CN102732475A - 一种用于细胞培养的微载体、其制备方法及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于细胞培养的载体，具体讲，涉及一种用魔芋葡甘聚糖为基质制备的微载体、其制备方法及检测方法。本发明涉及一种用于细胞培养的微载体，所述的微载体是用魔芋葡甘聚糖为基质制备的微球，所述的微载体的电荷密度为0～3.5mmol/g-干球，湿真密度为1.01～1.10g/ml，粒径为50～800微米。其制备方法为将魔芋葡甘聚糖微球用化学交联的方法连接上带电荷的修饰剂或覆层物。化学交联法中所用的交联剂选自带有双官能团或多官能团取代的化合物，修饰剂或覆层物选自胺及胺盐、糖类、蛋白质、蛋白多糖、多肽、细胞外基质组分、合成高分子化合物。

Description

一种用于细胞培养的微载体、其制备方法及检测方法

技术领域

本发明涉及一种用于细胞培养的载体，具体讲，涉及一种用魔芋葡甘聚糖为基质制备的微载体、其制备方法及检测方法。

背景技术

动物细胞是疫苗等蛋白质药物的主要生产方式。疫苗的生产过程中，动物细胞培养和表达决定了疫苗的产量和整个生产过程的效率。在动物细胞的大规模培养技术中，微载体培养法由于具有比表面积大，单位体积培养液的细胞产率高；采用均匀悬浮培养，无营养物或产物梯度；可用简单显微镜观察微载体表面的生长情况；细胞收获过程相对简单，劳动强度小；培养基利用率高，占地面积小；放大容易等优点，是目前公认的最有发展前途的一种培养模式。由于对微载体技术的重视，国外已开发了数量颇多的微载体，部分已经商品化，主要的基质材料有交联葡聚糖、纤维素、蛋白质、高分子合成材料、无机玻璃材料以及液膜微载体等。交联葡聚糖是目前使用最广的一类微载体，大家熟悉的Cytodex系列(GE公司)就是这类微载体，其中，Cytodex 1(即DEAE-交联葡聚糖)是当前用途最广的一种微载体。Cytodex3是将一层变性胶原(来自猪皮I型胶原)用化学偶联的方式连接到交联葡聚糖基质上。

魔芋葡甘聚糖是由葡萄糖与甘露糖以β-1，4-糖甘键连接而成的杂多糖，具有作为生化材料的良好性能，如亲水性、表面富含羟基易于修饰等。王佳兴等采用魔芋葡甘聚糖合成了凝胶型和大孔型的层析介质，授权号为ZL200610088917.7，该专利公开了一种大孔型魔芋葡甘糖微球及其制备方法。该专利中制备的魔芋葡甘聚糖微球的目的为用于蛋白的分离和纯化。本发明对魔芋葡甘聚糖微球做了进一步的研究，发现通过采用化学交联的方法，魔芋葡甘聚糖微球可作为细胞培养的微载体，并取得了很好的效果。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种用于细胞培养的微载体。

本发明的第二发明目的在于提供这种细胞培养的微载体的制备方法。

本发明的第三发明目的在于提供这种细胞培养的微载体的质量检测方法。

本发明的第四发明目的在于提供以魔芋葡甘聚糖为基质制备的微球在用于细胞培养的微载体的应用。

为了解决本发明的第一发明目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一种用于细胞培养的微载体，所述的微载体是用魔芋葡甘聚糖微球为基质制备而成。

该技术方案的第一优选技术方案为：所述的微载体的电荷密度为0～3.5mmol/g-干球，优选0.5～3.0mmol/g-干球，更优选1～2.5mmol/g-干球；湿真密度为1.01～110g/ml，优选1.01～1.05g/ml；粒径为50～800微米，优选100～300微米。

该技术方案的第二优选技术方案为：所述的微载体为凝胶型或大孔型，所述的大孔型微载体的孔径为0.05～50微米，优选0.1～30微米，更优选0.5～20微米。

为了实现本发明的第二发明目的，本发明提供了该用于细胞培养的微载体的制备方法：将魔芋葡甘聚糖微球用化学交联的方法连接上带电荷的修饰剂或覆层物。

该技术方案的第一优选技术方案为：所述的魔芋葡甘聚糖微球与修饰剂或覆层物连接的方式包括以下几种方式：

(1)魔芋葡甘聚糖微球先与交联剂反应结合，再通过交联剂与修饰剂或覆层物反应，从而使魔芋葡甘聚糖微球与修饰剂或覆层物连接；

(2)魔芋葡甘聚糖微球先与一端未经活化的交联剂反应结合后，然后活化交联剂上未经活化的官能团，活化后的官能团与修饰剂或覆层物反应，从而使魔芋葡甘聚糖微球与修饰剂或覆层物连接；

(3)先将交联剂与修饰剂或覆层物连接，再通过交联剂上的官能团与魔芋葡甘聚糖微球反应连接。

该技术方案的第二优选技术方案为：所述的化学交联的方法中所用的交联剂选自带有双官能团或多官能团取代的化合物；所述交联剂上的双官能团或多官能团分别与微球、修饰剂或覆层物连接，或所述交联剂上的双官能团或多官能团经过活化后分别与微球、修饰剂或覆层物连接。

该技术方案的第三优选技术方案为：所述官能团选自卤素、胺基、环氧基、取代的缩水甘油醚基、胍基、烯烃基。

该技术方案的第四优选技术方案为：所述双官能团或多官能团取代的化合物选自卤素和环氧基取代的烷烃、烯基取代的缩水甘油醚基、氨基取代的烯烃；进一步优选环氧氯丙烷、环氧氯丙烷-多元醇衍生物、二环氧丁烷、1，4-丁二醇醚。

该技术方案的第五优选技术方案为：修饰剂或覆层物选自胺及胺盐、糖类、蛋白质、蛋白多糖、多肽、细胞外基质组分、合成高分子化合物；

其中，所述胺及胺盐选自NH₂R₁、NHR₁R₂、NR₁R₂R₃、R₄-CO-NH-R₅及其常用盐，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅分别选自取代或未取代的C_1～15直链或支链的烷烃、取代或未取代的C_1～15直链或支链烯烃，进一步优选取代或未取代的C_2～12直链或支链的烷烃、取代或未取代的C_2～12直链或支链烯烃；取代基选自氨基、羟基、卤素；

所述的蛋白选自纤维连接蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、软骨粘连蛋白、明胶；

所述的多肽选自RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)、YIGSR(酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸)、IKVAV(异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脱氢视黄醇)、多聚赖氨酸、多鸟氨酸；

所述的多糖选自乳糖、N-乙酰葡糖胺、壳聚糖、季胺化壳聚糖、海藻酸盐；

所述的合成高分子化合物选自聚氨酯、聚丙烯酸酯、聚醚酰亚胺(PEI)。

该技术方案的第六优选技术方案为：所述的胺及胺盐选自2-二乙氨基氯乙烷盐酸盐、己二胺、二乙胺、三甲基乙醇胺、N-[3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺、聚乙烯亚胺，正丙胺、n-庚胺、N-十二胺、乙醇胺。

为实现本发明的第三发明目的，采用的技术方案为：本发明还提供了一种所述的微载体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)含水量的测定方法

采用TDL-40B型离心机以1000rpm离心5min，从干燥器中取两只已干燥至恒重的称量瓶，分别放入准确称量的待测样品3-5g，准确至1mg(0.001g)；将介质摊平，称量瓶敞盖在100±5℃温度下烘干3h；称量瓶盖严后，取出置于干燥器中冷却至室温，在分析天平上称量；按式I计算含水量X；

$X=\frac{m_2-m_3}{m_2-m_1}\×100\%---\left(I\right)$

式中：X-介质样品的含水量，％；

      m₁-空称量瓶的质量，g；

m₂-烘干前称量瓶和介质样品的质量，g；

m₃-烘干后称量瓶和介质样品的质量，g。

(2)湿真密度的测定方法

根据GB/T 8330-2008离子交换树脂湿真密度测定方法执行；

(3)电荷密度的测定方法

在量筒中准确量取二份各10ml已处理的微载体样品，将样品全部转入交换柱中，并测量此时的树脂床高度，通过50mL 0.5mol/L氢氧化钠溶液，流速为0.8～1.0ml/min，通毕后用蒸馏水进行洗淋，至流出液对酚酞不显色为止，测量此时的树脂床高度，用酸式滴定管准确量取25ml 0.1mol/L标准盐酸溶液加入到分液漏斗中，以0.4～0.5mL/min流速通过树脂床；通毕，用1mol/L氯化钠溶液充分淋洗漏斗及树脂床，所通过的酸液及淋洗液收集到锥形瓶中，加入2～3滴酚酞指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至微红色并保持15s不褪色为终点，记录所耗碱液体积，介质样品的离子交换容量(E)按照式II进行计算；

C₁——盐酸标准溶液浓度，单位为mmol/mL，

V₁——盐酸标准溶液体积，单位为mol/L，

C₂——氢氧化钠标准溶液的浓度，单位为mol/L，

V₂——滴定时所耗氢氧化钠标准溶液体积，单位为mL，

m₁——树脂样品的质量，单位为mg，

X——树脂样品的含水量，单位为％；

(4)粒径测定方法：由Mastersizer 2000E激光粒度仪测定；

(5)孔径测定方法：样品孔径由JSM-6700F SEM冷场发射扫描电子显微镜观测；

(6)微球外观观察方法：微球外观由光学显微镜观察。

本发明还公开了一种以魔芋葡甘聚糖为基质制备的微球在用于细胞培养的微载体的应用。

下面对本发明的内容做进一步的解释和说明。

微载体的性能和结构对细胞培养具有重要影响，尤其是微载体的基质材料、亲水性、表面化学结构、电荷性质和表面形状、基质结构等对细胞的贴附、生长和增殖都具有重要影响。细胞一般带有负电荷，因此易于贴附在带有正电荷的微载体上，在有些用蛋白质或糖等进行覆层后的中性表面上也能够进行吸附。电荷密度是影响细胞贴附的重要因素，对于带有正电荷的微载体，如果电荷密度过低，细胞贴附力不强，在培养过程中容易从微球上脱落下来。如果电荷密度过高，会产生“毒性”作用，抑制细胞生长。本发明提供的魔芋葡甘聚糖细胞培养微载体的适宜的电荷密度为0～3.5mmol/g-干球。其中，电荷密度为0，指用蛋白质或糖等进行覆层后的中性表面。微载体的含水量大于90％。

微载体的离子交换容量(E)的定义为：

C₁-盐酸标准溶液浓度(mmol/ml)；V₁-盐酸标准溶液体积(mol/L)；

C₂-氢氧化钠标准溶液的浓度(mol/L)；V₂-滴定时所耗氢氧化钠标准溶液体积(ml)；

m₁-微载体样品的质量(mg)；X-微载体样品的含水量(％)。

微载体的湿真密度是贴壁细胞悬浮培养的另一个关键因素。密度适宜才能够使贴附细胞的微载体悬浮在培养液中，从而使细胞得到充足的营养。密度过高或过低，会下沉或上浮，虽然提高搅拌能够增强悬浮能力，但也会提高剪切力，可能对细胞造成伤害。湿真密度由魔芋葡甘聚糖微载体的葡甘聚糖含量、配基密度和水分含量微载体决定，魔芋葡甘聚糖微载体的湿真密度控制在1.01～1.10g/ml范围内。

本发明提供的微载体的粒径为50～500微米。魔芋葡甘聚糖微载体可以为凝胶型，也可以为大孔型。大孔型魔芋葡甘聚糖微载体的渗透性好，方便营养物质和细胞代谢物质的扩散，提供良好的生长环境。大孔型魔芋葡甘聚糖微载体的孔径在0.05～50微米范围内。

本发明还提供了一种魔芋葡甘聚糖微载体的制备方法。由于魔芋葡甘聚糖微球含有大量的羟基，可以通过多种化学修饰方法将修饰剂或覆层物交联在微球上。

魔芋葡甘聚糖微球与修饰剂或覆层物连接的方式包括以下几种方式：

(1)魔芋葡甘聚糖微球先与交联剂反应结合，再通过交联剂与修饰剂或覆层物反应，从而使魔芋葡甘聚糖微球与修饰剂或覆层物连接；

(2)魔芋葡甘聚糖微球先与交联剂反应结合后，活化交联剂上的官能团，交联剂活化后的官能团与修饰剂或覆层物反应，从而使魔芋葡甘聚糖微球与修饰剂或覆层物连接；

(3)先将交联剂与修饰剂或覆层物连接，再通过交联剂上的官能团与魔芋葡甘聚糖微球反应连接；或选用具有交联作用的修饰剂或覆层物直接反应得到。

交联剂可选用具有双官能团的试剂，其一端的官能团与魔芋葡甘聚糖微载体表面的羟基发生反应，另一端的官能团与修饰剂或覆层物反应。由于某些具有双官能团的化合物性质过于活泼，反应不易控制，所以采用的交联剂一端具有可与魔芋葡甘聚糖微载体表面的羟基发生反应的官能团，另一端具有一个可通过活化反应后生成的可与修饰剂或覆层物的官能团，例如双键通过加成反应形成卤代基。所述官能团选自卤素、胺基、环氧基、取代的缩水甘油醚基、胍基、烯烃基。所述卤素选自氟、氯、溴、碘。

该技术方案的第四优选技术方案为：所述双官能团或多官能团取代的化合物选自卤素和环氧基取代的烷烃、烯基取代的缩水甘油醚基、氨基取代的烯烃；进一步优选环氧氯丙烷、环氧氯丙烷-多元醇衍生物、二环氧丁烷、1，4-丁二醇醚。

该技术方案的第五优选技术方案为：修饰剂或覆层物选自胺及胺盐、糖类、蛋白质、蛋白多糖、多肽、细胞外基质组分、合成高分子化合物；本发明的修饰剂或覆层物优选但不限于以下试剂：

所述胺及胺盐选自NH₂R₁、NHR₁R₂、NR₁R₂R₃、R₄-CO-NH-R₅及其常用盐，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅分别选自取代或未取代的C_1～15直链或支链的烷烃、取代或未取代的C_1～15直链或支链烯烃，进一步优选取代或未取代的C_2～12直链或支链的烷烃、取代或未取代的C_2～12直链或支链烯烃；所述的胺及胺盐更优选选自2-二乙氨基氯乙烷盐酸盐、己二胺、二乙胺、三甲基乙醇胺、N-[3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺、聚乙烯亚胺，正丙胺、n-庚胺、N-十二胺、乙醇胺；取代基选自氨基、羟基、卤素；

所述的蛋白选自纤维连接蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、软骨粘连蛋白、明胶；

所述的多肽选自RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)、YIGSR(酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸)、IKVAV(异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脱氢视黄醇)、多聚赖氨酸、多鸟氨酸；

所述的多糖选自乳糖、N-乙酰葡糖胺、壳聚糖、季胺化壳聚糖、海藻酸盐；

所述的合成高分子化合物选自聚氨酯、聚丙烯酸酯、聚醚酰亚胺(PEI)。

其中，微球与交联剂的反应条件和时间依据交联剂的形式而定，是本领域技术人员可根据共知常识和经验得到的。

本专利通过对上述专利所述的魔芋葡甘聚糖微球进行化学修饰后，得到新型的魔芋葡甘聚糖细胞培养微载体，适用于Vero细胞、CHO细胞等贴壁细胞的培养及生长。

其中，本发明中用到的原料魔芋葡甘聚糖微球根据中国发明专利ZL200610088917.7制备。该制备方法包括以下步骤：

(1)将魔芋葡甘聚糖降解成小分子链的葡甘聚糖，过滤杂质，得到魔芋葡甘聚糖水溶液；

(2)将所得的魔芋葡甘聚糖水溶液在50～95℃温度下加入到含有油相乳化剂的油性物质中，同时滴加交联剂，在搅拌成球的同时发生交联反应；

(3)一步交联成球形成的凝胶微球，经洗涤、收集，即可得到魔芋葡甘聚糖凝胶微球。

其中，魔芋葡甘聚糖水溶液的质量百分比浓度为5～20％，同时还可以在魔芋葡甘聚糖的水溶液中添加致孔剂来制备大孔性魔芋葡甘聚糖，致孔剂的用量为魔芋葡甘聚糖水溶液重量百分比的2～20％。

由于细胞培养过程中对所需的微载体的性能具有很高的要求，所以并非所有种类的多糖能用于制备用于细胞培养的微载体。用于细胞培养的微载体首先要能够形成具有一定大小的微球，其次，该微载体还要具有适应的电荷密度和湿真密度，这样细胞才能吸附于其上，并进行生长和增值。微载体的基质材料、亲水性、表面化学结构、电荷性质和表面形状、基质结构都会对细胞培养产生影响，所以并非所有种类的多糖都能够满足适合制备细胞培养微载体的要求。因此，筛选出一种具体的能够符合细胞培养要求的多糖是非常困难的。目前市场上普遍使用的GE公司Cytodex系列微载体，是利用葡聚糖作为基质制备而成，但是由于多糖分子的复杂性，也并非所有的种类的葡聚糖都能应用于微载体制备。正是由于细胞培养对微载体要求的复杂性，大家普遍认为只有该特定种类的葡聚糖才能应用于微载体的制备。而发明人克服了该偏见，通过对魔芋葡甘聚糖的深入的研究，制备出了一种以魔芋葡甘聚糖为基质的用于细胞培养的微载体。

魔芋是一种特殊的植物，其成熟为球茎，可作为食品使用。将其干燥、制粉后可分为粗粉及精粉。根据原料球茎的产地、品种、加工方法等方面的差异，精粉可分为许多种类[(日)冲增哲等编著，古明选译，四川大学出版社，1990，成都魔芋科学p88]。精粉称为魔芋或魔芋粉，是白色或灰白色的粉末。魔芋粉的成分含有多种物质，水、灰分、淀粉、氨基酸和低级缩氨酸及糖类物质，是一种天然的、多种物质的混合体，不同的魔芋粉中上述物质的组成不同，其流动力学方面的性能也不相同。而本发明中所采用的魔芋葡甘聚糖是指去除魔芋粉中的多种物质后，提取纯化后的单种多糖，称为魔芋葡甘聚糖。魔芋葡甘聚糖是从魔芋中提取出的单一糖类经过降解，其降解成浆液，而后分散到油相、交联成球制备的。本发明魔芋葡甘聚糖微球根据中国发明专利ZL200610088917.7制备而成。不同的制备方法得到的魔芋葡甘聚糖微球是不同的。附图5中为魔芋直接交联成球的照片，由该图可以看知，魔芋微球表面凸凹不平，为孔洞结构，布满皱褶，与本发明所述的外观光圆的魔芋葡甘聚糖微球完全不同。此外，作为优良的细胞培养微载体，对微球的含水量、粒径、湿真密度等都有一定要求，本申请提供的将魔芋葡甘聚糖降解成浆液，而后分散到油相、交联成球制备工艺，能够根据需要对上述性质进行调控。因此，并非所有制备方法的到的魔芋葡甘聚糖微球都能够用于微载体的制备。而将魔芋作为基质材料，受到天然产物自身性能的限制，对微球性能的调控也因此受到影响，因而不能够制成符合要求的用于细胞培养的微载体。

魔芋葡甘聚糖是一种由葡萄糖与甘露糖以β-1，4糖苷键连接而成的杂多糖，而葡聚糖是由葡萄糖通过不同方式形成的聚糖，虽然两者都属于亲水性的多糖、具有大量的可修饰的羟基，但两者的分子组成和立体结构与葡聚糖存在很大的差别，是性质不同的两种物质，分子组成和立体结构的差别会造成多糖性质上的差别。而细胞培养是一个复杂的过程，基质具有重要的影响。并非所有具有可修饰羟基的多糖都可以制备成用于细胞培养的微载体，在没有进行大量的实验之前，没有办法判断一个多糖是否适合用于制备微载体。发明人通过研究发现，采用魔芋葡甘聚糖制备用于细胞培养的微载体，取得了令人惊喜的效果。

魔芋葡甘聚糖微载体可以产生较高的细胞增殖密度，可高达1×10⁶～1×10⁸cell/ml以上，同时能够在维持细胞最大活性、功能和完整性的同时将细胞从微载体上分离出来。这种以魔芋葡甘聚糖为基质的微载体的结构稳定，可进行高温灭菌，并可重复使用。

经比较试验发现，采用本发明的微载体用于细胞培养的效果要优于GE公司Cytodex系列。同时，本发明的微载体具有很强的成本优势，对于打破外国公司在微载体方面的技术垄断、建立我国具有完整知识产权的微载体技术系统具有深远的意义。

附图说明

图1实验例1中魔芋葡甘聚糖微载体培养Vero细胞结果，细胞培养144小时的照片；

图2实验例2中魔芋葡甘聚糖微载体培养L929细胞结果，细胞培养120小时的照片；

图3实验例3中魔芋葡甘聚糖微载体培养CHO-K1细胞结果，细胞培养120小时的照片；

图4实验例4中魔芋葡甘聚糖微载体培养CHO22H11细胞结果，细胞培养160小时的照片。

图5魔芋直接交联成球的表面电镜照片。

图6为细胞增长曲线对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但是本发明并不局限于下列实施例。本发明所用的试剂均为市售的试剂。

实施例1

取20.0g的交联魔芋葡甘聚糖微球(魔芋葡甘聚糖微球根据中国发明专利200610088917.7制备)。加入1.2mol/L NaOH溶液40ml和环氧氯丙烷20ml，35℃恒温反应2h。反应完后，用去离子水洗去未反应的环氧氯丙烷，抽干。放入pH 9.5的Na₂CO₃-Na₂HCO₃缓冲液中，加入1.0g二乙胺，35℃恒温反应18h。反应完后，用去离子水洗去未反应物质。测得微球的含水量为95.0％，电荷密度为1.2mmol/g-干球，微球粒径为200微米。

实施例2

取50.0g交联魔芋葡甘聚糖微球，加入25ml 50％NaOH溶液，10ml烯丙基缩水甘油醚，50℃反应18h。反应完后，用去离子水洗去未反应的醚，然后加入过量溴水进行溴化，反应2h。反应完后，把微球清洗干净，放入pH 9.5的Na₂CO₃-Na₂HCO₃缓冲液中，加入4.0g己二胺，35℃恒温反应18h。反应完后，用去离子水洗去未反应物质。测得微球的含水量为99.2％，电荷密度为2.6mmol/g-干球，微球粒径为100微米。

实施例3

取20.0g的交联魔芋葡甘聚糖微球，用去离子水清洗，真空抽干后移入反应器中。加入50ml 50％NaOH溶液，12.5g DEAE-HCl，在70℃恒温水浴中反应24h。反应完后，用去离子水反复清洗。测得微球的含水量为97.2％，离子交换容量为3.5mmol/g-干球，微球粒径为300微米。

实施例4

取50.0g交联魔芋葡甘聚糖微球，加入25ml、0.5mg/ml 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联剂(比例为1∶1)，35℃恒温反应2h。反应完后，用去离子水洗去未反应交联剂，再加入20mg RGD多肽，常温反应4h。反应完后，用去离子水洗去未反应多肽。微球含水量为98.6％，微球粒径为150微米。

实施例5

取30.0g的大孔型交联魔芋葡甘聚糖微球。加入2.0mol/L NaOH溶液60ml和环氧氯丙烷30ml，35℃恒温反应2h。反应完后，用去离子水洗去未反应的环氧氯丙烷，抽干。放入pH 9.5的Na₂CO₃-Na₂HCO₃缓冲液中，加入3.0g二乙胺，35℃恒温反应18h。反应完后，用去离子水洗去未反应物质。测得微球的含水量为90.0％，电荷密度为2.4mmol/g-干球，微球粒径为400微米。

实施例6

取20.0g的大孔型交联魔芋葡甘聚糖微球，加入20ml 1％的胶原溶液，其中含0.15 mmol/l的京尼平，室温下交联24h。反应后，用去离子水洗去未交联物质。微球含水量为98.0％，微球粒径为250微米。

实验例1

取实施例1制备的魔芋葡甘聚糖微载体培养Vero细胞，细胞培养条件为：细胞接种密度1.5～2.0×10⁵cells/ml、微载体密度2.0～2.5g/l、培养终体积100ml、培养液为DMEM/M199(1∶1)+10％胎牛血清，培养168小时，细胞密度可达1.0～1.2×10⁶cells/ml。其中，图1实验例1中魔芋葡甘聚糖微载体培养Vero细胞结果，细胞培养144小时的照片。

实验例2

取实施例2制备的魔芋葡甘聚糖微载体培养L929细胞，细胞培养条件为：细胞接种密度2.5～3.0×10⁵cells/ml、微载体密度5g/l、培养体积20ml、培养168小时，细胞最大密度达到1.0～1.5×10⁶cells/ml。其中图2实验例2中魔芋葡甘聚糖微载体培养L929细胞结果，细胞培养120小时的照片。

实验例3

取实施例3制备的魔芋葡甘聚糖微载体培养CHO-K1细胞，细胞培养条件为：细胞接种密度2.0～2.5×10⁵cells/ml、微球密度2.5～3.0g/l、培养终体积100ml、培养液为Ham F-12+5％胎牛血清，培养144小时，细胞最大密度可达1.0～1.5×10⁶cell/ml。图3实验例3中魔芋葡甘聚糖微载体培养CHO-K1细胞结果，细胞培养120小时的照片。

实验例4

取实施例4制备的魔芋葡甘聚糖微载体培养基因重组的CHO22H11细胞，此细胞中含有编码人源嵌合抗体的基因。细胞培养条件为：细胞接种密度2.0～2.5×10⁵cells/ml，微载体密度为2.5～3.0g/l、培养体积为100ml，培养液为DMEM/F-12(1∶1)+10％胎牛血清，培养172小时，细胞密度达到1.0～1.2×10⁶cells/ml。图4实验例4中魔芋葡甘聚糖微载体培养CHO22H11细胞结果，细胞培养160小时的照片。

实验例5

取实施例5制备的魔芋葡甘聚糖微载体培养Vero细胞，细胞培养条件为：细胞接种密度1.5～2.0×10⁵cells/ml、微球密度2.0～2.5g/l、培养液终体积100ml、培养液为DMEM/M199(1∶1)+5％胎牛血清，培养216小时，细胞最大密度可达1.5～1.8×10⁶cells/ml。

实验例6

取实施例6制备的魔芋葡甘聚糖微载体培养BHK细胞，细胞培养条件为：细胞接种密度2.0～2.5×10⁵cells/ml、微球密度4g/l、培养终体积80ml、培养液M199+5％FBS，培养168小时，细胞密度达到3.0～3.5×10⁶cells/ml。

实验例7

取实施例11中魔芋葡甘聚糖微载体培养的Vero细胞，用PBS-EDTA溶液洗涤两次，再加入80ml 0.25％胰酶溶液，在间歇式搅拌下于37℃消化10～15min，收集细胞悬液，1000rpm离心5min后用新鲜培养液重悬细胞沉淀，测定细胞活力；消化后的微载体用PBS洗涤1～2次，重复利用的微载体密度调整为3.0～3.5g/l，接入细胞密度为3.0×10⁵cells/ml，继续培养216小时，细胞密度可达到2.0～2.5×10⁶cells/ml。

实验例8

取实施例3制备的魔芋葡甘聚糖微载体培养CHO-K1细胞，细胞培养条件为：细胞接种密度2.0-2.5×10⁵cells/ml、微球密度2.5-3.0g/l、培养终体积100ml、培养液为DMEM/F-12(1∶1)+5％胎牛血清，培养168小时，细胞最大密度可达1.5×10⁶cell/ml。同样条件下，用Cytodex 1微载体进行细胞培养，细胞最大密度为1.2×10⁶cell/ml。

实验例9

取实施例1制备的魔芋葡甘聚糖微载体培养Vero细胞，细胞培养条件为：细胞接种密度10～12×10⁴cells/ml、微载体密度2.0～2.5g/l、培养终体积100ml、培养液为DMEM/M199(1∶1)+10％胎牛血清，培养216小时，细胞密度可达到139.5×10⁴cells/ml，细胞增长曲线见附图6中的曲线1。

同时，取国外进口微载体Cytodex 1在同条件下培养Vero细胞，得到细胞培养密度为102×10⁴cells/ml，其细胞增长曲线见附图6中的曲线2。

Claims (12)

1.一种用于细胞培养的微载体，其特征在于，所述的微载体是用魔芋葡甘聚糖微球为基质制备而成，所述的微载体的电荷密度为0～3.5mmol/g-干球，湿真密度为1.01～1.10g/ml，粒径为50～800微米。

2.根据权利要求1所述的微载体，其特征在于，所述的微载体的电荷密度为0.5～3.0mmol/g-干球，优选1～3.0mmol/g-干球；湿真密度为1.01～1.05g/ml；粒径为100～300微米。

3.根据权利要求1所述的微载体，其特征在于，所述的微载体为凝胶型或大孔型，所述的大孔型微载体的孔径为0.05～50微米，优选0.1～30微米，更优选0.5～20微米。

4.根据权利要求1所述的微载体，其特征在于，所述的魔芋葡甘聚糖微载体是由魔芋葡甘聚糖微球用化学交联的方法连接上带电荷的修饰剂或覆层物制备而成。

5.根据权利要求4所述的微载体，其特征在于，所述的魔芋葡甘聚糖微球与修饰剂或覆层物连接的方式包括以下几种方式：

(1)魔芋葡甘聚糖微球先与交联剂反应结合，再通过交联剂与修饰剂或覆层物反应，从而使魔芋葡甘聚糖微球与修饰剂或覆层物连接；

(2)魔芋葡甘聚糖微球先与另一端未活化的交联剂反应结合后，然后活化交联剂上的官能团，活化后的官能团与修饰剂或覆层物反应，从而使魔芋葡甘聚糖微球与修饰剂或覆层物连接；

(3)先将交联剂与修饰剂或覆层物连接，再通过交联剂上的官能团与魔芋葡甘聚糖微球反应连接。

6.根据权利要求4或5所述的微载体，其特征在于，所述的化学交联的方法中所用的交联剂选自带有双官能团或多官能团取代的化合物；所述交联剂上的双官能团或多官能团分别与微球、修饰剂或覆层物连接，或所述交联剂上的双官能团或多官能团经过活化后分别与微球、修饰剂或覆层物连接。

7.根据权利要求6所述的微载体，其特征在于，所述官能团选自卤素、胺基、环氧基、取代的缩水甘油醚基、胍基、烯烃基。

8.根据权利要求6所述的微载体，其特征在于，所述双官能团或多官能团取代的化合物选自卤素和环氧基取代的烷烃、烯基取代的缩水甘油醚基、氨基取代的烯烃；进一步优选环氧氯丙烷、环氧氯丙烷-多元醇衍生物、二环氧丁烷、1，4-丁二醇醚。

9.根据权利要求4所述的微载体，其特征在于，修饰剂或覆层物选自胺及胺盐、糖类、蛋白质、蛋白多糖、多肽、细胞外基质组分、合成高分子化合物；

其中，所述胺及胺盐选自NH₂R₁、NHR₁R₂、NR₁R₂R₃、R₄-CO-NH-R₅及其常用盐，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅分别选自取代或未取代的C_1～15直链或支链的烷烃、取代或未取代的C_1～15直链或支链烯烃，进一步优选取代或未取代的C_2～12直链或支链的烷烃、取代或未取代的C_2～12直链或支链烯烃；取代基选自氨基、羟基、卤素；

所述的蛋白选自纤维连接蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、软骨粘连蛋白、明胶；

所述的多肽选自RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)、YIGSR(酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸)、IKVAV(异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脱氢视黄醇)、多聚赖氨酸、多鸟氨酸；

所述的多糖选自乳糖、N-乙酰葡糖胺、壳聚糖、季胺化壳聚糖、海藻酸盐；

所述的合成高分子化合物选自聚氨酯、聚丙烯酸酯、聚醚酰亚胺(PEI)。

10.根据权利要求9所述的微载体，其特征在于，所述的胺及胺盐选自2-二乙氨基氯乙烷盐酸盐、己二胺、二乙胺、三甲基乙醇胺、N-[3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、正丙胺、n-庚胺、N-十二胺、乙醇胺。

11.一种权利要求1所述的微载体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)含水量的测定方法

采用TDL-40B型离心机以1000rpm离心5min，干燥器中取两只已干燥至恒重的称量瓶，分别放入准确称量的待测样品3-5g，准确至1mg(0.001g)；将介质摊平，称量瓶敞盖在100±5℃温度下烘干3h；称量瓶盖严后，取出置于干燥器中冷却至室温，在分析天平上称量；按式I计算含水量X；

$X=\frac{m_2-m_3}{m_2-m_1}\×100\%---\left(I\right)$

式中：X-介质样品的含水量，％；

      m₁-空称量瓶的质量，g；

      m₂-烘干前称量瓶和介质样品的质量，g；

      m₃-烘干后称量瓶和介质样品的质量，g。

(2)湿真密度的测定方法

根据GB/T 8330-2008离子交换树脂湿真密度测定方法执行；

(3)电荷密度的测定方法

在量筒中准确量取二份各10ml已处理的微载体样品，将样品全部转入交换柱中，并测量此时的树脂床高度，通过50mL 0.5mol/L氢氧化钠溶液，流速为0.8～1.0ml/min，通毕后用蒸馏水进行洗淋，至流出液对酚酞不显色为止，测量此时的树脂床高度，用酸式滴定管准确量取25ml 0.1mol/L标准盐酸溶液加入到分液漏斗中，以0.4～0.5mL/min流速通过树脂床；通毕，用1mol/L氯化钠溶液充分淋洗漏斗及树脂床，所通过的酸液及淋洗液收集到锥形瓶中，加入2～3滴酚酞指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至微红色并保持15s不褪色为终点，记录所耗碱液体积，介质样品的离子交换容量(E)按照式II进行计算；

C₁——盐酸标准溶液浓度，单位为mmol/mL，

V₁——盐酸标准溶液体积，单位为mol/L，

C₂——氢氧化钠标准溶液的浓度，单位为mol/L，

V₂——滴定时所耗氢氧化钠标准溶液体积，单位为mL，

m₁——树脂样品的质量，单位为mg，

X——树脂样品的含水量，单位为％；

(4)粒径测定方法：由Mastersizer 2000E激光粒度仪测定；

(5)孔径测定方法：样品孔径由JSM-6700F SEM冷场发射扫描电子显微镜观测；

(6)微球外观观察方法：微球外观由光学显微镜观察。

12.一种以魔芋葡甘聚糖为基质制备的微球在用于细胞培养的微载体中的应用。

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