CN111566197A

CN111566197A - 具有高细胞粘附性的聚合物细胞培养表面

Info

Publication number: CN111566197A
Application number: CN201880068084.9A
Authority: CN
Inventors: A·塔哈; B·莫瑞尔; M·威尔斯
Original assignee: SIO2 Medical Products Inc
Current assignee: SIO2 Medical Products Inc
Priority date: 2017-10-20
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2020-08-21
Also published as: WO2019079727A1; WO2019079682A1; EP3697888A1; JP2021500031A; US20200291342A1; CA3079191A1

Abstract

使聚合物衬底与工艺气体接触，并将射频电功率引入所述工艺气体中，从而形成与未处理的接触表面相比具有改善的细胞回收率的经处理的接触表面。所述工艺气体可选地可以是氮气、氧气、或含有氮原子、氧原子或氮原子和氧原子的组合的气体。所述方法可选地提高了鸡胚细胞培养物从所述经处理的接触表面的细胞回收率。

Description

具有高细胞粘附性的聚合物细胞培养表面

背景技术

该技术总体上涉及塑料衬底的表面或表面改性(在本披露中有时称为接触表面)，该表面是亲水性的，或使该表面亲水并增强细胞对表面的粘附。更具体地，该技术涉及塑料衬底，例如医疗装置或实验室器具，其具有由于其增强的细胞粘附性而用于细胞培养和细胞生长的经处理的表面。此类医疗装置包括但不限于细胞培养容器和滚瓶。

尽管比如造血细胞系和转化细胞等一些细胞在悬浮液(例如3D球形培养悬浮液)中生长，但大多数其他细胞的生长有利于高表面结合(例如单层生长)；也就是说，它们需要表面附着来增殖。历史上，玻璃被用作生长表面，因为它具有优异的光学性质，是亲水性的且自然带电的，这有利于促进细胞生长。一次性塑料，尤其是聚苯乙烯，现在最常用于细胞培养生长。聚苯乙烯培养容器具有良好的光学质量。

然而，由于大多数塑料是疏水性的并且不适于细胞生长，因此它们的表面需要处理或涂层。

在细胞生长容器中，希望增强细胞吸附以及细胞与用于生物物质的塑料器具的结合。由聚合塑料制成的普通实验室器具部件的表面是疏水性的，并且通常没有良好的细胞粘附性。因此，期望使得用于塑料实验室器具和其他与生物物质接触的物品的表面具有更高的亲水性并由此具有改善的细胞粘附性。

本发明还涉及用于进行化学、生物化学、医学和/或生物学用途的涂覆容器的制造的技术领域。这些方法和系统在包括医学诊断、医学治疗、环境监测、制造质量控制、药物发现和科学研究的各种应用中至关重要。

本发明总体上涉及细胞生长和细胞培养容器以及塑料实验室器具的制造。本发明还涉及通过等离子体处理产生亲水性表面。本发明进一步涉及产生具有增强的细胞粘附性的亲水性表面，并由此改善细胞培养和细胞生长。

传统玻璃器具呈现亲水性表面，并且因此被使用，并继续用于细胞培养和细胞生长。然而，玻璃器具容易破碎，非常昂贵，易于出现颗粒问题，产生重金属可萃取物，并且可能对细胞生长和/或蛋白质和其他生物制品的聚集产生不利影响。

这些问题中的一些可以通过用注塑模制塑料器具代替玻璃器具来解决。具体地说，由于玻璃器具存在大量问题，所以塑料器具在生物制剂领域，如医药、医学研究、药物发现和科学研究的领域中是优选的。塑料器具解决了玻璃器具的一些问题，但塑料器具也产生某些问题。塑料器具含有可萃取物/可浸出物，从而阻碍使用塑料器具或使其不适用于许多类型的实验室体外和分析测试。塑料器具呈现疏水性表面，其通常给予低的细胞粘附性。高细胞粘附性被认为可以增强细胞生长。这些问题限制了塑料器具用于细胞培养容器和滚瓶的用途。

滚瓶在各种应用中用作细胞培养容器。滚瓶通常由聚苯乙烯(PS)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)制成。这些材料呈现出优异的光学透明度、高稳定性、减少的破损和许多其他优点。

滚瓶相对较大的接触表面增强了细胞粘附，从而促进了细胞生长。为了扩大接触表面，一些滚瓶被设计成在主体上具有圆周的、轴向的或其他肋状物，这可以增加生长表面。

为了产生有益于细胞生长的亲水性表面，使用了一些亲水性涂层，包括聚乙二醇(PEG)和两性离子聚合物涂层，它们提供了良好的细胞粘附性。这些聚合物涂层中的许多不与物品表面共价结合，并且具有移动(溶解、分散)到流体有效负载中的潜力，造成干扰细胞生长或测试，从而限制了它们的效用。与物品表面共价连接的聚合物涂层将不具有移动(溶解、分散)到流体有效负载中的潜力，从而消除了干扰细胞生长的这种源。此外，共价结合的聚合物涂层将防止聚合物表面涂层的移动，由此防止物品表面的不希望的暴露。

因此，对于塑料实验室器具(如细胞培养容器和滚瓶)的表面的亲水性涂层/处理存在需要，这将增强细胞对塑料表面的粘附性。同样，对于塑料实验室器具(如细胞培养容器和滚瓶)的表面的共价结合的聚合物涂层/处理存在需要，这将防止聚合物表面涂层的移动，从而防止塑料表面不希望的颗粒干扰和暴露。

发明内容

本发明的一个方面是通常通过以下来实施的方法：提供包括初始接触表面的聚合物衬底，使初始接触表面与工艺气体接触，并在工艺气体中引入射频电功率，从而形成与未处理的接触表面相比具有改善的细胞回收率的经处理的接触表面。

除了初始接触表面之外，聚合物衬底还包括邻近初始接触表面的内部部分。

工艺气体可选地可以是氮气、氧气或含有氮原子、氧原子或氮原子和氧原子的组合以及其他种类原子的非均相气体，例如惰性气体。合适的工艺气体的非限制性实例包括氧气、氮气、一氧化二氮气体，或这些气体中的任何两种或更多种的组合。

可选地，射频电功率被引入邻近初始接触表面的工艺气体中，以邻近初始接触表面产生等离子体。结果，形成了具有经处理的接触表面的经处理的聚合物衬底。

相对于初始接触表面，该方法可选地提高了鸡胚细胞培养物从经处理的接触表面的细胞回收率，可选地导致从经处理的接触表面的细胞回收率是在细胞回收测试开始时提供给经处理的接触表面的细胞的至少140％。

附图说明

在附图中，

图1是可用于实施本发明任一实施例的等离子体处理装置的示意图。

图2是类似于图1的视图，示出了用于同时处理三个容器的等离子体处理装置。

图3是图1的装置的示意性剖视图，示出了该装置的内部细节和用于平衡被处理容器内部和外部压力的附加特征。

图4示出了CELLTREAT^TM滚瓶的透视图。

图5示出了类似于图4的商业滚瓶的照片视图，该滚瓶在其壁的内部和外部具有多个圆周肋状物，扩大了细胞附着的表面积。

图6示出了如在本说明书实例2中提到的图5的CELLTREAT^TM滚瓶，标识了该瓶的相关部分。

图7A和图7B示出了可以用于封闭本发明容器的无菌帽的两个实例。图7A示出了

无菌转移帽，并且图7B示出了Sartorius

封闭件。

在图中使用了以下参考字符：

相同的参考字符表示对应的部分。

具体实施方式

本披露涉及制造具有接触表面的滚瓶或其他实验室器具或衬底的方法，该接触表面是亲水性的，并且比未处理表面或生物涂层处理表面具有更高的细胞粘附性。

可选地，当本发明的衬底用于细胞生长时，这些细胞在生长过程完成后被收获或回收。可选地，回收率高于生物涂层处理的，在其他方面相同的衬底。可选地，回收率高于康宁(Corning)Cellbind衬底。

可选地，如果衬底被实施为容器，则容器进一步包括封闭件。封闭件可以是任何种类的。例如，封闭件可以是任何塞子、帽、盖子、顶部、软木塞或它们的任意组合。例如，可以将塑料或弹性体塞子插入帽中以形成封闭件。

细胞生长需要无菌环境。经常打开和关闭细胞培养/生长容器的帽是污染源之一。可选地，细胞培养/生长容器(例如滚瓶)可以用无菌转移帽封闭，以防止在培养基进料、接种、样品添加/收集、转移等过程中由于打开和关闭帽而造成的污染。可选地，该封闭件适用于无菌过程，可选地在高温、低温、高压灭菌、辐射或任何其他不寻常条件下。例如，该封闭件可以是带有其他附件的无菌转移帽，以消除在细胞培养/生长过程中打开帽的需要。可选地，该封闭件可以是

无菌转移帽。可选地，该封闭件可以是Sartorius

封闭件。

封闭件包括分配到帽中的硅酮弹性体。该帽通过将管道和气体交换筒插入位于帽上的预制孔中来组装。

可选地，该方法包括以下步骤：(a)提供具有接触表面的衬底，例如容器；(b)邻近接触表面抽真空；(c)在接触表面附近提供包含O2，可选地含有氮气的气体；以及(d)由气体产生等离子体，从而形成经处理的接触表面。形成的接触表面是高细胞结合表面。

可选地，如果衬底是滚瓶或其他容器，则在步骤(c)中，气体可选地通过插入容器中的气体入口被引入容器中(如图XX所示)。可选地，在此实施例中，将RF用于产生等离子体。

令人惊讶的是，发现RF功率与使用将气体混合物引入容器中的气体入口相结合，在增强细胞生长实验的结果方面提供了很大的优势。结果优于未涂覆的在其他方面相同的表面，并且还优于康宁Cellbind处理的表面。不受理论的限制，当使用RF功率来处理没有气体入口插入到容器中以输送气体混合物的容器时，在表面上可能产生较少的反应性官能团，因此可能获得较不希望的处理。使用插入容器中的气体入口来输送气体混合物有助于在表面上产生更多反应性官能团，从而改善表面活化和表面均匀性，以实现更好的细胞粘附/细胞生长结果。

相对于微波源，使用RF电源存在几个优点：因为RF在越低的功率下运行，存在越少的衬底/容器的加热。因为本发明的焦点是塑料衬底的等离子体表面处理，因此更低的加工温度是所希望的，以防止该衬底的熔化/变形。更高频率的微波还可能引起在该塑料衬底中的挥发性物质像残留水、低聚物以及其他材料的放气。这种放气可能干扰处理。

术语“接触表面”表示处于与样品或其他材料接触的位置，并具有决定其与该样品或与其接触的其他材料的相互作用的表面特性的表面。接触表面的一些实例是容器的内部表面(例如，界定容器内腔)或容器、片、块或其他物体的外部表面的一部分或全部。可选地，在接触表面用等离子体处理之前，接触表面由与内部部分相同的材料制成。

术语“内部部分”表示本体物品或涂层的一部分，该部分不为接触表面，而是形成该本体物品或涂层的内部的一部分。在对衬底的接触表面进行处理以改变其特性的实施例中，该衬底的内部部分包括未被处理改变的任何部分。

如在任一实施例中提及的“等离子体”具有其在四种基本物质状态之一的物理学中的常规含义，其特征在于其组成颗粒的广泛离子化(通常为气态形式)和白炽(即它产生辉光放电，意味着它发光)。

经处理的接触表面对于所有实施例被定义为已经如本说明书中所描述进行了等离子体处理并且作为这种处理的结果展示增强的细胞生长的接触表面。

贯穿本说明书使用的术语“容器”可以是适于容纳或输送液体、气体、固体或以上材料中的任何两种或更多种的任何类型的物品。容器的一个实例是具有至少一个开口(例如，取决于应用，一个、两个或更多个)和包括内部接触表面的壁的物品。

参照图1-3，本方法通常可以通过以下来实施：提供包括初始接触表面102的聚合物衬底101，使初始接触表面102与工艺气体104(在图1中示出为气体源，并且在图1和3中示出为容器中的气体)接触，并在工艺气体104中引入射频电功率，从而形成与未处理的接触表面102相比具有改善的细胞回收率的经处理的接触表面102。

可选地在任一实施例中，除了初始接触表面102之外，聚合物衬底101还包括邻近初始接触表面102的内部部分103。

可选地在任一实施例中，工艺气体104可以是氮气、氧气或含有氮原子、氧原子或氮原子和氧原子的组合以及其他种类原子的非均相气体。合适的工艺气体104的非限制性实例包括氧气、氮气、一氧化二氮气体，或这些气体中的任何两种或更多种的组合。可选地，工艺气体104可以包括载气，例如惰性气体，例如氦气、氖气、氩气、氪气或氙气或这些气体中的任何两种或更多种的混合物。

可选地在任一实施例中，射频电功率被引入邻近初始接触表面102的工艺气体中104，以邻近初始接触表面102产生等离子体。结果，形成了具有经处理的接触表面102的经处理的聚合物衬底101。

可选地在任一实施例中，经处理的接触表面102的x射线光电子能谱XPS原子组成是：

·从10％到25％的氧、从0％到5％的氮以及从70％到90％的碳；

·可选地，从15％到24％的氧、从0.1％到5％的氮以及从70％到80％的碳；

·可选地，从20％到24％的氧、从0.1％到1％的氮以及从70％到79％的碳。

可选地在任一实施例中，经处理的聚合物衬底101的内部部分103的XPS原子组成比经处理的接触表面102包含更少的氧和更多的碳。

可选地在任一实施例中，经处理的聚合物衬底101的内部部分103在0.6nm深度处的XPS原子组成包含从1％到10％的氧。

可选地在任一实施例中，经处理的聚合物衬底101的内部部分103在1.2nm深度处的XPS原子组成包含从0.5％到5％的氧。

可选地在任一实施例中，经处理的聚合物衬底101的内部部分103在1.7nm深度处的XPS原子组成包含从0.3％到3％的氧。

可选地在任一实施例中，经处理的聚合物衬底101的内部部分103在2.3nm深度处的XPS原子组成包含从0.1％到1％的氧。

可选地在任一实施例中，经处理的聚合物衬底101的内部部分103在2.9nm深度处的XPS原子组成包含从0.1％到1％的氧。

可选地在任一实施例中，相对于初始接触表面102，与经处理的接触表面102接触生长并收获的鸡胚细胞培养物的存活率是至少88％，可选地是从88％到99％、可选地是从88％到97％、可选地是从94％到96％。

可选地在任一实施例中，相对于初始接触表面102，与经处理的接触表面102接触生长并收获的鸡胚细胞培养物的回收率是至少132％，可选地是从132％到300％、可选地是从140％到250％、可选地是从140％到230％。

可选地在任一实施例中，水与经处理的接触表面102的表面接触角是从38°到62°，可选地是从50°到70°、可选地是从55°到65°、可选地是从60°到64°、可选地是从30°到50°、可选地是从30°至40°、可选地是从35°到45°、可选地是从37°到41°。

可选地在任一实施例中，经处理的聚合物衬底101包括容器105，该容器具有壁106，该壁具有封闭内腔108的内表面107、外表面109以及在内表面107与外表面109之间并与其隔开的内部部分103。除非本说明书中另有说明，否则内部部分103内的位置由它们距内表面107的距离来标识。

可选地，内表面107是大致圆柱形的，并且可选地，经处理的接触表面102包括容器105的内表面107的至少一部分。

可选地在任一实施例中，容器105包括如图1、图2和其他图所示的滚瓶。可选地，滚瓶包括限定经处理的接触表面102的内表面107、具有多个肋状物110的接触表面102。已经发现，接触表面102的部分或全部中(例如在滚瓶或其他容器105的细胞接触侧或端壁中)的肋状物或其他结构复杂性可用于增加接触表面102的表面积。可选地在任一实施例中，容器105的体积容量是从1mL到100L、可选地是从100mL到5L、可选地是约1L、可选地是约2L。可选地在任一实施例中，经处理的聚合物衬底101可以包括板、盘、烧瓶、如图1和图3中的瓶、如图2中的管，或任何其他类型的实验室器具或生产设备。

可选地在任一实施例中，经处理的聚合物衬底101包括可注塑模制的热塑性或热固性材料，例如热塑性材料，例如热塑性树脂，例如注塑模制的热塑性树脂。可选地在任一实施例中，所述热塑性材料包括烃聚合物，例如烯烃聚合物、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚甲基戊烯、聚苯乙烯、氢化聚苯乙烯、聚环己基乙烯(PCHE)或以上材料中的两种或更多种的组合，或杂原子取代的烃聚合物，例如聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚萘二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚偏二氯乙烯(PVdC)、聚氯乙烯(PVC)、聚碳酸酯、聚乳酸、环氧树脂、尼龙、聚氨酯聚丙烯腈、聚丙烯腈(PAN)、离聚物树脂，或以上材料中的任何两种或更多种的任何组合、复合物、共混物或层合物。可选地在任一实施例中，热塑性树脂包括聚苯乙烯，其通常用于许多实验室器具应用，包括滚瓶、微孔板、培养皿等。

可选地在任一实施例中，工艺气体104包含氧原子、氮原子或氧原子和氮原子两者，并且优选地包含氧、氮、一氧化二氮，或这些原子中的任何两种或更多种的组合。可选地在任一实施例中，工艺气体104基本上不含水。

可选地在任一实施例中，本方法通过使接触表面102与工艺气体104接触来实施。这可以通过例如将工艺气体104输送通过气体入口导管111来进行，该气体入口导管具有邻近初始接触表面102的出口112。

可选地在任一实施例中，用于产生等离子体的RF电功率的频率是从1MHz到50MHz，可选地是13.56MHz。可选地在任一实施例中，用于激发所述等离子体的射频电功率是从1瓦特到1000瓦特，可选地是从100瓦特到900瓦特、可选地是从50瓦特到600瓦特、可选地是从200瓦特到700瓦特、可选地是从400瓦特到600瓦特、可选地是从100瓦特到500瓦特、可选地是从500瓦特到700瓦特、可选地是从1瓦特到100瓦特、可选地是从1瓦特到30瓦特、可选地是从1瓦特到10瓦特、可选地是从1瓦特到5瓦特。

可选地在任一实施例中，所述射频电功率至少部分地由总体上包围初始接触表面102的外部施加器113引入。可选地在任一实施例中，射频电功率至少部分地由至少部分地位于内腔108内的内部施加器114引入。可选地在任一实施例中，至少部分地位于内腔108内的内部施加器114进一步包括气体入口导管111，用于使初始接触表面102与工艺气体104接触。

可选地在任一实施例中，如图1所示的装置可以用于处理容器105的初始接触表面102。图1和图3示出了容器105的实例，该容器被配置为滚瓶。典型的1升或2升容量的滚瓶的更好视图在图4-6中示出。

本说明书中提及的滚瓶或其他容器的容量并不一定表示完全装满所需的流体量。此类容器的指定容量通常允许当容器被填充到其容量时有顶部空间。例如，在滚瓶中，当细胞在容器中生长时，瓶被侧放并通过机械装置滚动，使得粘附到接触表面102的细胞交替通过顶部空间和瓶的液体内容物(如生长培养基)，从而促进生长。

滚瓶或其他容器105具有壁106，该壁具有封闭内腔108的内表面107和外表面109。容器壁106具有在内表面107与外表面109之间并与其隔开的内部部分103。内表面107的至少一部分和可选地全部限定了接触表面102，该接触表面或者被称为当前处理之前的初始接触表面，或者被称为当前处理之后的经处理的接触表面。接触表面102是根据本披露处理的内表面107的任何部分。

图1、图2或图3所示的装置适用于处理根据任一实施例的容器105，尽管还可以使用其他装置。此装置可以包括图1和图2所示的圆柱形陶瓷腔室115，具有铝底116和铝盖子117(其在使用过程中是关闭的，但在图x中显示为打开的，因为它可以在装载或卸载时打开)。腔室115的直径可以是大约12英寸(30cm)，并且深度可以是大约8英寸(20cm)，尽管还可以使用任何其他合适的尺寸替代。

由真空导管119进料至真空泵120的可选地通过阀121控制的腔室115的泵送口118可以在铝底116处，并且直径可以是大约4英寸(10cm)，其中1/2英寸(12mm)直径的气体入口导管111通过泵送口118同心地突出到处理区域122中。等离子体屏幕(未示出)可以被安装在泵送口118的上方中并且可以由铜网和钢绒构成。工艺气体104可以经由腔室115下方的气体系统123进料到气体入口导管111。质量流量控制器如124可以用于压缩工艺气体104。

陶瓷腔室115可以具有铜外部施加器113，该外部施加器可以同心地缠绕在腔室115的外部，并且可以是大约7英寸(18cm)高。外部施加器113可以连接到

匹配网络125，这可以允许

1000瓦特RF(13.56MHz)电源126的50欧姆输出被匹配以获得最佳功率耦合(低反射功率)。

设备由美国马萨诸塞州格洛斯特市的康戴尔公司(Comdel,Inc.,Gloucester,Massachusetts,USA)出售。电源126可以经由同轴电缆127附接到

匹配网络125。两个电容压力计(0-1托和0-100托)(未示出)可以附接到真空导管119(也称为泵管线)以测量工艺压力。

图2中所示的用于处理容器105的装置可以与图1中的装置相同，但如图所示，具有多于一个的气体入口导管111，以在单个处理循环中容纳多于一个的容器105。

图1或图2所示的装置可选地包括如图3所示的真空旁路管线128。

可选地在任一实施例中，被配置为烧瓶、瓶或管的实验室器具可以在类似于图1-3的装置中被处理。

可选地在任一实施例中，被配置为板、微孔板、盘或具有相对平坦的待处理外部表面的其他物体的实验室器具可以在类似于图1-3但适于处理更平坦工件的装置中被处理。可选地在任一实施例中，如这里所示的陶瓷腔室115的内部可以如WO 2016/176561的图6所示进行调整，以在如本说明书所述的处理过程中支撑多个微孔板或其他相对平坦的物体。可选地在任一实施例中，微孔板或其他平坦物体可以被定向成使得待处理的表面面向陶瓷腔室115的中心，从而便于将等离子体激励气体直接施加到呈现用于处理的表面。

相对于初始接触表面102，该方法可选地提高了鸡胚细胞培养物从经处理的接触表面102的细胞回收率，导致从经处理的接触表面102的细胞回收率是在细胞回收测试开始时提供给经处理的接触表面102的细胞的至少140％。

细胞还可以在微载体表面上生长，这是也增加接触表面积的另一种类型的衬底。微载体是允许粘附细胞生长的支撑基质。微载体通常是125-250微米的球(珠)，并且它们的密度允许它们在温和搅拌下保持悬浮在培养基中。微载体或珠可以由许多不同的材料制成，包括DEAE葡聚糖、玻璃、聚苯乙烯塑料、丙烯酰胺、胶原和藻酸盐。这些微载体或珠材料，以及不同的表面化学物质，可能影响细胞行为，包括形态和增殖。使用微载体(或珠)技术有许多优点，例如需要更少的培养基和更少的实验室器具。

虽然增强细胞粘附和细胞生长很重要，但在生长过程完成后收获细胞并保持细胞质量也同样重要。可选地，当使用微载体时，细胞收获可被认为是包括两个步骤：首先，将细胞从微载体分离，以产生细胞-微载体悬浮液；并且其次，进一步的分离步骤使细胞在不存在微载体的情况下悬浮。

典型地，第一步骤，即细胞从微载体分离是通过酶消化来完成的。基于微载体的类型、细胞的类型等，可以使用不同的酶。酶可以是，例如，胰蛋白酶、促胰酶、胶原酶或胰蛋白酶-促胰酶混合物。在第二步骤中，将过滤器或离心机用于从微载体分离细胞。

本发明还可选地涉及微载体(例如珠)表面的等离子体涂覆或处理，以提供高亲水性表面来增强细胞粘附和细胞生长。涂层或处理对细胞粘附、细胞生长和细胞回收过程中的细胞完整性没有负面影响。

细胞培养、细胞收获和回收方案

预期将以下材料、设备和方法用于本披露。材料：

1,000mL滚瓶(产品229582)、

T-182烧瓶(产品229351)、培养基DMEM(Gibco；参考号1995-065)、小牛血清(Gibco；参考号16170-078)、1x PBS(Gibco；参考号14190-136)、具有用1x PBS稀释的0.18mM EDTA的1x胰蛋白酶(Gibco；参考号25200-056)、计数载玻片(Bio-Rad；目录号145-0011)、细胞计数器(Bio-Rad；TC10型)、台盼蓝溶液0.4％(Armesco，代码：K940-100ML)、青霉素链霉素溶液，100X(康宁；参考号30-002CI)、竞争者(competitor)2,000mL滚瓶。

当在周五收到时，对所选择细胞进行计数，并将其分成T-182烧瓶(3/33)x15。在周一时，将细胞的15x T-182烧瓶合并。将10mL细胞加入到1L滚瓶中，并将20mL细胞加入到2L滚瓶中。在空气中含有5％CO2的39℃下的加湿腔室中，使滚瓶以0.25rpm旋转。在48小时后，收获细胞。

对于1L滚瓶，细胞的收获以下列方式进行。倾析培养基。用25mL的1x PBS冲洗细胞。然后加入具有0.18mM EDTA的10mL1x胰蛋白酶并孵育10分钟。最后加入40mL完全培养基。收集1mL样品并进行细胞计数。

对于2L滚瓶，如下进行细胞收获。倾析培养基。用50mL的1x PBS冲洗细胞。然后加入具有0.18mM EDTA的20mL的1x胰蛋白酶并孵育10分钟。加入80mL完全培养基。收集1mL样品并进行细胞计数。

将每个样品稀释10倍以帮助分离细胞。将细胞样品再次稀释10倍，但另外用0.4％锥虫蓝以1:1的比率稀释。将10μL细胞/锥虫蓝样品装入计数载玻片中，将其装入Bio-Rad细胞计数器并记录。

所进行的分析比较活细胞回收率，其计算如下：

活细胞回收率％＝收获的总活细胞/初始总活细胞

实例1

实施此实验以检查由于当前表面处理应用于由聚苯乙烯制成的1L CellTreat滚瓶而导致的细胞回收率(即细胞生长)改善和接触角。此实验还关于细胞生长将本发明的处理与竞争性处理，如康宁组织培养处理(TCT)滚瓶和康宁Cellbind滚瓶进行了比较。用于测试的细胞系是鸡胚细胞。本说明书中描述了处理过程。根据本发明处理了滚瓶1-4，并且所使用的参数在表1a中示出。然后用如表1b所示的细胞装载经处理的瓶。表2-4中的结果显示，滚瓶2的处理，在本说明书中有时称为处理2，始终提供最佳的细胞生长结果(以细胞回收率数据表示)。除非另有说明，否则以下实例中所示的表面分析是在用处理2的方法处理的滚瓶上进行的。

还测定了水接触角，如表5所报告。

表1a：处理参数

滚瓶	氮	氧气	功率(W)	时间(s)
					1	10	20	475	60
2	10	10	600	60
					3	0	20	400	60
4	0	10	500	90

表1b：开始细胞装载

表2：细胞回收率结果(第1轮)

表3：细胞回收率结果(第2轮)

表4：细胞回收率结果(第3轮)

表5：水接触角

滚瓶	表面接触角
		1	61°
2	52°
		3	39°
4	38°
		康宁TC(2升)	62°
康宁CellBIND(2升)	39°

实例2.本发明的经处理的滚瓶和未处理的滚瓶的XPS表面分析

实施此实例以测定未处理的由聚苯乙烯制成的1L CELLTREAT^TM滚瓶的接触表面和经处理的在其他方面相同滚瓶B的接触表面的化学组成和化学键合。用于图6的滚瓶的表面处理过程与实例1中的处理2相同。在瓶A的接触表面的一个区域(中间区域)和瓶B的接触表面的四个区域上进行XPS。这四个区域在图6中示出。元素的浓度由高分辨率光谱确定。这些XPS结果总结在表6中。

表6：原子浓度(单位为原子％)

样品	C	N	O	Si
					瓶A(中间)	90.1	0.1	7.4	2.4
瓶B(顶部)	71.1	0.6	22.8	5.4
					瓶B(中间)	72.4	0.7	21.9	5.0
瓶B(底部)	73.6	0.6	21.2	4.6
					瓶B(基座)	71.2	0.6	22.7	5.5

结果表明，本发明的处理在经处理的表面上比在相同的未处理表面上产生三倍更多的氧。

化学键合信息在表7中示出。

表7：碳和硅的化学状态(单位为原子％)

所检测元素的化学状态由高分辨率光谱确定。对于元素C和Si，将光谱曲线拟合以估计在不同氧化态下的每种元素的相对量。曲线拟合结果在各个光谱上示出，并总结在表7中。

实例3.本发明的经处理的滚瓶和未处理的滚瓶的XPS深度分析

此实例用于确定本发明的经处理的滚瓶B的接触表面的深度化学组成。

测量光谱是针对经处理的滚瓶B的接触表面获取的。使用1kV Ar+获取深度剖面。结果在表8中示出。选择此束电压以最小化氧原子的优先溅射。虽然这使优先溅射最小化，但并不能完全消除这种伪影。因此，预期深度剖面中的氧浓度将高于测量值。请注意，本研究中的深度尺度假设样品溅射的速率与

旋铸聚苯乙烯薄膜相同。

表8.原子浓度

^a归一化至100％所检测的元素。XPS无法检测到H或He。

^b虚线“-”表示元素未被检测到。

尽管已经详细地并且参照其具体实例和实施例描述了本技术，但是对本领域技术人员来说，将明显的是在不背离其精神和范围的情况下可以对其进行各种改变和修改。在权利要求中提供了额外的披露内容，这些权利要求被认为是本说明书的一部分，每个权利要求限定可选和可选实施例。

Claims

1.一种方法，包括：

·提供聚合物衬底，该聚合物衬底包括初始接触表面以及邻近所述初始接触表面的内部部分，

·使所述初始接触表面与工艺气体接触；以及

·在邻近所述初始接触表面的所述工艺气体中引入射频电功率，以使在所述初始接触表面附近产生等离子体，由此在相对于所述初始接触表面有效地提高鸡胚细胞培养物从经处理的接触表面的细胞回收率的条件下，形成具有经处理的接触表面的经处理的聚合物衬底，从而导致从所述经处理的接触表面的细胞回收率是在细胞回收测试开始时提供给所述经处理的接触表面的细胞的至少140％。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述经处理的接触表面的x射线光电子能谱(XPS)原子组成是：

·从10％到25％的氧、从0％到5％的氮以及从70％到90％的碳；

3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述经处理的聚合物衬底的所述内部部分的XPS原子组成比所述经处理的接触表面包含更少的氧和更多的碳。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述经处理的聚合物衬底的所述内部部分在0.6nm深度处的XPS原子组成包含从1％到10％的氧。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述经处理的聚合物衬底的所述内部部分在1.2nm深度处的XPS原子组成包含从0.5％到5％的氧。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述经处理的聚合物衬底的所述内部部分在1.7nm深度处的XPS原子组成包含从0.3％到3％的氧。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述经处理的聚合物衬底的所述内部部分在2.3nm深度处的XPS原子组成包含从0.1％到1％的氧。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述经处理的聚合物衬底的所述内部部分在2.9nm深度处的XPS原子组成包含从0.1％到1％的氧。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中相对于所述初始接触表面，与所述经处理的接触表面接触生长并收获的鸡胚细胞培养物的存活率是至少88％，可选地是从88％到99％、可选地是从88％到97％、可选地是从94％到96％。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中相对于所述初始接触表面，与所述经处理的接触表面接触生长并收获的鸡胚细胞培养物的回收率是至少132％，可选地是从132％到300％、可选地是从140％到250％、可选地是从140％到230％。

11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述经处理的接触表面的表面接触角是从38°到62°，可选地是从50°到70°、可选地是从55°到65°、可选地是从60°到64°、可选地是从30°到50°、可选地是从30至40°、可选地是从35°到45°、可选地是从37°到41°。

12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述经处理的聚合物衬底包括容器，所述容器具有壁，所述壁具有封闭内腔的内表面、外表面、以及在所述内表面与所述外表面之间并与其隔开的内部部分。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述内表面是大致圆柱形的。

14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述经处理的接触表面包括所述容器的所述内表面的至少一部分。

15.如前述权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述容器包括滚瓶。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述滚瓶包括限定所述经处理的接触表面的内表面，所述内表面具有多个肋状物。

17.如前述权利要求12至16中任一项所述的方法，其中所述容器的体积容量是从1mL到100L、可选地是从100mL到5L、可选地是约1L、可选地是约2L。

18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述经处理的聚合物衬底包括板、盘、烧瓶、瓶或管。

19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述经处理的聚合物衬底包括热塑性材料，例如热塑性树脂，例如注塑模制的热塑性树脂。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述热塑性材料包括烃聚合物，例如烯烃聚合物、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚甲基戊烯、聚苯乙烯、氢化聚苯乙烯、聚环己基乙烯(PCHE)或以上材料中的两种或更多种的组合，或杂原子取代的烃聚合物，例如聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚萘二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚偏二氯乙烯(PVdC)、聚氯乙烯(PVC)、聚碳酸酯、聚乳酸、环氧树脂、尼龙、聚氨酯聚丙烯腈、聚丙烯腈(PAN)、离聚物树脂，或以上材料中的任何两种或更多种的任何组合、复合物、共混物或层合物。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述热塑性树脂包括聚苯乙烯。

22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述工艺气体包含氧原子、氮原子或氧原子和氮原子两者，并且优选地包含氧、氮、一氧化二氮、或这些原子中的任何两种或更多种的组合。

23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述工艺气体基本上不含水。

24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过将工艺气体输送穿过气体入口导管而使所述表面与所述工艺气体接触，所述气体入口导管具有邻近所述初始接触表面的出口。

25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述射频是从1MHz到50MHz，可选地是13.56MHz。

26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于激发所述等离子体的射频电功率是从1瓦特到1000瓦特，可选地是从100瓦特到900瓦特、可选地是从50瓦特到600瓦特、可选地是从200瓦特到700瓦特、可选地是从400瓦特到600瓦特、可选地是从100瓦特到500瓦特、可选地是从500瓦特到700瓦特、可选地是从1瓦特到100瓦特、可选地是从1瓦特到30瓦特、可选地是从1瓦特到10瓦特、可选地是从1瓦特到5瓦特。

27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述射频电功率至少部分地由总体上包围所述初始接触表面的外部施加器引入。

28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述经处理的聚合物衬底是包括限定内腔的内表面的容器，并且所述射频电功率至少部分地由至少部分地位于所述内腔内的内部施加器引入。

29.如权利要求28所述的方法，其中至少部分地位于所述内腔内的所述内部施加器进一步包括气体入口导管，用于使所述初始接触表面与所述工艺气体接触。