ITMI20100601A1 - "nuovo sostituto dermico e sua applicazione terapeutica" - Google Patents
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Description
La presente invenzione ha per oggetto un nuovo sostituto dermico che comprende delle cellule staminali mesenchimali derivate da tessuto adiposo, inserite in una matrice biocompatibile, ed il suo uso per favorire la riparazione delle ferite e la rigenerazione cutanea.
La riparazione delle ferite è un processo coordinato e complesso che vede la partecipazione di eventi biochimici e molecolari fondamentali coinvolti nella crescita e nel differenziamento cellulare. Spesso nel caso di importanti lesioni cutanee, ustioni, traumi, lesioni post-chirurgiche e nelle gravi affezioni della cute e dei tessuti molli, il processo di riparazione non è in grado di ricostituire l’integrità del tessuto e porta ad esiti come le ferite definite “difficili”, le ulcere croniche, o le cicatrici ipertrofiche e cheloidee, quest 'ultime spesso associate a gravi deficit funzionali ed estetici.
In un processo di guarigione efficace delle ferite il derma, cioè la porzione di pelle al di sotto dell’epidermide, svolge un ruolo centrale nelle rigenerazione dei tessuti e quindi nella riparazione ottimale della lesione. 11 derma rappresenta la parte più voluminosa dell'organo cutaneo e fornisce il supporto vascolare per la sopravvivenza dell’epidermide. Le cellule del derma, ed in particolare i fibroblasti, producono la matrice connettivale formata principalmente da fibre collagene, importanti fattori di crescita tissutale e vascolare e sono i principali attori nel processo di contrazione delle ferite.
Sono stati prodotti diversi sostituti del derma con lo scopo di favorire e migliorare i processi di guarigione delle ferite. Tuttavia tali sostituti non si sono dimostrati particolarmente efficaci nel trattamento delle ferite cosiddette “difficili”; tali ferite rappresentano una patologia molto diffusa e destinata ad aumentare nel prossimo futuro per l’invecchiamento progressivo della popolazione mondiale e per la maggior incidenza di problemi vascolari nell’anziano. Anche le errate abitudini alimentari (e conseguenti disturbi metabolici come sindrome metabolica, diabete, iperdislipidemie) e di stile di vita (fumo, sedentarietà) stanno portando ad un aumento dell’incidenza di problemi vascolari (che rappresentano la prima causa di questo tipo di lesioni cutanee) e non solo nell 'anziano.
Al momento, i prodotti disponibili sul mercato si basano sull’uso di sostituti dermici prevalentemente privi di cellule, costituiti ad esempio unicamente da matrici di collagene o di acido ialuronico. In alternativa, si impiegano innesti eterologhi di derma da cadavere o quando possibile, di cute autoioga prelevata dallo stesso paziente. Si comprende facilmente che l’utilizzo di innesti di cute autoioga è associato alla produzione di un’ulteriore lesione nella sede del prelievo cutaneo (non sempre attuabile e/o opportuno) e alla necessità di procedure chirurgiche multiple, complesse, di lunga ed incerta guarigione clinica ed inoltre molto costose. Al contrario, l’utilizzo di cute eterologa può esporre al rischio di reazione immunologica ed a potenziali rischi di trasmissione di malattie infettive dal donatore.
L’efficacia curativa dei sostituti dermici sopra citati risulta p elianto insufficiente, indicando la necessità di ottimizzare e di approfondire nuove strategie.
Scopo della presente invenzione è fornire un sostituto dermico che superi gli inconvenienti della tecnica anteriore e promuova attivamente la rigenerazione dei tessuti.
Così, secondo uno dei suoi aspetti l’invenzione ha per oggetto un sostituto dermico che comprende cellule staminali mesenchimali derivate da tessuto adiposo, inserite in una matrice biocompatibile. Secondo un altro dei suoi aspetti l’invenzione ha per oggetto l’uso delle cellule staminali mesenchimali derivate da tessuto adiposo, inserite in una matrice biocompatibile, per la preparazione di un sostituto dermico.
L’espressione “cellule staminali mesenchimali derivate da tessuto adiposo” (dette anche “cellule stami nali/strom ali mesenchimali” o qui di seguito anche solo “ADSC” dall’inglese “Adipose Derived Stem/Stromal Cells”) intende indicare una popolazione di cellule derivate da una frazione cellulare denominata ‘Trazione Stromale Vascolare” (nota anche come SVF dall’inglese “Stromal Vascular Fraction”) isolata da tessuto adiposo, vantaggiosamente tessuto adiposo sottocutaneo.
Per “matrice biocompatibile” (qui di seguito anche solo “matrice) si intende indicare un complesso (qui di seguito anche scaffold) tridimensionale formato da materiale biologico, biocompatibile e, vantaggiosamente, riassorbibile. Delle matrici adatte sono ad esempio delle matrici che comprendono collagene e eventualmente glicosaminoglicani, ad esempio collagene e coindroitina-6-solfato e/o acido ialuronico, o ancora matrici che comprendono collagene e elastina. Tali matrici sono disponibili in commercio. Un esempio di matrice adatta secondo l’invenzione, a base di collagene e coindroina-6-solfato, è il prodotto attualmente commercializzato con il marchio “Integra<®>”; un altro esempio di matrice, a base di collagene e elastina, è attualmente commercializzata con il marchio “Matriderm<®>”. Altre matrici utilizzabili sono quelle che comprendono anche acido ialuronico o chilo sano.
Le ADSC sono cellule multipotenti che sono in grado differenziarsi in diverse linee cellulari, a seguito di adeguati stimoli differenziativi. È noto infatti che le ADSC siano in grado di differenziarsi in cellule di tipo adipogenico, osteogenico, condrogenico o anche connettivale, a seconda degli stimoli a cui vengono sottoposte.
Le ADSC, quando fatte crescere in un mezzo di coltura opportuno, tali ADSC possono presentare una morfologia ed una attività molto simile alle cellule che principalmente costituiscono per l’appunto il derma, cioè i fibroblasti.
In altre parole, le ADSC, cioè le cellule staminali mesenchimali derivate da tessuto adiposo, possono essere utilizzate per la sostituzione di una parte fondamentale della struttura della pelle, cioè il deima.
Così, includendo le ADSC in una matrice biocompatibile e riassorbibile, si può ottenere un sostituto dermico (e/o ipodermico) in cui le cellule producono delle sostanze extracellulari (similmente ai fibroblasti del derma) ricche di fibre collagene e glicosaminoglicani prodotti ex novo, in grado di favorire la rigenerazione della cute, anche laddove la gravità e la profondità della ferita non sarebbe curabile con la sola applicazione dei sostituti dermici noti.
In alternativa, è possibile includere le ADSC nella matrice biocompatibile e riassorbibile prescelta e differenziarle con stimoli di crescita adeguati .
Secondo un altro dei suoi aspetti, l’invenzione ha per oggetto un sostituto dermico che comprende ADSC inserite in una matrice biocompatibile, come sopra definita.
Per le favorire la crescita delle ADSC, è ad esempio possibile farle crescere in colture contenenti uno o più fattori di crescita dei fibroblasti.
Per “fattore di crescita dei fibroblasti” si intende indicare uno dei fattori di crescita dei fibroblasti di mammifero, preferibilmente uno dei fattori di crescita dei fibroblasti umani, ad esempio il fattore di crescita dei fibroblasti “basico” o bFGF.
TI sostituto dermico dell’invenzione presenta una migliore efficacia se le ADSC in esso inserite producono una “sostanza extracellulare ”, dove per “sostanza extracellulare” si intende una miscela di componenti, in genere in forma di gel, costituita principalmente da polisaccaridi (glicosaminoglicani) ricco di proteine fibrose (in particolare di fibre collagene). Per favorire la produzione di sostanza extracellulare, come sopra definita, da parte delle ADSC, è ad esempio possibile fare crescere dette cellule in colture contenenti acido ascorbico, preferibilmente alla concentrazione di circa 250 μΜ. A titolo di esempio, è possibile aggiungere acido ascorbico al mezzo di coltura delle ADSC usato per la semina nella matrice.
Secondo un altro dei suoi aspetti, l’invenzione ha per oggetto il sostituto deimi co dell’invenzione, come sopra definito per il suo uso nel trattamento delle ferite e per favorire la ricrescita cutanea. Per “ferite” si intende qui indicare qualsiasi lesione della pelle anche, e soprattutto, lesioni estese al deima e/o anche all’ipoderma.
Secondo un aspetto preferito, il sostituto dermico dell’invenzione è per uso umano e/o veterinario. A titolo illustrativo e non limitativo, il sostituto dermico dell’invenzione può essere utilizzato nel trattamento delle ferite anche molto profonde quali le ferite di natura acuta e di natura cronica, inserite le ulcere diabetiche, le ulcere vascolari, le ustioni, le piaghe da decubito, le lesioni traumatiche, le ferite post chirurgiche, le ferite da pressione o le complicazioni associate alle ferite come le cicatrici ipertrofiche, cheloidee ecc.
Come detto le ADSC utilizzabili per l’uso secondo l’invenzione, possono derivare, preferibilmente, da tessuto adiposo sottocutaneo, ad esempio per microaspirazione di una piccola quantità di tessuto adiposo sottocutaneo. Si comprende quindi come la soluzione tecnica proposta dall’invenzione sia di grande interesse clinico, poiché impiega una materia prima facilmente accessibile, che può essere prelevata ambulatorialmente, cioè anche in condizioni operative non necessariamente chirurgiche, come invece nel caso di prelievo di midollo o di espianto di lembi di cute per il trapianto autologo (o eterologo).
L’impiego del sostituto dermico dell’invenzione porta quindi a un notevole progresso nel campo della guarigione delle ferite, riducendo i tempi e fornendo un risultato estetico e funzionale migliore rispetto ai prodotti della tecnica nota. In particolare, il sostituto dermico dell’invenzione fornisce un minore tessuto cicatriziale e un maggiore “volume” tissutale ove necessario (cioè quando la profondità della ferita ha causato una abbondante perdita di derma e ipoderma) una minore “retrazione” della ferita così da risultare in un effetto estetico più accettabile, fatto importante soprattutto, ma non solo, in caso di ustioni o di altre ferite profonde.
In pratica, secondo una delle forme di realizzazione dell’invenzione, per la preparazione del sostituto dermico dell’invenzione, si preleva una piccola quantità di tessuto adiposo, vantaggiosamente sottocutaneo. Da questo tessuto si estraggono le cellule appartenenti alla SVF (Frazione Straniale Vascolare) mediante digestione enzimatica dello stroma connettivale. Le ADSC ottenute vengono fatte crescere in presenza di un fattore di crescita dei fibrobiasti (ad esempio bFGF), espanse in vitro e seminate in uno scaffold adeguato, come sopra definito. Successivamente si procede all’applicazione nella sede della lesione. Dei dettagli tecnici sono fomiti nella sezione sperimentale della presente descrizione.
In alternativa all’uso delle ADSC, è possibile usare la SFV come sopra definita, così come ottenuta dall’estrazione da tessuto adiposo, che viene seminata per seminare direttamente uno scaffold adeguato, come sopra definito; l’insieme può essere mantenuto per un breve lasso tempo, ad esempio poche ore, in presenza di terreno di coltura appropriato, e poi si procede all’applicazione nella sede della lesione.
Così, secondo uno dei suoi aspetti l’invenzione ha per oggetto un sostituto dermico che comprende della SVF (Frazione Straniale Vascolare) derivata da tessuto adiposo, inserita in una matrice biocompatibile.
Secondo un ulteriore aspetto, l’invenzione comprende l’uso della SVF (Frazione Straniale Vascolare) derivata da tessuto adiposo, inserita in una matrice biocompatibile, per la preparazione di un sostituto dermico.
Dei dettagli tecnici relativi alla preparazione delle cellule e del sostituto dermico dell’invenzione sono fornite nella sezione sperimentale che segue.
Secondo una forma di realizzazione preferita, il sostituto dermico dell’invenzione comprende delle cellule staminali/stramali multipotenti autologhe ottenute da micro aspi razione di tessuto adiposo sottocutaneo (ADSC), fibroblastosimili, capaci di produrre matrice connettivale e citochine con azione di stimolo dei processi rigenerativi e di vascolarizzazione come i fibroblasti del derma;
dette cellule essendo inserite in una matrice biocompatibile tridimensionale che promuove l’integrazione nell’ospite, favorendo la fisiologica distribuzione nello spazio delle cellule in essa seminate, guidando la migrazione delle cellule dell’ospite e favorendo la penetrazione dei vasi neoformati nel tessuto.
La quantità di ADSC seminate nella matrice biocompatibile può variare da 3 x IO<4>a 5 x IO<4>cellule per mm<3>. In linea generale e a titolo puramente illustrativo, è possibile utilizzare 4 x IO<4>cellule per cm<3>di matrice. Quantità diverse possono comunque essere impiegate se desiderato o necessario.
Le cellule vengono inserite nella matrice attraverso Γ impregnazione della matrice stessa con un terreno di coltura liquido contenente le dette cellule, preferibilmente un terreno di coltura completo (come descritto nella sezione sperimentale che segue).
Secondo un altro dei suoi aspetti, l’invenzione ha per oggetto un procedimento per la preparazione di un sostituto dermico che comprende:
a. estrarre la SVF da tessuto adiposo, preferibilmente sottocutaneo;
b. isolare le ADSC in coltura;
c. seminare le ADSC in una matrice biocompatibile, come sopra definita; e
d. stimolare la differenziazione delle ADSC in tessuto dermico, preferibilmente in presenza di acido ascorbico.
Secondo un altro dei suoi aspetti, l’invenzione ha per oggetto un procedimento per la preparazione di un sostituto dermico che comprende:
e. estrarre la SVF da tessuto adiposo, preferibilmente sottocutaneo;
f. seminare la SVF in una matrice biocompatibile, come sopra definita.
Degli esempi illustrativi dei procedimenti dell’invenzione sono descritti nella sezione sperimentale che segue.
Il sostituto dermico preparato secondo il procedimento qui descritto costituisce un ulteriore oggetto dell’invenzione, come pure il suo uso nel trattamento delle ferite.
Il sostituto dermico dell’invenzione si presenta in forma di un “foglio” o lamina, è facilmente manipolabile e agevolmente applicabile sulle parti lese a cui può essere fissato mediante, ad esempio, graffe chirurgiche posizionate da una suturatrice meccanica.
Oltre ai vantaggi sopra descritti, la presenza della matrice rende anche più maneggevole il prodotto e più agevole la sua applicazione rispetto alle sole colture cellulari (ad esempio alle semplici colture di epitelio).
Se desiderato o necessario è possibile applicare un diverso sostituto epidermico sopra il sostituto dermico dell’invenzione. A titolo illustrativo, dopo aver applicato il sostituto dermico dell’invenzione sulla parte lesa (ferita, ulcera, ustione ecc) è possibile posizionare ad esempio una lamina di epitelio. Tale ulteriore sostituto epidermico potrà essere applicato sul sostituto dermico dell’ invenzione, immediatamente o dopo qualche tempo.
È inoltre possibile, secondo un’altra forma di realizzazione dell’invenzione, seminare nella matrice, contemporaneamente alle ADSC, anche altre cellule come fibroblasti, cellule endoteliali, cellule staminali epiteliali (come le cellule staminali cheratino citane, le cellule staminali dell’urotelio, le cellule epiteliali staminali della mucosa buccale) o ancora precursori neuronali. Secondo questa forma di realizzazione dell’invenzione è possibile creare delle unità pluritessutali (composte da più tessuti di diversa derivazione) che possono essere utilizzate per ottenere dei sostituti dermoepidermici (di cute) o anche dei sostituti di mucosa buccale o di mucosa uroteliale. I precursori neuronali e le cellule endoteliali possono favorire la formazione di vasi e di fibre nervose in questi tessuti.
Così, se ad esempio si seminano delle cellule epiteliali (come i cheratinociti) nella matrice contemporaneamente alla semina con ADSC verna applicato sulla sede della lesione il sostituto dermoepidermico ottenuto dalla semina di cheratinociti e ADSC autologhe nella matrice tridimensionale.
Secondo un aspetto ulteriore dell’invenzione, le ADSC possono anche essere utilizzate in associazione ad altri tipi cellulari come le cellule epiteliali (ad esempio i cheratinociti), endoteliali e nervose per produrre strutture simili ad organi (come la cute e le mucose).
In alternativa e secondo un aspetto ulteriore, l’invenzione ha per oggetto un metodo per il trattamento delle ferite e la ricrescita cutanea che comprende applicare sulla parte lesa (ferita, ulcera, ustione ecc) il sostituto dermico dell’invenzione e successivamente (immediatamente dopo o qualche tempo dopo) uno o più diversi sostituti dermici atti a rigenerare l’epitelio.
Secondo un altro dei suoi aspetti, l’invenzione ha per oggetto il sostituto dermico dell’invenzione in combinazione con uno o più ulteriori sostituti epidermici per l’uso nel trattamento delle ferite e per la ricrescita cutanea.
Secondo un altro dei suoi aspetti, l’invenzione ha per oggetto un metodo per il trattamento delle ferite e la ricrescita cutanea che comprende applicare sulla parte lesa (ferita, ulcera, ustione ecc) il sostituto dermico dell’invenzione.
Se desiderato o necessario è possibile modificare geneticamente le ADSC prima di seminarle nella matrice, ad esempio mediante inserimento di geni per la produzione di fattori trofici e migliorare così la guarigione delle ferite o danni tissutali.
Sono stati condotti vari saggi al fine di determinare le caratteristiche delle ADSC e la loro idoneità per gli scopi prefissati dall’invenzione. I dettagli dei detti saggi sono fomiti nella sezione sperimentale.
In breve, si è osservato che le cellule ADSC crescono in vitro adese alla superficie di coltura e la loro morfologia in coltura mantiene un aspetto costante nelle diverse estrazioni effettuate, nonostante la provenienza delle cellule da pazienti diversi per età o sesso.
La Colony Fonning Unit fibroblast (o CFU-f) ha permesso la valutazione della capacità delle ADSC di formare cloni e quindi di auto-mantenersi (self-renewal) in coltura. L’analisi del cariotipo delle ADSC, a diversi passaggi di crescita in coltura, ha dimostrato l’assenza di anomalie cromosomiche nelle cellule.
Si è poi osservato che una volta seminate nella matrice biocompatibile le ADSC si distribuiscono in maniera omogenea, assumendo una morfologia simile a quella dei fìbroblasti del donna. Un’accurata analisi della popolazione cellulare ha messo in evidenza la presenza di cellule in fase mitotica, a dimostrazione del fatto che queste cellule all’interno della matrice mantengono la capacità replicativa.
Come detto, le ADSC sono cellule multipotenti in grado differenziarsi in vari tipi di cellule, ad esempio in cellule di tipo adipogenico, osteogenico, condrogenico o anche connettivale, a seconda degli stimoli a cui vengono sottoposte.
Così, secondo un altro dei suoi aspetti, l’invenzione ha per oggetto l’uso delle cellule staminali mesenchimali derivate da tessuto adiposo (ADSC), inserite in una matrice biocompatibile, per la preparazione di sostituti di tessuti, ad esempio di tessuti scelti tra tessuto adiposo, tessuto osseo, tessuto cartilagineo e tessuto connettivale.
L’invenzione ha altresì per oggetto un procedimento per la preparazione di un sostituto tissutale che comprende:
g. estrarre la SVF da tessuto adiposo, preferibilmente sottocutaneo;
h. isolare le ADSC in coltura;
i. seminare le ADSC in una matrice b io compatibile, come sopra definita; e
j. stimolare la differenziazione delle ADSC nel tessuto desiderato.
Sezione sperimentale
Esempio 1
Estrazione della frazione stromale vascolare (SVF) e isolamento e coltura in vitro di cellule staminali mesenchimali derivate da tessuto adiposo (ADSC)
La componente cellulare denominata SVF è stata isolata da tessuto adiposo sottocutaneo ottenuto mediante lipoaspìrazione (praticata con ago cannula da 1,5-2 mm collegata a siringa) o da campioni chirurgici dopo interventi di addomino plastica in pazienti sani di ambo i sessi e di età compresa tra i 25 e 50 anni.
Tutte le procedure di seguito descritte avvengono in condizioni di sterilità.
Il campione chirurgico di tessuto adiposo proveniente dalla sala operatoria viene immerso in soluzione sterile di DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) addizionata ad 1% di PSA (penicillina-streptomicina-amfotericina B). Si procede ad un rapido lavaggio con soluzione fisiologica. Il tessuto adiposo sottocutaneo con i setti di tessuto connettivo ed i vasi in esso compresi, vengono dissezionati mediante l’ausilio di forbici e pinze sterili. I campioni vengono immersi in una soluzione contenente 0,75 mg/ml collagenasi I in HBSS (Hank’s balance solution), 20mM Hepes e 1,5% BSA (Bovin Serum Albumin) (ph 7,1). La quantità di questa soluzione è pari al volume di grasso che si intende processare. Si procede quindi ad una fine micro-dissezione dei lobi adiposi mediante forbici e pinze sterili. I campioni immersi nella soluzione di collagenasi vengono quindi trasferiti in contenitori di materiale plastico monouso e sterili con ancorette magnetiche in agitazione a 37°C, 5% C02.
Per il tessuto adiposo ottenuto mediante lipoaspirazione si procede direttamente mediante immersione dello stesso nella soluzione contenente 0,75 mg/ml collagenasi 1 in HBSS, 20mM Hepes e 1,5% BSA (ph 7,1) in contenitori di materiale plastico monouso e sterili con ancorette magnetiche in agitazione a 37°C, 5% C02. La quantità di questa soluzione è pari al volume di grasso che si intende processare.
In entrambi i casi dopo 1 ora il prodotto della digestione in collagenasi viene filtrato mediante un velo di garza sterile allo scopo di eliminare il grasso indesiderato ed i setti connettivali rimasti anche dopo la digestione.
La sospensione viene quindi centrifugata per 5 minuti a 1500 rpm (524 RCF o Relative Centriluge Force).
La parte sovranatante e di grasso da adipociti maturi viene eliminata mediante aspirazione.
Il pellet cellulare viene risospeso nel terreno di coltura completo (vedi composizione sotto) e contemporaneamente si procede alla conta cellulare (previa lisi eritrocitaria) mediante saggio di esclusione di vitalità con Trypan Blue.
A questo scopo vengono prelevati 400 μΐ di sospensione cellulare che vengono centrifugati per 5 minuti a 3000 rpm (2095 RCF). Il sovranatante viene aspirato e scartato ed il pellet risospeso in 400 μΐ di buffer di lisi eritrocitaria (0,82% NH4C1 e 0,1% KHC03) a temperatura ambiente per 5 minuti.
A questo punto le cellule vengono contate al microscopio mediante camera di Biirker e seminate (Passaggio PO) in fiasche ad una densità di 100.000 cellule su cm<2>nel terreno di coltura completo ottimizzato per la crescita delle ADSC.
Isolamento e Coltura in vitro di ADSC
Le ADSC contenute nella frazione cellulare SVF, vengono isolate per le loro caratteristiche di crescita aderente su piastra e vengono mantenute in coltura in un terreno di coltura completo composto da:
Dulbecco’s Modified Eagle Medium /Ham’s F12 (in rapporto 3:1)
20% di siero di vitello fetale (FBS)
1% di antibiotico penicillina/streptomicina/amfotericina B
2% di glutammina
10 ng/ml di fattore di crescita dei fibroblasti (basic fibroblast growth factor; bFGF).
Le cellule vengono amplificate seminando ad ogni passaggio successivo al PO (PI, P2, P3 ecc.) in piastra di coltura 20.000 cell/cm<2>.
Per le semine si procede dapprima a tripsinizzazione per 5 minuti a 37°C, utilizzando una soluzione contenente 0,05% tripsina - 0,02% EDTA. Avvenuto il distacco delle cellule, si blocca l’azione della tripsina mediante terreno contenente 10% di siero di vitello fetale e le cellule vengono centrifugate a 1200 rpm (335 RCF) per 8 minuti.
Il sovranatante viene quindi aspirato e il pellet risospeso nel terreno di coltura completo.
Le ADSC possono essere conservate mediante congelamento. In questo caso dopo tripsinizzazione e centrifugazione vengono contate e risospese in una soluzione costituita da:
80% siero di vitello fetale (FBS)
10% DMSO
10% terreno di coltura completo.
Normalmente vengono congelate 2 xlO<6>cellule per criotubi (o vial).
Le cellule nei criotubi vengono progressivamente congelate. Mantenute per 48 ore a -80°C e poi per un tempo indefinito in azoto liquido a -190°C.
Per lo scongelamento si procede velocemente riso spendendo le cellule di un criotubo in 10 mi di terreno di coltura contenente 10% siero di vitello fetale. Si centrifuga a 1200 rpm per 8 minuti. Si aspira il sovranatante e si risospende il pellet nel terreno di coltura completo.
Le cellule della popolazione SVF, in particolar modo le ADSC, crescono in vitro adese alla superficie di coltura. La morfologia, valutata in microscopia in campo chiaro appare fibroblastosimile e comparabile alle cellule staminali mesenchimali derivate da midollo osseo. La morfologia delle ADSC in coltura mantiene un aspetto costante nelle diverse estrazioni effettuate nonostante la provenienza delle cellule da pazienti diversi per età o sesso.
Esempi o 2
Test di proliferazione cellulare (Figura 1)
Questo test permette di valutare la capacità di proliferazione cellulare della popolazione di cellule costituita dalle ADSC ed in particolare il tempo di duplicazione cellulare (PDT). 1 valori di proliferazione sono stati ottenuti in base al calcolo della Population Doubling Time (PDT) o tempo di proliferazione della popolazione cellulare e della Population Doubling (PD) ovvero del numero di duplicazioni nel tempo. In particolare come riportato in letteratura:
dove Nj è il numero di cellule al tempo i
N0è il numero di cellule al tempo 0
T, è il tempo in cui le cellule sono state in coltura
II tempo di duplicazione delle ADSC è risultato di circa 1,9 giorni.
Nella Figura 1 è mostrato il risultato del Test di proliferazione cellulare condotto per diversi passaggi in coltura.
Esempio 3
Caratterizzazione delle ADSC
Esempio 3a
Saggio di CFU-F
Questo saggio è stato condotto per valutare la capacità delle ADSC di formare cloni e quindi di auto-mantenersi (self-renewal) in coltura.
Il test è stato condotto per ADSC ottenute da pazienti di ambo i sessi, di età compresa tra i 25 e 50 anni e a diversi passaggi di coltura. In particolar modo sono state considerate ADSC a passaggio PO, PI, P2 e P3 dove PO rappresenta il passaggio a tempo 0 ovvero dopo estrazione da tessuto adiposo, PI cellule in coltura per un passaggio dopo Pestrazione, P2 cellule in coltura per due passaggi dopo l’estrazione e P3 cellule in coltura per tre passaggi dopo l’estrazione.
Si è proceduto seminando 1 multipozzetto (multiwell) da 96 pozzetti utilizzando il metodo delle diluizioni seriali. Dopo 9 giorni dalla semina il multipozzetto è stato lavato con tampone PBS<‘>, fissato con formalina tamponata al 4%, colorato per 20 minuti con una soluzione allo 0,1% di blu di toluidina. Per la conta dei cloni si assumono come colonie solo i gruppi cellulari contenenti almeno 20 cellule. I pozzetti positivi sono quindi quelli che contengono almeno una colonia. Quindi viene applicata l’equazione di Poisson.
F0=e<"u>
dove Fo è la frazione di pozzetti negativi senza colonie, u è il numero medio di colonie per pozzetto ed e è la base del logaritmo naturale (o numero di Nepero).
Quando u è uguale a 1 :
In questo modo, si assume che la colonna che contiene almeno tre su otto pozzetti negativi (37%) è quella che ci permette di individuare la concentrazione di cellule necessaria per ottenere una singola CFU (Figura 3).
Un altro metodo per valutare la CFU-f consiste nella semina di ADSC a bassa densità in piastre. In particolare si seminano le piastre con ADSC a diversi passaggi (PO, PI, P2...) e con densità basse e progressivamente crescenti : 5, 25, 95, 238, 500 e 1000 cellule/cm . Anche in questo caso il test è stato condotto per ADS ottenute da pazienti di ambo i sessi, di età compresa tra i 25 e 50 anni e a passaggi diversi.
La CFU-f ha permesso di dimostrare la capacità delle ADSC di formare cloni e quindi di automantenersi (self-renewal) in coltura.
Nella Figura 2 è mostrato il risultato della CFU-f condotta con il metodo delle diluizioni seriali. Dai risultati, si evidenzia che mentre a PO solo 1:625 cellule seminate ha mostrato la capacità di formare cloni, a PI e P2 ben 1:39 cellule seminate ha mostrato la capacità di formare cloni. Questo risultato mostra che il metodo di coltura ha selezionato cellule con capacità clonogeniche.
Esempio 3b
Analisi immunofenotipica mediante citometria a flusso (FACSl
Le ADSC sono sottoposte ad analisi immunofenotipica mediante citofluorimetro per verificare la presenza dei markers di ADSC riconosciuti dalla letteratura intemazionale.
Le ADSC vengono trattate con differenti anticoipi per 30 minuti a 4°C.
Si procede quindi a lettura dei risultati, indicativi della presenza o meno degli antigeni sulle ADSC, mediante celi sorter.
Il test è stato effettuato anche in questo caso per ADSC ottenute da pazienti di ambo i sessi, di età compresa tra i 25 e i 50 anni e a passaggi diversi. Inoltre l’analisi mediante FACS è stata condotta anche sui fibroblasti umani normali in parallelo allo scopo di effettuare un confronto.
Dall’analisi immunocitofluorimetrica risulta che le ADSC presentano un profilo immunofenotipico molto simile a quello osservato nelle cellule staminali mesenchimali derivate da midollo osseo (hBM-MSC), in quanto positive a marcatori mesenchimali, quali CD73, CD90, CD105, CD146, e negative per i marcatori ematopoietici (CD45).
Esempio 3c
Confronto con fibroblasti umani
Come popolazione cellulare con cui confrontare le ADSC sono stati utilizzati i fibroblasti umani normali, cellule di derivazione mesenchimale responsabili della formazione della matrice del tessuto connettivo che rappresentano il tipo cellulare maggiormente presente nel derma. I fibroblasti sono stati ottenuti da cute sana prelevata mediante punch biopsy. Il pezzo posto in una piastra Petri sterile viene trattato secondo la metodica originariamente descritta da Reinhwald e Green. Brevemente il tessuto adiposo viene eliminato dalla cute mediante l’uso di pinze e forbici sterili. Il lembo viene poi tagliato in frammenti più piccoli e disinfettato mediante due passaggi in alcool 70% e due passaggi in tampone PBS (Phosphate Buffered Saline). I frammenti sono stati poi immersi in terreno DMEM, addizionato di PS A (1%) e successivamente posti in frigorifero a 4°C per almeno 2 ore (allo scopo di ridurre l’eventuale carica batterica). In seguito, il tessuto è stato trasferito in Dispase (collagenasi IV) per tutta la notte a 4°C, allo scopo di separare l’epidermide dal derma a livello della lamina lucida. Una volta effettuata la separazione, anche mediante l’uso di pinze sterili, il derma è stato ulteriormente frammentato in piccoli pezzi che sono stati successivamente trasferiti in una fiasca F25 (25 cm ) con 1 mi di terreno di coltura DMEM addizionato con 10% di siero di vitello fetale, 4 mM di glutammina, 50 lU/ml di PS A, in modo che i frammenti di derma possano rimanere ben adesi alla plastica. La fiasca viene mantenuta inizialmente per tre giorni in incubatore senza cambio di terreno, che viene successivamente cambiato ogni 48 ore. I frammenti di derma non sono prelevati dalla fiasca fino a quando i fibroblasti non incominciano ad espandersi dal derma, a una settimana dalla semina.
Le colture di ADSC nello scaffold si sono mostrate morfologicamente e funzionalmente (capacità di produrre sostanza extracellulare, come qui definita) simili ai fibroblasti umani.
Esempio 4
Analisi del cariotipo
Per dimostrare l’assenza di trasformazione delle ADSC in coltura è stata effettuata l’analisi del cariotipo a diversi passaggi. Dopo tripsinizzazione e centrifugazione le ADSC in sospensione vengono stimolate alla mitosi mediante fitoemagglutinina (PHA) e bloccate in metafase mitotica con la colchicina. Le cellule vengono sottoposte a lisi osmotica in una soluzione tampone adatta e vengono isolate le piastra metafasiche. I cromosomi vengono quindi colorati mediante metodo del "banding". Le piastre metafasiche vengono infine fotografate.
L’analisi del cariotipo a diversi passaggi delle ADSC ha dimostrato l’assenza di anomalie cromosomiche di queste cellule dopo diversi passaggi in coltura (passaggio 1 e passaggio 3).
Esempio 5
Preparazione di un sostituto dermico secondo l’invenzione
La matrice (o scaffold) utilizzata è rappresentata da un sistema costituito da una matrice tridimensionale porosa di materiale biologico (ad esempio da fibre collagene) completamente riassorbibile nel tempo. La matrice deve assicurare la replicazione e la crescita delle ADSC in essa seminate, deve essere costituita da un materiale sufficientemente rigido e resistente da poter essere agevolmente trasportato e applicato nella sede dell’ innesto e non deve essere causa di reazioni infiammatorie da parte dell’ospite. Uno scaffold adeguato è ad esempio quello attualmente commercializzato con il nome di INTEGRA<®>. Questo scaffold è costituito da una matrice porosa composta da fibre di collagene reticolato, ottenuto da tendine bovino, e da un glucosamminoglicano (tipo condroitina-6-solfato), prodotta a porosità controllata e a tasso di degradazione definito. La matrice utilizzata deve essere sterile e possibilmente conservata in tampone fosfato a 2°C.
La metodica per la produzione di sostituto dermico cellulari zzato prevede la semina delle ADSC, all’interno dello scaffold e il mantenimento dello scaffold cellularizzato all’ interfaccia aria-mezzo di coltura (ad esempio su piastre multiwell da 6 pozzetti di tipo transwell). A questo fine lo scaffold viene appoggiato su un supporto a griglia e le cellule sono mantenute in diretto contatto con l’atmosfera (vedi fig. 3). In questo modello le caratteristiche morfologiche ed architetturali del derma che si svilupperà potranno essere sovrapponibili a quello in vivo. In particolare le ADSC andranno a posizionarsi nella struttura porosa dello scaffold mimando una funzione di tridimensionalità indispensabile per una adeguata riparazione tissutale. Il sostituto dermico viene mantenuto nel terreno di coltura completo, sostituito ogni due giorni, per un periodo di 3 settimane a 37°C, 5% C02. Prima della semina delle ADSC all’ interno dello scaffold, la matrice viene tagliata e posta all’interno di una capsula di Pelri con della soluzione fisiologica per 15 minuti. Quindi viene spostata in una nuova capsula di Petri contenente una soluzione di Hank’s Balance Solution e 1% di PSA, per l ora a 37°C, 5%C02.
La procedura per la semina delle ADSC all’interno della matrice prevede che dopo tripsinizzazione e centrifugazione, le ADSC al passaggio PI o P2 vengono contate e seminate in numero di 400.000/ cm<2>risospese in terreno di coltura completo. Tale sospensione cellulare viene quindi distribuita sulla superficie dello scaffold asciugato su garza sterile e posizionato sulla superfìcie della griglia per la crescita in emersione (ad esempio superficie della Transwell).
Dopo tre settimane il sostituto dermico cellularizzato può essere studiato mediante istologia e immunoistochimica. Per i preparati istologici i campioni vengono fissati in formalina tamponata al 4%, inclusi in paraffina e tagliati al microtomo. Nel caso dei preparati per immunoistochimica i campioni vengono congelati e successivamente tagliati al criostato ad uno spessore di 4 μιη.
Le sezioni vengono colorate mediante Ematossilina-Eosina per evidenziare la morfologia del tessuto. Nei preparati istologici si evidenzia una omogenea distribuzione delle cellule all’interno dello scaffold con presenza di figure mitotiche, indice di replicazione delle cellule.
Le sezioni vengono anche utilizzate per un’analisi immunoistochimica delle principali proteine che costituiscono la matrice extracellulare del tessuto connettivo mediante anti corpi anti collagene I, collagene ΙΠ e fibronectina di origine umana. L’indagine immunoistochimica evidenzia la presenza di fibre collagene e fibronectina di origine umana neodeposte tra le fibre collagene di origine bovina che costituiscono lo scaffold.
Esempio 6
Verifica dell 'aumentata produzione di matrice connettivale per aggiunta di acido ascorbico
Lo scaffold cellularizzato è stato mantenute in coltura con il seguente medium contenenti Dulbecco’s Modifìed Eagle Medium /Ham’s F12 (in rapporto 3:1)
20% di siero di vitello fetale (FBS)
1% di antibiotico penicillina/streptomicina/anfotericina
2% di glutammina
10 ng/ml di basic fibroblast growth factor (bFGF)
250 μΜ di acido ascorbico.
Le cellule sono mantenute in coltura per 30 giorni a 37°C, 5% C02. La quantità di matrice extracellulare prodotta può essere studiata mediante istologia (Ematossilina-Eosina; Tricromica di Masson e Alcian Blu) e immunoistochimica (con anticorpi anti-collagene 1 umano, anti-collagene TU umano e anti-fibronectina umano). I risultati del saggio hanno dimostrato che vi è un aumento della produzione di matrice connettivale in presenza di acido ascorbico.
Esempio 7
Trattamento dello scaffold cellularizzato con fattori differenziativi per ottenere tessuto osso
Lo scaffold celularizzato trattate con uno specifico terreno di coltura differenziativo capace di indurre la differenziazione delle staminali/stromali mesenchimali in osteoblasti.
Le cellule sono seminate nello scaffold come descritto in precedenza alla concentrazione di 40.000 cellule/cm<2>. Si è quindi proceduto al trattamennto differenziativo osteogenico mediante teireno differenziativo (composto da DMEM/F12, 10% FBS, 1% PSA, lOmM β-glicerofosfato, lOnM Dexametasone, 0,25 mM Acido Ascorbico) per 21 giorni.
La differenziazione nelle linea osteogenica è stata dimostrata mediante dimostrazione di attività di fosfatasi alcalina e mediante colorazioni specifiche come l’Alizarìn Red
Claims (15)
- Rivendicazioni 1. Sostituto dermico che comprende cellule staminali mesenchimali derivate da tessuto adiposo, inserite in una matrice biocompatibile.
- 2. Sostituto dermico secondo la rivendicazione 1, in cui dette cellule staminali mesenchimali derivate da tessuto adiposo sono inserite in una matrice biocompatibile e mantenute in coltura in presenza anche di acido ascorbico.
- 3. Sostituto dermico secondo le rivendicazioni 1 o 2, in cui detto tessuto adiposo è tessuto adiposo sottocutaneo.
- 4. Sostituto dermico secondo le rivendicazioni da 1 a 3, in cui detta matrice è tridimensionale.
- 5. Sostituto dermico secondo le rivendicazioni da 1 a 4, in cui detta matrice comprende collagene.
- 6. Sostituto dermico secondo le rivendicazioni da 1 a 5, in cui detta matrice comprende anche elastina e/o glicosamminoglicani.
- 7. Sostituto dermico secondo le rivendicazioni da 1 a 6, in cui detta matrice comprende collagene e condroitina-6-solfato.
- 8. Sostituto dermico secondo le rivendicazioni da 1 a 7, che comprende inoltre alti tipi di cellule.
- 9. Sostituto dermico secondo le rivendicazioni da 1 a 8, per il suo uso nel trattamento e nella riparazione delle ferite e per favorire la rigenerazione cutanea.
- 10. Sostituto dermico secondo le rivendicazioni da 1 a 9, per il suo uso nel trattamento delle ferite di natura acuta e di natura cronica, delle ulcere diabetiche, delle ulcere vascolari, delle ustioni, delle piaghe da decubito, delle lesioni traumatiche, delle ferite post chirurgiche delle ferite da pressione, delle complicanze delle ferite, delle cicatrici ipertrofiche e dei cheloidi.
- 11. Sostituto dermico secondo le rivendicazioni da 1 a 10, in combinazione con uno o più ulteriori sostituti dermoepidermici per il suo uso nel trattamento delle ferite e la rigenerazione cutanea.
- 12. Cellule staminali mesenchimali derivate da tessuto adiposo, inserite in una matrice biocompatibile, per la preparazione di un sostituto dermico.
- 13. Sostituto dermico che comprende della SVF (Frazione Stromale Vascolare) derivata da tessuto adiposo, inserita in una matrice biocompatibile.
- 14. Procedimento per la preparazione di un sostituto dermico che comprende: a. estrarre la SVF da tessuto adiposo, preferibilmente sottocutaneo; b. isolare le ADSC in coltura; c. seminare le ADSC in una matrice biocompatibile; e d. stimolare la differenziazione delle ADSC in tessuto dermico.
- 15. Procedimento per la preparazione di un sostituto dermico che comprende: d. estrarre della SVF da tessuto adiposo; e. seminare la SVF in una matrice biocompatibile.
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