção fornece uma composi- ção farmacêutica contendo uma célula de mamífero (o segundo aspec- to) da invenção.

[0011] Em um quarto aspecto, a invenção fornece um método para fazer um meio de cultura para induzir ou melhorar as propriedades de cicatrização de feridas de uma população de célula-tronco mesenqui- mal ou para isolar uma população de célula-tronco mesenquimal, o método compreendendo a mistura para obter um volume final de 500 ml de medio de cultura: i. 250 ml! de DMEM ii. 118 ml de M171 iii. 118 m! de DMEM/F12 iv. 12,5 ml de Soro Bovino Fetal (FBS) para obter uma con- centração final de 2,5 % (v/v).

[0012] Em um quinto aspecto, a invenção fornece um meio de cul- tura de células que pode ser obtido pelo método do quarto aspecto.

[0013] Em um sexto aspecto, a invenção fornece um método para isolar uma população de célula-tronco mesenquimal, compreendendo a cultura da população de célula-tronco mesenquimal no meio de cul- tura preparado pelo método do quarto aspecto.

[0014] Em um sétimo aspecto, a invenção fornece um meio de cul- tura de células que compreende: - DMEM na concentração final de cerca de 55 a 65 % (v/v), - F12 em uma concentração final de cerca de 5a 15% (vv), - M171 em uma concentração final de cerca de 15 a 30 % (vv) e - FBS em uma concentração final de cerca de 1 a 8 % (v/v).

[0015] Em um oitavo aspecto, a invenção fornece o uso de um meio de cultura de células do sétimo aspecto para induzir ou melhorar as propriedades de cicatrização de feridas de uma população de célu- la-tronco mesenquimal ou para isolar a população de célula-tronco mesenquimal.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0016] A invenção será melhor compreendida com referência à descrição detalhada quando considerada em conjunto com os exem- plos não limitantes e os desenhos, nos quais:

[0017] A Fig. 1 mostra a folha de informações técnicas de Lonza para o meio de Eagle modificado de Dulbecco, incluindo o número de catálogo do DMEM usado para a confecção do exemplo ilustrativo de um meio da invenção (PTT-6) na Seção Experimental;

[0018] A Fig. 2 mostra a folha de informações técnicas de Lonza para meio F12 de Ham;

[0019] A Fig. 3 mostra a folha de informações técnicas de Lonza para meio DMEM:F12 (1:1), incluindo o número de catálogo do meio DMEM:F12 (1:1) usado para a confecção do exemplo ilustrativo de um meio da invenção (PTT-6) na Seção Experimental;

[0020] A Fig. 4 mostra a folha de informação técnica da Life Technologies Corporation para o meio M171, incluindo o número de catálogo do meio M171 usado para a preparação do exemplo ilustrati- vo de um meio da invenção (PTT-6) na Seção Experimental;

[0021] A Fig. 5 mostra a lista de ingredientes, incluindo seu forne- cedor comercial e o número de catálogo que foram usados na Seção Experimental para a confecção do meio PTT-6.

[0022] As Figs. 6A-C mostram os resultados de experimentos de citometria de fluxo em que células-tronco mesenquimais isoladas do cordão umbilical foram analisadas quanto à expressão dos marcado- res de células-tronco mesenquimais CD73, CD90 e CD105. Para es- ses experimentos, as células-tronco mesenquimais foram isoladas do tecido do cordão umbilical pela cultura do tecido do cordão umbilical em três meios de ela cultura diferentes, seguido pela subcultura das células-tronco mesenquimais no respectivo meio. Os três seguintes meios de cultura foram usados nestes experimentos: a) 90 % (v/vW/DMEM suplementado com 10 % de FBS (v/v), b) o meio de cultura PTT-A4 descrito no pedido de patente Norte-americana 2008/0248005 e o pedido de patente internacional correspondente WO2007/046775 que consiste em 90 % (v/v) CMRL1066 e 10 % (v/v) de FBS (veja, pa- rágrafo [0183] de WO2007/046775 ec) o meio de cultura da presente invenção PTT-6, cuja composição é aqui descrita. Nesta análise de citometria de fluxo, duas amostras diferentes da população de célula- tronco mesenquimal de revestimento do cordão (CLMC) foram anali- sadas para cada um dos três meios de cultura usados. Os resultados são mostrados na Fig. 6A a Fig.6C.

[0023] Em mais detalhes, a Fig. 6A mostra a porcentagem de cé- lulas-tronco de revestimento do cordão mesenquimal isoladas que ex- pressam os marcadores de células-tronco CD73, CD90 e CD105 após o isolamento do tecido do cordão umbilical e ela cultura em DMEM/10 % de FBS, a Fig. 68B mostra a porcentagem de células-tronco de re- vestimento do cordão mesenquimal isoladas que expressam marcado- res de células-tronco CD73, CD90 e CD105 após o isolamento do te- cido do cordão umbilical e ela cultura em PTT-4 e Fig. 6C mostra a porcentagem de células-tronco de revestimento do cordão mesenqui- mal isoladas que expressam os marcadores de células-tronco CD73, CD90 e CD105 após o isolamento do tecido do cordão umbilical e ela cultura em PTT-6.

[0024] As Figs. 7A-B mostram os resultados de experimentos de citometria de fluxo em que células-tronco mesenquimais isoladas do cordão umbilical foram analisadas quanto à sua expressão de marca- dores de células-tronco (CD73, CD90 e CD105, CD34, CD45 e HLA- DR (Antígeno Leucocitário Humano - relacionado ao antígeno D) que são usados para definir a adequação de células-tronco mesenquimais humanas multipotentes para terapia celular e comparadas à expressão desses marcadores por células-tronco mesenquimais da medula ós- sea. Para este experimento, as células-tronco mesenquimais da mem- brana aminótica do cordão umbilical foram isolados do tecido do cor- dão umbilical por ela cultura do tecido do cordão umbilical no meio de cultura da presente invenção PTT-6 enquanto as células-tronco me- senquimais da medula óssea foram isoladas da medula óssea humana usando um protocolo padrão.

[0025] A Fig. 7A mostra a porcentagem de células-tronco de re- vestimento do cordão mesenquimal isoladas que expressam os mar- cadores de células-tronco CD73, CD90 e CD105 e não apresentam expressão de CD34, CD45 e HLA-DR após o isolamento do tecido do cordão umbilical e ela cultura em meio PTT-6 enquanto a Fig. 7B mos- tra a porcentagem de células-tronco mesenquimais da medula óssea isoladas que expressam CD73, CD90 e CD105 e não apresentam ex- pressão de CD34, CD45 e HLA-DR.

[0026] A Fig. 8 mostra uma configuração das experiências com cavidades cinza escuro, padrões reconstituídos com meio PTT-4 e amostras correspondentes de MSCs cultivadas em PTT-4; Cavidades cinza claro, padrões reconstituídos com meio PTT-6 e amostras cor- respondentes de MSCs cultivadas em PTT-6. As amostras em itálico são sobrenadantes controle que estão sendo testados como parte de testes recorrentes de amostras armazenadas.

[0027] A Fig. 9 mostra a medição singleplex de TGFB1. Como po- de ser visto, as culturas CL-MSC e WJ-MSC produzem mais TGFRB1 quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-A4. Apenas as culturas AT-MSC e BM-MSC produziram quantidades mais ou menos iguais de TGFB1 quando cultivadas em PTT-6 ou PTT-A4. Todas as barras de erro são o desvio padrão das medições em triplica- ta.

[0028] A Fig.10A mostra a medição multiplex de PDGF-AA. Como pode ser visto, as culturas CL-MSC, WJ-MSC, AT-MSC e BM-MSC produzem mais PDGF-AA quando cultivadas em PTT-4 do que quando cultivadas em PTT-6. Todas as barras de erro são o desvio padrão das medições em triplicata.

[0029] A Fig.10B mostra a medição multiplex de VEGF. Como po- de ser visto, as culturas CL-MSC, WJ-MSC, AT-MSC e BM-MSC pro-

duzem mais VEGF quando cultivadas em PTT-6 do que quando culti- vadas em PTT-4. Todas as barras de erro são o desvio padrão das medições em triplicata.

[0030] A Fig. 10C mostra a medição multiplex de Ang-1. Como pode ser visto, as culturas CL-MSC e WJ-MSC produzem muito mais Ang-1 quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-

4. As culturas AT-MSC e BM-MSC essencialmente não produziram qualquer Ang-1. Todas as barras de erro são o desvio padrão das me- dições em triplicata.

[0031] A Fig. 11 mostra a medição multiplex de HGF. Como pode ser visto, as culturas CL-MSC e WJ-MSC produzem muito mais HGF quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-4. As culturas AT-MSC e BM-MSC essencialmente não produziram qualquer HGF. Todas as barras de erro são o desvio padrão das medições em triplicata.

[0032] A Fig. 12 mostra a medição multiplex de PDGF-AA. Como pode ser visto, as culturas CL-MSC e WJ-MSC produzem mais PDGF- AA quando cultivadas em PTT-4 do que quando cultivadas em PTT-6. As culturas AT-MSC e BM-MSC produziram quantidades iguais de PDGF-AA em ambos os meios de cultura. Todas as barras de erro são o desvio padrão das medições em triplicata.

[0033] A Fig. 13A mostra a medição multiplex de VEGF. Como pode ser visto, as culturas CL-MSC, WJ-MSC, AT-MSC e BM-MSC produzem mais VEGF quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-4. Todas as barras de erro são o desvio padrão das medições em triplicata.

[0034] A Fig. 13B mostra a medição multiplex de Ang-1. Como pode ser visto, as culturas CL-MSC e WJ-MSC produzem muito mais Ang-1 quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-

[0035] A Fig. 13C mostra a medição multiplex de HGF. Como po- de ser visto, as culturas CL-MSC e WJ-MSC produzem muito mais HGF quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-

4. As culturas AT-MSC e BM-MSC essencialmente não produziram nenhum HGF. Todas as barras de erro são o desvio padrão das medi- ções em triplicata.

[0036] A Fig. 14 mostra a medição multiplex de bFGF. Como pode ser visto, as culturas CL-MSC e WJ-MSC produzem mais bFGF quan- do cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-4. As cultu- ras AT-MSC e BM-MSC produziram quantidades iguais de bFGF quando cultivadas em PTT-4 e PTT-6. Todas as barras de erro são o desvio padrão das medições em triplicata.

[0037] A Fig. 15 resume a medição de TGFB1 ao longo de 5 expe- riências diferentes (170328, 170804, 170814, 180105, 180226). A in- tensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de TGFR entre os experimentos está representada no gráfico abaixo no lado esquerdo. A MFI para as curvas padrão TGFR obtidas no meio PTT-4 e PTT-6 é mostrada nos gráficos acima. O gráfico abaixo no lado direito mostra que as culturas CL-MSC e WJ-MSC produzem mais TGFB1 quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-4. As culturas de AT-MSC e BM-MSC produziram quantida- des iguais de TGFB1 quando cultivadas em PTT-6 ou PTT-4. Todas as barras de erro são desvios padrão de diferentes medições para os ex- perimentos 170328, 170804, 170814, 180105, 180226.

[0038] A Fig. 16 resume a medição de Ang-1 em 6 experiências diferentes (170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226). A in- tensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de Ang-1 em todos os experimentos é representada no gráfico abaixo no lado esquerdo. A MFI para as curvas padrão Ang-1 obtidas no meio PTT-4 e PTT-6 é mostrada nos gráficos acima. O gráfico abaixo no lado direito mostra que as culturas CL-MSC e WJ-MSC produzem mais Ang-1 quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-4. Apenas as culturas AT-MSC e BM-MSC produziram quantida- des essencialmente iguais de Ang-1 quando cultivadas em PTT-6 ou PTT-4. Todas as barras de erro são desvios padrão de diferentes me- dições para os experimentos 170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226.

[0039] A Fig. 17 resume a medição de PDGF-BB em 6 experiên- cias diferentes (170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226). A intensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas pa- drão de PDGF-BB em todos os experimentos está representada no gráfico abaixo no lado esquerdo. MFI para as curvas padrão de PDGF- BB obtidas no meio PTT-4 e PTT-6 são mostradas nos gráficos acima. Notavelmente, em nenhuma das experiências foi detectado PDGF-BB.

[0040] A Fig. 18 resume a medição de PDGF-AA em 6 experiên- cias diferentes (170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226). A intensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas pa- drão de PDGF-AA entre os experimentos é representada no gráfico abaixo no lado esquerdo. MFI para as curvas padrão de PDGF-AA ob- tidas no meio PTT-4 e PTT-6 são mostradas nos gráficos acima. O gráfico abaixo no lado direito representa que as culturas CL-MSC, AT- MSC e BM-MSC e WJ-MSC produzem ligeiramente mais PDGF-AA quando cultivadas em PTT-4 do que quando cultivadas em PTT-6. To- das as barras de erro são o desvio padrão das medições dos experi- mentos 170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226.

[0041] A Fig. 19 resume a medição de IL-10 em 6 experiências diferentes (170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226). A in- tensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de IL-10 entre os experimentos está representada no gráfico abaixo no lado esquerdo. A MFI para as curvas padrão IL-10 obtidas no meio PTT-4 e PTT-6 é mostrada nos gráficos acima. Notavelmente, em ne- nhum dos experimentos IL-10 foi detectado.

[0042] A Fig. 20 resume a medição de VEGF em 6 experimentos diferentes (170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226). A in- tensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão VEGF entre os experimentos é representada no gráfico abaixo no lado esquerdo. A MFI para as curvas padrão VEGF obtidas no meio PTT-4 e PTT-6 é mostrada nos gráficos acima. O gráfico abaixo no lado direi- to mostra que as culturas CL-MSC, AT-MSC e BM-MSC e WJ-MSC produzem mais VEGF quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-4. Todas as barras de erro são desvios padrão de diferentes medições para os experimentos 170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226.

[0043] A Fig. 21 resume a medição de HGF em 6 experiências di- ferentes (170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226). A inten- sidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de HGF em experimentos é representada no gráfico abaixo no lado es- querdo. A MFI para as curvas padrão de HGF obtidas no meio PTT-4 e PTT-6 é mostrada nos gráficos acima. O gráfico abaixo no lado direito mostra que as culturas CL-MSC e WJ-MSC produzem mais HGF quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-4. Por outro lado, as culturas AT-MSC e BM-MSC não produziram tanto HGF como as outras culturas. Todas as barras de erro são desvios padrão de diferentes medições para os experimentos 170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226.

[0044] Figura 22: Medição de singleplex de TGFRB1. A intensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas TGFB1 padrão entre os experimentos é representada no gráfico do lado esquerdo.

Como pode ser visto o gráfico do lado direito de CL-MSC, WJ-MSC e MSC placentária produzem mais TGFB1 quando cultivado em PTT-6 do que quando cultivado em PTT-4 ou DMEM/F12 (referido apenas como DMEM na Fig. 22).

[0045] Figura 23: Resume a medição de PDGF-BB nos sobrena- dantes analisados de CL-MSC, WJ-MSC e MSC placentária cultivadas em PTT-6, PTT-4 ou DMEM/F12. A intensidade de fluorescência mé- dia (MFI) medida para as curvas padrão de PDGF-BB entre os expe- rimentos é representada no gráfico do lado esquerdo. Notavelmente, em nenhuma das experiências foi detectado PDGF-BB.

[0046] Figura 24: Resume a medição de IL-10 nos sobrenadantes analisados de CL-MSC, WJ-MSC e MSC placentária cultivadas em PTT-6, PTT-4 ou DMEM/F12. A intensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de VEGF entre os experimentos é representada no gráfico do lado esquerdo. S6 denota o padrão mais baixo usado no ensaio. Quaisquer amostras abaixo são consideradas abaixo da detecção. Como pode ser visto no gráfico do lado direito, todas as CL-MSC, WJ-MSC e MSC placentária produzem níveis de- tectáveis de I1L-10 quando cultivadas em PTT-6, enquanto pouca ou nenhuma 1IL-10 foi detectada quando as MSC's foram cultivadas em PTT-4 ou DMEM/F12

[0047] Figura 25: Resume a medição de VEGF nos sobrenadan- tes analisados de CL-MSC, WJ-MSC e MSC placentária cultivadas em PTT-6, PTT-4 ou DMEM/F12. A intensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de VEGF entre os experimentos é representada no gráfico do lado esquerdo. S1 denota o padrão mais alto usado no ensaio. Quaisquer amostras que caiam acima são con- sideradas extrapoladas (muito concentradas). Como pode ser visto no gráfico do lado direito, todas as CL-MSC, WJ-MSC e MSC placentária produzem níveis muito mais elevados de VEGF quando cultivadas em

PTT-6 em comparação com quando as MSC foram cultivadas em PTT- 4 ou DMEM/F12.

[0048] Figura 26: Resume a medição multiplex de bFGF. A inten- sidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de PDGF-AA entre os experimentos está representada no gráfico do lado esquerdo. Como pode ser visto a partir do gráfico no lado direito, CL- MSC e WJ-MSC cultivadas produzem mais bFGF quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-4. Como pode ser visto, todas as CL-MSC, WJ-MSC e MSC placentária produzem níveis muito mais baixos de bFGF quando cultivadas em PTT-6 em comparação com quando as MSC foram cultivadas em PTT-4 ou DMEM/F12.

[0049] Figura 27: Resume a medição de PDGF-AA. A intensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de PDGF- AA entre os experimentos está representada no gráfico do lado es- querdo. S6 denota o padrão mais baixo usado no ensaio. Quaisquer amostras abaixo são consideradas abaixo da detecção. Como pode ser visto, todas as CL-MSC, WJ-MSC e MSC placentárias produzem níveis mais elevados de PDGF-AS quando cultivadas em PTT-6 em comparação com quando as MSC foram cultivadas em PTT-4 ou DMEM/F12.

[0050] Figura 28: Resume a medição de Ang-1. A intensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de Ang-1 en- tre os experimentos é representada no gráfico do lado esquerdo. S1 denota o padrão mais alto usado no ensaio. Quaisquer amostras que caiam acima são consideradas extrapoladas (muito concentradas). O gráfico do lado direito mostra que todas as CL-MSC, WJ-MSC e MSC placentárias produzem níveis muito mais elevados de Ang-1 quando cultivadas em PTT-6 em comparação até quando as MSC foram culti- vadas em PTT-4 ou DMEM/F12.

[0051] Figura 29: Resume a medição de HGF. A intensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de HGF en- tre os experimentos é representada no gráfico do lado esquerdo. O gráfico do lado direito mostra que todas as CL-MSC, WJ-MSC e MSC placentária produzem níveis muito mais elevados de Ang-1 quando cultivadas em PTT-6 em comparação com quando as MSC foram cul- tivadas em PTT-4 ou DMEM/F12.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0052] Como explicado acima, em um primeiro aspecto, a inven- ção é direcionada a um método de induzir ou melhorar as proprieda- des de cicatrização de feridas de uma população de célula-tronco me- senquimal, o método compreendendo a cultura da população de célu- la-tronco mesenquimal em um meio de cultura que compreende DMEM (meio de Eagle modificado de Dulbecco), F12 (meio F12 de Ham), M171 (meio 171) e FBS (Soro Bovino Fetal). Foi surpreenden- temente verificado no presente pedido que usar tal meio tem o efeito de induzir ou melhorar as propriedades de cicatrização de feridas de uma ampla gama de população de célula-tronco mesenquimal, inde- pendentemente do ambiente/compartimento natural da população- tronco mesenquimal. Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que a indução ou melhoria das propriedades de cicatrização de feridas da população de célula-tronco mesenquimal é causada pela capacida- de do meio da presente invenção para aumentar a expressão e/ou se- creção de pelo menos um, dois, três ou todos os quatro de Angiopoie- tina 1 (Ang-1), TGF-B1, VEGF e HGF pela população de célula-tronco mesenquimal. Cf. a Seção Experimental mostrando que a expres- são/secreção de Angiopoietina 1 (Ang-1), TGF-B1, VEGF e HGF por uma população de célula-tronco mesenquimal da membrana amniótica do cordão umbilical é aumentada pela cultura no meio de cultura da presente invenção PTT-6 relativa à cultura de tal população de célula- tronco mesenquimal em um meio (PTT-4) que foi usado no pedido de patente Norte-americana 2008/0248005 e no pedido de patente inter- nacional correspondente WO2007/046775 para o isolamento de uma população célula-tronco mesenquimal da membrana amniótica do cor- dão umbilical que foi mostrado no pedido de patente Norte-americana 2008/0248005 e no pedido de patente internacional WO2007/046775 ter excelentes propriedades de cicatrização de feridas (cf. Exemplos 23-26 de WO 2007/046775 mostrando que tal população de célula- tronco mesenquimal da membrana amniótica do cordão umbilical (UCMC) alivia queimaduras de espessura total (Exemplo 23), feridas de espessura parcial (Exemplo 24), feridas por radiação que não cica- trizam (Exame ple 25), bem como feridas diabéticas que não cicatri- zam e feridas de pés diabéticos que não cicatrizam (Exemplo 26)). Conforme mostrado na seção experimental deste documento, a cultura em um meio compreendendo DMEM (meio de Eagle modificado de Dulbecco), F12 (Meio F12 de Ham), M171 (Meio 171) e FBS (Soro Bo- vino Fetal), aumenta as quantidades de Angiopoietina 1 (Ang-1), TGF- B1, VEGF e/ou HGF não apenas na população de célula-tronco me- senquimal da membrana amniótica do cordão umbilical, mas também em populações de células-tronco mesenquimais de outros comparti- mentos do cordão umbilical, como geléia de Wharton ou de um com- partimento (vizinho), como a placenta. Assim, acredita-se que o pre- sente pedido fornece um ensinamento geralmente aplicável para indu- zir ou melhorar as propriedades de cicatrização de feridas de uma da- da população-tronco mesenquimal cultivando a população de célula- tronco mesenquimal em um meio da invenção, tal como o meio PTT-6.

[0053] Neste contexto, a descoberta da presente invenção de que um aumento combinado na quantidade de Ang-1, TGF-B1, VEGF e/ou HGF que uma população de célula-tronco mesenquimal produz é para melhorar ou melhorar as propriedades de cicatrização de feridas desta população de célula-tronco também se abre para imitar as proprieda-

des de cicatrização de feridas da população de célula-tronco por uma composição/solução que contém três ou quatro de Ang-1, TGF-B1, VEGF ou HGF como as únicas proteínas de cicatrização de feridas.

[0054] Neste contexto, nota-se que o envolvimento das proteínas Angiopoietina 1 (Ang-1), TGF-B1, VEGF e HGF no processo de cicatri- zação de feridas é conhecido da pessoa versada na técnica. Para o envolvimento da Angiopoietina 1 na cicatrização de feridas, veja, por exemplo, Li et al. Stem Cell Research & Therapy 2013, 4: 113 "Mesen- chymal stem cells modified with angiopoietin-1 gene promote wound healing" ou Bitto et al, "Angiopoietin-1 gene transfer improves the im- paired wound healing of the genetically diabetic mice without increas- ing VEGF expression", Clinical Science 14 de maio de 2008, 114 (12) 707-718. No estudo de Li et al, o gene da angiopoietina-1 foi inserido nas células-tronco mesenquimais da medula óssea e os resultados mostraram que "Ang1-MSCs promoveu significativamente a cicatriza- ção de feridas com aumento da regeneração epidérmica e dérmica e aumentou a angiogênese em comparação com MSCs, Ad -Ang1 ou tratamento simulado". Notavelmente, os autores de Li et al/ afirmam que as células-tronco mesenquimais (MSCs) por si só não produzem Ang-1 suficiente e, por esta razão, os autores inseriram o gene Ang1 nas MSC para produzir uma célula geneticamente modificada. Em contraste com o estudo de Li, foi surpreendentemente descoberto no presente pedido que a cultura de células-tronco mesemquimais "natu- rais" em um meio de cultura como PTT-6 fornece condições sob as quais, por exemplo, células-tronco mesenquimais de tecido do cordão umbilical (ou seja, população de célula-tronco mesenquimal que é cul- tivada em PTT-6) produz um nível elevado de Ang-1 e, assim, torna as células-tronco mesenquimais adequadas para a cicatrização de feridas ou para melhorar ainda mais suas propriedades de cicatrização de fe- ridas. Isso significa que a presente invenção fornece a vantagem de que, em vez de modificar geneticamente as hastes mesenquimais de ocorrência natural para induzir propriedades de cicatrização de feridas em células-tronco mesenquimais (que não é apenas que não é apenas trabalhoso, mas também não é uma opção preferida para aplicações terapêuticas devido aos riscos inerentes da terapia genética) as pro- priedades de cicatrização de feridas de células-tronco mesenquimais de ocorrência natural são induzidas ou aumentadas pela cultura "sim- ples" de uma população de célula-tronco mesenquimal no meio de cul- tura da invenção. Essa abordagem é mais fácil, segura e também mais econômica.

[0055] Revertendo para as outras proteínas que, para o envolvi- mento do fator de crescimento de hepatócitos (HGF) na cicatrização de feridas, em particular na cicatrização de feridas crônicas/que não cicatrizam, consulte, por exemplo, Yoshida et al., "Neutralization of Hepatocyte Growth Factor Leads to Retarded CutaneousWound Hea- ling Associated with Decreased Neovascularization and Granulation Tissue Formation" J. Invest. Dermatol. 120:335-343, 2003, Li, Jin-Feng et al. "HGF Accelerates Wound Healing by Promoting the Dedifferen- tiation of Epidermal Cells through B 1-Integrin/ILK Pathway." BioMed Research International 2013 (2013): 470418 ou Conway et al, "Hepatocyte growth factor regulation: An integral part of why wounds become chronic". Wound Rep Reg (2007) 15 683-—692.

[0056] Para o envolvimento do Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) na cicatrização de feridas, em particular na cicatriza- ção de feridas crônicas/que não cicatrizam, veja, por exemplo Froget et al., Eur. Cytokine Netw., Vol. 14, março de 2003, 60-64 ou Bao et al., "The Role of Vascular Endothelial Growth Factor in Wound Heal- ing" J Surg Res. 15 de maio de 2009; 153 (2): 347-358.

[0057] Para o envolvimento do Fator de Transformação de Cres- cimento Beta (incluindo TGF-B1, TGF-B2 e TGF-B3) na cicatrização de feridas, em particular na cicatrização de feridas crônicas/que não cica- trizam, veja, por exemplo, Ramirez et al. "The Role of TGFb Signaling in Wound Epithelialization" Advances In Wound Care, Volume 3, Número 7, 2013, 482-491 ou Pakyari et al., Critical Role of Transform- ing Growth Factor Beta in Different Phases of Wound Healing, Ad- vances in Wound Care, Volume 2, Número 5, 2012, 215-224.

[0058] Neste contexto, é também notado que a presente invenção tem a vantagem adicional surpreendente de que a cultura no meio de cultura da presente invenção fornece o isolamento de uma população de célula-tronco mesenquimal, como uma população de célula-tronco mesenquimal da membrana amniótica do cordão umbilical do qual mais de 90 %, ou mesmo 99 % ou mais das células são positivas para os três marcadores de células-tronco mesenquimais CD73, CD90 e, ao mesmo tempo, essas células-tronco não têm expressão de CD34, CD45 e HLA-DR (veja, a Seção Experimental), o que significa 99 % ou até mais células desta população expressam os marcadores de célu- las-tronco CD73, CD90 e CD105, embora não expressem os marcado- res CD34, CD45 e HLA-DR. Essa população de células extremamente homogênea e bem definida é a candidata ideal para ensaios clínicos e terapias baseadas em células, uma vez que, por exemplo, atendem totalmente aos critérios geralmente aceitos para células-tronco me- senquimais humanas a serem usadas para terapia celular como defi- nido, por exemplo, por Dominici et al, "Minimal criteria for defining mul- tipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellu- lar Therapy position statement", Cytotherapy (2006) Vol. 8, No. 4, 315- 317, Sensebe et al,."Production of mesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices: a, review", Stem Cell Re- search & Therapy 2013, 4:66), Vonk et a/., Stem Cell Research & Therapy (2015) 6:94, ou Kundrotas Acta Medica Lituanica. 2012. Vol.

19. No. 2. P. 75-79. Além disso, usando um biorreator como o Quan-

tum Cell Expansion System, é possível obter um grande número de células-tronco mesenquimais, como 300 a 700 milhões de células- tronco mesenquimais por corrida (veja, também a Seção Experimen- tal). Assim, a presente invenção fornece a vantagem adicional de for- necer as quantidades de células-tronco que são necessárias para apli- cações terapêuticas, tais como seu uso na cicatrização de feridas de uma maneira econômica. Além disso, todos os componentes usados para fazer o meio de cultura da presente invenção estão comercial- mente disponíveis na qualidade GMP. Consequentemente, a presente invenção abre o caminho para a produção de GMP de uma população de célula-tronco mesenquimal altamente homogênea, por exemplo de tecido da placenta ou tecido do cordão umbilical, por exemplo, uma população de célula-tronco mesenquimal da membrana amniótica do cordão umbilical ou um tecido mesenquimal população de célula- tronco de geléia de Wharton.

[0059] A população de célula-tronco mesenquimal que está sendo tornada adequada para a cicatrização de feridas (quer induzindo pro- priedades de cicatrização de feridas em uma população que não tinha propriedades de cicatrização de feridas antes de passar pelo processo de cultura da invenção ou melhorando as propriedades de cicatrização de feridas) pode ser qualquer mesenquimal adequado células-tronco conhecidas na técnica, por exemplo, uma população de célula-tronco adultas ou uma célula-tronco neonatal. A população de célula-tronco mesenquimal O fon pode ser derivado de qualquer tecido ou compar- timento/parte do corpo de mamífero conhecido por conter células- tronco mesenquimais. Em exemplos ilustrativos, a população de célu- la-tronco mesenquimal pode ser uma população de célula-tronco me- senquimal do cordão umbilical (são exemplos de células-tronco neona- tais), uma população de célula-tronco mesenquimal da placenta (tam- bém um exemplo adicional de células-tronco neonatais), uma popula-

ção de célula-tronco mesenquimal população de células da junção cordão-placenta (um outro exemplo de uma população de célula- tronco neonatais), uma população de célula-tronco mesenquimal do sangue do cordão (mais um exemplo de células-tronco neonatais), uma população de célula-tronco mesenquimal da medula óssea (que pode ser uma população de célula-tronco adultas), ou uma população de célula-tronco mesenquimal derivada de tecido adiposo (mais um exemplo de uma população de célula-tronco adultas).

[0060] A população de célula-tronco mesenquimal do cordão umbi- lical pode ser (derivada) de qualquer compartimento do tecido do cor- dão umbilical que contenha células-tronco mesenquimais. A população de célula-tronco mesenquimal pode ser uma população de célula- tronco mesenquimal do âmnio (AM), uma população de célula-tronco mesenquimal perivascular (PV), uma população de célula-tronco me- senquimal de geléia de Wharton (WJ), uma população de célula-tronco mesenquimal da membrana amniótica do cordão umbilical, mas tam- bém uma população mista de células-tronco mesenquimais do cordão umbilical (MC), o que significa uma população de célula-tronco me- senquimal que inclui células-tronco de dois ou mais desses comparti- mentos. As células-tronco mesenquimais desses compartimentos e o isolamento das mesmas são conhecidos dos versados na técnica e são descritos, por exemplo, por Subramanian et al "Comparative Cha- racterization of Cells from the Various Compartments of the Human Umbilical Cord Shows that the Geleia de Wharton Compartment Provi- des the Best Source of Clinically Utilizable Mesenchymal Stem Cells", PLoS ONE 10(6): e0127992, 2015 e as referências aí citadas, Van Pham et al. "Isolation and proliferation of umbilical cord tissue derived mesenchymal stem cells for clinical applications", Cell Tissue Bank (2016) 17:289-302, 2016. Uma população mista de células-tronco me- senquimais do cordão umbilical pode, por exemplo, ser obtida pela remoção as artérias e veias do tecido do cordão umbilical, cortando o tecido remanescente e a geleia de Wharton em pedaços e cultivando o tecido do cordão umbilical (por explante de tecido) no meio de cultura da presente invenção. Uma população mista de células-tronco mesen- quimais do cordão umbilical também pode ser obtida através da cultu- ra de todo o tecido do cordão umbilical com vasos umbilicais intactos como explante de tecido sob as condições (cultura em DMEM suple- mentado com soro com 10 % de soro bovino fetal, 10 % de soro de cavalo e 1 % Penicilina/Estreptomicina) conforme descrito por Schugar et al. "High harvest yield, high expansion, and phenotype stability of CD146 mesenchymal stromal cells from whole primitive human umbili- cal cord tissue. Journal of biomedicine & biotechnology. 2009; 2009: 789526". Nesse contexto, nota-se que uma população de célula-tronco mesenquimal da junção cordão-placenta pode ser isolada conforme descrito por Beeravolu et al. "Isolation and Characterization of Mesen- chymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta." J Vis Exp. 2017; (122): 55224.

[0061] De acordo com o acima, observa-se aqui que a população de célula-tronco mesenquimal que é cultivada na presente invenção em um meio de cultura que compreende DMEM (meio de Eagle modi- ficado por Dulbecco), F12 (Meio F12 de Ham), M171 (Meio 171) e FBS (Soro Bovino Fetal) para induzir ou melhorar suas propriedades de ci- catrização de feridas pode ser isolado de seu ambiente natural antes da cultura no meio de cultura da presente invenção. Tal abordagem é usada em particular para a população de célula-tronco mesenquimal que não podem ser facilmente isoladas por explante de tecido, como uma população de célula-tronco mesenquimal do sangue do cordão ou uma população de célula-tronco mesenquimal da medula óssea. No entanto, esta abordagem também pode ser adotada para uma popula- ção de célula-tronco mesenquimal do cordão umbilical, uma população de célula-tronco mesenquimal da placenta ou uma população de célu- la-tronco mesenquimal derivada de tecido adiposo.

Tal população de célula-tronco, digamos que uma população de célula-tronco mesen- quimal de geleia de Wharton pode ser isolada primeiro conforme des- crito acima por Subramanian et al, 2015, PLoS ONE, supra ou pedido de patente internacional WO 2004/072273 "Progenitor Cells From Wharton's Jelly Of Human Umbilical Cord" e, em seguida, ser submeti- do à cultura da população de célula-tronco mesenquimal isolada no meio de cultura da presente invenção que compreende DMEM (meio de Eagle modificado de Dulbecco), F12 (Meio F12 de Ham), M171 (Meio 171) e FBS (Soro Bovino Fetal). Além disso, uma população de célula-tronco mesenquimal da placenta pode ser isolada da placenta, conforme descrito no pedido de patente europeia EP1 288 293, Tal- wadekar et al, "Cultivation and Cryopreservation of Cord Tissue MSCs with Cord Blood AB Plasma" Biomed Res J 2014; 1 (2): 126-136, Tal- wadekar et al, "Placenta-derived mesenchymal stem cells possess bet- ter immunoregulatory properties compared to their cord-derived coun- terparts - a paired sample study" Scientific Reports 5:15784 (2015), ou Beeravolu et al. "Isolation and Characterization of Mesenchymal Stro- mal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta." J Vis Exp. 2017; (122): 55224, por exemplo, e subsequentemente cultivado no meio de cultura da presente invenção.

Da mesma forma, uma popula- ção de célula-tronco mesenquimal derivada de tecido adiposo pode ser isolada conforme descrito por Schneider et al, "Adipose-derived mesenchymal stem cells from liposuction and resected fat are feasible sources for regenerative medicine" Eur J Med Res. 2017; 22: 17 como as referências aí citadas e subsequentemente cultivadas no meio de cultura da presente invenção (cf, também a Seção Experimental). Co- mo outro exemplo ilustrativo, também uma população de célula-tronco mesenquimal da junção cordão-placenta pode primeiro ser isolada conforme descrito por Beeravolu et al. "Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta." J Vis Exp. 2017; (122): 55224 e subsequentemente cultiva- do no meio de cultura da presente invenção.

[0062] Alternativamente, e em particular para células-tronco me- senquimais que podem ser isoladas por meio de explantes de tecido, a população de célula-tronco mesenquimal pode ser isolada diretamente de seu ambiente de tecido natural cultivando o tecido natural no meio de cultura de células da invenção. Tal metodologia é particularmente adequada para a cultura de populações de células-tronco mesenqui- mais de tecido do cordão umbilical, tecido da placenta (o tecido da placenta pode, por exemplo, compreender ou ser a membrana amnió- tica da placenta) ou da junção cordão-placenta.

[0063] Neste contexto, observa-se que o meio de cultura da pre- sente invenção, portanto, também permite o isolamento de uma popu- lação de célula-tronco mesenquimal (também referidas como "células- tronco mesenquimais") de seu ambiente natural. Consequentemente, o meio de cultura da presente invenção também isola uma população de célula-tronco mesenquimal sob condições que permitem a proliferação celular das células-tronco mesenquimais/progenitoras sem diferencia- ção das células-tronco mesenquimais/progenitoras.

[0064] Em uma modalidade, o meio de cultura da presente inven- ção permite o isolamento da população de célula-tronco mesenquimal da membrana amniótica sob condições que permitem a proliferação celular das células-tronco mesenquimais/progenitoras sem diferencia- ção das células-tronco mesenquimais/progenitoras. Assim, após o iso- lamento das células-tronco mesenquimais da membrana amnrniótica, como aqui descrito, a população de célula-tronco mesenqui- mal/progenitoras isoladas tem a capacidade de se diferenciar em vá- rios tipos de células, conforme descrito no pedido de patente Norte-

americana 2006/0078993, patente Norte-americana 9.085.755, pedido de patente internacional WOZ2006/019357, patente Norte-americana

8.287.854 ou WO2007/046775, por exemplo. Conforme descrito no pedido de patente Norte-americana 2006/0078993, por exemplo, as células-tronco mesenquimais da membrana amniótica do cordão umbi- lical têm um formato de fuso, expressam os seguintes genes: POU5f1, Bmi-1, fator inibidor de leucemia (LIF) e secretam Activina A e folistati- na. As células-tronco mesenquimais isoladas na presente invenção podem, por exemplo, ser diferenciadas em qualquer tipo de célula me- senquimal, como, mas não se limitando a, fibroblastos da pele, con- drócitos, osteoblastos, tenócitos, fibroblastos de ligamento, cardiomió- citos, células do músculo liso, células do músculo esquelético, adipóci- tos, células produtoras de mucina, células derivadas de glândulas en- dócrinas, como células produtoras de insulina (por exemplo, células de ilhotas B) ou células neurectodérmicas. As células-tronco isoladas na presente invenção podem ser diferenciadas in vitro para, subsequen- temente, usar a célula diferenciada para fins médicos. Um exemplo ilustrativo de tal abordagem é a diferenciação das células-tronco me- senquimais em células de ilhotas B produtoras de insulina que podem então ser administradas, por exemplo, por implante, a um paciente que sofre de deficiência de insulina, como diabetes melito (cf. também WOZ2007/046775 a este respeito). Alternativamente, as células-tronco mesenquimais da invenção podem ser usadas em seu estado indife- renciado para terapia baseada em células, por exemplo, para fins de cicatrização de feridas, tais como tratamento de queimaduras ou feri- das diabéticas crônicas. Nessas aplicações terapêuticas, as células- tronco mesenquimais da invenção podem servir para promover a cica- trização de feridas interagindo com o tecido doente circundante ou também podem se diferenciar em uma célula de pele respectiva (cf., novamente, WO2007/046775, por exemplo).

[0065] De acordo com a descrição acima, observa-se aqui que tal população de célula-tronco mesenquimal aqui descrita pode ser isola- da e cultivada (ou seja, são derivada) de qualquer tecido do cordão umbilical, desde que o tecido do cordão umbilical contenha a membra- na amniótica (que também é referido como "revestimento do cordão"). Assim, a população mesenquimal pode ser isolada de (pedaços de) todo o cordão umbilical, conforme descrito na seção Experimental do presente pedido.

Esse tecido do cordão umbical pode, portanto, con- ter, além da membrana amniótica, qualquer outro tecido/componente do cordão umbilical.

Conforme mostrado, por exemplo, na Figura 16 do pedido de patente Norte-americana 2006/0078993 ou pedido de patente internacional WO2006/019357, a membrana amniótica do cor- dão umbilical é a parte mais externa do cordão umbilical, cobrindo o cordão.

Além disso, o cordão umbilical contém uma veia (que transpor- ta sangue oxigenado e rico em nutrientes para o feto) e duas artérias (que transportam sangue desoxigenado e pobre em nutrientes para longe do feto). Para proteção e suporte mecânico, esses três vasos sanguíneos são incorporados à geléia de Wharton, uma substância gelatinosa feita em grande parte de mucopolissacarídeos.

Consequen- temente, o tecido do cordão umbilical utilizado na presente invenção também pode compreender esta veia, as duas artérias e a geleia de Wharton.

O uso de uma seção inteira (intacta) do cordão umbilical tem a vantagem de que a membrana amniótica não precisa ser separada dos outros componentes do cordão umbilical.

Isso reduz as etapas de isolamento e, assim, torna o método da presente invenção, mais sim- ples, rápido, menos sujeito a erros e mais econômico - que são todos aspectos importantes para a produção de GMP que é necessária para a aplicação terapêutica das células-tronco mesenquimais.

O isolamen- to das células-tronco mesenquimais pode, portanto, começar por ex- plante de tecido, que pode ser seguido por subcultura (cultura) das cé-

lulas-tronco mesenquimais isoladas se maiores quantidades de célu- las-tronco mesenquimais forem desejadas, por exemplo, para uso em ensaios clínicos. Alternativamente, também é possível separar primei- ro a membrana amniótica dos outros componentes do cordão umbilical e isolar as células-tronco de revestimento do cordão mesenquimal da membrana amniótica por cultura da membrana amniótica em um meio de cultura da presente invenção. Esta cultura também pode ser reali- zada por explante de tecido, opcionalmente seguido por subcultura das células-tronco mesenquimais isoladas.

[0066] Neste contexto, o termo "explante de tecido" ou "método de explante de tecido" é usado em seu significado normal na técnica para se referir a um método no qual um tecido (por exemplo, tecido da pla- centa ou tecido do cordão umbilical), uma vez sendo colhido, ou um pedaço do tecido está sendo colocado em uma placa de cultura de cé- lulas contendo meio de cultura (crescimento) e, ao longo do tempo, as células-tronco migram do tecido para a superfície da placa. Essas cé- lulas-tronco primárias podem então ser expandidas e transferidas para pratos frescos por meio de micropropagação (subcultura), como tam- bém descrito aqui. Neste contexto, nota-se que, em termos de produ- ção das células para fins terapêuticos, na primeira etapa de isolamen- to/obtenção de uma população de célula-tronco mesenquimal da pre- sente invenção, por exemplo, células-tronco mesenquimais de cordão umbilical, como membrana amniótica ou células tronco mesenquimais de geléia de Wharton, um banco de células mestre das células-tronco mesenquimais isoladas, é obtido, enquanto na subcultura subsequente um banco de células de trabalho pode ser obtido. Se uma população de célula-tronco mesenquimal da invenção (em particular uma popula- ção de célula-tronco mesenquimal das quais pelo menos cerca de 97 % ou mais, 98 % ou mais ou 99 % ou mais das células expressam ca- da um dos marcadores CD73, CD90 e CD105 e ausência de expres-

são de cada um dos marcadores: CD34, CD45 e HLA-DR) é usado para ensaios clínicos ou como um terapêutico aprovado, uma popula- ção de células do banco de células de trabalho será tipicamente usada para este propósito. Tanto a população de célula-tronco da etapa de isolamento (que pode constituir o banco de células mestre) e a popu- lação de célula-tronco da etapa de subcultura (que pode constituir o banco de células de trabalho) podem, por exemplo, ser armazenadas na forma criopreservada.

[0067] Como mencionado acima, o presente método de induzir ou melhorar as propriedades de cicatrização de feridas da população de células mesenquimais (e, opcionalmente, ao mesmo tempo de isola- mento de células-tronco mesenquimais de um tecido como a geleia de Wharton ou a membrana amniótica do cordão umbilical) tem a vanta- gem que todos os componentes usados no meio de cultura da inven- ção estão disponíveis com qualidade GMP e, assim, fornecem a pos- sibilidade de isolar as células-tronco mesenquimais sob condições GMP para administração terapêutica subsequente.

[0068] Por "induzir ou melhorar as propriedades de cicatrização de feridas de uma população de célula-tronco mesenquimal" entende-se aqui a capacidade do meio de cultura para aumentar ou iniciar (induzir) a expressão e/ou secreção de pelo menos uma das proteínas Ang-1, TGF- B1, VEGF e HGF pela população de célula-tronco mesenquimal. Como explicado acima, o envolvimento de todas essas quatro proteí- nas na cicatrização de feridas é conhecido. "Induzir ou melhorar as propriedades de cicatrização de feridas" é avaliada em relação à cultu- ra da população de célula-tronco mesenquimal em uma referência (cultiva o meio PTT-4 (que consiste em 90 % (v/v) CMRL1066 e 10 % (v/v) FBS) que foi usado no pedido de patente Norte-americana 2008/0248005 e no pedido de patente internacional correspondente WOZ2007/046775 para o isolamento e cultura de uma população de célula-tronco mesenquimal da membrana amniótica do cordão umbilical que foi mostrado no pedido de patente Norte-americana 2008/0248005 e no pedido de patente internacional WO2007/046775 como tendo exce- lentes propriedades de cicatrização de feridas.

No caso, a população de célula-tronco mesenquimal secretará uma quantidade maior (cor- respondendo a um nível de secreção mais alto ou uma concentração mais alta) de pelo menos uma das quatro proteínas marcadoras Ang- 1, TGF-B1, VEGF e HGF no sobrenadante/meio de cultura, quando cultivado em um meio de cultura da invenção em comparação com a cultura da população de célula-tronco mesenquimal no meio de refe- rência, então as propriedades de cicatrização de feridas da população de célula-tronco mesenquimal são aumentadas.

No caso, nenhuma secreção (detectável) de nenhuma dessas quatro proteínas marcado- ras pela população de célula-tronco mesenquimal é observada durante a cultura no meio de referência, enquanto a secreção detectável de pelo menos um dos quatro marcadores é observada durante ou após a cultura do tronco mesenquimal população de células no meio de cultu- ra da invenção, então as propriedades de cicatrização de feridas da população de célula-tronco são induzidas.

As propriedades de cicatri- zação de feridas da população de célula-tronco mesenquimal também são melhoradas quando a expressão ou secreção de pelo menos dois ou de pelo menos três ou de todas as quatro proteínas marcadoras Ang-1, TGF-B1, VEGF e HGF é aumentada em relação à cultura da população de célula-tronco no meio de referência.

A secreção das quatro proteínas marcadoras no meio de cultura (e, portanto, a produ- ção desses fatores pela população de célula-tronco) pode ser medi- da/determinada com qualquer método adequado, por exemplo, medin- do a quantidade de proteína por meio de anticorpos disponíveis co- mercialmente/imunoensaios (cf, a Seção Experimental). Essas medi- ções podem ser feitas de forma automatizada, utilizando, por exemplo,

um sistema como o sistema FLEXMAP 3D (Luminex Corporation, Aus- tin, Texas, USA).

[0069] Por "DMEM" entende-se o meio de Eagle modificado de Dulbecco que foi desenvolvido em 1969 e é uma modificação do meio de Eagle basal (BME) (cf. Fig.1 mostrando a planilha de dados de DMEM disponível na Lonza). A fórmula de DMEM original contém 1000 mg/L de glicose e foi relatada pela primeira vez para a cultura de células embrionárias de camundongo. DMEM desde então se tornou um meio padrão para cultura de células que está disponível comerci- almente em várias fontes, como ThermoFisher Scientific (número de catálogo 11965-084), Sigma Aldrich (número de catálogo D5546) ou Lonza, para citar apenas alguns fornecedores. Assim, qualquer DMEM disponível comercialmente pode ser usado na presente invenção. Em modalidades preferidas, o DMEM usado aqui é o meio DMEM disponí- vel na Lonza sob o número de catálogo 12-604F. Este meio é DMEM suplementado com 4,5 g/L de glicose e L-glutamina). Em outra moda- lidade preferida, o DMEM aqui utilizado é o meio DMEM do número de catálogo D5546 da Sigma Aldrich que contém 1000 mg/L de glicose e bicarbonato de sódio mas não tem L-glutamina.

[0070] Por meio "F12" entende-se o meio F12 de Ham. Este meio também é um meio de cultura de células padrão e é uma mistura de nutrientes inicialmente projetada para cultivar uma ampla variedade de células de mamíferos e de hibridoma quando usado com soro em combinação com hormônios e transferrina (cf. Fig. 2, mostrando a fo- lha de dados de meio F12 de Ham de Lonza). Qualquer meio F12 de Ham disponível comercialmente (por exemplo, da ThermoFisher Sci- entific (número de catálogo 11765-054), Sigma Aldrich (número de ca- tálogo N4888) ou Lonza, para apenas alguns novos fornecedores) po- de ser usado na presente invenção. Em modalidades preferidas, o meio F12 de Ham da Lonza é usado.

[0071] Por "DMEM/F12" ou "DMEM:F12" entende-se uma mistura 1:1 de DMEM com meio de cultura F12 de Ham (cf. Fig. 3 mostrando a planilha de dados para meio DMEM:F12 (1:1) de Lonza). Além disso, o meio DMEM/F12 (1:1) é um meio basal amplamente utilizado para apoiar o crescimento de muitas células diferentes de mamíferos e está disponível comercialmente em vários fornecedores, como ThermoFis- her Scientific (número de catálogo 11330057), Sigma Aldrich (número de catálogo D6421) ou Lonza. Qualquer meio DMEM:F12 disponível comercialmente pode ser usado na presente invenção. Em modalida- des preferidas, o meio DMEM:F12 usado aqui é o meio DMEM/F12 (1:1) disponível na Lonza sob o número de catálogo 12-719F (que é DMEM:F12 com L-glutamina, HEPES 15 mM e 3,151 g/Glicose L).

[0072] Por "M171" entende-se o meio de cultura 171, que foi de- senvolvido como meio basal para a cultura ou para o crescimento de células epiteliais mamárias humanas normais (cf. Fig. 4 mostrando a folha de dados para o meio M171 da Life Technologies Corporation). Além disso, este meio basal é amplamente utilizado e está comercial- mente disponível em fornecedores como ThermoFisher Scientific ou Life Technologies Corporation (número de catálogo M171500), por exemplo. Qualquer meio M171 disponível comercialmente pode ser usado na presente invenção. Em modalidades preferidas, o meio M171 usado aqui é o meio M171 disponível na Life Technologies Cor- poration sob o número de catálogo M171500.

[0073] Por "FBS" entende-se soro bovino fetal (que também é re- ferido como "soro de bezerro fetal"), ou seja, a fração de sangue que permanece após a coagulação natural do sangue, seguida por centri- fugação para remover quaisquer glóbulos vermelhos remanescentes. O soro bovino fetal é o soro-suplemento mais amplamente usado para cultura de células in vitro de células eucarióticas porque tem um nível muito baixo de anticorpos e contém mais fatores de crescimento, per-

mitindo versatilidade em muitas aplicações de cultura de células dife- rentes. a FBS é preferencialmente obtido de um membro da Internati- onal Serum Industry Association (ISIA), cujo foco principal é a segu- rança e o uso seguro de soro e produtos derivados de animais por meio de rastreabilidade de origem adequada, veracidade na rotulagem e padronização e supervisão apropriadas. Os fornecedores da FBS que são membros do ISIA incluem Abattoir Basics Company, Animal Technologies Inc., Biomin Biotechnologia LTDA, GE Healthcare, Gibco por Thermo Fisher Scientific e Life Science Production, para mencio- nar apenas alguns. Em modalidades atualmente preferidas, a FBS é obtido da GE Healthcare sob o número de catálogo A15-151.

[0074] Voltando agora ao meio de cultura da presente invenção, o meio de cultura pode compreender para induzir ou melhorar as propri- edades de cicatrização de feridas ou para o isolamento ou cultura das células-tronco mesenquimais DMEM em uma concentração final de cerca de 55 a 65 % (v/v), F12 em uma concentração final de cerca de a 15 % (v/v), M171 em uma concentração final de cerca de 15 a 30 % (v/v) e FBS em uma concentração final de cerca de 1 a 8 % (v/v). O valor de " % (v/v)", quando aqui usado, refere-se ao volume do com- ponente individual em relação ao volume final do meio de cultura. Isto significa que se DMEM estiver, por exemplo, presente no meio de cul- tura em uma concentração final de cerca de 55 a 65 % (v/v), 1 litro de meio de cultura contém cerca de 550 a 650 ml de DMEM.

[0075] Em outras modalidades, o meio de cultura pode compreen- der DMEM em uma concentração final de cerca de 57,5 a 62,5 % (v/v), F12 em uma concentração final de cerca de 7,5 a 12,5 % (v/v), M171 em uma concentração final de cerca de 17,5 a 25,0 % (v/v) e FBS em uma concentração final de cerca de 1,75 a 3,5 % (v/v). Em outras mo- dalidades, o meio de cultura pode compreender DMEM em uma con- centração final de cerca de 61,8 % (v/v), F12 em uma concentração final de cerca de 11,8 % (v/v), M171 em uma concentração final de cerca de 23,6 % (v/v) e FBS em uma concentração final de cerca de 2,5 % (v/v).

[0076] Além dos componentes mencionados acima, o meio de cul- tura pode compreender suplementos que são vantajosos para a cultu- ra das células-tronco de revestimento do cordão mesenquimal. O meio de cultura da presente invenção pode, por exemplo, compreender Fa- tor de Crescimento Epidérmico (EGF). Se presente, o EGF pode estar presente no meio de cultura em uma concentração final de cerca de 1 ng/ml a cerca de 20 ng/ml. Em algumas dessas modalidades, o meio de cultura pode compreender EGF em uma concentração final de cer- ca de 10 ng/mL.

[0077] O meio de cultura da presente invenção também pode compreender insulina. Se presente, a insulina pode estar presente em uma concentração final de cerca de 1 ug/ml a 10 pg/ml. Em algumas dessas modalidades, o meio de cultura pode compreender Insulina em uma concentração final de cerca de 5 ug/ml.

[0078] O meio de cultura pode ainda compreender pelo menos um dos seguintes suplementos: adenina, hidrocortisona e sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo-L-tironina (T3). Em tais modalidades, o meio de cultura pode compreender todos os três dentre adenina, hidrocortisona e sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo-L-tironina (T3). Nessas modalidades, o meio de cultura pode compreender adenina em uma concentração final de cerca de 0,05 a cerca de 0,1 ug/ml de adenina, hidrocortisona em uma concentração final de cerca de 1 a cerca de 10 pg/ml de hidrocortisona e/ou 3,3',5- Sal de sódio de tri-iodo-L-tironina (T3) em uma concentra- ção final de cerca de 0,5 a cerca de 5 ng/ml.

[0079] Em uma modalidade do método da invenção, o tecido, co- mo o tecido do cordão umbilical ou da placenta, pode ser cultivado até que um número adequado de células-tronco mesenquimais (primá-

rias), como células-tronco de revestimento do cordão, geléia de Whar- ton ou células-tronco da placenta tenham crescido a partir de tecido. Em modalidades típicas, o tecido do cordão umbilical é cultivado até que o crescimento celular das células-tronco mesenquimais do respec- tivo tecido atinja cerca de 70 a cerca de 80 % de confluência. Observa- se aqui que o termo "confluência" ou "confluência" é usado em seu significado regular na técnica de cultura de células e se destina a uma estimativa/indicador do número de células aderentes em um prato de cultura ou frasco, referindo-se a a proporção da superfície que é co- berta por células. Por exemplo, 50 por cento de confluência significa que cerca de metade da superfície está coberta e ainda há espaço pa- ra o crescimento das células. 100 por cento de confluência significa que a superfície está completamente coberta pelas células, e não há mais espaço para as células crescerem como uma monocamada.

[0080] Uma vez que um número adequado de células primárias (células-tronco mesenquimais) foi obtido do respectivo tecido por ex- plante de tecido, as células-tronco mesenquimais são removidas do recipiente de cultura usado para a cultura. Fazendo isso, um banco de células mestre contendo as células-tronco mesenquimais isoladas (primárias), por exemplo, do cordão umbilical ou da placeta, pode ser ob- tido. Normalmente, uma vez que tais células-tronco mesenquimais são células aderentes, a coleta das células é realizada usando tratamento enzimático padrão. Por exemplo, o tratamento enzimático pode compre- ender a tripsinação, conforme descrito no pedido de patente internacional US 2006/0078993, pedido de patente internacional WO2006/019357 ou pedido de patente internacional WO2007/046775, o que significa que as células em crescimento podem ser colhidas por tripsinização (0,125 % de tripsina/0,05 % de EDTA) para expansão futura. Se as células- tronco mesenquimais colhidas forem, por exemplo, usadas para gerar um banco de células mestre, as células também podem ser criopre-

servadas e armazenadas para uso posterior, conforme explicado abai- xo.

[0081] Depois de colhidas, as células-tronco mesenquimais podem ser transferidas para um recipiente de cultura para subcultura. A sub- cultura ou cultura (ambos os termos são usados intercambiáveis a se- guir) também serão realizadas se uma população de célula-tronco me- senquimal for usada que tenha sido isolada de seu ambiente natural anteriormente (como explicado acima, tais células-tronco isoladas usadas no método da invenção pode ser do sangue do cordão umbili- cal, medula óssea ou tecido adiposo, mas também do cordão umbilical ou tecido placentário). A subcultura também pode ser iniciada a partir de células primárias congeladas, isto é, a partir do banco de células mestre. Para a subcultura, qualquer quantidade adequada de células pode ser semeada em um recipiente de cultura, como uma placa de cultura de células. As células mesenquimais podem, para este propósi- to, ser suspensas em um meio adequado (mais convenientemente, o meio de cultura da presente invenção) para subcultura a uma concen- tração de, por exemplo, cerca de 0,5 x 10º células/ml a cerca de 5,0 x 10º células/ml. Em uma modalidade, as células são suspensas para subcultura a uma concentração de cerca de 1,0 x 10º células/ml. À subcultura pode ser realizada por cultura em frascos de cultura sim- ples, mas também, por exemplo, em um sistema de multicamadas, como CellStacks (Corning, Corning, NY, USA) ou Cellfactory (Nunc, parte da Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) que podem ser empilhados em incubadoras. Alternativamente, a subcultura tam- bém pode ser realizada em um sistema fechado independente, como um biorreator. Diferentes designs de biorreatores são conhecidos pe- los versados na técnica, por exemplo, biorreatores de placa paralela, fibra oca ou microfluídica. Veja, por exemplo, Sensebe et al. "Produc- tion of mesenchymal stromal/stem cells according to good manufactur-

ing practices: a review", supra. Um exemplo ilustrativo de um biorreator de fibra oca disponível comercialmente é o QuantumO Cell Expansion System (Terumo BCT, Inc). que tem sido, por exemplo, usado para a expansão de células-tronco mesenquimais da medula óssea para en- saios clínicos (cf. Hanley et a/, Efficient Manufacturing of Therapeutic Mesenchymal Stromal Cells Using the Quantum Cell Expansion Sys- tem, Cytotherapy. 2014 August; 16 (8): 1048-1058). Outro exemplo de biorreatores comercialmente disponíveis que podem ser usados para a subcultura da população de célula-tronco mesenquimal da presente invenção é o Xuri Cell Expansion System disponível na GE Heathcare. A cultura da população de célula-tronco mesenquimal em um sistema automatizado como o QuantumO Cell Expansion System é particular- mente benéfico se um banco de células de trabalho para aplicação te- rapêutica for produzido sob condições de GMP e um alto número de células for desejado.

[0082] A subcultura das células-tronco mesenquimais da invenção ocorre em um meio de cultura da presente invenção. Por conseguinte, o meio de cultura da presente invenção pode ser usado para o isola- mento da população de célula-tronco mesenquimal, por exemplo, da membrana amniótica da placenta, ou da membrana amniótica ou da geleia de cordão umbilical de Wharton e a cultura subsequente das células primárias isoladas por subcultura. Também para a subcultura, as células-tronco mesenquimais podem ser cultivadas até que uma quantidade adequada de células tenha crescido. Em modalidades ilus- trativas, as células-tronco mesenquimais são subcultivadas até que as células-tronco mesenquimais atinjam cerca de 70 a cerca de 80 % de confluência.

[0083] O isolamento/cultura da população de célula-tronco mesen- quimal pode ser realizado em condições padrão para a cultura de célu- las de mamíferos. Normalmente, o método da invenção de isolamento da população de célula-tronco mesenquimal é tipicamente realizado em condições (temperatura, atmosfera) que são normalmente usadas para a cultura de células das espécies das quais as células são deri- vadas. Por exemplo, tecido do cordão umbilical humano e as células- tronco de revestimento do cordão mesenquimal, respectivamente, são geralmente cultivados a 37 ºC em atmosfera normal com 5 % de CO,. Neste contexto, é notado que na presente invenção a população de células mesenquimais pode ser derivada de qualquer espécie de ma- mífero, como camundongo, rato, porquinho da índia, porco, coelho, cabra, cavalo, cachorro, gato, ovelha, macaco ou humano, com célu- las-tronco mesenquimais de origem humana sendo preferidas em uma modalidade.

[0084] Uma vez que um número desejado/adequado de células- tronco mesenquimais foi obtido da cultura ou subcultura, as células- tronco mesenquimais são colhidas removendo-as do recipiente de cul- tura usado para a subcultura. A colheita das células-tronco mesenqui- mais é normalmente realizada novamente por tratamento enzimático, incluindo a tripsinação das células. As células-tronco mesenquimais isoladas são subsequentemente coletadas e podem ser usadas dire- tamente ou preservadas para uso posterior. Normalmente, a preserva- ção é realizada por criopreservação. O termo "criopreservação" é usa- do neste documento em seu significado regular para descrever um processo onde as células-tronco mesenquimais são preservadas por resfriamento a baixas temperaturas abaixo de zero, como (tipicamen- te) -80 ºC ou -196 ºC (o ponto de ebulição do nitrogênio líquido). A cri- opreservação pode ser realizada conforme conhecido pelos versados na técnica e pode incluir o uso de crioprotetores, como dimetilsulfóxido (DMSO) ou glicerol, que retardam a formação de cristais de gelo nas células do cordão umbilical.

[0085] A população isolada das células-tronco mesenquimais que é obtida pelo método de cultura e/ou isolamento da presente invenção é altamente definida e homogênea. Em modalidades típicas do méto- do, pelo menos cerca de 90 % ou mais, cerca de 91 % ou mais, cerca de 92 % ou mais, cerca de 93 % ou mais, cerca de 94 % ou mais, cer- ca de 95 % ou mais, cerca de 96 % ou mais, cerca de 97 % ou mais, cerca de 98 % ou mais cerca de 99 % ou mais das células-tronco me- senquimais isoladas expressam os seguintes marcadores: CD73, CD90 e CD105. Além disso, nessas modalidades, pelo menos cerca de 90 % ou mais, cerca de 91 % ou mais, cerca de 92 % ou mais, cer- ca de 93 % ou mais, cerca de 94 % ou mais, cerca de 95 % ou mais, cerca de 96 % ou mais, cerca de 97 % ou mais, cerca de 98 % ou mais, cerca de 99 % ou mais das células-tronco mesenquimais isola- das podem não ter expressão da ausência de expressão dos seguin- tes marcadores: CD34, CD45 e HLA-DR. Em modalidades particula- res, cerca de 97 % ou mais, cerca de 98 % ou mais, ou cerca de 99 % ou mais da população de célula-tronco mesenquimal isolada expres- sam CD73, CD90 e CD105, embora não tenham expressão de CD34, CDA45 e HLA-DR.

[0086] Assim, de acordo com a descrição acima, a presente inven- ção também é direcionada a uma população de célula-tronco mesen- quimal, como uma população de célula-tronco mesenquimal da pla- centa ou uma população de célula-tronco mesenquimal do cordão um- bilical (por exemplo, isolada de geléia de Wharton ou da membrana amniótica do cordão umbilical), em que pelo menos cerca de 90 % ou mais células da população de célula-tronco expressam cada um dos seguintes marcadores: CD73, CD90 e CD105. Em modalidades prefe- ridas, pelo menos cerca de 91 % ou mais, cerca de 92 % ou mais, cer- ca de 93 % ou mais, cerca de 94 % ou mais, cerca de 95 % ou mais, cerca de 96 % ou mais, cerca de 97 % ou mais, cerca de 98 % ou mais cerca de 99 % ou mais células da população de célula-tronco mesenquimal isolada são CD73+, CD90+ e CD105+, o que significa que esta porcentagem da população de células isoladas expressa ca- da um dentre CD73, CD90 e CD105 (cf. a Seção Experimental do pre- sente pedido) . Além disso, pelo menos cerca de 90 % ou mais, cerca de 91 % ou mais, cerca de 92 % ou mais, cerca de 93 % ou mais, cer- ca de 94 % ou mais, cerca de 95 % ou mais, cerca de 96 % ou mais, cerca de 97 % ou mais, cerca de 98 % ou mais cerca de 99 % ou mais das células-tronco mesenquimais isoladas podem não ter expressão dos seguintes marcadores: CD34, CD45 e HLA-DR. Em modalidades particulares, cerca de 97 % ou mais, cerca de 98 % ou mais, ou cerca de 99 % ou mais da população de célula-tronco mesenquimal isolada expressa CD73, CD90 e CD105, embora não tenha expressão de CD34, CD45 e HLA-DR. Essa população altamente homogênea de células-tronco mesenquimais derivadas da membrana amniótica do cordão umbilical foi relatada aqui pela primeira vez e atende aos crité- rios para células-tronco mesenquimais a serem usadas para terapia celular (também cf. a Seção Experimental e, para exemplo, Sensebe et al. "Production of mesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices: a review", supra). Observa-se neste contexto que esta população de célula-tronco mesenquimal pode ser obtida pelo método de isolamento da presente invenção, mas também por um método diferente, como classificação de células, se desejado. Em uma modalidade de tal população-tronco mesenquimal do cordão umbilical da presente invenção, em que pelo menos cerca de 91 % ou mais células da população de célula-tronco expressam cada CD73, CD90 e CD105 e não apresentam expressão de CD34, CD45 e HLA- DR, uma população de célula-tronco mesenquimal isolada da mem- brana amniótica do cordão umbilical é excluída.

[0087] De acordo com o acima, a presente invenção também é direcionada a uma composição farmacêutica compreendendo uma po-

pulação-tronco mesenquimal, conforme descrito neste documento, em que pelo menos cerca de 90 % ou mais células da população de célu- la-tronco expressam cada um dos seguintes marcadores: CD73, CD90 e CD105 e, opcionalmente, não apresentam expressão de CD34, CD45 e HLA-DR. A composição farmacêutica pode compreender qualquer excipiente farmaceuticamente aceitável e pode ser formulada para qualquer forma farmacêutica de administração desejada. A com- posição farmacêutica pode, por exemplo, ser adaptada para aplicação sistêmica ou tópica. Em um aspecto relacionado, a presente invenção também fornece uma composição farmacêutica que contém três ou quatro de Ang-1, TGF-B1, VEGF ou HGF como as únicas proteínas de cicatrização de feridas. Tal composição farmacêutica pode ser formu- lada como um líquido, por exemplo, usando um tampão farmaceutica- mente adequado, tal como solução salina 0,9 %, solução de Ringer ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou uma formulação liofili- zada/liofilizada.

[0088] Em um aspecto adicional, a invenção é direcionada a um método de preparação de um meio de cultura para induzir ou melhorar as propriedades de cicatrização de feridas e/ou para isolar a popula- ção de célula-tronco mesenquimal, em que o método compreende a mistura para obter um volume final de 500 ml de meio de cultura: i. 250 ml! de DMEM ii. 118 ml de M171 iii. 118 m! de DMEM/F12 iv. 12,5 ml de Soro Bovino Fetal (FBS) para atingir uma concentração final de 2,5 % (v/v).

[0089] Como explicado acima, o meio DMEM/F12 é uma mistura 1:1 de meio DMEM e F12 de Ham. Assim, 118 ml de meio DMEM/F12 contêm 59 ml de DMEM e 59 ml de F12. Por conseguinte, ao usar este método de fazer um meio de cultura, as concentrações finais (v/v) com volume total de 500 ml de são as seguintes: DMEM: 250 ml + 59 ml = 309 ml, corresponde a 309/500 = 61,8 % (v/v) M171: 118 ml, corresponde a 118/500 = 23,6 % (v/v) F12: 59 ml, corresponde a 59/500 = 11,8 % (v/v).

[0090] As modalidades deste método de fazer um meio de cultura compreendem ainda adicionar v. 1 ml de solução-mãe de EGF (5 pg/ml) para atingir uma concentração final de EGF de 10 ng/ml, e vi. solução-mãe de 0,175 ml de insulina (14,28 mg/ml) para atingir uma concentração final de insulina de 5 ug/ml.

[0091] Observa-se aqui que, nessas modalidades, os volumes acima mencionados desses componentes |. a vi quando misturados resultam em um volume final de 499,675 ml de meio de cultura. Se nenhum outro componente for adicionado ao meio de cultura, os 0,325 ml restantes (para somar um volume de 500 ml) podem, por exemplo, ser qualquer um dos componentes |. a iv, isso significa DMEM, M171, DMEM/F12 ou FBS. Alternativamente, a concentração da solução-mãe de EGF ou Insulina pode, evidentemente, ser ajustada de modo que o volume total do meio de cultura seja 500 ml. Além disso, também é observado que os componentes i. a iv. não têm necessariamente de ser adicionados na ordem em que estão listados, mas é claro que também é possível usar qualquer ordem para misturar esses compo- nentes para chegar ao meio de cultura da presente invenção. Isso sig- nifica que, por exemplo, M171 e DMEM/F12 podem ser misturados e depois combinados com DMEM e FBS para atingir as concentrações finais conforme descrito aqui, ou seja, uma concentração final de DMEM de cerca de 55 a 65 % (v/v), a concentração final de F12 de cerca de 5 a 15 % (v/v), uma concentração final de M171 de cerca de a 30 % (v/v) e uma concentração final de FBS de cerca de 1a 8%

(v/v).

[0092] Em outras modalidades, o método compreende ainda adici- onar ao DMEM um volume de 0,325 ml de um ou mais dos seguintes suplementos: adenina, hidrocortisona, sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo-L- tironina (T3), atingindo assim um volume total de 500 ml de meio de cultura. Nestas modalidades, a concentração final desses suplementos em DMEM pode ser a seguinte: cerca de 0,05 a 0,1 ug/ml de adenina, por exemplo cerca de 0,025 pg/ml de adenina, cerca de 1 a 10 ug/ml de hidrocortisona, cerca de 0,5 a 5 ng/ml de sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo-L- tironina (T3), por exemplo 1,36 ng/ml de sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo- L-tironina (T3).

[0093] De acordo com a descrição acima, a invenção também é direcionada a um meio de cultura de células que pode ser obtido ou que é obtido pelo método de preparação do meio como descrito aqui.

[0094] Além disso, a invenção também se refere a um método de isolamento de células-tronco mesenquimais da membrana amniótica do cordão umbilical, em que este método compreende a cultura de te- cido de membrana amniótica no meio de cultura preparado pelo méto- do descrito aqui.

[0095] Assim, a presente invenção também é direcionada a um meio de cultura de células que compreende: - DMEM na concentração final de cerca de 55 a 65 % (v/v), - F12 em uma concentração final de cerca de 5a 15% (vv), - M171 em uma concentração final de cerca de 15 a 30 % (vv) e - FBS em uma concentração final de cerca de 1 a 8 % (v/v).

[0096] Em certas modalidades do meio de cultura aqui descrito, o meio compreende DMEM na concentração final de cerca de 57,5 a 62,5 % (v/v), F12 em uma concentração final de cerca de 7,5 a 12,5% (v/v), M171 em um concentração final de cerca de 17,5 a 25,0 % (v/v) e FBS em uma concentração final de cerca de 1,75 a 3,5 % (v/v). Em outras modalidades, o meio de cultura pode compreender DMEM em uma concentração final de cerca de 61,8 % (v/v), F12 em uma concen- tração final de cerca de 11,8 % (v/v), M171 em uma concentração final de cerca de 23,6 % (v/v) e FBS em uma concentração final de cerca de 2,5 % (v/v).

[0097] Além disso, o meio de cultura pode compreender ainda Fa- tor de Crescimento Epidérmico (EGF) em uma concentração final de cerca de 1 ng/ml a cerca de 20 ng/ml. Em certas modalidades, o meio de cultura compreende EGF em uma concentração final de cerca de ng/mL. O meio de cultura aqui descrito pode compreender ainda Insulina em uma concentração final de cerca de 1 ug/ml a 10 pg/ml. Em tais modalidades, o meio de cultura pode compreender Insulina em uma concentração final de cerca de 5 ug/ml.

[0098] O meio de cultura de células da invenção pode ainda com- preender pelo menos um dos seguintes suplementos: adenina, hidro- cortisona e sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo-L-tironina (T3). Em certas modalidades, o meio de cultura compreende todos os três dentre ade- nina, hidrocortisona e sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo-L-tironina (T3). Se estiver presente, o meio de cultura pode compreender adenina em uma concentração final de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 ug/ml de ade- nina ou de cerca de 0,05 a cerca de 0,1 ug/ml de adenina, hidrocorti- sona em uma concentração final de cerca de 0,1 a cerca de 10 pg/ml de hidrocortisona ou de cerca de 1 a cerca de 10 pg/ml de hidrocorti- sona e/ou sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo-L-tironina (T3) em uma con- centração final de cerca de 0,5 a cerca de 5 ng/ml.

[0099] Em modalidades do meio de cultura de células, 500 ml do meio de cultura de células da presente invenção compreendem: i. 250 ml! de DMEM ii. 118 ml de M171 iii. 118 m! de DMEM/F12 iv. 12,5 ml de Soro Bovino Fetal (FBS) (concentração final de 2,5 %)

[00100] Em outras modalidades, o meio de cultura celular pode compreender ainda v. EGF em uma concentração final de 10 ng/ml, e vi. Insulina na concentração final de 5 pg/ml.

[00101] Tanto a insulina como o EGF podem ser adicionados ao meio de cultura usando uma solução-mãe de escolha, de modo que o volume total do meio de cultura não exceda 500 ml.

[00102] Em um exemplo específico, os componentes i. a vi. do meio de cultura da presente invenção são os componentes indicados na Fi- gura 5, o que significa que são obtidos dos respectivos fabricantes uti- lizando o número de catálogo indicado na Figura 5. O meio que é obti- do da mistura dos componentes i. a vi. como indicado na Figura 5 também é referido aqui como "PTT-6". É novamente observado neste contexto que os constituintes i. a vi. assim como qualquer outro ingre- diente, tal como um antibiótico de qualquer outro fornecedor comercial, pode ser usado na preparação do meio da presente invenção.

[00103] Além disso, o meio de cultura de células da invenção pode compreender adenina em uma concentração final de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 ug/ml de adenina ou de cerca de 0,05 a cerca de 0,1 pg/ml de adenina, hidrocortisona em uma concentração final de cerca de 0,1 a 10 ug/ml, de cerca de 0,5 a cerca de 10 pg/ml, ou de cerca de 1 a cerca de 10 ug/ml de hidrocortisona e/ou sal de sódio de 3,3',5-Tri- iodo-L-tironina (T3) em uma concentração final de cerca de 0,1 a cerca de 5 ng/ml ou de cerca de 0,5 a cerca de 5 ng/ml.

[00104] Finalmente, a invenção também fornece um método de tra- tamento de um mamífero não humano (como gatos, cães, cavalos, pa- ra citar apenas alguns) ou um paciente humano com uma doença ou sofrendo de uma condição, o método compreendendo a administração ao paciente mamífero não humano ou humano uma população de cé- lula-tronco mesenquimal ou uma composição farmacêutica contendo uma população de célula-tronco como aqui descrito.

A doença pode ser qualquer doença ou condição, em particular qualquer doença ou condição na qual a cicatrização da ferida é desejada/necessária.

O indivíduo (paciente ou mamífero não humano) pode sofrer de uma fe- rida que é causada por uma queimadura, uma mordida, um trauma, uma cirurgia ou uma doença, como uma doença de pele ou um distúr- bio metabólico.

Como um exemplo de tal distúrbio metabólico, o paci- ente pode, por exemplo, sofrer de diabetes tipo | ou tipo Il e sofrer de úlceras crônicas nos pés.

Para o tratamento do indivíduo, a população de célula-tronco mesenquimal da invenção pode ser administrada de qualquer forma adequada, por exemplo, incluindo, mas não se limitan- do a, administração tópica, por implante ou por injeção.

Em princípio, qualquer forma de administração tópica é aqui entendida.

A adminis- tração da população de célula-tronco mesenquimal pode ser realizada por meio de uma seringa.

No entanto, também é possível entrar em contato com as células-tronco mesenquimais em um creme, pomada, gel, suspensão ou qualquer outra substância adequada antes de apli- car as células-tronco mesenquimais ao indivíduo.

A população de célu- la-tronco pode, por exemplo, ser colocada diretamente em uma ferida, como uma queimadura ou uma ferida diabética (veja, pedido de paten- te internacional WO2007/046775). Após a sua aplicação ao indivíduo, a população de células estaminais mesenquimais pode ser mantida no lugar, por exemplo, por um curativo como o curativo TegadermO e uma bandagem de crepe para cobrir o curativo TegadermO.

Alternati-

vamente, a população de célula-tronco também pode ser implantada por via subcutânea, por exemplo, diretamente sob na pele, na gordura corporal ou no peritônio.

[00105] A presente invenção também se refere a uma dosagem uni- tária compreendendo cerca de 20 milhões de células, de cerca de 15 milhões de células, de cerca de 10 milhões de células, de cerca de 5 milhões de células, de cerca de 4 milhões de células, de cerca de 3 milhões de células, de cerca de 2 milhões de células, de cerca de 1 milhão de células, de cerca de 0,5 milhões de células, de cerca de 0,25 milhões de células ou de menos de 0,25 milhões de células de uma população de célula-tronco mesenquimal como aqui descrito.

[00106] Também se prevê que a dosagem unitária compreende cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, cerca de 2, cerca de 1, cerca de 0,5, cerca de 0,25 ou cerca de 0,1 milhão de células. De preferência, a dosagem unitária compreende cerca de 10 milhões de células. É ainda conside- rado que a dosagem unitária compreende cerca de 1000 células a cer- ca de 5 milhões de células. A dosagem unitária pode ser aplicada em uma dosagem de cerca de 100.000 células, 300.000 células ou

500.000 células. Conforme descrito neste documento, a dosagem uni- tária pode ser aplicada topicamente, em particular se usada para a ci- catrização de feridas. Por exemplo, a dosagem unitária pode ser apli- cada topicamente por cm?.

[00107] Se desejado, a dosagem unitária pode ser aplicada uma, duas, três vezes ou mais por semana. Por exemplo, a dosagem unitá- ria pode ser aplicada para uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze semanas ou mais. A dosagem unitária compre- endendo cerca de 100.000 células, cerca de 300.000 células ou cerca de 500.000 células pode ser aplicada duas vezes por semana durante 8 semanas, de preferência em 1 cm?.

[00108] A dosagem unitária pode estar contida em qualquer recipi- ente adequado. Por exemplo, a unidade de dosagem pode estar conti- da em um frasco de 1 ml. Em tais casos, por exemplo, 0,1 ml do frasco pode ser aplicado no indivíduo, de preferência por cm?. A dosagem unitária pode, alternativamente, estar contida em uma seringa.

[00109] “Na dosagem unitária da presente invenção, as células po- dem estar em contato com um veículo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um veículo líquido. O transportador pode ser qualquer transportador conhecido, como HypoThermosol"Y, HypothermosolT"- FRS ou PlasmaLyte. O meio de cultura da presente invenção também pode ser usado como veículo para uma (dosagem unitária) da popula- ção de célula-tronco mesenquimal da presente invenção. Nesse caso, as células-tronco mesenquimais podem ser separadas do transporta- dor antes da administração. Por exemplo, as células podem ser centri- fugadas e isoladas antes da administração a um indivíduo.

[00110] O método de tratamento e a dosagem unitária da presente invenção podem compreender a utilização de células viáveis. A viabili- dade da população de célula-tronco mesenquimal pode ser testada com métodos conhecidos, por exemplo, manchamento com azul tripa- no conforme descrito na seção experimental.

[00111] A invenção será ainda ilustrada pelos seguintes Exemplos Experimentais não limitantes.

[00112] A invenção será ainda ilustrada pelos seguintes Exemplos Experimentais não limitantes.

[00113] As sequências, tal como aqui utilizadas, estão representa- das na Tabela 1 abaixo.

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Exemplos Experimentais

1. Criopreservação do tecido do cordão umbilical antes do isola- mento das células-tronco mesenquimais

[00114] O tecido do cordão umbilical (os cordões umbilicais foram doados com consentimento informado da mãe) foi processado para o subsequente isolamento das células-tronco mesenquimais da mem- brana amniótica do cordão umbilical como segue.

1.1 Lavagem da amostra de tecido do cordão umbilical: a. Remova os bisturis da capa protetora.

b. Segure o cordão umbilical com firmeza usando a pinça e corte o cordão em um pedaço de 10 cm de comprimento usando um bisturi. Coloque o cabo inutilizável de volta no copo de tecido original.

c. Transfira o pedaço de cordão umbilical de 10 cm de comprimento para uma nova placa de cultura de 150 mm. O prato de cultura de 150 mm pode ser usado no lugar dos copos.

d. Use a tampa do prato de cultura de 150 mm como local de descanso para uma pinça e bisturi.

e. Remova 25 ml de Plasmalyte A (Baxter, Catálogo t 2B2543Q) com uma seringa de 30 ml. Segure a seringa em um ângulo de 45º com uma mão e dispense o Plasmalyte A diretamente no tecido do cordão umbilical.

f. Segurando o prato de cultura em um leve ângulo, remova o Plasmalyte A com uma seringa de 30 ml e agulha romba.

g. Colete o Plasmalyte A usado em um saco de transferên- cia de 300 ml de que serve como recipiente para lixo e descarte-o na lixeira.

h. Repita o procedimento de lavagem, se necessário, usan- do um novo prato de cultura para cada lavagem. Certifique-se de que todos os coágulos de sangue na superfície foram removidos. Mais Plasmalyte A pode ser usado se necessário para limpar o tecido.

i. Coloque o tecido em um novo prato de cultura de tecido rotulado para continuar cortando o tecido. Coloque 20 ml de Plas- malyte A no prato para que o tecido não seque durante o corte.

j. Corte os cordões em seções iguais de aproximadamente 1 cm, resultando em 10 seções no total.

k. Corte cada seção de 1 cm em pedaços menores com aproximadamente 0,3 cm x 0,3 cm a 0,5 cm x 0,5 cm por seção.

|. Remova qualquer Plasmalyte A que esteja no prato.

m. Retire 25 ml de Plasmalyte A com uma seringa de 30 ml do saco de Plasmalyte A original e dispense diretamente sobre os pe- daços de tecido do cordão umbilical.

n. Segure o prato de cultura em um ângulo para coletar to- do o Plasmalyte A usado para lavar o tecido em um lado e remova-o com uma seringa e agulha romba.

o. Repita a lavagem mais uma vez. Não deve haver ne- nhum coágulo restante.

[00115] NOTA: Se o cordão não for congelado imediatamente, o tecido do cordão umbilical é mantido em Plasmalyte A até que esteja pronto para congelar.

1.2 Criopreservação do tecido do cordão umbilical: a. Prepare a solução de criopreservação: i. Prepare 50 ml de solução de congelamento consistindo de 60 % de Plasmalyte A, 30 % de Albumina de Soro Humano 5 % e % de dimetilsulfóxido (DMSO).

ii. Marque um saco de transferência de 150 ml de com "So- lução de congelamento de tecido" e anexe um conjunto de transferên- cia de plasma à porta usando uma técnica asséptica.

iii. Remova 30 ml de Plasmalyte A com uma seringa de 30 ml do saco de Plasmalyte A original e transfira-o para o saco de trans- ferência denominado "solução para congelamento de tecido" com a hora e a data em que a solução é feita.

iv. Remova 15 ml de albumina de soro humano a 5 % com uma seringa de 20 ml e transfira para o saco de transferência rotulado.

v. Adicione 5 ml de DMSO ao saco de transferência.

vi. Misture bem e registre a mistura da solução de conge- lamento b. Remova o Plasmalyte A do tecido antes de adicionar a solução de congelamento.

c. Usando uma seringa de 60 ml, puxe todos os 50 ml da solução de congelamento para dentro da seringa e adicione aproxima- damente 30 ml de solução de congelamento ao prato de cultura de cé- lulas de 150 mm contendo o tecido do cordão umbilical. Coloque uma agulha romba na seringa para mantê-la estéril.

d. Agite a placa de cultura contendo o tecido e a solução de congelamento a cada minuto por 10 minutos.

e. Usando uma pinça, selecione 8 seções escolhidas alea- toriamente e coloque-as em cada um dos quatro criotubos de 4 ml. Se- lecione 4 seções escolhidas aleatoriamente e coloque-as em um crio- tubo de 1,8 ml. Essas seções devem estar livres de coágulos sanguií- neos.

f. Encha cada criotubo contendo o tecido do cordão umbili- cal com a solução de congelamento restante até a linha de enchimento de 3,6 ml para os tubos de 4 ml e a linha de 1,8 ml para o frasco de Nunc de 1,8 ml.

g. Identifique um frasco Bactec Lytic/10 - Anaeróbico/F e um Bactec Plus Aerobic/F com a identificação de tecido.

h. Remova 20 ml da solução de congelamento do prato de cultura com uma seringa e uma agulha romba, depois de limpar os frascos de Bactec com um algodão embebido em álcool, troque a agu- lha romba por uma agulha de 18 g e inocule os frascos aeróbio e ana-

eróbio de Bactec com 10 ml de cada.

i. Ligue o congelador de taxa controlada.

j. Após a conclusão do congelamento de taxa controlada, coloque as unidades em um congelador de nitrogênio líquido monito- rado por temperatura contínua até uso posterior.

2. Isolamento de Células-tronco de Revestimento do Cordão Me- senquimal do tecido do cordão umbilical

2.1. Preparação do meio para processamento de MSCs de tecido do cordão umbilical: a. Para fazer 500 ml de PTT-6 (meio de cultura/cresci- mento), adicione o seguinte na ordem listada: i. DMEM, 250 ml ii. M171 118 ml iii. DMEM F12 118 ml iv. FBS 12,5 ml de (concentração final de 2,5 %) v. EGF 1 ml de (concentração final de 10 ng/ml) vi. Insulina 0,175 ml de (concentração final de 5 pg/ml)

[00116] Os volumes de componentes mencionados acima i. a vi quando resultar em um volume final de 499,675 ml de meio de cultura. Se nenhum outro componente for adicionado ao meio de cultura, os 0,325 ml restantes (para somar um volume de 500 ml) podem, por exemplo, ser qualquer um dos componentes i. a iv, isso significa DMEM, M171, DMEM/F12 ou FBS. Alternativamente, a concentração da solução-mãe de EGF ou Insulina pode, evidentemente, ser ajustada de modo que o volume total do meio de cultura seja 500 ml. Alternati- vamente, uma solução-mãe de um antibiótico como Penicilina- Estreptomicina-Anfotericina pode ser adicionada para resultar em um volume final de 500 ml. Também é possível adicionar ao meio de cultu- ra um volume de 0,325 ml de um ou mais dos seguintes suplementos: adenina, hidrocortisona, sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo-L-tironina (T3),

atingindo assim um total volume de 500 ml de meio de cultura.

vii. Marque o frasco "PTT-6" com a data em que a meio foi preparada, inicial do operador, e a frase "expira em" seguida da data de validade. A data de expiração é a data de expiração mais próxima de qualquer componente ou 1 mês a partir da data de preparação, o que ocorrer primeiro.

b. Para fazer a meio de enxágue (solução salina tampona- da de Hank (HBSS) sem cálcio ou magnésio e com 5 % de FBS), adi- cione 2,5 ml de FBS a 47,5 ml de HBSS em um tubo de centrífuga de 50 ml. Identifique o tubo como "Meio de Enxágue" com as iniciais do operador e a data em que a meio foi feita.

c. Todos os meios serão testados para esterilidade usando Bactec Lytic/10 - Anaerobic/F (Becton Dickinson & Company) e Bactec Pluc + Aerobic/F (Becton Dickinson & Company). Injetar 20 ml do meio preparado em cada frasco.

2.2 Descongelamento do tecido do cordão umbilical para colheita de MSC: a. Inicie o descongelamento assim que um operador estiver preparado para processar a amostra no ambiente limpo. Não descon- gele mais de 1 frasco de cada vez, a menos que os frascos sejam ori- ginários do mesmo doador.

b. Limpe o banho-maria com desinfetante seguido de iso- propanol 70 % e encha-o com 1 L de água estéril. Aqueça o banho- maria até 36-38 ºC.

c. Prepare 10 mL de meio de enxágue consistindo de 70 % a 90 % de PlasmaLyte A no ambiente limpo sob uma cabine de bios- segurança. Filtrar estéril a solução com um filtro de seringa de 0,2 um conectado a uma seringa de 10 ml e manter a solução refrigerada até O Uso.

d. Coloque um rótulo de processamento em um tubo cônico de 50 ml.

e. Confirme se a temperatura do banho-maria está entre 36-38 ºC.

f. Pegue o (s) frasco (s) de tecido do armazenamento de nitrogênio líquido e descongele rapidamente em banho-maria a 37 ºC preenchido com 1L de água estéril. O suporte do frasco para o recipi- ente de congelamento Mr. Frosty Nalgene Cryo 1 ºC flutua com os frascos no lugar e pode ser usado como uma prateleira flutuante ao descongelar as amostras.

g. Remova o frasco do banho-maria e borrife-o com solução de isopropanol a 70 %. Um bom momento para retirar o frasco do ba- nho-maria é quando um pequeno gelo pode ser visto flutuando no frasco - sugere que a temperatura interna do frasco é inferior a 37 ºC.

h. Coloque o frasco na passagem e alerte o técnico de pro- cessamento do ambiente limpo.

2.3 Preparação para processamento de tecido: a. O processamento do tecido do cordão umbilical deve ser realizado em um ambiente limpo com monitoramento ambiental (EM):. No final de cada turno, é realizada a limpeza completa do ambiente e do capuz b. Prepare/limpe o gabinete de biossegurança.

c. Realize uma contagem de partículas viável enquanto tra- balha no gabinete de biossegurança.

d. Reúna todos os suprimentos necessários no gabinete de biossegurança, verificando se há danos na embalagem e datas de va- lidade de cada um. Ao manusear seringas, pipetas sorológicas, pinças estéreis, bisturis, placas de tecido e agulhas, certifique-se de não tocar em nenhuma superfície que possa entrar em contato com o produto estéril. Apenas o exterior do corpo da seringa, tubo, ponta do êmbolo e/ou tampa da agulha ou bainha podem ser manuseados com segu-

rança. Descarte o suprimento se a superfície foi tocada ou tocou uma superfície não esterilizada.

e. Registre os números de lote e as datas de validade (se aplicável) de todos os reagentes e suprimentos a serem usados.

f. Receba o frasco descongelado, limpando o frasco com um pano sem fiapos umedecido com álcool 70 % antes de transferir para a cabine de biossegurança.

g. Usando uma agulha de aspiração com uma seringa, reti- re o máximo de líquido do frasco. Evite aspirar o tecido.

h. Usando uma pinça estéril, transfira o tecido para uma placa de Petri estéril de 100 mm.

i. Adicione uma alíquota de 5 ml de meio de enxágue aos fragmentos de tecido.

j. Agite o conteúdo por 15-30 segundos e, em seguida, re- mova o meio de enxágue com uma pipeta ou seringa com agulha de aspiração. Repita este processo de enxágue duas vezes.

k. Adicione 2 mL de meio de enxágue ao tecido para evitar ressecar o tecido.

2.4. Iniciando a excrescência de MSC do tecido: a. Identifique o fundo de uma placa de 6 cavidades como "Excrescência 1" com o número de lote da MSC ou ID do tecido do cordão umbilical e a data da excrescência é iniciada. Se for usada uma placa de cultura de tecidos de 60 mm, divida a placa em 4 quadrantes, desenhando uma grade no fundo da placa.

b. Usando uma pinça estéril e descartável, coloque um te- cido de 3 x 3 mm a 5x 5 mm em cada cavidade. Se estiver usando uma placa de cultura de tecido de 60 mm, coloque o tecido no meio de cada quadrante para mantê-los separados (mais de 1 cm um do ou- tro).

c. Encha cada cavidade com 3 ml de PTT-6.

d. Usando uma agulha de aspiração acoplada a uma serin- ga de 30 ml, retire meio suficiente para cobrir o tecido. Não incline a placa. Não toque no fundo da cavidade com a agulha de aspiração.

e. Usando um microscópio de luz invertida, observe a ex- crescência celular todos os dias (24 + 6 horas). O sistema de imagem de cultura de células em tempo real pode ser usado no lugar do mi- croscópio óptico.

f. Mude do meio todos os dias. Certifique-se de equilibrar o meio à temperatura ambiente antes de usar.

i. Aspire fora do meio.

ii. Adicione 3 ml de PTT-6.

iii. Aspire até que o tecido quase não esteja submerso no meio.

g. Quando o crescimento celular é observado do tecido, transplante o tecido para uma nova placa de 6 cavidades usando o mesmo procedimento de 4.a a 4.e acima, exceto marcar a placa como "Excrescência 2". Manter a excrescência das células na placa "Ex- crescência 1" adicionando 2 ml de PTT-6 a cada cavidade. Observe a confluência todos os dias. Substitua o meio a cada 2-3 dias (certifique- se de equilibrar o meio à temperatura ambiente antes de usar).

h. Quando a excrescência celular é observada na placa "Excrescência 2", repita a etapa 4.a a 4.e, exceto marcar a placa como "Excrescência 3". Manter o crescimento celular na placa "Excrescência 2", adicionando 2 ml de PTT-6 a cada cavidade. Observe a confluência todos os dias. Substitua o meio a cada 2-3 dias (certifique-se de equi- librar o meio à temperatura ambiente antes de usar).

i. Quando a excrescência for observada na placa "Excres- cência 3", descarte o tecido. Se os tecidos forem muito pequenos e não parecerem interferir no crescimento celular, descarte o tecido ao fazer a subcultura.

j. Quando as células atingem 40-50 % de confluência, ob- serve as células todos os dias para evitar a expansão excessiva.

k. Quando as células atingirem 70-80 % de confluência, fa- ça uma subcultura das células. Não permita que as células se expan- dam além da confluência de 80 %.

[00117] Como tamanho dos explantes de tecido sendo de cerca de 1-3 mm, e o explante de tecido/cultura de células é realizado em pla- cas de cultura de 175 mm quadrados, o número médio de células- tronco mesenquimais colhidas de um explante é normalmente cerca de 4.000 - 6.000 células/explante. Por conseguinte, quando as células- tronco mesenquimais são cultivadas simultaneamente em 48 explan- tes, cerca de 300.000 células podem ser obtidas na colheita. Essas

300.000 células-tronco mesenquimais coletadas de explantes podem então ser usadas para subcultura semeando um frasco de cultura de células de 175 cm? com 300.000 células conforme descrito no Exem- plo 2.5 a seguir (isso pode ser referido como Passagem 1). As células- tronco mesenquimais obtidas a partir desta passagem 1 podem então ser usadas para semear novamente frascos de 175 cm? (passagem 2) e expandir as células conforme descrito no Exemplo 2.5 a seguir. As células obtidas na passagem 1 e na passagem 2 podem ser "armaze- nadas" por criopreservação, com as células-tronco mesenquimais ob- tidas após a passagem 2 sendo consideradas como representando o Banco de Células Mestre que será para expansão posterior das célu- las-tronco mesenquimais, por exemplo, em um biorreator, conforme explicado abaixo no Exemplo 2.7.

2.5. Subcultura de MSC em placas de cultura de células a. Execute partículas viáveis enquanto trabalha no gabinete de biossegurança. Equilibre todas os meios à temperatura ambiente antes de usar.

b. Quando o crescimento celular atinge cerca de 70-80 %

de confluência, as células são subcultivadas.

i. Remova o PTT-6 da placa de Petri.

ii. Enxágue com HBSS sem cálcio ou magnésio.

iii. Adicione 0,2 ml de TrtypLE-EDTA 1X e agite por 1-2 mi- nutos.

iv. Incline o prato 30-45 *º para permitir que as células se desloquem para baixo por fluxo gravitacional. Bater suavemente na lateral da placa acelera o desprendimento.

v. Adicione Iml de PTT-6. Pipete para cima e para baixo suavemente e depois transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 ml. Use uma ponta de pipeta limpa em cada cavidade. As célu- las de todas as 6 cavidades podem ser agrupadas em um único tubo de 15 ml.

vi. Centrifugue por 10 minutos a 1200 rpm.

vii. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células com ml de PTT-6.

c. Subcultura de MSC i. Aliquote 50 ul da suspensão de células e teste para TNC e viabilidade por ensaio de exclusão de azul tripano.

ii. Conte as células usando um hemocitômetro. Espere con- tar 20-100 células/quadrado. Se a contagem for superior a 100, dilua a amostra original 1:5 e repita o método do Azul Tripano com um hemo- citômetro.

iii. Calcule células viáveis/ml e células viáveis totais:

1. Células viáveis/ml = contagem de células viáveis x fator de diluição x 10º

2. Células viáveis totais = contagem de células viáveis x fator de diluição x volume total x 10º iv. Calcule a % de viabilidade:

1. % de viabilidade = contagem de células viáveis x

100/(contagem de células viáveis + contagem de células mortas) v. Dilua a suspensão de células para 1,0 x 10º células/ml:

1. Volume "X" = células viáveis totais/10º células/ml

2. Por exemplo, se o número total de células viáveis for 1,0 x 10;

3. "X" = 107/108 células/ml ou 10 ml, portanto, você aumen- taria seu volume celular total para 10 ml de adicionando 5 ml de à sua suspensão de células (ou seja, 5 ml).

vi. Se a suspensão de células for inferior a 10º/ml, determi- ne o volume necessário para semear 2 x 108º células para cada placa de Petri de 150 mm ou frasco de 175 cm2.

1. Volume para 2 x 10º células = 2 x 10º células + células viáveis/ml

2. Por exemplo, se células viáveis/ml de são 8 x 10º célu- las/ml, 2 x10º células + 8 x 10º células/ml ou 2,5 ml de são necessá- rios.

vii. Reserve 0,5 ml para a análise do marcador MSC.

viii. Semeie 2 x 10º células para cada placa de Petri de 150 mm ou frasco de 175 cm? com 30 ml de PTT-6.

ix. Observe as células para fixação, formação de colônias e confluência a cada três dias. Quando as células atingem 40-50 % de confluência, observe as células a cada um ou dois dias para evitar a expansão excessiva. NÃO permita que as células se expandam além da confluência de 80 %. Um sistema de monitoramento de cultura de células em tempo real pode ser usado no lugar do microscópio óptico.

x. Substitua o meio a cada 2-3 dias.

2.6 Criopreservação de células MSC a. Execute partículas viáveis enquanto trabalha no gabinete de biossegurança.

b. Quando as células atingem 70-80 % de confluência, se-

pare as células usando 2 ml de 1X TrypLE-EDTA para cada placa de Petri de 150 mm ou frasco de 175 cm2.

i. Remova o PTT-6 da placa de Petri.

ii. Lave com 5 ml de HBSS ou PBS sem cálcio ou magné- sio.

iii. Adicione 2 ml de TrypLE-EDTA 1X e agite por 1-2 minu- tos.

iv. Incline o prato 30-45 *º para permitir que as células se desloquem para baixo por fluxo gravitacional. Bater suavemente na lateral da placa de Petri ajuda a acelerar o desprendimento.

v. Adicione 10 ml de PTT-6 para inativar TrypLE. Misture bem para dissociar aglomerados de células.

vi. Transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 ml de usando uma pipeta Pasteur.

vii. Centrifugue por 10 minutos a 1200 rpm.

viii. Aspire o meio e ressuspenda com 10 ml de PTT-6.

ix. Aliquote 50 ul e determine o número total de células viá- veis e a % de viabilidade como acima. A contagem de células deverá ser realizada em 15 minutos, pois as células podem começar a se agrupar.

c. Preparação de células para criopreservação i. Prepare o meio de suspensão celular e o meio de criopre- servação e congele as células

2.7. Subcultura (expansão) de MSC em um Biorreator Quantum (Terumo BTC, Inc.)

[00118] Também é possível usar um Biorreator Quantum para ex- pandir o MSC. O número de células iniciais para a expansão no Quan- tum Bioreactor deve variar entre 20 a 30 milhões de células por corri- da. O rendimento típico por corrida é de 300 a 700 milhões de MSC na colheita. O biorreator é operado seguindo o protocolo do fabricante. As células-tronco mesenquimais assim obtidas são tipicamente criopre- servadas (veja abaixo) e servem como Banco de Células de Trabalho. MATERIAIS/REAGENTES:

1. Conjunto de Expansão Quantum

2. Saco de Lixo Quantum

3. Saco de Meio Quantum

4. Saco de Entrada Quantum

5. PTT-6

6. PBS

7. Fibronectina

8. TrypLE

9. Seringa de 3ml

10. Tiras de teste de glicose

11. Tiras de teste de lactato

12. Placa de Cultura Celular de 60 ml ou equivalente

13. Mistura de Gás CO>2 5 % de Grau Médico

14. 50 ml de Combi-tip EQUIPAMENTO:

1. Gabinete de Biossegurança

2. Medidor de Glicose (Medidor de Glicose no Sangue Ba- yer Healthcare/Ascensia Contour)

3. Lactate Plus (Nova Biomedical)

4. Bomba peristáltica com cabeça

5. Centrífuga, Eppendorf 5810

6. Conector de Tubo Estéril

7. Pipetador de Repetição M4

8. RF Sealer PROCEDIMENTO:

1. Preparação do Biorreator Quantum a) Inicie o Biorreator Quantum b) Revesta o biorreator: 1) Prepare a solução de fibronectina na cabine de biosse- gurança.

1) Deixe a fibronectina liofilizada se aclimatar à temperatura ambiente (> 15 min à temperatura ambiente) 2) Adicione 5 ml de água destilada estéril; não gire ou agite 3) Deixe a fibronectina entrar na solução por 30 min.

4) Use uma seringa de 10 ml de conectada com uma agu- lha de 18 g, transfira a solução de fibronectina para um saco de entra- da Ccell contendo 95 ml de PBS.

2) Anexe o saco à linha de "reagente" 3) Verifique se há bolhas (as bolhas podem ser removidas usando "Remover IC Air" ou "Remover EC Air" e usando "Lavar" como fonte de entrada.

4) Abra ou configure o programa para revestir o biorreator (Figura 1. Etapas 3-5).

5) Execute o programa 6) Enquanto o programa está sendo executado para reves- tir o biorreator, prepare um saco do meio com 4L do meio PTT-6.

7) Conecte o saco do meio à linha do meio IC usando um conector de tubo estéril.

8) Quando as etapas de revestimento do biorreator forem concluídas, destaque o saco de entrada de células usado para solução de fibronectina usando um selador de RF.

c) Lavae o excesso de fibronectina d) Condicione o biorreator com meio

2. Cultura de células no Biorreator Quantum a) Carregar e anexar as células com suspensão uniforme: b) Alimentar e cultivar as células

1) Escolha a taxa de fluxo do meio para alimentar as célu- las.

2) Amostra de lactato e glicose todos os dias.

3) Ajuste a taxa de fluxo do meio conforme os níveis de lac- tato aumentam. A concentração real máxima tolerável de lactato será definida por um frasco de cultura de onde as células se originam. De- termine se o meio PTT-6 adequada está no saco do meio. Se neces- sário, substitua o saco do meio PTT-6 por um saco do meio PTT-6 no- vo.

4) Quando a taxa de fluxo atingir o valor desejado, meça o nível de lactato a cada 8-12 horas. Se o nível de lactato não diminuir ou se continuar a aumentar, colete as células.

3. Coleta das células do Biorreator Quantum a) Quando a concentração de lactato não diminuir, colete as células após a amostragem de lactato e glicose pela última vez.

b) Colete as células: 1) Conecte o saco de entrada de células cheio com 100 ml de TrypLE à linha de "Reagente" usando um conector de tubo estéril.

2) Confirme se há PBS suficiente no saco de PBS. Caso contrário, coloque um novo saco com pelo menos 1,7 litros de PBS na linha de "Lavagem" usando um conector de tubo estéril.

3) Execute o programa de colheita

4. Criopreservação das células 1) Uma vez que as células foram colhidas, transfira-as para um tubo de centrífuga de 50 ml para sedimentar as células.

2) Ressuspenda-as usando 25 ml de solução de suspensão celular fria. Conte as células usando o contador Sysmex ou Biorad Cell. Anexe o relatório de contagem de células ao respectivo Registro de Batelada de Processamento Quantum.

3) Ajuste a concentração de células para 2x107/ml

4) Adicione solução de criopreservação de volume igual e misture bem (não agitar ou agitar em vórtice) 5) Usando um pipetador de repetição, adicione 1 ml da suspensão de células em criopreservativo a cada frasco de 1,8ml. Cri- opreserve usando o programa CRF conforme descrito no SOP D6.100 CB Cryopreservation Using Controlled Rate Freezers 6) Armazene os frascos em um espaço de armazenamento de nitrogênio líquido designado.

7) Anexe o relatório de execução de CRF ao respectivo formulário MSC P3-Quantum Processing Batch Record.

3. Análise da Expressão do Marcador de Células-Tronco em Popu- lações-Tronco de Revestimento do Cordão Mesenquimal isoladas do tecido do cordão umbilical, usando diferentes meios de cultura

[00119] Experimentos de citometria de fluxo foram realizados para analisar células-tronco mesenquimais isoladas do cordão umbilical quanto à expressão dos marcadores de células-tronco mesenquimais CD73, CD90 e CD105.

[00120] Para esses experimentos, as células-tronco mesenquimais foram isoladas do tecido do cordão umbilical por cultura do tecido do cordão umbilical em três meios de cultura diferentes, seguido por sub- cultura das células-tronco mesenquimais no respectivo meio, conforme estabelecido no Exemplo 2.

[00121] Os três seguintes meios de cultura foram usados nestes experimentos: a) 90 % (v/v/DMEM suplementado com 10 % de FBS (v/v), b) o meio de cultura PTT-4 descrito no pedido de patente Norte- americana 2008/0248005 e no pedido de patente internacional corres- pondente WO 2007/046775 que consiste em 90 % (v/v) CMRL1066 e % (v/v) de FBS (veja, parágrafo [0183] de WO 2007/046775 e c) o meio de cultura da presente invenção PTT-6, cuja composição é aqui descrita. Nesta análise de citometria de fluxo, duas amostras diferen-

tes da população de célula-tronco mesenquimal de revestimento do cordão (CLMC) foram analisadas para cada um dos três meios de cul- tura usados.

[00122] O seguinte protocolo foi usado para a análise de citometria de fluxo. Materiais e métodos BD FACS CANDO [Bo] VO07300367 Microscópio Invertido, CKX41SF Olympus 4K40846 Centrífuga, Micro spin Tabletop 010213-1201-0003 Tripsina 10 X X0930-100 Soro Bovino Fetal GE healthcare A11-151 CD73 Humano Purificado AD2 0.1mg [Bo] 550256 CD90 Humano Purificado 5E10 ImL [Bo] 550402 CD105 Humano Purificado 266 0.1mg [Bo] 555690 IgG anticamundongo de cabra Alexa A21235 Fluor 647 (H+L) *2 mg/mL* PBS 1 X (1L) 100 ml de PBS 10 X + 900 ml de H20 destilada estéril PBA 1x (50 ml) 49,5 ml of 1XPBS + 0,5 ml de de

FBS Procedimento a) Isolamento celular e cultura da membrana de revestimento do cordão umbilical

1. Amostras de tecido de explante foram incubadas em uma placa de cultura de células e submersas no respectivo meio, em se-

guida, mantenha-as na incubadora de CO» a 37 “ºC, conforme explica- do no Exemplo 2.

2. O meio foi trocado a cada 3 dias.

3. A excrescência celular de explantes de cultura de tecidos foi monitorada sob microscopia de luz.

4. Em uma confluência de cerca de 70 %, as células foram separadas da placa por tripsinização (0,0125 % de tripsina/0,05 % de EDTA) e usadas para experimentos de citometria de fluxo.

b) Tripsinização de células para experimentos

1. Remova o meio da placa de cultura de células

2. Lave suavemente com PBS 1X estéril para remover ves- tígios de FBS, pois a FBS interfere na ação enzimática da tripsina.

3. Adicione tripsina 1X à placa de cultura de células e incu- be por 3-5 min a 37 ºC.

4. Observe as células ao microscópio para garantir que se- jam desalojadas. Neutralize a tripsina adicionando meio completo con- tendo FBS (DMEM com 10 % de FBS).

5. Use uma pipeta para quebrar aglomerados de células pipetando as células na meio contra uma parede da placa. Colete e transfira a suspensão de células para tubos de centrífuga de 50 ml

6. Adicione PBS 1X estéril à placa e enxágue. Colete a suspensão de células no mesmo tubo de centrífuga.

7. Centrifugue a 1800 rpm por 10 minutos.

8. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pélete celular com meio PBA.

c) Contagem de células

1. Certifique-se de que o hemocitômetro e sua lamínula es- tão limpos e secos, de preferência lavando-os com etanol 70 % e dei- xando-os secar antes de limpá-los com lenços Kim (papel sem fiapos).

2. Aliquote uma pequena quantidade de células em sus-

pensão em um tubo de microcentrífuga e remova-a da tampa BSC.

3. Manche as células em suspensão com um volume igual de Azul Tripano, por exemplo, a 500 ul de suspensão adicionar 500 ul de azul tripano (fator de diluição = 2X, resultando em solução de azul tripano a 0,2 %).

4. Evite a exposição das células ao azul tripano por mais de minutos, pois o azul tripano é tóxico e levará a um aumento de cé- lulas não viáveis, resultando em uma contagem de células falsa.

5. Adicione 20 ul da mistura de suspensão de células a ca- da câmara de um hemocitômetro e observe ao microscópio óptico.

a. Conte o número de células viáveis (células brilhantes; células não viáveis absorvem Azul Tripano facilmente e, portanto, são escuras) em cada quadrante do hemocitômetro para um total de 8 quadrantes na câmara superior e inferior.

A contagem total de células é dada como (número médio de células/quadrante) x 10º células/ml.

d) Manchamento das células i. Preparação antes da manchamento das células * As suspensões de células são alíquotas em 3 tubos (CD73, CD90, CD105) em duplicata e 2 tubos (controle negativo), ca- da um contendo 50.000 células.

ii. Manchamento com anticorpo primário (Ab) * Adicionar 1 ul [0,5 mg/ml de Ab] de anticorpo primário a 100 ul de suspensão de células. Incubar a 4 ºC por 45 min.

* Completar até 1ml com PBA.

* Centrifugue a 8000 rpm a 4 ºC durante 5 minutos.

* Remova o sobrenadante.

* Adicionar 1ml de PBA e suspender novamente o pélete * Centrifugue a 8000 rpm a 4 ºC durante 5 minutos.

* Remova o sobrenadante.

* Ressuspenda em 100 ul de PBA. iii. Manchamento com Ab secundário - no escuro * Adicionar 1ul [0,5 mg/ml ab] de anticorpo secundário à suspensão de células 100 ul. Incubar a 4 ºC por 30 min.

* Completar até 1ml com PBA.

* Centrifugue a 8000 rpm a 4 ºC durante 5 minutos.

* Remova o sobrenadante.

* Remova o sobrenadante * Ressuspenda em 200-300 ul PBA para análise de citome- tria de fluxo * Transferir células para tubo FACS para leitura em citome- tria de fluxo BD FACS CANDO.

[00123] Os resultados da análise de citometria de fluxo são mostra- dos nas Fig. 6a a Fig.6c. A Fig. 6a mostra a porcentagem de células- tronco do revestimento do cordão mesenquimal isoladas que expres- sam os marcadores de células-tronco CD73, CD90 e CD105 após o isolamento do tecido do cordão umbilical e cultura em DMEM/FBS 10 %, a Fig. 6b mostra a porcentagem de células-tronco do revestimento do cordão mesenquimal isoladas que expressam marcadores de célu- las-tronco CD73, CD90 e CD105 após o isolamento do tecido do cor- dão umbilical e cultura em PTT-4 e a Fig. 6c mostra a porcentagem de células-tronco de revestimento do cordão mesenquimal isoladas que expressam os marcadores de células-tronco CD73, CD90 e CD105 após o isolamento do tecido do cordão umbilical e cultura em PTT-6. Como pode ser visto na Fig. 6a, a população isolada usando DMEM/FBS 10 % como meio de cultura de cultura tem cerca de 75 % de células CD73+, 78 % de células 90+ e 80 % de células CD105+ (média de dois experimentos), enquanto após o isolamento/cultura de tecido do cordão umbilical usando meio de cultura PTT-4 (veja, Fig. 6b) o número de células-tronco mesenquimais que são CD73- positivas, CD90-positivas e CD105-positivas são cerca de 87 % (célu- las CD73+), 93 %/células CD90+) e 86 % (células CD105+) em média de duas experiências. A pureza da população de célula-tronco mesen- quimal que foi obtida por meio de cultura no meio PTT-6 da presente invenção é de pelo menos 99,0 % em relação a todos os três marca- dores (CD73, CD90, CD105), o que significa a pureza desta população de células é significativamente maior do que para a cultura usando meio PTT-4 ou DMEM/FBS 10 %. Além disso, e ainda mais importan- te, a população de célula-tronco mesenquimal obtida por meio da cul- tura em PTT-6 é essencialmente uma população de célula-tronco 100 % pura e definida. Isso torna a população de célula-tronco da presente invenção o candidato ideal para terapias baseadas em células-tronco. Assim, esta população de célula-tronco de revestimento do cordão mesenquimal pode se tornar o padrão ouro para tais abordagens tera- pêuticas baseadas em células-tronco.

[00124] Os achados mostrados na Fig. 6 são ainda corroborados pelos resultados da análise de citometria de fluxo que são mostrados nas Fig. 7a e Fig.7b. A Fig. 7a mostra a porcentagem de células- tronco de revestimento do cordão mesenquimal isoladas (células- tronco mesenquimais da membrana amniótica do cordão umbilical) que expressam os marcadores de células-tronco CD73, CD90 e CD105 e não apresentam expressão de CD34, CD45 e HLA-DR após o isolamento de tecido do cordão umbilical e cultura em meio PTT-6. Como mostrado na Fig. 7a, a população de célula-tronco mesenquimal continha 97,5 % de células viáveis, das quais 100 % expressaram ca- da um dentre CD73, CD90 e CD105 (veja, as linhas "CD73+ CD90+" e "CD73+ CD105+") enquanto 99,2 % da população de célula-tronco não expressaram CD45 e 100 % da população de célula-tronco não ex-

pressaram CD34 e HLA-DR (veja, as linhas "CD34-CD45- e" CD34- HLA-DR-). Assim, a população de célula-tronco mesenquimal obtida por cultura em meio PTT-6 é essencialmente uma população de célu- la-tronco 100 % pura e definida que atende aos critérios que as célu- las-tronco mesenquimais devem cumprir para serem usadas para te- rapia celular (95 % ou mais do a população de célula-tronco expressa CD73, CD90 e CD105, enquanto 98 % ou mais da população de célu- la-tronco carece de expressão de CD34, CD45 e HLA-DR, veja, Sen- sebe et al. "Production of mesenchymal stromal/stem cells according to good manutfacturing practices: a review", supra). Observa-se aqui que as presentes células-tronco mesenquimais da membrana amniótica aderem ao plástico em condições de cultura padrão e se diferenciam in vitro em osteoblastos, adipócitos e condroblastos, veja, patentes Norte-americanas 9.085.755, patente Norte-americana 8.287.854 ou WOZ2007/046775 e, portanto, atendem aos critérios geralmente aceito para uso de células-tronco mesenquimais em terapia celular.

[00125] A Fig.7b mostra a porcentagem de células-tronco mesen- quimais isoladas da medula óssea que expressam CD73, CD90 e CD105 e não apresentam expressão de CD34, CD45 e HLA-DR. Con- forme mostrado na Fig. 7b, a população de célula-tronco mesenquimal da medula óssea continha 94,3 % de células viáveis, das quais 100 % expressaram cada um dentre CD73, CD90 e CD105 (veja, as linhas "CD73+ CD90+" e "CD73+ CD105+") enquanto apenas 62,8 % da po- pulação de célula-tronco da medula óssea precisaram de expressão de CD45 e 99,9 % da população de célula-tronco precisaram de ex- pressão de CD34 e HLA-DR (veja, as linhas "CD34-CDA45- e" CD34- HLA-DR-). Assim, as células-tronco mesenquimais da medula óssea que são consideradas o padrão-ouro das células-tronco mesenquimais são de longe menos homogêneas/puras em termos de marcador de células-tronco do que a população de célula-tronco mesenquimal (da membrana amniótica do cordão umbilical) do presente pedido. Esta descoberta também mostra que a população de célula-tronco da pre- sente invenção pode ser a candidata ideal para terapias baseadas em células-tronco e pode se tornar o padrão ouro para abordagens tera- pêuticas baseadas em células-tronco.

4. Análise da Secreção de Proteína Marcadora de Cicatrização de Feridas em Populações de Células-Tronco Mesenquimais isoladas cultivadas no meio de cultura da invenção

[00126] Com base nos resultados altamente notáveis (obtenção de uma população de célula-tronco mesenquimal essencialmente 100 % pura e definida por cultura em PTT-6), várias populações de células- tronco mesenquimais isoladas foram cultivadas em PTT-6 e foram analisadas em relação à secreção de proteína marcadora de cicatriza- ção de feridas em comparação com a cultura em meio PTT-4 (servindo como meio de referência).

[00127] Em mais detalhes, as seguintes populações de células- tronco mesenquimais isoladas foram analisadas.

- células-tronco mesenquimais da membrana amniótica do cordão umbilical (revestimento do cordão MSC/CL-MSC). Esta popula- ção de CL-MSC foi isolada por explante de tecido de membrana de revestimento de cordão humano conforme descrito no Exemplo 2 de WOZ2007/046775 (cultura em DMEM suplementado com 10 % de soro bovino fetal, DMEM/FBS 10 %) - células-tronco mesenquimais de geléia de Wharton (WJ- MSC). Esta população de WJ-MSC foi isolada por explante de tecido (cultura em DMEM com 4.500 mg/mL de glicose e 2 mM de L- glutamina, suplementado com 10 % de soro humano/FBS e solução antibiótica) de geleia de Wharton de cordão umbilical humano, confor- me descrito por Beeravolu et al. "Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Pla-

centa." J Vis Exp. 2017; (122): 55224.

- Células tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (AT-MSC). Esta população de AT-MSC foi isolada do tecido adiposo de tecido cutâneo doado após abdominoplastia por explante de tecido (cultura em DMEM suplementado com 5 % de penicilina/estrepto- micina e 10 % de FBS), conforme descrito por Schneider et a/, "Adipo- se-derived mesenchymal stem cells from liposuction and resected fat are feasible sources for regenerative medicine" Eur J Med Res. 2017; 22:17 - Células tronco mesenquimais da medula óssea (BM- MSC). Esta população de BM-MSC foi um presente da AO Foundation, Davos, Switzerland.

- células-tronco mesenquimais da placenta (PT-MSC). Esta população de PT-MSC foi isolada da placenta, conforme descrito em Beeravolu et al. "Isolation and Characterization of Mesenchymal Stro- mal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta." J Vis Exp. 2017; (122): 55224.

Protocolo de Cultura para Cultura das MSCs isoladas * 5 milhões de MSCs de cada fonte foram semeados em placas de cultura de tecidos de 100 mm em DMEM/F12/10 % FCS por 24 horas.

* O meio foi descartado e PTT-6/PTT-4 foi adicionado à cul- tura por 24 horas.

* Descarte o meio e as células lavadas com PBS.

* 10 ml de DMEM adicionado à cultura por 24 horas.

* Descarte o meio e 5 ml! de DMEM adicionados à cultura.

* Após 24 horas de cultura, os meios condicionados foram colhidos, centrifugados para remover os resíduos celulares, o sobre- nadante aliquotado em tubos para armazenamento a -80ºC e subse- quente análise da secreção de proteína marcadora por ensaios de ci-

tocinas Ensaios de Citocinas em PTT-6 vs. Sobrenadantes dos Meios PTT-4 de MSCs de CL-MSC, WJ-MSC, MSC de Medula Óssea e Origem de MSC Adiposa

[00128] A detecção de citocinas foi realizada em sobrenadantes MSC. As medições e análises foram realizadas usando o software Luminex 200 e Xponent.

[00129] O objetivo deste experimento foi medir os níveis relativos de citocinas Multiplex (PDGF-AA, PDGF-BB, IL-10, VEGF, Ang-1 e HGF), Singleplex de TGFRB1 e citocinas Singleplex de bFGF2 em so- brenadantes de cultura de células. Os sobrenadantes são (MSC, célu- las-tronco mesenquimais; CL, revestimento do cordão; WJ, Geleia de Wharton; AT, tecido adiposo; BM, medula óssea): * CL-MSC cultivada em PTT-4 * WJ-MSC cultivada em PTT-4 * AT-MSC cultivada em PTT-4 * BM-MSC cultivada em PTT-4 * CL-MSC cultivada em PTT-6 * WJ-MSC cultivada em PTT-6 * AT-MSC cultivada em PTT-6 * BM-MSC cultivada em PTT-6

[00130] Cada amostra foi testada em triplicata (3 cavidades), exceto as amostras fornecidas em PTT-4, que foram testadas em 6 cavida- des. Além disso, as amostras CROO1A, CROO1C, CROO1ID e CRO01IG foram incluídas como controle positivo para validar o ensaio de citoci- nas (os meios condicionados de CROO1A, CROO01C, CRO01D e CRO01G não foram preparados pela cultura de células em PTT-6 ou PTT-4)

[00131] O objetivo deste experimento foi gerar perfis de citocinas de MSCs cultivadas em PTT-4 ou PTT-6 e comparar os perfis de MSCs de diferentes origens de tecidos (revestimento do cordão umbilical vs. gel de Wharton vs. tecido adiposo vs. medula óssea). O perfil lançará luz sobre qual população de célula-tronco cresceu em qual meio se- cretaria mais das citocinas de interesse, a fim de promover a cicatriza- ção de feridas.

[00132] A configuração da placa para todas as placas é descrita na Figura 8. Os seguintes acrônimos são usados no seguinte: MSC, célu- la-tronco mesenquimal; CL, revestimento do cordão; WJ, Geleia de Wharton; AT, tecido adiposo; BM, medula óssea. Análise Multiplex Informações multiplex: R&D Systems/Bio-techne cat. % LXSAHM. Este kit é o lote tt L123680, expira em 28/08/18, com os seguintes analisados: * Ang-1, angiopoietina * VEGF, fator de crescimento endotelial vascular * PDGF-AA, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-AA refere-se a homodímero ligado por dissulfeto consistindo em cadeias A, enquanto PDGF-BB consiste em um homodímero B. R&D afirma que o anticorpo PDGF-BB detecta também heterodímero PDGF-AB) * PDGF-BB * HGF, fator de crescimento de hepatócitos * IL-10, interleucina-10 Informações do Singleplex de TGFB1: R&D Systems/Bio- techne): * Kit básico, cat. % LTGMOO, lote %& P156217, recebido em 27/02/18, expira em 30/08/18.

* Componente TGFBRB1, cat. tt LTGM100, lote tt P161760, recebido em 27/02/18, expira em 27/11/19.

Informações do Singleplex de bFGF2 (usado em 19 de março de 2018): eBioscience/Thermo: * Kit básico, cat. % EPX010-10420-901, lote % 172174000, expira em 31/01/20.

* componente bFGF2, cat. tt EPX01A-12074-901, lote *& 169751102, expira em 31/12/19.

Informações do Singleplex de bFGF2 (usado em 22 de março de 2018): eBioscience/Thermo: * Kit básico, cat. % EPX010-10420-901, lote % 172174000, expira em 31/01/20.

* componente bFGF2, cat. tt EPX01A-12074-901, lote *& 166916102, expira em 31/12/19.

Informações multiplex: R&D Systems/Bio-techne cat. % LXSAHM. Este kit é o lote tt L123999, expira em 25/09/18, com os seguintes analisados: * Ang-1, angiopoietina * VEGF, fator de crescimento endotelial vascular * PDGF-AA, fator de crescimento derivado de plaquetas 2, * PDGF-BB * HGF, fator de crescimento de hepatócitos * IL-10, interleucina-10 * bFGF, fator de crescimento de fibroblastos básico Entrada de dados

[00133] A saída de dados crus está nos formatos PDF e Excel. Os dados em formato Excel são usados para processar os dados. Procedimento

[00134] A detecção de citocinas em sobrenadantes de MSC foi rea- lizada de acordo com as informações detalhadas do protocolo. Como parte desse experimento, o protocolo tem uma única alteração: O Pad. 8 no kit Multiplex não é mais usado. O motivo para descontinuar o Pad. 8 é porque o próprio protocolo de R&D Systems usa apenas os

Padrões 1 a 6. Além disso, o Pad. 8 foi validado na ClinlmMmune para apenas dois dos seis analisados que compõem o Multiplex: PDGF-BB e HGF. No caso do PDGF-BB, este analisado nunca foi detectado nos sobrenadantes. No caso do HGF, esse analisado cai na região inter- mediária da curva padrão. Uma vez que os padrões são reconstituídos usando meio de crescimento, as curvas padrão foram construídas com PTT-6 e PTT-4. As amostras de teste cultivadas em PTT-6 ou PTT-4 foram extrapoladas a partir das respectivas curvas padrão.

[00135] Os resultados foram extrapolados pelo software Luminex a partir da curva padrão específica do analisado que é gerada pelo mesmo software: o algoritmo de análise é definido como Logistic 5P Weighted com análise ponderada, usando 1/y2 para ponderação. Amostras

1. Meios PTT-4 e PTT-6 (não expostos a MSCs)

2. Sobrenadantes de MSC a serem testados

3. Opcional: sobrenadantes de CL-MSCs de diferentes do- adores; CROO1A, C, De G. Sumário do resultado dos experimentos Ensaio Singleplex de TGFB1

[00136] + Alíquota 1 de 3 usada - é mostrada na Figura 9. Todas as barras de erro são o desvio padrão das medições em triplicata.

[00137] Figura 9: Medição de singleplex de TGFB1. Como pode ser visto, as culturas CL-MSC e WJ-MSC produzem mais TGFB1 quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-4. Apenas as culturas AT-MSC e BM-MSC produziram quantidades mais ou menos iguais de TGFB1 quando cultivadas em PTT-6 ou PTT-4. Todas as barras de erro são o desvio padrão das medições em triplicata. 1º Ensaio Multiplex * Alíquota 1 de 3 usada.

* PDGF-BB e IL-10 não foram detectados em nenhuma amostra.

[00138] Os dados são representados nas Fig. 10 e 11.

[00139] Figura 10: Fig.10A Medição Multiplex de PDGF-AA. Como pode ser visto, as culturas CL-MSC, WJ-MSC, AT-MSC e BM-MSC produzem mais PDGF-AA quando cultivadas em PTT-4 do que quando cultivadas em PTT-6. Todas as barras de erro são o desvio padrão das medições em triplicata. Fig. 10B Medição multiplex de VEGF. Como pode ser visto, as culturas CL-MSC, WJ-MSC, AT-MSC e BM-MSC produzem mais VEGF quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-4. Todas as barras de erro são o desvio padrão das medições em triplicata. Fig.10C Medição Multiplex de Ang-1. Como pode ser visto, as culturas CL-MSC e WJ-MSC produzem muito mais Ang-1 quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-

[00140] Figura 11: Medição multiplex de HGF. Como pode ser vis- to, as culturas CL-MSC e WJ-MSC produzem muito mais HGF quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-4. As culturas AT-MSC e BM-MSC essencialmente não produziram qualquer HGF. Todas as barras de erro são o desvio padrão das medições em triplica- ta. Ensaio Multiplex (com bFGF incluído) * Alíquota 3 de 3 usada. Os dados são mostrados na Fig. 12-14.

[00141] Figura 12: Medição multiplex de PDGF-AA. Como pode ser visto, as culturas CL-MSC e WJ-MSC produzem mais PDGF-AA quan- do cultivadas em PTT-4 do que quando cultivadas em PTT-6. As cultu- ras AT-MSC e BM-MSC produziram quantidades iguais de PDGF-AA em ambos os meios de cultura. Todas as barras de erro são o desvio padrão das medições em triplicata.

[00142] Figura 13: Fig.13A Medição Multiplex de VEGF. Como po- de ser visto, as culturas CL-MSC, WJ-MSC, AT-MSC e BM-MSC pro- duzem mais VEGF quando cultivadas em PTT-6 do que quando culti- vadas em PTT-4. Todas as barras de erro são o desvio padrão das medições em triplicata. Fig. 13B Medição Multiplex do Ensaio Multi- plex de Ang-1. Como pode ser visto, as culturas CL-MSC e WJ-MSC produzem muito mais Ang-1 quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-4. As culturas AT-MSC e BM-MSC essen- cialmente não produziram qualquer Ang-1. Todas as barras de erro são o desvio padrão das medições em triplicata. Fig.13C. Medição multiplex de HGF. Como pode ser visto, as culturas CL-MSC e WJ- MSC produzem muito mais HGF quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-4. As culturas AT-MSC e BM-MSC essen- cialmente não produziram nenhum HGF. Todas as barras de erro são o desvio padrão das medições em triplicata.

[00143] Figura 14: Medição multiplex de PFGF. Como pode ser vis- to, as culturas CL-MSC e WJ-MSC produzem mais bFGF quando culti- vadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-4. As culturas AT- MSC e BM-MSC produziram quantidades iguais de bFGF quando cul- tivadas em PTT-4 e PTT-6. Todas as barras de erro são o desvio pa- drão das medições em triplicata.

[00144] Deve-se notar que as amostras de bFGF são muito baixas em abundância, no ou próximo ao limite inferior de detecção.

[00145] As Figuras 15 a 21 representam um resumo dos dados ob- tidos em diferentes experimentos.

[00146] Figura 15: Resume a medição de TGFB1 em 5 experimen- tos diferentes (170328, 170804, 170814, 180105, 180226). A intensi- dade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de TGFR entre os experimentos está representada no gráfico abaixo no lado esquerdo. MF! para as curvas padrão TGFR obtidas no meio PTT- 4 e PTT-6 é mostrada nos gráficos acima. O gráfico abaixo no lado direito mostra que as culturas CL-MSC e WJ-MSC produzem mais TGFRB1 quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-4. As culturas de AT-MSC e BM-MSC produziram quantidades iguais de TGFB1 quando cultivadas em PTT-6 ou PTT-4. Todas as barras de erro são desvios padrão de diferentes medições para os ex- perimentos 170328, 170804, 170814, 180105, 180226.

[00147] Figura 16: Resume a medição de Ang-1 em 6 experimen- tos diferentes (170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226). À intensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas pa- drão de Ang-1 em todos os experimentos é representada no gráfico abaixo no lado esquerdo. A MFI para as curvas padrão Ang-1 obtidas no meio PTT-4 e PTT-6 é mostrada nos gráficos acima. O gráfico abaixo no lado direito mostra que as culturas L-MSC e WJ-MSC pro- duzem mais Ang-1 quando cultivadas em PTT-6 do que quando culti- vadas em PTT-4. Apenas as culturas AT-MSC e BM-MSC produziram quantidades essencialmente iguais de Ang-1 quando cultivadas em PTT-6 ou PTT-4. Todas as barras de erro são desvios padrão de dife- rentes medições para os experimentos 170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226.

[00148] Figura 17: Resume a medição de PDGF-BB em 6 experi- mentos diferentes (170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226). A intensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de PDGF-BB em todos os experimentos está represen- tada no gráfico abaixo no lado esquerdo. MFI para as curvas padrão de PDGF-BB obtidas no meio PTT-4 e PTT-6 são mostradas nos gráfi- cos acima. Notavelmente, em nenhuma das experiências foi detectado PDGF-BB.

[00149] Figura 18: Resume a medição de PDGF-AA em 6 experi-

mentos diferentes (170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226). A intensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de PDGF-AA entre os experimentos é representada no gráfico abaixo no lado esquerdo. MFI para as curvas padrão de PDGF- AA obtidas no meio PTT-4 e PTT-6 são mostradas nos gráficos acima. O gráfico abaixo no lado direito representa que as culturas CL-MSC, AT-MSC e BM-MSC e WJ-MSC produzem ligeiramente mais PDGF- AA quando cultivadas em PTT-4 do que quando cultivadas em PTT-6. Todas as barras de erro são o desvio padrão das medições dos expe- rimentos 170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226.

[00150] Figura 19: Resume a medição de IL-10 em 6 experimentos diferentes (170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226). A in- tensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de IL-10 entre os experimentos está representada no gráfico abaixo no lado esquerdo. A MFI para as curvas padrão IL-10 obtidas no meio PTT-4 e PTT-6 é mostrada nos gráficos acima. Notavelmente, em ne- nhum dos experimentos IL-10 foi detectado.

[00151] Figura 20: Resume a medição de VEGF em 6 experimen- tos diferentes (170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226). À intensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas pa- drão VEGF entre os experimentos é representada no gráfico abaixo no lado esquerdo. A MFI para as curvas padrão VEGF obtidas no meio PTT-4 e PTT-6 é mostrada nos gráficos acima. O gráfico abaixo no lado direito mostra que as culturas CL-MSC, AT-MSC e BM-MSC e WJ-MSC produzem mais VEGF quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-4. Todas as barras de erro são desvios pa- drão de diferentes medições para os experimentos 170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226.

[00152] Figura 21: Resume a medição de HGF em 6 experimentos diferentes (170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226). A in-

tensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de HGF em experimentos é representada no gráfico abaixo no lado esquerdo. A MFI para as curvas padrão de HGF obtidas no meio PTT- 4 e PTT-6 é mostrada nos gráficos acima. O gráfico abaixo no lado direito mostra que as culturas CL-MSC e WJ-MSC produzem mais HGF quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-

4. Por outro lado, as culturas AT-MSC e BM-MSC não produziram tan- to HGF como as outras culturas. Todas as barras de erro são desvios padrão de diferentes medições para os experimentos 170602, 170511, 170414, 170224, 180105, 180226. Ensaios de Citocinas nos Meios PTT-6 vs. PTT-4 ou Sobrenadan- tes DMEM/F12 de MSCs de CL-MSC, WJ-MSC e Origem de MSC de Placenta

[00153] A detecção de citocinas foi realizada em Sobrenadantes MSC. As medições e análises foram conduzidas conforme descrito acima.

[00154] O objetivo deste experimento foi medir os níveis relativos de citocinas Multiplex (PDGF-AA, PDGF-BB, IL-10, VEGF, Ang-1 e HGF), citocinas Singleplex de TGFB1 e Singleplex de bFGF2 em so- brenadantes de cultura de células. Os sobrenadantes são obtidos de células-tronco mesenquimais do revestimento do cordão umbilical (CL), da Geleia de Wharton (WJ) e da placenta. As células-tronco me- senquimais foram cultivadas em meio PTT-6, PPT-4 ou DMEM/F12.

* CL-MSC cultivada em PTT-4 * WJ-MSC cultivada em PTT-4 * MSC placentária cultivada em PTT-4 * CL-MSC cultivada em PTT-6 * WJ-MSC cultivada em PTT-6 * MSC placentária cultivada em PTT-6 * CL-MSC cultivada em DMEM/F12

* WJ-MSC cultivada em DMEM/F12

[00155] Cada amostra foi testada em triplicata, exceto as amostras de sobrenadante da placenta. O objetivo deste experimento foi gerar perfis de citocinas de MSCs cultivadas em PTT-4 ou PTT-6 e comparar os perfis de MSCs de diferentes origens de tecido (revestimento do cordão umbilical vs. Geleia de Wharton vs. MSC placentária). As me- dições de citocinas foram realizadas como descrito acima. O perfil lan- çará luz sobre qual população de célula-tronco cresceu, cujo meio se- cretaria mais das citocinas de interesse, a fim de promover a cicatriza- ção de feridas.

[00156] Figura 22: Medição de singleplex de TGFB1. A intensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas TGFB1 padrão entre os experimentos é representada no gráfico do lado esquerdo. Como pode ser visto o gráfico do lado direito de CL-MSC, WJ-MSC e MSC placentária produzem mais TGFB1 quando cultivado em PTT-6 do que quando cultivado em PTT-4 ou DMEM/F12 (referido apenas como DMEM na Fig. 22).

[00157] Figura 23: Resume a medição de PDGF-BB nos sobrena- dantes analisados de CL-MSC, WJ-MSC e MSC placentária cultivados em PTT-6, PTT-4 ou DMEM / F12. A intensidade de fluorescência mé- dia (MFI) medida para as curvas padrão de PDGF-BB entre os expe- rimentos é representada no gráfico do lado esquerdo. Notavelmente, em nenhuma das experiências foi detectado PDGF-BB.

[00158] Figura 24: Resume a medição de IL-10 nos sobrenadantes analisados de CL-MSC, WJ-MSC e MSC placentária cultivados em PTT-6, PTT-4 ou DMEM/F12. A intensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de VEGF entre os experimentos é representada no gráfico do lado esquerdo. S6 denota o padrão mais baixo usado no ensaio. Quaisquer amostras abaixo são consideradas abaixo da detecção. Como pode ser visto no gráfico do lado direito,

todas as CL-MSC, WJ-MSC e MSC placentária produzem níveis detec- táveis de I1L-10 quando cultivadas em PTT-6, enquanto pouca ou ne- nhuma IL-10 foi detectada quando as MSC's foram cultivadas em PTT- 4 ou DMEM/F12

[00159] Figura 25: Resume a medição de VEGF nos sobrenadantes analisados de CL-MSC, WJ-MSC e MSC placentária cultivados em PTT-6, PTT-4 ou DMEM/F12. A intensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de VEGF entre os experimentos é representada no gráfico do lado esquerdo. S1 denota o padrão mais alto usado no ensaio. Quaisquer amostras que caiam acima são con- sideradas extrapoladas (muito concentradas). Como pode ser visto no gráfico do lado direito, todas as CL-MSC, WJ-MSC e MSC placentária produzem níveis muito mais elevados de VEGF quando cultivadas em PTT-6 em comparação com quando as MSC foram cultivadas em PTT- 4 ou DMEM/F12.

[00160] Figura 26: Resume a medição multiplex de bFGF. A inten- sidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de PDGF-AA entre os experimentos está representada no gráfico do lado esquerdo. Como pode ser visto a partir do gráfico no lado direito, CL- MSC e WJ-MSC cultivadas produzem mais bFGF quando cultivadas em PTT-6 do que quando cultivadas em PTT-4. Como pode ser visto, todas as CL-MSC, WJ-MSC e MSC placentária produzem níveis muito mais baixos de bFGF quando cultivadas em PTT-6 em comparação com quando as MSC foram cultivadas em PTT-4 ou DMEM/F12.

[00161] Figura 27: Resume a medição de PDGF-AA. A intensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de PDGF- AA entre os experimentos está representada no gráfico do lado es- querdo. S6 denota o padrão mais baixo usado no ensaio. Quaisquer amostras abaixo são consideradas abaixo da detecção. Como pode ser visto, todas as CL-MSC, WJ-MSC e MSC placentária produzem níveis mais elevados de PDGF-AS quando cultivadas em PTT-6 em comparação com quando as MSC foram cultivadas em PTT-4 ou DMEM/F12.

[00162] Figura 28: Resume a medição de Ang-1. A intensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de Ang-1 en- tre os experimentos é representada no gráfico do lado esquerdo. S1 denota o padrão mais alto usado no ensaio. Quaisquer amostras que caiam acima são consideradas extrapoladas (muito concentradas). O gráfico do lado direito mostra que todas as CL-MSC, WJ-MSC e MSC placentária produzem níveis muito mais elevados de Ang-1 quando cultivadas em PTT-6 em comparação até quando as MSC foram culti- vadas em PTT-4 ou DMEM/F12.

[00163] Figura 29: Resume a medição de HGF. A intensidade de fluorescência média (MFI) medida para as curvas padrão de HGF en- tre os experimentos é representada no gráfico do lado esquerdo. O gráfico do lado direito mostra que todas as CL-MSC, WJ-MSC e MSC placentária produzem níveis muito mais elevados de Ang-1 quando cultivadas em PTT-6 em comparação com quando as MSC foram culti- vadas em PTT-4 ou DMEM/F12.

[00164] A partir dos experimentos descritos acima, o seguinte pode ser concluído. Quando as células-tronco mesenquimais, em particular as células-tronco mesenquimais isoladas de um compartimento do cordão umbilical ou isoladas da placenta, são cultivadas em meio PTT- 6, a secreção dos fatores Angiopoietina 1 (Ang-1), T]GF-B1, VEGF, e o HGF pela população de célula-tronco mesenquimal é significativamen- te aumentado quando comparado ao seu nível de produção em meio PTT-4 ou um meio de cultura disponível comercialmente, como DMEM/F12. Notavelmente, o meio PTT-6 é capaz de aumentar a pro- dução/secreção desses fatores, independentemente do ambien- te/compartimento natural da população do tronco mesenquimal.

[00165] Uma vez que o meio PTT-6 causa a secreção de todos os Ang-1, TGF-B1, VEGF e HGF (o envolvimento dos quais na cicatriza- ção de feridas é conhecido, conforme discutido aqui) em populações de células-tronco mesenquimais, está claro que o meio PTT-6 tem o efeito de induzir ou melhorar as propriedades de cicatrização de feri- das de uma ampla gama de população de célula-tronco mesenquimal, independentemente do ambiente/compartimento natural da população- tronco mesenquimal da qual as células-tronco mesenquimais foram originalmente derivadas - é observado aqui novamente que o Experi- mento 4 foi realizado com populações de células que foram isoladas de seu ambiente natural antes do cultivo em PTT-6.

[00166] Além disso, o cultivo de células-tronco mesenquimais em PTT-6 por explante de tecido fornece uma população de célula-tronco mesenquimal altamente homogênea (que continha 97,5 % de células viáveis, das quais 100 % expressavam cada um dentre CD73, CD90 e CD105, enquanto 99,2 % da população de célula-tronco não expres- savam CD45 e 100 % da população de célula-tronco não expressaram CD34 e HLA-DR (ver as linhas "CD34-CD45- e" CD34-HLA-DR-) da membrana amniótica do umbilical. Desde o cultivo de uma população de célula-tronco mesenquimal de geléia de Wharton em PTT-6 tem o mesmo efeito positivo na produção das citocinas Ang-1, TGF-B1, VEGF e HGF que na produção dessas citocinas nas células-tronco do revestimento do cordão, pode-se esperar que o cultivo da geleia de Wharton em PTT-6 também resultará em uma população de célula- tronco gelatinosas mesenquimais de Wharton altamente homogênea. Portanto, também pode-se esperar que o explante de tecido de outros compartimentos do cordão umbilical, como o cultivo do vaso do cordão umbilical, resultará em uma população de célula-tronco mesenquimal perivascular (PV) de homogeneidade semelhante. Da mesma forma, o explante de tecido da placenta, incluindo a membrana amniótica da placenta por cultivo em PTT-6, pode produzir uma população de célu- la-tronco mesenquimal da placenta de homogeneidade semelhante. Assim, o presente fornece uma metodologia geralmente aplicável para obter uma população de célula-tronco mesenquimal, em que pelo me- nos cerca de 91 % ou mais, cerca de 92 % ou mais, cerca de 93 % ou mais, cerca de 94 % ou mais, cerca de 95 % ou mais, cerca de 96 % ou mais, cerca de 97 % ou mais, cerca de 98 % ou mais cerca de 99 % ou mais células da população de célula-tronco mesenquimal isolada expressam cada um dentre CD73, CD90 e CD105 e não têm expres- são de cada um dentre CD34, CD45 e HLA- DR.

[00167] Ainvenção também é caracterizada pelos seguintes itens.

1. Um Método para induzir ou melhorar as propriedades de cicatrização de feridas de uma população de célula-tronco mesenqui- mal, o método que compreende o cultivo da população de célula- tronco mesenquimal em um meio de cultura que compreende DMEM (meio de Eagle modificado de Dulbecco), F12 (Meio F12 de Ham), M171 (Meio 171) e FBS (Soro Bovino Fetal).

2. O método do item 1, em que a população de célula- tronco mesenquimal é selecionada a partir do grupo que consiste em uma população de célula-tronco mesenquimal do cordão umbilical, uma população de célula-tronco mesenquimal da placenta, uma popu- lação de célula-tronco mesenquimal da junção cordão-placenta, uma população de célula-tronco mesenquimal do sangue do cordão, uma população de célula-tronco mesenquimal da medula óssea e uma po- pulação de célula-tronco mesenquimal derivada do tecido adiposo.

3. O método do item 2, em que a população de célula- tronco mesenquimal do cordão umbilical é selecionada a partir do gru- po que consiste em uma população de célula-tronco mesenquimal do âmnio (AM), uma população de célula-tronco mesenquimal perivascu- lar (PV), uma população de célula-tronco mesenquimal de geléia de

Wharton (WJ), uma população de célula-tronco mesenquimal da membrana amniótica do cordão umbilical e uma população de célula- tronco mesenquimal mista do cordão umbilical (MC).

4. O método de qualquer um dos itens 1 a 3, em que o meio de cultura compreende DMEM em uma concentração final de cerca de 55 a 65 % (v/v), F12 em uma concentração final de cerca de 5a 15% (v/v), M171 em uma concentração final de cerca de 15 a 30 % (v/v) e FBS em uma concentração final de cerca de 1 a 8 % (v/v).

5. O método do item 4, em que o meio de cultura compre- ende DMEM em uma concentração final de cerca de 57,5 a 62,5% (v/v), F12 em uma concentração final de cerca de 7,5 a 12,5 % (v/v), M171 em uma concentração final de cerca de 17,5 a 25,0 % (v£v) e FBS em uma concentração final de cerca de 1,75 a 3,5 % (v/v).

6. O método do item 5, em que o meio de cultura compre- ende DMEM em uma concentração final de cerca de 61,8 % (v/v), F12 em uma concentração final de cerca de 11,8 % (v/v), M171 em uma concentração final de cerca de 23,6 % (v/v) e FBS em uma concentra- ção final de cerca de 2,5 % (v/v).

7. O método de qualquer um dos itens 1 a 6, em que o meio de cultura compreende ainda Fator de Crescimento Epidérmico (EGF) em uma concentração final de cerca de 1 ng/ml a cerca de 20 ng/ml.

8. O método do item 7, em que o meio de cultura compre- ende EGF em uma concentração final de cerca de 10 ng/mL.

9. O método de qualquer um dos itens 1 a 8, em que o meio de cultura compreende Insulina em uma concentração final de cerca de 1 ug/ml a 10 uo/ml.

10. O método do item 9, em que o meio de cultura compre- ende insulina em uma concentração final de cerca de 5 ug/ml.

11. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 10, em que o meio de cultura compreende ainda pelo menos um dos se-

guintes suplementos: adenina, hidrocortisona e sal de sódio de 3,3',5- Tri-iodo-L-tironina (T3).

12. O método de qualquer um dos itens 1 a 11, em que o meio de cultura compreende todos os três dentre adenina, hidrocorti- sona e sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo-L-tironina (T3).

13. O método do item 12 ou 13, em que o meio de cultura compreende adenina em uma concentração final de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 ug/ml de adenina, hidrocortisona em uma concentração final de cerca de 0,1 a cerca de 10 pg/ml de hidrocortisona e/ou sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo-L-tironina (T3) em uma concentração final de cerca de 0,5 a cerca de 5 ng/mL.

14. O método de qualquer um dos itens 1 a 13, em que o cultivo da população de célula-tronco mesenquimal no meio de cultura, como definido em qualquer um dos itens 1 a 13 anteriores, resulta em um aumento da expressão e/ou secreção de pelo menos um dentre Angiopoietina 1 (Ang-1), TGF-B (em particular TGF-B1), VEGF e HGF pela população de célula-tronco mesenquimal em relação a um meio de cultura de referência que não compreende todo o DMEM (meio de Eagle modificado de Dulbecco), F12 (Meio F12 de Ham), M171 (Meio 171) e FBS (Soro Bovino Fetal).

15. O método do item 14, em que o meio de referência con- siste em 90 % (v/v) de CMRL1066 e 10 % (v/v) de FBS.

16. O método de qualquer um dos itens anteriores, em que a população de célula-tronco mesenquimal foi isolada de seu ambiente natural antes do cultivo no meio de cultura, como definido em qualquer um dos itens anteriores 1 a 13.

17. O método de qualquer um dos itens 1 a 15, compreen- dendo o isolamento da população de célula-tronco mesenquimal de um ambiente de tecido natural pelo cultivo do tecido natural no meio de cultura de células, como definido em qualquer um dos itens 1 a 13 anteriores.

18. Método do item 17, em que o tecido é um tecido do cor- dão umbilical.

19. O método do item 18, em que o tecido do cordão umbi- lical é selecionado a partir do grupo que consiste em tecido de todo o cordão umbilical, tecido que compreende a membrana amniótica do cordão umbilical, tecido que compreende geleia de Wharton, tecido que compreende a membrana amniótica, o âmnio e geleia de Wharton, Os vasos sanguíneos isolados do cordão umbilical, a geleia de Whar- ton separada dos outros componentes do tecido do cordão umbilical e a membrana amniótica isolada do cordão umbilical.

20. O método do item 17, em que o tecido compreende ou é tecido da membrana amniótica da placenta.

21. O método de qualquer um dos itens anteriores 17 a 20, em que o tecido do cordão umbilical é um pedaço de todo o cordão umbilical, um pedaço da membrana amniótica do cordão umbilical ou um pedaço da membrana amniótica da placenta.

22. O método de qualquer um dos itens 19 a 22, compre- endendo a cultura do tecido do cordão umbilical ou do tecido da mem- brana amniótica da placenta até que a excrescência celular da popula- ção de célula-tronco mesenquimal da membrana amniótica atinja cer- ca de 70-80 % de confluência.

23. O método do item 22, compreendendo a remoção da população de célula-tronco mesenquimal do recipiente de cultivo usa- do para o cultivo.

24. O método do item 23, em que a remoção da população de célula-tronco mesenquimal do recipiente de cultivo é realizada por tratamento enzimático.

25. O método do item 24, em que o tratamento enzimático compreende tripsinação.

26. O método de qualquer um dos itens 23 a 25, em que a população de célula-tronco mesenquimal é transferida para subcultura para um recipiente de cultivo para subcultura.

27. O método de qualquer um dos itens 1 a 16, em que a população de célula-tronco mesenquimal é transferida para cultivo pa- ra um recipiente de cultivo para subcultura.

28. O método do item 26 ou 27, em que a população de cé- lulas mesenquimais é suspensa para cultivo ou subcultura a uma con- centração de 1,0 x 10º células/ml.

29. O método do item 28, em que a população de célula- tronco mesenquimal é subcultivada em um meio de cultura como defi- nido em qualquer um dos itens 1 a 13.

30. O método do item 29, em que a população de célula- tronco mesenquimal é subcultivada até que as células-tronco mesen- quimais atinjam cerca de 70-80 % de confluência.

31. O método de qualquer um dos itens 26 a 30, em que a cultura ou subcultura é realizada em um biorreator autossutficiente.

32. O método do item 31, em que o biorreator é seleciona- do a partir do grupo que consiste em um biorreator de placa paralela, um biorreator de fibra oca e um biorreator microfluídico.

33. O método de qualquer um dos itens anteriores, em que o cultivo é realizado em uma incubadora de cultura de células de CO? a uma temperatura de 37 ºC.

34. O método do item 33, compreendendo a remoção da população de célula-tronco mesenquimal do recipiente de cultivo usa- do para o (sub)cultivo.

35. O método do item 34, em que a remoção da população de célula-tronco mesenquimal do recipiente de cultivo é realizada por tratamento enzimático.

36. Método do item 35, em que o tratamento enzimático compreende tripsinação.

37. O método do item 36, compreendendo ainda a coleta da população de célula-tronco mesenquimal isolada.

38. O método de qualquer um dos itens anteriores, em que pelo menos cerca de 90 % ou mais, cerca de 91 % ou mais, cerca de 92 % ou mais, cerca de 93 % ou mais, cerca de 94 % ou mais, cerca de 95 % ou mais, cerca de 96 % ou mais, cerca de 97 % ou mais, cer- ca de 98 % ou mais cerca de 99 % ou mais das células-tronco mesen- quimais isoladas expressam os seguintes marcadores: CD73, CD90 e CD105.

39. O método de qualquer um dos itens anteriores, em que pelo menos cerca de 90 % ou mais, cerca de 91 % ou mais, cerca de 92 % ou mais, cerca de 93 % ou maise, cerca de 94 % ou mais, cerca de 95 % ou mais, cerca de 96 % ou mais, cerca de 97 % ou mais, cer- ca de 98 % ou mais cerca de 99 % ou mais das células-tronco mesen- quimais isoladas faltam expressão dos seguintes marcadores: CD34, CD45 e HLA-DR (Antígeno Leucocitário Humano - relacionado ao an- tígeno D).

40. Método, de acordo com qualquer um dos itens 38 ou 39, em que cerca de 97 % ou mais, cerca de 98 % ou mais cerca de 99 % ou mais das células-tronco mesenquimais isoladas expressam CD73, CD90 e CD105 e não têm expressão de CD34, CD45 e HLA- DR.

41. O método de qualquer um dos itens anteriores, com- preendendo ainda a preservação da população de célula-tronco/pro- genitora isolada para uso posterior.

42. O método do item 41, em que a preservação é realizada por criopreservação.

43. Uma população-tronco mesenquimal isolada, em que pelo menos cerca de 90 % ou mais células da população de célula-

tronco expressam cada um dos seguintes marcadores: CD73, CD90 e CD105.

44. A população de célula-tronco mesenquimal do item 43, em que pelo menos cerca de 90 % ou mais células da população de célula-tronco não expressam os seguintes marcadores: CD34, CD45 e HLA-DR.

45. A população de célula-tronco mesenquimal do item 44, em que pelo menos cerca de 91 % ou mais, cerca de 92 % ou mais, cerca de 93 % ou mais, cerca de 94 % ou mais, cerca de 95 % ou mais, cerca de 96 % ou mais, cerca de 97 % ou mais, cerca de 98 % ou mais cerca de 99 % ou mais células da população de célula-tronco mesenquimal isolada expressam cada um dentre CD73, CD90 e CD105 e não têm expressão de cada um dentre CD34, CD45 e HLA- DR.

46. A população de célula-tronco mesenquimal de qualquer um dos itens 43 a 45, em que a população de célula-tronco mesen- quimal é selecionada a partir do grupo que consiste em uma popula- ção de célula-tronco mesenquimal do cordão umbilical, uma população de célula-tronco mesenquimal da placenta, uma população de célula- tronco mesenquimal do sangue do cordão, uma população de célula- tronco mesenquimal da medula óssea e uma população de célula- tronco mesenquimal derivada de tecido adiposo.

47. A população de célula-tronco mesenquimal de qualquer um dos itens 43 a 46, em que a população de célula-tronco mesen- quimal do cordão umbilical é selecionada a partir do grupo que consis- te em uma população de célula-tronco mesenquimal do âmnio (AM), uma população de célula-tronco mesenquimal perivascular (PV), uma população de célula-tronco mesenquimal de geleia de Wharton (WJ), uma população de célula-tronco mesenquimal da membrana amniótica do cordão umbilical e uma população de célula-tronco mesenquimal mista do cordão umbilical (MC).

48. A população de célula-tronco mesenquimal de qualquer um dos itens 43 a 47, em que a população pode ser obtida pelo méto- do definido em qualquer um dos itens 1 a 42.

49. A população de célula-tronco mesenquimal de qualquer um dos itens 43 a 48, em que a população é obtida pelo método como definido em qualquer um dos itens 1 a 42.

50. Composição farmacêutica compreendendo uma popu- lação de célula-tronco mesenquimal isolada, como definido em qual- quer um dos itens 43 a 47, em que pelo menos cerca de 90 % ou mais células da população de célula-tronco expressam cada um dos seguin- tes marcadores: CD73, CD90 e CD105 e falta expressão de cada um dos seguintes marcadores: CD34, CD45 e HLA-DR.

51. A composição farmacêutica do item 50, em que a com- posição farmacêutica é adaptada para aplicação sistêmica ou tópica.

52. A composição farmacêutica do item 50 ou 51, compre- endendo ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.

53. Método para preparar um meio de cultura adequado para induzir ou melhorar as propriedades de cicatrização de feridas de uma população de célula-tronco mesenquimal, o método que compre- ende a mistura para obter um volume final de 500 ml de meio de cultu- ra: |. 250 ml! de DMEM ii. 118 ml de M171 iii. 118 ml de DMEM/F12 iv. 12,5 ml de Soro Bovino Fetal (FBS) (concentração final de 2,5 %)

54. O método do item 53, compreendendo ainda adicionar v. 1 ml de solução-mãe de EGF (5 ug/ml) para atingir uma concentração final de 10 ng/ml)

vi. Solução-mãe de 0,175 ml de insulina (14,28 mg/ml) para atingir uma concentração final de 5 pg/ml.

55. O método do item 53 ou 54, compreendendo ainda adi- cionar ao DMEM um ou mais dos seguintes suplementos: adenina, hi- drocortisona, sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo-L-tironina (T3), atingindo assim um volume total de 500 ml de meio de cultura.

56. O método do item 55, em que a concentração final dos suplementos no DMEM é a seguinte: cerca de 0,05 a 0,1 ug/ml de adenina, por exemplo cerca de 0,025 pg/ml de adenina, cerca de 1 a 10 ug/ml de hidrocortisona, cerca de 0,5 a 5 ng/ml de sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo-L- tironina (T3), por exemplo 1,36 ng/ml de sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo- L-tironina (T3).

57. Um meio de cultura de células que pode ser obtido pelo método de qualquer um dos itens 53 a 56.

58. Método para induzir ou melhorar as propriedades de cicatrização de feridas de uma população de célula-tronco mesenqui- mal, que compreende o cultivo de tecido de membrana amniótica no meio de cultura preparado pelo método como definido em qualquer um dos itens 53 a 56.

59. Método do item 58, em que a população de célula- tronco mesenquimal é selecionada a partir do grupo que consiste em uma população de célula-tronco mesenquimal do cordão umbilical, uma população de célula-tronco mesenquimal da placenta, uma popu- lação de célula-tronco mesenquimal do sangue do cordão, uma popu- lação de célula-tronco mesenquimal da medula óssea e uma popula- ção de célula-tronco mesenquimal derivada do tecido adiposo.

60. O método do item 59, em que a população de célula- tronco mesenquimal do cordão umbilical é selecionada a partir do gru-

po que consiste em uma população de célula-tronco mesenquimal do âmnio (AM), uma população de célula-tronco mesenquimal perivascu- lar (PV), uma população de célula-tronco mesenquimal de geléia de Wharton (WJ), uma população de célula-tronco mesenquimal da membrana amniótica do cordão umbilical e uma população de célula- tronco mesenquimal mista do cordão umbilical (MC).

61. Meio de cultura de células, que compreende: - DMEM na concentração final de cerca de 55 a 65 % (v/v), - F12 em uma concentração final de cerca de 5 a 15 % (vv), - M171 em uma concentração final de cerca de 15 a 30 % (vlv) e - FBS em uma concentração final de cerca de 1 a 8 % (v/v).

62. O meio de cultura de células do item 61, em que o meio de cultura compreende DMEM na concentração final de cerca de 57,5 a 62,5 % (v/v), F12 em uma concentração final de cerca de 7,5 a 12,5 % (v/v), M171 em uma concentração final de cerca de 17,5 a 25,0 % (v/v) e FBS em uma concentração final de cerca de 1,75 a 3,5 % (v/v).

63. O meio de cultura de células do item 62, em que o meio de cultura compreende DMEM em uma concentração final de cerca de 61,8 % (v/v), F12 em uma concentração final de cerca de 11,8 % (v/v), M171 em uma concentração final de cerca de 23,6 % (v/v) e FBS em uma concentração final de cerca de 2,5 % (v/v).

64. O meio de cultura de células de qualquer um dos itens 61 a 62, em que o meio de cultura compreende ainda Fator de Cres- cimento Epidérmico (EGF) em uma concentração final de cerca de 1 ng/ml a cerca de 20 ng/ml.

65. Meio de cultura de células, de acordo com qualquer um dos itens 61 a 65, em que o meio de cultura compreende EGF em uma concentração final de cerca de 10 ng/ml.

66. Meio de cultura de células, de acordo com qualquer um dos itens 61 a 65, em que o meio de cultura compreende insulina em uma concentração final de cerca de 1 ug/ml a 10 pg/ml.

67. Meio de cultura de células, de acordo com o item 66, em que o meio de cultura compreende insulina em uma concentração final de cerca de 5 pg/ml.

68. O meio de cultura de células, de acordo com qualquer um dos itens 61 a 67, em que o meio de cultura compreende ainda pe- lo menos um dos seguintes suplementos: adenina, hidrocortisona e sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo-L-tironina (T3) .

69. O meio de cultura de células, de acordo com o item 68, em que o meio de cultura compreende todos os três dentre adenina, hidrocortisona e sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo-L-tironina (T3).

70. O meio de cultura de células do item 68 ou 69, em que o meio de cultura compreende adenina em uma concentração final de cerca de 0,05 a cerca de 0,1 ug/ml de adenina, hidrocortisona em uma concentração final de cerca de 1 a cerca de 10 ug/ml de hidrocortisona e/ou sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo-L-tironina (T3) em uma concentra- ção final de cerca de 0,5 a cerca de 5 ng/mL.

71. O meio de cultura de células de qualquer um dos itens 61 a 70, em que 500 ml do meio de cultura de células compreende: |. 250 ml! de DMEM ii. 118 ml de M171 iii. 118 ml de DMEM/F12 iv. 12,5 ml de Soro Bovino Fetal (FBS) (concentração final de 2,5 %)

72. O meio de cultura de células do item 71, compreenden- do ainda v. EGF em uma concentração final de 10 ng/ml vi. Insulina na concentração final de 5 pg/ml.

vi. Insulina 0,175 ml (concentração final de 5 pg/ml)

73. O meio de cultura de células do item 71 ou 72, compre- endendo ainda adenina em uma concentração final de cerca de 0,05 a cerca de 0,1 ug/ml de adenina, hidrocortisona em uma concentração final de cerca de 1 a cerca de 10 ug/ml de hidrocortisona e/ou 3, sal de sódio de 3',5-Tri-iodo-L-tironina (T3) em uma concentração final de cerca de 0,5 a cerca de 5 ng/ml.

74. O uso de um meio de cultura de células como definido em qualquer um dos itens 61 a 73 para induzir ou melhorar as proprie- dades de cicatrização de feridas de uma população de célula-tronco mesenquimal.

75. O uso de um meio de cultura de células como definido em qualquer um dos itens 61 a 73 para o isolamento de uma popula- ção de célula-tronco mesenquimal.

76. O uso do item 74 ou 75, em que a população de célula- tronco mesenquimal é selecionada a partir do grupo que consiste em uma população de célula-tronco mesenquimal do cordão umbilical, uma população de célula-tronco mesenquimal da placenta, uma popu- lação de célula-tronco mesenquimal do sangue do cordão, uma popu- lação de célula-tronco mesenquimal da medula óssea e uma popula- ção de célula-tronco mesenquimal derivada de tecido adiposo.

77. O uso do item 76, em que a população de célula-tronco mesenquimal do cordão umbilical é selecionada a partir do grupo que consiste em uma população de célula-tronco mesenquimal do âmnio (AM), uma população de célula-tronco mesenquimal perivascular (PV), uma população de célula-tronco mesenquimal de geléia de Wharton (WJ), uma população de célula-tronco mesenquimal da membrana amniótica do cordão umbilical e uma população de célula-tronco me- senquimal mista do cordão umbilical (MC).

78. O uso de qualquer um dos itens 74 a 77, em que pelo menos cerca de 90 % ou mais células da população de célula-tronco mesenquimal expressam cada um dos seguintes marcadores: CD73, CD90 e CD105.

79. O uso do item 78, em que pelo menos cerca de 90 % ou mais células da população de célula-tronco mesenquimal não expres- sam os seguintes marcadores: CD34, CD45 e HLA-DR.

80. O uso do item 79, em que pelo menos cerca de 91 % ou mais, cerca de 92 % ou mais, cerca de 93 % ou mais, cerca de 94 % ou mais, cerca de 95 % ou mais, cerca de 96 % ou mais, cerca de 97 % ou mais, cerca de 98 % ou mais cerca de 99 % ou mais células da população de célula-tronco mesenquimal isolada expressam cada um dentre CD73, CD90 e CD105 e não têm expressão de cada um dentre CD34, CD45 e HLA-DR.

81. Uma composição farmacêutica contendo três ou quatro de Ang-1, TGF-B1, VEGF ou HGF como as únicas proteínas de cicatri- zação de feridas.

82. A composição farmacêutica do item 81, formulada como um líquido ou como formulação liofilizada/liofilizada.

[00168] Será facilmente aparente para uma pessoa versada na téc- nica que várias substituições e modificações podem ser feitas na in- venção descrita neste documento, sem se afastar do escopo e do es- pírito da invenção.

[00169] Todas as patentes e publicações mencionadas na especifi- cação são indicativas dos níveis daqueles versados na técnica à qual a invenção pertence. Todas as patentes e publicações são aqui incor- poradas por referência na mesma extensão como se cada publicação individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorpo- rada por referência.

[00170] As invenções descritas ilustrativamente neste documento podem ser praticadas adequadamente na ausência de qualquer ele-

mento ou elementos, limitação ou limitações, não descritos especifi- camente neste documento.

Assim, por exemplo, os termos "compre- endendo", "incluindo", "contendo", etc. devem ser lidos de forma ex- pansiva e sem limitação.

Além disso, os termos e expressões usados neste documento foram usados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção no uso de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes dos recursos mostrados e descritos ou partes deles, mas é reconhecido que várias modificações são possí- veis dentro do escopo da invenção reivindicada.

Assim, deve ser en- tendido que, embora a presente invenção tenha sido especificamente descrita por modalidades preferidas e características opcionais, a mo- dificação e variação das invenções incorporadas aqui descritas podem ser recorridas por aqueles versados na técnica, e que tais modifica- ções e variações são consideradas como estando dentro do escopo desta invenção.

A invenção foi aqui descrita ampla e genericamente.

Cada uma das espécies mais restritas e agrupamentos subgenéricos que caem dentro da descrição genérica também fazem parte da inven- ção.

Isso inclui a descrição genérica da invenção com uma condição ou limitação negativa removendo qualquer assunto do gênero, inde- pendentemente de o material excisado ser ou não especificamente citado neste documento.

Além disso, onde as características ou aspec- tos da invenção são descritos em termos de grupos Markush, aqueles versados na técnica reconhecerão que a invenção também é assim descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush.

Outras modalidades da invenção tornar- se-ão evidentes a partir das seguintes reivindicações.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para induzir ou melhorar as propriedades de ci- catrização de feridas de uma população de célula-tronco mesenqui- mal, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura da popula- ção de célula-tronco mesenquimal em um meio de cultura que com- preende DMEM (meio de Eagle modificado de Dulbecco), F12 (Meio F12 de Ham), M171 (Meio 171) e FBS (Soro Bovino Fetal).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população de célula-tronco mesenquimal é selecio- nada a partir do grupo que consiste em uma população de célula- tronco mesenquimal do cordão umbilical, uma população de célula- tronco mesenquimal da placenta, uma população de célula-tronco me- senquimal da junção cordão-placenta, uma população de célula-tronco mesenquimal do sangue do cordão, uma população de célula-tronco mesenquimal da medula óssea e uma população de célula-tronco me- senquimal derivada do tecido adiposo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a população de célula-tronco mesenquimal do cordão umbilical é selecionada a partir do grupo que consiste em uma popula- ção de célula-tronco mesenquimal do âmnio (AM), uma população de célula-tronco mesenquimal perivascular (PV), uma população de célu- la-tronco mesenquimal de geléia de Wharton (WJ), uma população de célula-tronco mesenquimal da membrana amniótica do cordão umbili- cal e uma população de célula-tronco mesenquimal mista do cordão umbilical (MC).

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende DMEM em uma concentração final de cerca de 55 a 65 % (v/v), F12 em uma concentração final de cerca de 5 a 15 % (v/v), M171 em uma concentração final de cerca de 15 a 30 % (v/v) e FBS em uma concen-

tração final de cerca de 1 a 8 % (v/v).

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende DMEM em uma con- centração final de cerca de 57,5 a 62,5 % (v/v), F12 em uma concen- tração final de cerca de 7,5 a 12,5 % (v/v), M171 em uma concentra- ção final de cerca de 17,5 a 25,0 % (v/v) e FBS em uma concentração final de cerca de 1,75 a 3,5 % (v/v).

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende DMEM em uma con- centração final de cerca de 61,8 % (v/v), F12 em uma concentração final de cerca de 11,8 % (v/v), M171 em uma concentração final de cerca de 23,6 % (v/v) e FBS em uma concentração final de cerca de 2,5 % (vv).

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende ainda Fator de Crescimento Epidérmico (EGF) em uma concentração final de cerca de 1 ng/ml a cerca de 20 ng/ml.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende EGF em uma concen- tração final de cerca de 10 ng/mL.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende Insulina em uma concentração final de cerca de 1 ug/ml a 10 po/ml.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende Insulina em uma con- centração final de cerca de 5 pg/ml.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compre- ende ainda pelo menos um dos seguintes suplementos: adenina, hi- drocortisona e sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo-L-tironina (T3).

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compre- ende todos os três dentre adenina, hidrocortisona e sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo-L-tironina (T3).

13. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, carac- terizado pelo fato de que o meio de cultura compreende adenina em uma concentração final de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 ug/ml de ade- nina, hidrocortisona em uma concentração final de cerca de 0,1 a cer- ca de 10 pg/ml de hidrocortisona e/ou sal de sódio de 3,3',5-Tri-iodo-L- tironina (T3) em uma concentração final de cerca de 0,5 a cerca de 5 ng/mL.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a cultura da população de célula-tronco mesenquimal no meio de cultura, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 13, resulta em um aumento da ex- pressão e/ou secreção de pelo menos um dentre Angiopoietina 1 (Ang-1), TGF-B (em particular TGF-B1), VEGF e HGF pela população de célula-tronco mesenquimal em relação a um meio de cultura de re- ferência que não compreende todo o DMEM (meio de Eagle modifica- do de Dulbecco), F12 (Meio F12 de Ham), M171 (Meio 171) e FBS (Soro Bovino Fetal).

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que o meio de referência consiste em 90 % (v/v) de CMRL1066 e 10 % (v/v) de FBS.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a população de célu- la-tronco mesenquimal foi isolada de seu ambiente natural antes da cultura no meio de cultura, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores 1 a 13.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 1 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende o isolamento da população de célula-tronco mesenquimal de um ambiente de tecido natural, cultivando o tecido natural no meio de cultura de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracteriza- do pelo fato de que o tecido é um tecido do cordão umbilical.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracteriza- do pelo fato de que o tecido do cordão umbilical é selecionado a partir do grupo que consiste em tecido de todo o cordão umbilical, tecido que compreende a membrana amniótica do cordão umbilical, tecido que compreende geleia de Wharton, tecido que compreende a membrana amniótica, o âmnio e a geléia de Wharton, os vasos sanguíneos isola- dos do cordão umbilical, a geléia de Wharton separada dos outros componentes do tecido do cordão umbilical e membrana amniótica iso- lada do cordão umbilical.

20. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracteriza- do pelo fato de que o tecido compreende ou é tecido da membrana amniótica da placenta.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 17 a 20, caracterizado pelo fato de que o tecido do cordão umbi- lical é um pedaço de todo o cordão umbilical, um pedaço da membra- na amniótica do cordão umbilical ou um pedaço da membrana amnió- tica da placenta.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 19 a 21, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura do tecido do cordão umbilical ou do tecido da membrana amniótica da placenta até que a excrescência celular da população de célula-tronco mesenquimal da membrana amniótica atinja cerca de 70-80 % de con- fluência.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracteriza-

do pelo fato de que compreende a remoção da população de célula- tronco mesenquimal de um recipiente de cultura utilizado para a cultu- ra.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracteriza- do pelo fato de que a remoção da população de célula-tronco mesen- quimal do recipiente de cultura é realizada por tratamento enzimático.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracteriza- do pelo fato de que o tratamento enzimático compreende tripsinação.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 23 a 25, caracterizado pelo fato de que a população de célula- tronco mesenquimal é transferida para subcultura para um recipiente de cultura para subcultura.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a população de célula- tronco mesenquimal é transferida para cultura para um recipiente de cultura para subcultura.

28. Método, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, carac- terizado pelo fato de que a população de células mesenquimais é sus- pensa para cultura ou subcultura a uma concentração de 1,0 x 10º cé- lulas/ml.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracteriza- do pelo fato de que a população de célula-tronco mesenquimal é sub- cultivada em um meio de cultura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracteriza- do pelo fato de que a população de célula-tronco mesenquimal é sub- cultivada até que as células-tronco mesenquimais atinjam cerca de 70- 80 % de confluência.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 30, caracterizado pelo fato de que a cultura ou subcultura é realizada em um biorreator independente.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracteriza- do pelo fato de que o biorreator é selecionado a partir do grupo que consiste em um biorreator de placa paralela, um biorreator de fibra oca e um biorreator microfluídico.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a cultura é realizada em uma incubadora de cultura de células de CO? a uma temperatura de 37ºC.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que compreende a remoção da população de célula-tronco mesenquimal do recipiente de cultura usado para a (sub)cultura.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracteriza- do pelo fato de que a remoção da população de célula-tronco mesen- quimal do recipiente de cultura é realizada por tratamento enzimático.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracteriza- do pelo fato de que o tratamento enzimático compreende tripsinação.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda coletar a população de célula- tronco mesenquimal isolada.

38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de 90 % ou mais, cerca de 91 % ou mais, cerca de 92 % ou mais, cerca de 93 % ou mais, cerca de 94 % ou mais, cerca de 95 % ou mais, cer- ca de 96 % ou mais, cerca de 97 % ou mais, cerca de 98 % ou mais cerca de 99 % ou mais das células-tronco mesenquimais isoladas ex- pressam os seguintes marcadores: CD73, CD90 e CD105.

39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de 90 % ou mais, cerca de 91 % ou mais, cerca de 92 % ou mais, cerca de 93 % ou mais, cerca de 94 % ou mais, cerca de 95 % ou mais, cer- ca de 96 % ou mais, cerca de 97 % ou mais, cerca de 98 % ou mais cerca de 99 % ou mais das células-tronco mesenquimais isoladas não expressam os seguintes marcadores: CD34, CD45 e HLA-DR (Antíge- no Leucocitário Humano - relacionado ao antígeno D)

40. Método, de acordo com a reivindicação 38 ou 39, carac- terizado pelo fato de que cerca de 97 % ou mais, cerca de 98 % ou mais cerca de 99 % ou mais das células-tronco mesenquimais isola- das expressam CD73, CD90 e CD105 e não apresentam expressão de CD34, CD45 e HLA-DR.

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda preservar a população de célula-tronco/progenitora isolada para uso posterior.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracteriza- do pelo fato de que a preservação é realizada por criopreservação.

43. População-tronco mesenquimal isolada, caracterizada pelo fato de que pelo menos 97 % ou mais células da população de célula-tronco expressam cada um dos seguintes marcadores: CD73, CD90 e CD105 e não têm expressão de cada um dentre CD34, CD45 e HLA-DR e; em que uma população de célula-tronco mesenquimal derivada da membrana amniótica do cordão umbilical é excluída.

44. População de célula-tronco mesenquimal, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que a população de célula-tronco mesenquimal é selecionada a partir do grupo que consis- te em uma população de célula-tronco mesenquimal do cordão umbili- cal, em que a população de célula-tronco mesenquimal do cordão um- bilical é selecionada a partir do grupo que consiste em uma população de célula-tronco mesenquimal do âmnio (AM), uma população de célu-

la-tronco mesenquimal perivascular (PV), uma população de célula- tronco mesenquimal de geléia de Wharton (WJ) e uma população de célula-tronco mesenquimal mista do cordão umbilical (MC), uma popu- lação de célula-tronco mesenquimal da placenta, uma população de célula-tronco mesenquimal do sangue do cordão umbilical, uma popu- lação de célula-tronco da medula óssea e uma população de célula- tronco mesenquimal derivada do tecido adiposo.

45. População de célula-tronco mesenquimal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 44, caracterizada pelo fato de que a população pode ser obtida pelo método definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 42.

46. População de célula-tronco mesenquimal, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 44, caracterizada pelo fato de que a população é obtida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 42.

47. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma população de célula-tronco mesenquimal isola- da, como definido em qualquer uma das reivindicações 43 a 46.

48. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 47, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica é adaptada para aplicação sistêmica ou tópica.

49. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 47 ou 48, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.

50. Uso de um meio de cultura de células, caracterizado pelo fato de que compreende: - DMEM em uma concentração de cerca de 55 a 65 % (v/v), - F12 em uma concentração de cerca de 5 a 15 % (v/v), - M171 em uma concentração de cerca de 15 a 30 % (vv) e - FBS em uma concentração de cerca de 1 a 8 % (v/v)

para induzir ou melhorar as propriedades de cicatrização de feridas de uma população de célula-tronco mesenquimal.

51. Uso, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende DMEM em uma con- centração de cerca de 57,5 a 62,5 % (v/v), F12 em uma concentração de cerca de 7,5 a 12,5 % (v/v), M171 em uma concentração de cerca de 17,5 a 25,0 % (v/v) e FBS em uma concentração de cerca de 1,75 a 3,5 % (v/v).

52. Uso, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende DMEM em concentra- ção de cerca de 61,8 % (v/v), F12 em uma concentração de cerca de 11,8 % (v/v), M171 em uma concentração de cerca de 23,6 % (v/v) e FBS em uma concentração de cerca de 2,5 % (v/v).

53. Uso de um meio de cultura de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 52, caracterizado pelo fato de que é para o isolamento de uma população de célula-tronco mesen- quimal.

54. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 53, caracterizado pelo fato de que a população de célula-tronco mesenquimal é selecionada a partir do grupo que consiste em uma população de célula-tronco mesenquimal do cordão umbilical, uma po- pulação de célula-tronco mesenquimal da placenta, uma população de célula-tronco mesenquimal do sangue do cordão, uma população de célula-tronco mesenquimal da medula óssea e uma população de cé- lula-tronco mesenquimal derivada de tecido adiposo.

55. Uso, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a população de célula-tronco mesenquimal do cordão umbilical é selecionada a partir do grupo que consiste em uma popula- ção de célula-tronco mesenquimal do âmnio (AM), uma população de célula-tronco mesenquimal perivascular (PV), uma população de célu-

la-tronco mesenquimal de geléia de Wharton (WJ), uma população de célula-tronco mesenquimal da membrana amniótica do cordão umbili- cal e uma população de célula-tronco mesenquimal mista do cordão umbilical (MC).

Fia.1 K . Www.lonza.com U.S.

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Meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) Uso do produto Gráfico de referência rápida O meio de Eagle modificado de Dulbecco foi desenvolvido em 1969 e é uma modificação do e meio de Eagle basal (BME) que difere de BME E E & e MEM pelas seguintes características: o E e Ir o ã E og 8 + Vitaminas 4 vezes maiores que MEM.

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