CN103409361A - 温敏微载体及其制备工艺和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种温敏微载体及其制备方法和使用方法，可扩增培养和收获临床治疗用高质量高活性的细胞，以用于细胞治疗和组织工程领域。本发明是以高分子材料细胞培养微球为基质通过表面化学处理接枝活性基团，再与温敏性聚合物反应，接枝上温敏性聚合物，得到温敏微载体，用于细胞培养，在细胞培养过程中，通过控制温度，使细胞贴附于该温敏微载体表面进行生长和扩增，然后降低温度收获表面蛋白完整的细胞。该方法一方面提供了一种短期内扩增大量治疗用细胞的方法，另一方面避免了使用胰酶和传统化学解离试剂，减少了对细胞表面蛋白和离子通道的破坏，并维持了细胞的原始功能，具有很强的临床应用价值和经济价值。

Description

温敏微载体及其制备工艺和使用方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及细胞培养，特别涉及一种用于扩增培养和收获临床治疗用高质量高活性细胞的温敏微载体及其制备方法和使用方法。

背景技术

细胞培养是指在合适的培养条件下，动物细胞离体生长和增殖，并保持其特征和功能的技术。来自于动物实体组织的大多数细胞需要贴壁单层生长。只要它们没有转化为非贴壁依赖性的，必须贴附在合适的固体介质上并铺展，才能开始生长。

传统的细胞培养是使用细胞平皿进行培养，平皿经过处理适于细胞贴附和生长，一个传统的平皿提供了78.52cm²并可以可支持10⁶-10⁷个细胞贴附生长。随后，人们开始使用细胞转瓶，滚瓶、以及中空纤维等装置进行细胞培养。

微载体细胞培养开始于19世纪60年代末期，最早使用离子交换凝胶（DEAE-Sephadex A50）作为载体，轻微搅动即可使该离子交换凝胶成为微小的颗粒悬浮在培养基中，由于这种微载体带有电荷，利于细胞贴附于载体上进行生长繁殖，而且载体处于悬浮状态不仅可大大增加细胞附着面积，又使细胞能与培养基充分接触，进而有利于细胞的生长，因此能达到大量培养细胞的目的。

良好的细胞培养微载体具有以下特点：表面积/体积（S/V）大，单位体积培养液的细胞产率高；把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况；简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制，重现性好；培养基利用率较高；容易进行放大培养；细胞收获过程不复杂；劳动强度小；培养系统占地面积和空间小。

微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，由于其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，且放大容易，已广泛用于培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞等。

但是，在把微载体培养由实验室规模放大到中试甚至工业生产规模时，传代被认为是限制性的一步。目前常用的传代方法有两种 ①不依赖于蛋白水解酶的微载体细胞传代，即基于某些培养细胞能在微载体间自动解离和转移的现象，加人新鲜培基和微载体进行扩大培养，但这种方法仅限于少数细胞系，如CHO细胞、CHO工程细胞、鼠成纤维细胞、内皮细胞等，而不适用于所有细胞； ②依赖于蛋白水解酶的微载体细胞传代，即先用蛋白水解酶将细胞从微载体上消化下来作为下一级的种子细胞，再加入新鲜培基和微载体以增殖细胞，用于这一用途的酶有胰酶、葡聚糖酶、胶原酶等，它们可单独使用或混合使用，该方法在理论上可行，实际生产中也比较常用，但经过胰酶消化不但会使细胞受到一定伤害，还可能会破坏微载体的部分结构，造成细胞贴壁率降低，微载体利用率下降，影响细胞的扩大培养，特别是当大规模培养时，还存在着劳动强度高，污染几率大的弊端。

细胞治疗是利用患者自体(或异体)的成体细胞(或干细胞)对组织、器官进行修复的治疗方法，广泛用于骨髓移植、晚期肝硬化、股骨头坏死、恶性肿瘤、心肌梗死等疾病。治疗用细胞要求高质量，高活性，细胞外基质和表面蛋白保存完整。而上述的细胞培养方法较难达到该要求。

虽然近年有文献报道（N.E.Timmins,M.Kiel,M.Gunther,etc. Closed System Isolation and Scalable Expansion of Human Placental Mesenchymal Stem Cells.2012），研究者利用微载体大规模培养来源于人胚胎的间充质干细胞用于临床治疗目的。但是不管是用微载体还是用之前组织培养聚苯乙烯（TCPS）构成的传统培养皿进行细胞培养，都需利用胰蛋白酶的蛋白水解作用使细胞外基质（ECM）分解和用乙二胺四乙酸（EDTA）络合Ca²⁺ 与 Mg²⁺的方法回收细胞，然而，非特异性的蛋白酶会破坏重要的细胞表面蛋白质，这就是这类细胞回收方法的主要缺陷，该方法费时，费力，细胞收获效率较低。此外，从细胞组织工程的角度来说，对新形成的组织结构的破坏，可以说是一种退步。

现有的细胞培养微载体有Cytodex1和Cytodex3等商业化产品，但是使用这些传统微载体具有费用昂贵，细胞消化时会对细胞表面蛋白造成损伤等缺点，大大限制了其在细胞治疗领域的应用。

发明内容

为了克服上述传统细胞回收的风险和问题，本发明提供了一种温敏微载体及其制备方法，以及将其用于细胞培养的方法。

本发明通过接枝反应将温敏性的聚合物固定于高分子材料细胞培养微球的表面，制备而得的温敏微载体仅改变温度就能实现细胞的自发分离，避免了在细胞回收时使用胰酶消化或者化学试剂解离，能得到无损伤的完整细胞系。参见图1，为本发明的温敏微载体进行细胞培养和分离的应用机理示意图。

聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAM）是目前最常用的温敏性聚合物之一，由N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAm）聚合而成，其大分子链上同时具有亲水性的酰胺基-CONH-和疏水性的异丙基 -CH(CH₃)₂，在NIPAAm聚合过程中加入交联剂或经处理产生化学交联后，就成为具有温度敏感特性的PNIPAAm水凝胶。其最大优点是：在常温下，线型PNIPAAm溶于水中形成均匀的溶液；而当温度升高至30-35℃之间某一温度时（因合成方法、合成条件等而异）溶液发生相分离，引起几十倍甚至上百倍的体积收缩变化，凝胶的其他性质（如相互作用参数、模量、折射率、介电常数、润湿性、光学各向异性等）也会发生突跃性变化，这些变化往往都是可逆的，此时的相转变温度称为最低临界溶液温度（low critical solution temperature, LCST）；LCST与哺乳动物和人体温度相近，且当调节聚合物骨架中的亲水或疏水组分时，LCST可以上移或下降。我们可以利用这一性质，用表面包覆有PNIPAM的微载体取代常用的组织培养聚苯乙烯（TCPS）进行细胞培养。 在细胞培养温度（37℃）下， PNIPAM接枝的微载体表面与TCPS表面相似，为疏水性，可用来进行细胞的附着与培养，当温度下降至室温时，微载体的PNIPAM表面由疏水性转变为亲水性，附在该表面的细胞会自发地迅速分离，得到无损伤的完整细胞系。

本发明的技术方案如下：

一种温敏微载体，其以高分子材料细胞培养微球作为基质，其上包覆有温敏性聚合物，其中，所述高分子材料细胞培养微球选自天然或合成高分子材料。天然或合成高分子材料作为基质与无机材料如二氧化硅材料相比，具有来源广，修饰容易的优点。

其中，温敏性聚合物选自：丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰胺和/或N-取代的（甲基）丙烯酰胺和/或N，N-二次取代的（甲基）丙烯酰胺作为单体的均聚物或者共聚物以及这些聚合物的混合物；

所述天然或合成高分子材料选自葡聚糖，壳聚糖，明胶，聚苯乙烯，海藻酸钠，聚2-羟乙基甲基丙烯酸中的至少一种。

一种上述的温敏微载体的制备方法，包括如下步骤：

1）对高分子材料细胞培养微球进行表面化学修饰，使其表面带有能与温敏性聚合物反应的活性基团，优选这些活性基团选自卤代原子、氯甲基、氨基或羧基中的至少一种，能提供该些活性基团用于高分子材料细胞培养微球表面化学修饰的试剂可选自2-氯丙酰氯、2-溴丙酰溴、2-溴丁酰溴、2-氯丁酰氯、乙基黄原酸钾、苄基三硫代碳酸酯基丙酸中的至少一种；其中，所述高分子材料细胞培养微球选自天然或合成高分子材料；反应的溶剂、反应温度、反应时间、反应浓度等可由本领域技术人员根据不同的高分子材料细胞培养微球、表面化学修饰试剂进行选取，此处不做限定。对于2-氯丙酰氯、2-溴丙酰溴、2-溴丁酰溴、2-氯丁酰氯、乙基黄原酸钾、苄基三硫代碳酸酯基丙酸等表面化学修饰试剂，优选反应的溶剂可为水或者其他自由溶液，反应的温度为60-100℃，反应时间为20 min-1 h；

2）在无氧环境及催化剂存在条件下，使温敏性聚合物单体在引发剂作用下在表面带有活性基团的高分子材料细胞培养微球表面聚合，从而将温敏性聚合物接枝在高分子材料细胞培养微球表面，收获温敏微载体。其中，引发剂的选择和添加量可由本领域技术人员根据常识选取，此处不做限定，引发剂还可以接枝在高分子材料细胞培养微球表面；该步骤还可以酌情加入其它助剂，例如抗氧化剂等，本领域技术人员可以根据实际情况选择添加，此处不做限定。

其中，所述催化剂优选自三-(N’N二甲氨基乙基胺)、 N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N-二甲基-4-吡啶胺、氯化铜、溴化铜中的至少一种。这些催化剂具有催化效率高，特异性强以及价格低廉等优点；接枝反应方法可选自等离子体处理，自由基引发的原子转移自由基聚合（ATRP）或可逆加成-断裂链转移聚合（RAFT）中的一种。这些接枝方法具有操作简单，接枝效率高，高分子分散均匀的优点，更利于细胞贴服和脱落，并且成本低廉。

优选地，所述步骤2）中，所述温敏性聚合物选自：丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰胺和/或N-取代的（甲基）丙烯酰胺和/或N，N-二次取代的（甲基）丙烯酰胺作为单体的均聚物或者共聚物以及这些聚合物的混合物，其中

优选所述N-取代的（甲基）丙烯酰胺选自乙基丙烯酰胺，N-正丙基丙烯酰胺，N-异丙基丙烯酰胺，N-异丙基甲基丙烯酰胺，N-环丙基丙烯酰胺，N- 环丙基甲基丙烯酰胺，N-乙氧基乙脂丙烯酰胺，N-乙氧基乙脂甲基丙烯酰胺，N-四氢呋喃丙烯酰胺，N-四氢呋喃甲基丙烯酰胺中的至少一种；

所述N，N-二次取代的（甲基）丙烯酰胺选自N-二甲基（甲基）丙烯酰胺，N-乙甲基丙烯酰胺，N-二乙基丙烯酰胺（32℃），1-（1-氧-2-丙烯）-吡咯，1-（1-氧-2-丙烯）-吡啶，,4-（1-氧-2-丙烯）-吗啉，1-（1-氧2-甲基-2-丙烯）-吡咯，1-（1-氧2-甲基-2-丙烯）-吡啶,4-（1-氧-2甲基-2-丙烯）-吗啉中的至少一种。

进一步优选地，所述温敏性聚合物选自聚N-异丙基丙烯酰胺，聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）-聚乙二醇共聚物、聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）-丙烯酸共聚物、壳聚糖-聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）共聚物、多聚N-异丙基丙烯酰胺半乳糖（Poly(NIPAAm-co-GAC)）共聚物。这些温敏性聚合物广泛用于生物领域，具有很好的生物相容性和合适温度的LCST，而且原料易得，成本低廉。

制备本发明的温敏微载体时，可以根据拟培养的细胞类型的不同拟定温敏微载体表面的温敏性聚合物的LCST，然后通过调节高分子材料细胞培养微球和温敏性聚合物的相互作用或通过不同原料的选择来控制表面包被的温敏性聚合物材料疏水性和亲水性的平衡调节，从而获得所需LCST的温敏微载体。 

接枝反应的温度、时间、浓度等可由本领域技术人员根据具体的反应原料选取，通常，以N-异丙基丙烯酰胺为原料的话，反应的温度为60-100℃，反应时间为20 min-1 h，N-异丙基丙烯酰胺的质量分数在10%-30%之间。催化剂的添加比例为0.5%-5%。

所述天然或合成高分子材料选自葡聚糖，壳聚糖，明胶，聚苯乙烯，海藻酸钠，聚2-羟乙基甲基丙烯酸中的至少一种。

一种上述的温敏微载体或上述的方法制备的温敏微载体用于细胞培养的方法，该方法包括如下步骤：

1）对温敏微载体进行灭菌预处理并添加于细胞培养装置中；

2）在添加了温敏微载体的细胞培养装置中接种细胞；使用本发明的微载体进行细胞培养时，游离的种子细胞可从方瓶或转瓶中获得，直接接种到细胞培养装置中；

3）向细胞培养装置中添加细胞培养基在适宜的温度条件下进行细胞培养扩增，通常细胞培养的温度范围为35-38℃，优选的温度为37℃；在正常细胞培养温度下（温敏性聚合物的LCST以上）适当调节搅拌速度，细胞便会在温敏微载体表面自行贴附和生长； 

4）当细胞长满载体，通过改变培养液温度使细胞从载体表面脱离；优选使细胞从载体表面脱离的温度为4-32℃，通常改变培养液温度为使温度降至室温，这种方法操作简便，能耗少，且能保持细胞活性；

5）分离细胞和载体，得到所需的细胞。利用本发明的温敏微载体进行细胞培养在细胞分离时，可以使用过滤网或者过滤器，也可以使用离心的方法。在使用离心方法收集时，一旦细胞脱离微载体，就通过离心方法收集，一旦浓缩好，培养液去除，细胞重悬在新培养基并被转移到新的细胞培养装置内，就可以直接提供给细胞治疗实验室。大规模细胞培养时候，使用细胞分离仪器，将细胞培养装置用一个无菌不锈钢滤网分隔为2个小室，上层包括一个混合装置，根据情况添加冷暖缓冲液并反应一段时间，然后通过添加遇冷的洗脱液体使细胞释放，细胞随温度降低而自发脱离微载体后随洗脱液一起通过滤网在下层收集，而温敏微载体则留在上层得到分离。

同时，利用本发明的温敏微载体进行进一步放大培养也变得简单，所述步骤3）与步骤4）之间还可以包括：进行细胞放大培养，降低培养基温度至温敏微载体表面的温敏性聚合物的LCST以下，通常为室温，待贴附在微载体表面的细胞自发脱落分离，以分离的细胞为种子细胞向反应器中补加适量新鲜的培养基和温敏微载体，再提高培养基温度至细胞生长适温，便可以达到放大的目的。

本发明的温敏微载体可以采用以上方法培养动物细胞或者可用于商业化的细胞；其中，动物细胞可为如下的一种或多种：成骨细胞，成肌细胞，成神经细胞，纤维母细胞，成神经胶质细胞，生殖细胞，肝细胞，软骨细胞，角质内皮细胞，平滑肌细胞，心肌细胞，结蹄组织细胞，上皮细胞，内皮细胞，激素分泌细胞，免疫系统细胞，神经细胞，胚胎干细胞，骨髓间充质干细胞，脐带血干细胞以及来源于其他组织和器官的干细胞；

商业化细胞可为CHO、Vero、BHK、NS0中的一种或多种。

本发明的亮点之一在于，所述步骤4）中，细胞从载体表面脱离时不使用胰酶或者化学试剂解离细胞，而仅仅通过改变温度来实现。

上述温敏微载体用于细胞培养的方法，细胞培养装置、细胞培养基、分离细胞和载体的装置与常规的细胞培养类似，例如细胞培养装置可以选用细胞培养皿，孔板，细胞培养转瓶，摇瓶和生物反应器，波浪式生物反应器细胞培养装置（WAVE）中的一种或多种；细胞培养基为有血清或者化学成分限定的培养基、培养液等；分离细胞和载体的装置或方法选自细胞过滤网，过滤器或者离心。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、使用本发明的温敏微载体进行细胞培养，在细胞分离时，避免使用胰酶消化或者化学试剂解离，减少了细胞的死亡，降低了对细胞外基质的损伤，提高了治疗用细胞的质量和活性；

2、本发明的温敏微载体在细胞培养过程中通过简单的升温和降温使细胞贴附和分离，替代了使用胰酶消化的复杂繁琐过程；

3、使微载体培养放大过程和分离收获更简单，同时提高了细胞的收获率；

4、由于动物细胞大多需要贴附于一定的表面进行生长，所以，本发明的温度敏感微载体提供了一个良好的依附面，适合于贴壁哺乳动物细胞的培养，可以培养的细胞包括成骨细胞，成肌细胞，成神经细胞，纤维母细胞，成神经胶质细胞，生殖细胞，肝细胞，软骨细胞，角质内皮细胞，平滑肌细胞，心肌细胞，结缔组织细胞，上皮细胞，内皮细胞，激素分泌细胞，免疫系统细胞，神经细胞，胚胎干细胞，骨髓间充质干细胞，脐带血干细胞以及来源于其他组织和器官的干细胞等各类细胞的贴附和生长，此外，本发明的细胞培养方法也适合商业化细胞的培养；

5、用于制备该温敏微载体的基质材料：高分子材料细胞培养微球的来源广泛且价格低廉，例如葡聚糖，壳聚糖，明胶，聚苯乙烯，海藻酸钠，聚2-羟乙基甲基丙烯酸（pHEMA）等天然和合成高分子材料；

6、可用于接枝的温敏高分子材料种类繁多，包括聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）及其共聚物PNIPAAm-聚乙二醇共聚物、PNIPAAm-丙烯酸共聚物、壳聚糖-PNIPAAm共聚物、Poly(NIPAAm-co-GAC)共聚物等； 

7、工艺简单，成本低，可用于工业化生产。

本发明一方面提供了一种短期内扩增大量治疗用细胞的方法，另一方面避免了使用胰酶和传统化学解离试剂，减少了对细胞表面蛋白和离子通道的破坏，并维持了细胞的原始功能，具有很强的临床应用价值和经济价值。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

图1是本发明的温敏微载体的应用机理示意图；

图2是实施例1人脐带间充质干细胞显微镜下的二维培养形态照片；

图3是实施例2流式细胞术鉴定人脐带间充质干细胞表面标志图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

1、 温敏微载体的制备：

1）25 mL圆底烧瓶中加入葡聚糖微球(G50)1.0 g，二甲基亚砜（DMSO）10 mL，加入2-氯丙酰氯1.0 g, 加入磁子搅拌1.5 h，用甲醇洗3-5次后，得到表面含有大量氯原子的化学修饰的葡聚糖微球；

2）N-异丙基丙烯酰胺（NiPAAm）通过自由基ATRP聚合接枝，方法如下：表面经过氯甲基化修饰含有大量氯原子的葡聚糖微球加入含有磁子的50mL圆底烧瓶，依次加入N异丙基丙烯酰胺(NIPAAm) 2.0 g， 氯化铜（CuCl₂） 0.34 g，三-(N’N二甲氨基乙基胺)（Me6Tren）0.46 g， 25 mL去离子水，无氧的环境下，加入抗坏血酸0.13 g ,室温反应24 h，然后用水洗3-5次后干燥，即得到接枝N异丙基丙烯酰胺的聚合物的具有温敏性的葡聚糖微球。

2、温敏微载体用于细胞培养的方法：

1）取3g上述制备而得的温敏微载体于100mL转瓶中，加入80mL PBS（磷酸缓冲液），浸泡过夜，进行灭菌预处理；

2）在超净台内弃去PBS，加入20mLα-MEM (10%FBS) 培养液（商用产品），浸泡6h；

3）按照2*105cells/mL浓度加入人脐带间充质干细胞于转瓶中，添加培养液至100mL体积，按照40rpm搅拌3min，静止12min的方式接种细胞，6h之后按照40rpm的搅拌转速进行培养，培养温度为37℃，每隔2天更换半体积培养液；

4）培养至第八天，细胞已经长满微载体，弃去培养液，加入预冷的PBS 100mL于转瓶内，使培养液温度由37℃改变为常温，并在常温下放置20min，细胞自动从微载体上脱落，显微镜下观察计数，进行细胞表面标志蛋白的检测。计算得，细胞收获率大约70%。

  图2为本实施例1中，人脐带间充质干细胞显微镜下的二维培养的形态，放大倍数为40倍，显微镜下，人脐带间充质干细胞呈长梭形贴附生长，细胞间紧密连接，融合度达到60%，细胞形态清晰，状态良好。

 

实施例2

1、 温敏微载体的制备：

1）  在25mL圆底烧瓶中加入海藻酸钠微球1.0 g，二甲基亚砜（DMSO）10 mL，加入2-胺甲基氯烷3 g, 加入磁子搅拌1 h，用甲醇洗3-5次后，得到表面含有大量氨基的化学修饰的海藻酸钠微球；

2）N-异丙基丙烯酰胺（NiPAAm）通过自由基ATRP聚合接枝，方法如下：将上述表面含有大量氨基的化学修饰的海藻酸钠微球加入含有磁子的50mL圆底烧瓶，依次加入N异丙基丙烯酰胺(NIPAAm) 2.0 g，溴化铜 (CuBr₂) 0.52 g，三-(N’N二甲氨基乙基胺) (Me6Tren) 0.46 g，20 mL去离子水，在无氧的环境下，加入抗坏血酸0.13 g，室温反应24 h，然后用水洗3-5次后干燥，即得到接枝N异丙基丙烯酰胺的海藻酸钠微球。

2、温敏微载体用于细胞培养的方法：

1） 取5g上述制备而得的温度敏感微载体于1000mL转瓶中，加入200mL PBS，浸泡过夜，进行灭菌预处理；

2）在超净台内弃去PBS，加入100mLα-MEM(10%FBS)培养液，浸泡6h；

3）按照3*105cells/mL浓度加入人脐带间充质干细胞于转瓶中，添加培养液至1000mL体积，按照40rpm搅拌3min，静止12min的方式接种细胞，6h之后按照40rpm的搅拌转速进行培养，培养温度为37℃，每隔2天更换半体积培养液；

培养至第九天，细胞已经长满微载体，弃去培养液，加入预冷的PBS 500mL于转瓶内，使培养液温度由37℃改变为常温，并在常温下放置20min，细胞自动从微载体上脱落，显微镜下观察计数，进行细胞表面标志蛋白的检测。计算得，细胞收获率大约50%。

图3为本实施例2中经过温度变化收获的人脐带间充质干细胞流式细胞仪形态检测，图中结果表明，收获的人脐带间充质干细胞高效表达间充质细胞标志CD29、CD44，不表达造血干细胞标志CD14及CD45，说明经过温度敏感微载体培养的人脐带间充质干细胞具有良好的活性与干细胞标志，并保持完整的未分化能力。

 

实施例3

1、温敏微载体的制备：

1）在100mL圆底烧瓶中加入壳聚糖微球5.0 g，二甲基亚砜（DMSO）30 mL，加入2-溴丙酰溴5.5 g, 加入磁子搅拌1 h，用甲醇洗3-5次后，得到表面含有大量溴原子的化学修饰的葡聚糖微球；将上述表面含有大量溴原子的化学修饰的葡聚糖微球与乙基黄原酸钾 3.0 g 在20 mL二氯甲烷和20 mL甲醇中，室温反应24 h，用水洗3次后干燥，可得到表面含有大量乙基黄原酸酯结构的壳聚糖微球；

2）N-异丙基丙烯酰胺（NiPAAm）通过等离子体处理接枝反应方法，方法如下：将上述表面含有大量乙基黄原酸酯结构的壳聚糖微球 3.0 g加入含有磁子的30mL圆底烧瓶，依次加入N异丙基丙烯酰胺(NIPAAm) 3.0 g，偶氮二异丁氰(AIBN) 0.06 g，10 mL1,4二氧六环，去除氧气后，70℃下反应10 h，然后用水洗3-5次后干燥，即得到接枝N异丙基丙烯酰胺的壳聚糖微球。

2、温敏微载体用于细胞培养的方法：

1）取10g上述制备而得的温敏微载体于2L Applikon生物反应器中，PBS浸泡处理，进行灭菌预处理；

2）添加500 mL DMEM（10%FBS）培养基于反应器中，37摄氏度浸泡过夜；

3）按照3*105cells/ml的密度接种人脂肪间充质干细胞于生物反应器中，按照间歇接种的方法进行培养，培养温度为37℃，根据葡萄糖消耗状态更换培养基；每天取样计数，观察细胞在微载体上生长状态；

4）培养至第10天，细胞基本长满微载体，停止细胞培养，通过蠕动泵弃去培养基，加入预冷过的PBS，使培养液温度由37℃改变为常温，搅拌状态下放置3h，观察到细胞逐渐脱落，通过离心方法收获到扩增后的人脂肪间充质干细胞，检测细胞表面标志蛋白。

 

实施例4

1、温敏微载体的制备：

1）壳聚糖微球1.0g于5°真空干燥1h，重悬于10ml DMSO（包括0.7 ml 三乙基胺）1h；2-溴丙酰溴1.0g 逐滴加入悬浮液中，混合物室温搅拌1h，然后使用DMSO和甲醇完全冲洗，得到的表面修饰的微球室温干燥1h，其作为下一步反应的引发物；

2）N-异丙基丙烯酰胺（NiPAAm）通过自由基ATRP聚合接枝，方法如下：步骤1）得到的表面修饰的微球引发物0.2g，N-异丙基丙烯酰胺 4.5g（40 mmol），溴化铜（0.057 g 0.4mmol），2.2-联吡啶0.125 g（0.8 mmol），被加入到50 ml摇瓶，混合物在真空下去除氧气；将去离子水10ml，加入摇瓶，室温搅拌4h，产物使用水和甲醇冲洗数次，室温干燥1h，即得到接枝N异丙基丙烯酰胺的壳聚糖微球。

2、温敏微载体用于细胞培养的方法：

1）取0.3g上述制备而得的温敏微载体于100mL转瓶中，加入80mL PBS，浸泡过夜，进行灭菌预处理；

2）在超净台内弃去PBS，加入20mLα-MEM(10%FBS)培养液，浸泡6h；

3）按照2*105cells/mL浓度加入人羊膜间充质干细胞于转瓶中，添加培养液至100mL体积，按照40rpm搅拌3min，静止12min的方式接种细胞，6h之后按照40rpm的搅拌转速进行培养，培养温度为37℃，每隔2天更换半体积培养基；

4）培养至第八天，细胞已经长满微载体，弃去培养基，加入预冷的PBS100mL于转瓶内，使培养液温度由37℃改变为常温，并常温下放置20min，细胞自动从微载体上脱落，显微镜下观察计数，进行细胞表面标志蛋白的检测。

    除以上实施例外，本发明还可以在需要的时候进行细胞的放大培养，方法为：在步骤3）与步骤4）之间进行如下操作：降低细胞培养基温度至温敏微载体表面的温敏性聚合物的最低临界溶液温度LCST以下，待贴附在微载体表面的细胞自发脱落分离，以分离的细胞为种子细胞向反应器中补加适量新鲜的细胞培养基和温敏微载体，再提高培养基温度至细胞生长适温进行放大培养。

本发明所列举的各原料及方法都能实现本发明，以及各原料和工艺的上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。

    以上实施例通过举例说明的方式对本发明的方案进行了进一步的详细说明，但上述实施例并不能限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求所限定的为准。 

Claims (14)

1.一种温敏微载体，其特征在于，所述温敏微载体以高分子材料细胞培养微球作为基质，其上包覆有温敏性聚合物，其中，所述高分子材料细胞培养微球选自天然或合成高分子材料。

2.如权利要求1所述的温敏微载体的制备方法，其特征在于，所述温敏性聚合物选自：丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰胺和/或N-取代的（甲基）丙烯酰胺和/或N，N-二次取代的（甲基）丙烯酰胺作为单体的均聚物或者共聚物以及这些聚合物的混合物；

所述天然或合成高分子材料选自葡聚糖，壳聚糖，明胶，聚苯乙烯，海藻酸钠，聚2-羟乙基甲基丙烯酸中的至少一种。

3.一种权利要求1所述的温敏微载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）对高分子材料细胞培养微球进行表面化学修饰，使其表面带有能与温敏性聚合物反应的活性基团，其中，所述高分子材料细胞培养微球选自天然或合成高分子材料；

2）在无氧环境及催化剂存在条件下，使温敏性聚合物单体在引发剂作用下在表面带有活性基团的高分子材料细胞培养微球表面聚合，从而将温敏性聚合物接枝在高分子材料细胞培养微球表面，收获温敏微载体。

4.如权利要求3所述的温敏微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中，所述高分子材料细胞培养微球表面带有的活性基团选自卤代原子、氯甲基、氨基或羧基中的至少一种。

5.如权利要求4所述的温敏微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中，用化学试剂对高分子材料细胞培养微球进行表面化学修饰，所述化学试剂选自2-氯丙酰氯、2-溴丙酰溴、2-溴丁酰溴、2-氯丁酰氯、乙基黄原酸钾、苄基三硫代碳酸酯基丙酸中的至少一种。

6.如权利要求3所述的温敏微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中，所述催化剂选自三-(N’N二甲氨基乙基胺)、 N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N-二甲基-4-吡啶胺、氯化铜、溴化铜中的至少一种。

7.如权利要求3所述的温敏微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中，接枝反应的方法选自等离子体处理，自由基引发的原子转移自由基聚合或可逆加成-断裂链转移聚合中的一种。

8.如权利要求3所述的温敏微载体的制备方法，其特征在于，所述天然或合成高分子材料选自葡聚糖，壳聚糖，明胶，聚苯乙烯，海藻酸钠，聚2-羟乙基甲基丙烯酸中的至少一种；

所述温敏性聚合物单体选自：丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰胺和/或N-取代的（甲基）丙烯酰胺和/或N，N-二次取代的（甲基）丙烯酰胺作为单体的均聚物或者共聚物以及这些聚合物的混合物。

9.如权利要求8所述的温敏微载体的制备方法，其特征在于，所述N-取代的（甲基）丙烯酰胺选自乙基丙烯酰胺，N-正丙基丙烯酰胺，N-异丙基丙烯酰胺，N-异丙基甲基丙烯酰胺，N-环丙基丙烯酰胺，N- 环丙基甲基丙烯酰胺，N-乙氧基乙脂丙烯酰胺，N-乙氧基乙脂甲基丙烯酰胺，N-四氢呋喃丙烯酰胺，N-四氢呋喃甲基丙烯酰胺中的至少一种；

所述N，N-二次取代的（甲基）丙烯酰胺选自N-二甲基（甲基）丙烯酰胺，N-乙甲基丙烯酰胺，N-二乙基丙烯酰胺，1-（1-氧-2-丙烯）-吡咯，1-（1-氧-2-丙烯）-吡啶，,4-（1-氧-2-丙烯）-吗啉，1-（1-氧2-甲基-2-丙烯）-吡咯，1-（1-氧2-甲基-2-丙烯）-吡啶,4-（1-氧-2甲基-2-丙烯）-吗啉中的至少一种。

10.如权利要求3或8或9所述的温敏微载体的制备方法，其特征在于，所述温敏性聚合物选自聚N-异丙基丙烯酰胺、聚N-异丙基丙烯酰胺-聚乙二醇共聚物、聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸共聚物、壳聚糖-聚N-异丙基丙烯酰胺共聚物、多聚N-异丙基丙烯酰胺-半乳糖共聚物中的一种或多种。

11.一种权利要求2-10中任一项所述的方法制备的温敏微载体用于细胞培养的用途。

12.一种权利要求2-10中任一项所述的方法制备的温敏微载体用于细胞培养的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1）对温敏微载体进行灭菌预处理并添加于细胞培养装置中；

2）在添加了温敏微载体的细胞培养装置中接种细胞；

3）向细胞培养装置中添加细胞培养基在适宜温度下进行细胞培养扩增；

4）当细胞长满载体，通过改变培养液温度使细胞从载体表面脱离；

5）分离细胞和载体，得到所需的细胞。

13.如权利要求12所述的温敏微载体用于细胞培养的方法，其特征在于，所述步骤4）中，细胞从载体表面脱离时不使用胰酶或者化学试剂解离细胞。

14.如权利要求12所述的温敏微载体在细胞培养中的使用方法，其特征在于，所述步骤3）与步骤4）之间还包括：进行细胞放大培养，降低细胞培养基温度至温敏微载体表面的温敏性聚合物的最低临界溶液温度以下，待贴附在微载体表面的细胞自发脱落分离，以分离的细胞为种子细胞向反应器中补加适量新鲜的细胞培养基和温敏微载体，再提高培养基温度至细胞生长适温进行放大培养。

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