CN102492178B - 一种尺寸均一的魔芋葡甘聚糖微球及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种尺寸均一的魔芋葡甘聚糖微球及其制备方法。所述魔芋葡甘聚糖微球为凝胶型或大孔型，尺寸均一，平均粒径在10-200μm范围内可控。其制备方法如下：首先将魔芋葡甘聚糖降解得到魔芋葡甘聚糖水溶液作为水相(W)；溶解有油溶性乳化剂且与水互不相溶的溶液作为油相(O)；将水相压入油相得到W/O型乳液；向乳液中滴加交联剂，搅拌进行反应；交联成球后，经洗涤、收集，即可得到尺寸均一的魔芋葡甘聚糖微球。本发明魔芋葡甘聚糖微球尺寸均一、粒径可控，各微球之间没有合并现象，在保存过程中不会出现并聚现象能够满足分离纯化、细胞培养微载体和诊断制剂等多方面的需求。

Description

一种尺寸均一的魔芋葡甘聚糖微球及其制备方法

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种尺寸均一的魔芋葡甘聚糖微球及其制备方法。

背景技术

魔芋葡甘聚糖(KGM)是一种高分子多糖，是由葡萄糖和甘露糖经β-1，4-糖苷键连接而成。葡聚糖作为天然多糖材料已经得到广泛的应用，魔芋葡甘聚糖与葡聚糖结构非常相似，具备了葡聚糖作为生物功能材料的许多特性：高亲水性、含有较多的活化羟基、不与生物大分子发生非特异性吸附等，因此制备的魔芋葡甘聚糖微球可以作为层析介质、微载体、药物缓控释载体等多种产品。由于葡甘聚糖分子含有较多的活性羟基，可以在一定条件下进行功能化反应引入不同的功能团，可以形成系列产品。

由于魔芋葡甘聚糖微球的重要应用价值，国内外也开发了多种制备魔芋葡甘聚糖微球的方法。日本学者[JP昭62-236839，JP平1-94949]制备的魔芋葡甘聚糖微球，其工艺路线冗长，生产周期约为5、6天时间，且消耗大量的溶剂，不但成本昂贵，更难以工业生产。

CN 1078724A提供了一种可用作凝胶过滤介质的珠状交联葡甘聚糖的制备方法。其特征在于：将葡甘聚糖水溶液分散于含有分散剂的水不溶性有机化合物中，然后蒸发液滴中的水，制得珠状葡甘聚糖粒子后，再与交联剂反应，制备珠状交联葡甘聚糖。但是该方法反应设备复杂，反应过程操作复杂且要求严格，不利于工业化大规模生产。

CN 101113180B公开了一种大孔型魔芋葡甘聚糖凝胶微球，其比表面积5～15M²/G，孔容为0.1～0.8ML/G。还公开了一种魔芋葡甘聚糖凝胶微球的制备方法。其中在魔芋葡甘聚糖水溶液中加入致孔剂，可通过控制致孔剂的用量来制备不同规格孔容的大孔型魔芋葡甘聚糖凝胶微球。该发明提供的制备方法采用成球、交联一步反应，缩短生产周期，简化成球工艺步骤，并且能够控制微球的孔径，工艺简单，易于放大。

然而，上述的魔芋葡甘聚糖微球的制备方法均为机械搅拌法，制备的微球粒径不均一、粒径难以控制，给实际应用带来很大困难。例如，作为分离介质应用时，粒径均一的微球在柱层析时有较高的塔板数及很高的分辨率，能够拆分结构极为近似的物质，有效避免不均一微球造成的沟流、床层压力不稳定等问题。将微球改性连接配基(如抗原等)，还可以作为临床诊断试剂使用，其原理是当检测液中含有特殊抗体时，抗体与微球上的配基发生反应，使微球之间发生聚集，从而可用肉眼或显微镜判断。但是，如果粒径不均一，即使体液内没有抗体，小微球比大微球表面能高，容易吸附在微球上，造成微球聚集，产生假阳性或假阴性的诊断结果，从而延误治疗。当作为细胞培养微载体时，粒径均一的微球能够为细胞提供更为均一的生长环境，有利于细胞的分化、生长和收集。由于微球的粒径对于多种应用有重要的影响，为得到均一粒径的微球，通常在微球制备后要进行筛分。而筛分过程不但会造成原材料的浪费，也耗费大量的人力、物力，导致生产成本的提高。而且即使对微球进行筛分，其粒径均一性依然不会很高。因此，有必要研究新的制备方法，制备尺寸均一的魔芋葡甘聚糖微球，以便克服传统制备方法的不足以及由此带来的应用上的缺陷。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种尺寸均一、粒径可控的魔芋葡甘聚糖微球，以满足分离纯化、细胞培养微载体和诊断制剂等多方面的需求；本发明同时还提供了一种上述魔芋葡甘聚糖微球的制备方法。

本发明提供的魔芋葡甘聚糖微球，平均粒径在10-200μm范围内可控，粒径分布系数可以控制在15％以内，优化条件下可以控制在10％以内。魔芋葡甘聚糖微球为凝胶型或大孔型。粒径分布系数按下式计算：

C.V.＝{[∑(d_i-d)²/N]^1/2/d}×100％

式中，C.V.代表粒径分布系数；d_i代表各个微球的直径；d代表微球的数均平均粒径，d＝∑d_i/N；N为用于计算粒径的微球数量，且N≥200个。

本发明的魔芋葡甘聚糖微球的尺寸非常均一，各微球之间没有合并现象，在保存过程中不会出现并聚现象。

为了达到上述目的，本发明通过如下技术方案实现魔芋葡甘聚糖微球的制备：

一种尺寸均一的魔芋葡甘聚糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)将魔芋葡甘聚糖降解成小分子链的葡甘聚糖，得到魔芋葡甘聚糖水溶液，作为水相(W)；

(2)溶解有油溶性乳化剂且与水互不相溶的溶液作为油相(O)；

(3)将水相通过微孔膜压入油相，得到W/O型乳液；

(4)向上述乳液中滴加交联剂，搅拌进行交联反应；

(5)交联成球后，经洗涤、收集，即可得到尺寸均一的魔芋葡甘聚糖微球。

魔芋葡甘聚糖是天然的复合多糖，分子量约80-100万左右，通常1％的葡甘聚糖在水中为胶冻状，难以搅拌，没有任何流动性，这样的粘稠态物质无法在油性物质中分散，因此必须先将分子量大的葡甘聚糖降解成分子量较低的分子，得到易流动的液体。通常多糖的降解有酸解和酶解两种方法。为了简便操作，多采用化学降解法。可使用的酸有醋酸、醋酸酐、丙酸、硝酸、盐酸等任意的有机酸及无机酸。

本发明采用的方法是将一定量的魔芋精粉溶于酸中，充分搅拌形成胶冻状，然后放入高压锅内高温降解，再将降解物取出降至室温，加入碱液溶解降解物，充分搅拌使其全部溶解，然后过滤杂质得到澄清液体即魔芋葡甘聚糖水溶液。

本发明所述魔芋葡甘聚糖水溶液浓度为0.1-40％(w/w)，更优选为4-20％(w/w)。

魔芋葡甘聚糖水溶液需要分散到油相中成球。本发明所述油相可选用氯代环氧丙烷、醋酸丁酯、透平油、煤油、机油、烃类及卤代烃，如二氯乙烷、液体石蜡、四氯化碳、环己烷、环己烷/四氯化碳、石油醚等，芳香化合物及其卤代物，如甲苯、二甲苯、二氯苯等，以上所述物质中的一种或至少两种的混合物作为溶剂，例如四氯化碳，透平油和/或机油，二氯乙烷/二甲苯/环己烷/四氯化碳等上述物质的任意组合均可用作油相溶剂。优选组合为液体石蜡和/或二甲苯。

为了制备出外观光圆的魔芋葡甘聚糖微球，油相乳化剂的选择非常重要。一般来说，需要选择既能溶于分散介质中，又可以形成稳定分散效果的物质。油相乳化剂可以单独使用，也可以两种或两种以上配合使用。在本发明提供的制备方法中所述油相乳化剂选自司班类乳化剂、吐温类乳化剂、油酸、油酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素、PO-500、Alarcel 83、锂基脂中的一种或至少两种的混合物，例如司班800，乙基纤维素和/或PO-500，锂基脂/PO-500/油酸等组合均可用于实施本发明；油相乳化剂的浓度优选为0.5-10wt％(以油相质量为基准)。

将配好的魔芋葡甘聚糖溶液在压力作用下通过孔径均一的多孔的疏水膜压入油相，得到W/O型乳液。操作温度一般在为4-95℃，优选20-80℃。水相与油相的体积比为1∶1-1∶100。在其他条件优化后，所得KGM微球的均一性主要由疏水膜孔径的均一性控制，疏水膜的孔径越均一得到的微球越均一。微球的粒径主要由疏水膜的孔径大小控制，疏水膜孔径越大，得到的KGM微球越大。

在搅拌条件下，在W/O型乳液中滴加入交联剂，交联温度为10-95℃，优选40-80℃。交联反应时间为4-24h，优选反应时间为5-12h。反应完毕后，经过多次洗涤、过滤，即可得到粒径均一的魔芋葡甘聚糖微球。本发明提供的制备方法中，交联剂可选用环氧氯丙烷、环氧氯丙烷-多元醇衍生物、二环氧丁烷、1，4-丁二醇醚、单环氧基或多环氧基的化合物及含有活泼卤素化合物等多官能团化合物的一种或至少两种的混合物，以上物质的任意组合皆可用作本发明交联剂。

在上述提供的制备方法中，在魔芋葡甘聚糖水溶液中还可以添加致孔剂，用于制备大孔型魔芋葡甘聚糖微球。选用的致孔剂不应参与交联反应，也不溶于油相。在微球制备过程中，致孔剂占据微球内的部分空间，交联成球后，除去致孔剂即可得到大孔型魔芋葡甘聚糖微球。

本发明所述致孔剂选自无机盐类、多元醇、多羟基化合物或其聚合物的一种或至少两种的混合物；优选NaCl、Na₂CO₃、丙三醇、PEG中的一种或至少两种的混合物，例如丙三醇，NaCl和/或Na₂CO₃，丙三醇/PEG/Na₂CO₃等组合均可用作致孔剂。致孔剂用量为魔芋葡甘聚糖水溶液的0-50％(w/w)，优选2-20％(w/w)。

与已有技术方案相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明魔芋葡甘聚糖微球尺寸均一、粒径可控，能够满足分离纯化、细胞培养微载体和诊断制剂等多方面的需求；

(2)本发明的魔芋葡甘聚糖微球的尺寸非常均一，各微球之间没有合并现象，在保存过程中不会出现并聚现象。

附图说明

图1为膜乳化法制备魔芋葡甘聚糖微球的制备流程图。

图2为实施例2中制备的魔芋葡甘聚糖凝胶微球的光学显微镜照片。

图3为实施例3中制备的魔芋葡甘聚糖凝胶微球的光学显微镜照片。

图4为实施例4中制备的魔芋葡甘聚糖凝胶微球的光学显微镜照片。

图5为实施例5中制备的魔芋葡甘聚糖凝胶微球的光学显微镜照片。

图6为实施例6中制备的魔芋葡甘聚糖凝胶微球的光学显微镜照片。

图中：1-魔芋葡甘聚糖水溶液；2-膜乳化；3-W/O乳液；4-KGM微球。

下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的权利范围以权利要求书为准。

具体实施方式

为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：

实施例1

魔芋葡甘聚糖水溶液的制备

在500ml反应器中，将20ml 0.5M的HCl与120g去离子水混合均匀，将魔芋葡甘聚糖20.0g倒入混合液中，搅拌均匀，溶胀5min后呈胶冻状。用parafilm膜或表面皿盖住反应器，放入高压灭菌锅中，在115℃下降解30min，降解完毕后取出反应器，放置至室温。加入40g 40％的NaOH溶液，搅拌使浆液溶解，过滤杂质后即可得到澄清的10％含量的魔芋葡甘聚糖水溶液。同法可以制备0.1％、4％、15％、20％、40％等固含量的魔芋葡甘聚糖水溶液备用。

实施例2

将孔径为50.2μm的疏水膜置于亲油性物质中浸润，使多孔膜充分湿润以确保膜上的疏水链完全舒展开。在200ml反应釜中加入含有0.8g司班800和0.4g乙基纤维素的二甲苯50ml，升温至60℃。取固含量为40％的魔芋葡甘聚糖溶液20ml，加入膜乳化装置中，在恒定压力下，通过孔径均一的疏水膜压入油相得到W/O型乳液。乳化完毕后，取出膜乳化装置。将8ml交联剂环氧氯丙烷缓慢滴加进乳液中，滴加约0.5h。滴加完毕升温至80℃，搅拌条件下反应8h，微球固化。反复清洗，过滤，得到粒径为198μm魔芋葡甘聚糖微球，CV值为8.56％。膜乳化过程如图1所示，微球的光学显微镜照片如图2所示。

实施例3

将孔径为19.6μm的疏水膜置于亲油性物质中浸润，使多孔膜充分湿润以确保膜上的疏水链完全舒展开。在500ml反应釜中加入含有2.0g司班60和0.5g锂基酯的液体石蜡200ml，升温至40℃。取固含量为10％的魔芋葡甘聚糖溶液50ml，加入膜乳化装置中，在恒定压力下，通过孔径均一的疏水膜压入油相得到W/O型乳液。乳化完毕后，取出膜乳化装置。将25ml交联剂环氧氯丙烷缓慢滴加进乳液中，约滴加1h。滴加完毕升温至70℃，搅拌条件下反应8h，微球固化。反复清洗，过滤，得到粒径为70μm魔芋葡甘聚糖微球，CV值为14.2％。微球的光学显微镜照片如图3所示。

实施例4

将孔径为4.7μm的疏水膜置于亲油性物质中浸润，使多孔膜充分湿润以确保膜上的疏水链完全舒展开。在200ml反应釜中加入含有2.4g司班80的液体石蜡80ml，升温至40℃。取固含量为4％的魔芋葡甘聚糖溶液20ml，加入膜乳化装置中，在恒定压力下，通过孔径均一的疏水膜压入油相得到W/O型乳液。乳化完毕后，取出膜乳化装置。将6ml交联剂环氧氯丙烷缓慢滴加进乳液中，约滴加0.3h。滴加完毕升温至60℃，搅拌条件下反应8h，微球固化。反复清洗，过滤，得到粒径为12.5μm魔芋葡甘聚糖微球，CV值为10.5％。微球的光学显微镜照片如图4所示。

实施例5

将孔径为5.7μm的疏水膜置于亲油性物质中浸润，使多孔膜充分湿润以确保膜上的疏水链完全舒展开。在200ml反应釜中加入含有2.0g司班60的液体石蜡100ml。取固含量为20％的魔芋葡甘聚糖溶液20ml，其中含有2.0gNa₂CO₃，加入膜乳化装置中，室温下，经恒定压力通过孔径均一的疏水膜压入油相得到W/O型乳液。乳化完毕后，取出膜乳化装置。将8ml交联剂环氧氯丙烷和2g 1，4-丁二醇二缩水甘油醚缓慢滴加进乳液中，约滴加0.4h。滴加完毕升温至90℃，搅拌条件下反应8h，微球固化。反复清洗，过滤，得到粒径为28μm的大孔型魔芋葡甘聚糖微球，CV值为12.3％。微球的光学显微镜照片如图5所示。

实施例6

将孔径为16.9μm的疏水膜置于亲油性物质中浸润，使多孔膜充分湿润以确保膜上的疏水链完全舒展开。在250ml反应釜中加入含有1.5g PO-500和0.2g锂基酯的液体石蜡100ml，升温至50℃。取固含量为15％的魔芋葡甘聚糖溶液50ml，其中含有2.5g NaCl，加入膜乳化装置中，在恒定压力下，通过孔径均一的疏水膜压入油相得到W/O型乳液。乳化完毕后，取出膜乳化装置。将25ml交联剂环氧氯丙烷缓慢滴加进乳液中，约滴加1h。滴加完毕升温至70℃，搅拌条件下反应8h，微球固化。反复清洗，过滤，得到粒径为98.6μm的大孔型魔芋葡甘聚糖微球，CV值为9.3％。微球的光学显微镜照片如图6所示。

实施例七

将孔径为4.7μm的疏水膜置于亲油性物质中浸润，使多孔膜充分湿润以确保膜上的疏水链完全舒展开。在250ml反应釜中加入含有3g PO-500的液体石蜡100ml，升温至95℃。取固含量为0.1％的魔芋葡甘聚糖溶液100ml，其中含有2.5g NaCl，加入膜乳化装置中，在恒定压力下，通过孔径均一的疏水膜压入油相得到W/O型乳液。乳化完毕后，取出膜乳化装置。将25ml交联剂环氧氯丙烷缓慢滴加进乳液中，约滴1h。滴加完毕升温至40℃，搅拌条件下反应4h，微球固化。反复清洗，过滤，得到粒径为12.2μm的大孔型魔芋葡甘聚糖微球，CV值为13.4％。

实施例八

将孔径为16.9μm的疏水膜置于亲油性物质中浸润，使多孔膜充分湿润以确保膜上的疏水链完全舒展开。在1000ml反应釜中加入含有1.0g Alarcel 83和0.2g油酸钠的液体石蜡500ml，降温至4℃。取固含量为15％的魔芋葡甘聚糖溶液50ml，其中含有2.5g NaCl，加入膜乳化装置中，在恒定压力下，通过孔径均一的疏水膜压入油相得到W/O型乳液。乳化完毕后，取出膜乳化装置。将25ml交联剂环氧氯丙烷缓慢滴加进乳液中，约滴加1h。滴加完毕升温至10℃，搅拌条件下反应24h，微球固化。反复清洗，过滤，得到粒径为56μm的大孔型魔芋葡甘聚糖微球，CV值为8.9％。

实施例九

将孔径为19.6μm的疏水膜置于亲油性物质中浸润，使多孔膜充分湿润以确保膜上的疏水链完全舒展开。在500ml反应釜中加入含有2.5g吐温60的二甲苯200ml，升温至30℃。取固含量为15％的魔芋葡甘聚糖溶液30ml，加入膜乳化装置中，在恒定压力下，通过孔径均一的疏水膜压入油相得到W/O型乳液。乳化完毕后，取出膜乳化装置。将25ml交联剂二环氧丁烷缓慢滴加进乳液中，约滴加1h。滴加完毕升温至40℃，搅拌条件下反应5h，微球固化。反复清洗，过滤，得到粒径为75μm魔芋葡甘聚糖微球，CV值为11.3％。

实施例十

将孔径为5.7μm的疏水膜置于亲油性物质中浸润，使多孔膜充分湿润以确保膜上的疏水链完全舒展开。在250ml反应釜中加入含有2.0g司班60和0.5g锂基酯的液体石蜡/二甲苯200ml，升温至40℃。取固含量为10％的魔芋葡甘聚糖溶液50ml，加入膜乳化装置中，在恒定压力下，通过孔径均一的疏水膜压入油相得到W/O型乳液。乳化完毕后，取出膜乳化装置。将25ml交联剂环氧氯丙烷缓慢滴加进乳液中，约滴加1h。滴加完毕升温至70℃，搅拌条件下反应12h，微球固化。反复清洗，过滤，得到粒径为19.6μm魔芋葡甘聚糖微球，CV值为7.2％。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的制备方法，但本发明并不局限于上述制备步骤，即不意味着本发明必须依赖上述制备步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (6)

1.一种尺寸均一的魔芋葡甘聚糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)将魔芋葡甘聚糖降解成小分子链的葡甘聚糖，得到魔芋葡甘聚糖水溶液，作为水相(W)；所述魔芋葡甘聚糖水溶液浓度为4-20％(w/w)；所述魔芋葡甘聚糖水溶液通过如下方法得到：将魔芋精粉溶于酸中，充分搅拌形成胶冻状，然后放入高压锅内高温降解，再将降解物取出降至室温，加入碱液溶解降解物，充分搅拌使其全部溶解，然后过滤杂质得到澄清液体即魔芋葡甘聚糖水溶液；

(2)溶解有油相乳化剂且与水互不相溶的溶液作为油相(O)；所述油相选用氯代环氧丙烷、醋酸丁酯、透平油、芳香化合物及其卤代物中的一种或至少两种的混合物作为溶剂；所述油相乳化剂选自司班类乳化剂、吐温类乳化剂、油酸、油酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素、PO-500、或锂基脂中的一种或至少两种的混合物；油相乳化剂的浓度以油相质量为基准为0.5-10wt％；

(3)将水相通过微孔膜压入油相，得到W/O型乳液；水相与油相的体积比为1:1-1:100；操作温度为4-95℃；

(4)向上述乳液中滴加交联剂，搅拌进行交联反应；交联温度为10-95℃；交联反应时间为4-24h；所述交联剂选用环氧氯丙烷、环氧氯丙烷-多元醇衍生物、二环氧丁烷或1，4-丁二醇醚中的一种或至少两种的混合物；

(5)交联成球后，经洗涤、收集，即得到尺寸均一的魔芋葡甘聚糖微球，所述微球的平均粒径在10-200μm范围内可控；粒径分布系数控制在10％以内；所述魔芋葡甘聚糖微球为凝胶型或大孔型。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)后任选进行：在上述水相(W)中加入致孔剂；所述致孔剂用量为魔芋葡甘聚糖水溶液的2-50％(w/w)。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述致孔剂用量为魔芋葡甘聚糖水溶液的2-20％(w/w)。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述致孔剂选自NaCl、Na₂CO₃、丙三醇、PEG中的一种或至少两种的混合物。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述油相选用液体石蜡和/或二甲苯作为溶剂。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)操作温度为20-80℃；步骤(4)交联温度为40-80℃；交联反应时间为5-12h。