CN103215217B - 一种动物细胞培养用胶原蛋白覆层微载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种动物细胞培养用胶原蛋白覆层微载体及其制备方法。本发明的微载体以魔芋葡甘聚糖微球为基质，用胶原蛋白覆层微球。本发明的微载体的制备方法如下：将基质微球中加入活化试剂与催化剂，在碱性环境下进行活化反应；将上步制备的微球清洗抽干后，加入缓冲液中，加入胶原蛋白，进行偶联反应；反应完毕的体系混匀后，加入水中，胶原蛋白在微球表面覆层凝聚，然后清洗微球；将微球加入反应容器中，再加入交联试剂与PBS缓冲液，搅拌使其反应，反应完毕清洗后即得微载体产品。该微载体表面蛋白覆盖均匀，连接牢固，利于细胞的快速贴附和高密度生长；且制成的微载体成本低廉，周期较短，有利于工业化生产。
Description
技术领域
本方法涉及一种动物细胞培养用微载体及其制备方法，尤其涉及一种动物细胞培养用胶原蛋白覆层微载体及其制备方法，属于生化工程领域。
背景技术
微载体是细胞培养中所使用的一类无毒性、非刚性、密度均一、通常是透明的小颗粒，能使依赖贴壁的细胞在悬浮培养时贴附在颗粒表面单层生长，从而增加细胞贴附生长的面积，有利于细胞的大规模培养和收集。微载体培养是目前用于动物细胞大规模培养的主要技术。利用微载体系统进行贴壁依赖型动物细胞的大规模培养是国内外生物医药企业采用的主要生产方式，用于各类细胞及细胞产品包括疫苗、抗体等生物药的生产。
自1967年Van Wezel首次成功应用微载体培养动物细胞以来，微载体培养技术越来越受关注，目前已有多种微载体产品上市。法玛西亚（Pharmacia）公司开发的Cytodex1、Cytodex2和Cytodex3系列商品是目前应用最为广泛的几种微载体。此外，进行表面修饰后的聚苯乙烯、琼脂糖、纤维素、壳聚糖等十多种微球也被用来作为微载体，并已商品化。另外，还有两种及以上混合材料制备的微载体，如丝素蛋白和壳聚糖大孔微载体(CN101624472A)，壳聚糖和明胶混合微载体(CN1321175C)。
在众多的微载体产品中，胶原蛋白覆层微载体近年来备受重视。这种微载体特别适用于某些难以生长的细胞、分化细胞培养系统、尤其是具有上皮样形态学特征细胞的培养。胶原蛋白覆层微载体的另一个优势在于变性胶原蛋白层可以在温和条件下很容易地被胰蛋白酶或胶原蛋白酶等多种蛋白酶消化，能在维持细胞最大活性、功能和完整性的同时将细胞从微载体上分离出来，这对组织过程等领域的需要至关重要。
胶原蛋白覆层微球作为微载体主要有以下制备技术。Hillegas等公开了一种胶原蛋白覆层聚苯乙烯微球(Hillegas R,William J,Arbor A.Collagen-coatedPolystyrene Microcarier Beads[P].US4994388.)，在聚苯乙烯微球表面覆层层粘连蛋白或纤连蛋白，再置于含胶原蛋白蛋白的醋酸溶液中升温蒸发，制备了一种胶原蛋白覆层聚苯乙烯微球。Machiko KATO等发明了一种胶原蛋白包被微载体的制备方法(Machiko KATO,Saitama.Ken SUGO,Saitama.Collagen-coatedcarrier and method for manufacturing collagen-coatedcarrier[P].US20060270037A1.)，其以磷酸钙盐化合物为基质，通过纤维连接蛋白或整合素为连接臂，将胶原蛋白蛋白连接到微球表面。但纤维连接蛋白所需的操作条件较为苛刻且价格较为昂贵，不利于工业化生产。王国祥等研究了明胶包被的琼脂糖微载体及其细胞培养特性(王国祥，聂峰光，苏志国等，明胶包被的琼脂糖微载体及其细胞培养特性[J]，药物生物技术，2001，8(5)：P264-267。)，提供了一种以琼脂糖为基质的胶原蛋白包被的微载体制备方法，这种方法是以阿拉伯胶与明胶所形成的聚电解质为原料来覆层，且覆层分子是以物理作用吸附于琼脂糖微球上，蛋白的连接并不牢固，生物相容性和细胞培养效果并不理想。
另一种成熟的胶原蛋白覆层微载体是Cytodex3。这种微载体覆层胶原蛋白选用的是Ⅰ型猪皮变性胶原蛋白，胶原蛋白的分子量为60,000-200,000，覆层量约为微球质量的16.2%，粒径为133-215μm。微载体的基质为葡聚糖微球，胶原蛋白通过环氧氯丙烷共价交联在葡聚糖微球表面。目前这种微载体已在多种细胞的培养中获得良好效果。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种动物细胞培养用胶原蛋白覆层微载体。本发明所提供的微载体表面蛋白覆盖均匀，连接牢固，利于细胞的快速贴附和高密度生长，能够在低的胶原蛋白覆层量下实现较Cytodex3相当甚至更优的细胞培养效果；且制成的微载体成本低廉，周期较短，有利于工业化生产。
本发明所提供的动物细胞培养用胶原蛋白覆层的微载体，所述微载体的基质为魔芋葡甘聚糖微球，胶原蛋白的覆层量为基质微球质量的1%-10%，如2%、3.5%、4%、5%、6.5%、7%、8.5%等，覆层的胶原蛋白通过活化试剂与基质微球共价偶联。
魔芋葡甘聚糖（KGM）微球具有良好的亲水性和生物相容性，对细胞没有毒性，覆层后仍为透明状，利于用显微镜直接观察细胞培养状态。基质微球具有孔道，使营养物质能够到达细胞与基底接触的部位，有利于细胞生长。
作为优选技术方案，所述的基质微球的粒径为50-500μm，优选为100-300μm，进一步优选160-250μm。魔芋葡甘聚糖微球可用CN102492178A的方法进行制备，只需控制最终制得的魔芋葡甘聚糖微球的粒径在50-500μm范围内即可。
优选地，所述的基质微球含水量为80%以上。
优选地，所述的胶原蛋白为猪明胶、鱼明胶、牛明胶或其混合物；例如为猪明胶或为牛明胶或为猪明胶与鱼明胶的混合或为三者的混合。
优选地，所述的胶原蛋白分子量为3,000-50,000，例如为4,000、5,500、6,500、9,000、11,000、15,000、23,000、28,050、30,100、38,000、42,000、46,000等，优选5,000-50,000，进一步优选5,000-20,000。
优选地，所述的活化试剂为含环氧基团的长链试剂，优选长链试剂至少含有6个碳原子，进一步优选1,4-丁二醇二缩水甘油醚、双环氧化丁二烯、正丁基缩水甘油醚、烯丙基缩水甘油醚或其混合物。例如为1,4-丁二醇二缩水甘油醚或双环氧化丁二烯或正丁基缩水甘油醚或烯丙基缩水甘油醚，或为1,4-丁二醇二缩水甘油醚和双环氧化丁二烯的混合物，或为正丁基缩水甘油醚和烯丙基缩水甘油醚的混合物，或为1,4-丁二醇二缩水甘油醚、双环氧化丁二烯和正丁基缩水甘油醚的混合物，或为1,4-丁二醇二缩水甘油醚、双环氧化丁二烯、正丁基缩水甘油醚和烯丙基缩水甘油醚的混合物等。
与现有产品相比，该微载体的基质为魔芋葡甘聚糖微球，含水量为80%以上，具有孔道。本发明使用的覆层胶原蛋白，包括胶原和变性胶原（明胶）。胶原蛋白通过长链交联剂与KGM微球进行共价偶联。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，能够促进细胞在微载体表面的贴附、生长和增殖。
与Cytodex3相比，本发明使用的胶原蛋白分子量小，但交联剂的疏水链长，所用交联剂均为含6个碳原子以上的试剂，胶原蛋白分子无法完全遮蔽住交联链，可以在胶原蛋白与疏水双重作用下，实现细胞的贴附、生长。已有文献报道，微载体的疏水性适当增加有利于细胞的贴附与生长。因此，本发明提供的微载体能够在低的胶原蛋白覆层量（1%-10%）下实现与之相当甚至更优的细胞培养效果。同时，胶原蛋白覆层量降低，有利于降低微载体的成本。
本发明的目的之一还在于提供本发明所述的微载体的制备方法，包括如下步骤：
a)在魔芋葡甘聚糖微球中加入活化试剂与催化剂，在碱性环境下进行活化反应，得到活化的魔芋葡甘聚糖微球；
b)将步骤a)得到的所述微球清洗抽干后，加入NaHCO3-Na2CO3缓冲液中，加入胶原蛋白，进行偶联反应；
c)将步骤b)反应完毕的体系混匀后，加入水中，胶原蛋白在微球表面覆层凝聚后，清洗微球；
d)将步骤c)处理好的微球加入反应容器中，再加入交联试剂与PBS缓冲液，搅拌使其反应，反应完毕清洗后即得所述的微载体产品。
作为优选技术方案本发明所提供的制备方法，步骤a)中所述的活化试剂为含环氧基团的长链试剂，优选长链试剂至少含有6个碳原子，进一步优选1,4-丁二醇二缩水甘油醚、双环氧化丁二烯、正丁基缩水甘油醚、烯丙基缩水甘油醚或其混合物。
优选地，所述活化剂的用量为每克微球加入1-10mmol，例如每克微球加入1.2mmol、1.5mmol、1.7mmol、2.5mmol、3.6mmol、4.8mmol、5mmol、6.2mmol、7.1mmol、8.3mmol、9.0mmol、9.6mmol等。
优选地，所述的催化剂为硼氢化钠，优选其加入量为0.5-50mg/g微球，例如每克微球加入0.8mg、2mg、3.5mg、7mg、9mg、12mg、15mg、20mg、25mg、32mg、38mg、43mg、46mg、49mg等，进一步优选0.5-25mg/g微球。
优选地，所述的碱性环境由阳离子为碱金属离子，阴离子为氢氧根离子的碱性溶液提供，优选为NaOH或KOH溶液。
优选地，所述碱性溶液浓度为0.1-3M，例如为0.25M、0.3M、0.7M、0.95M、1.2M、1.5M、2.1M、2.35M、2.53M、2.8M等，优选0.5-3M，进一步优选0.5-2M。
优选地，所述的碱性溶液的加入量为0.5-5mL/g微球，例如为0.8mL/g、1.3mL/g、1.7mL/g、2.4mL/g、2.8mL/g、3.5mL/g、4.1mL/g、4.6mL/g等。
优选地，所述活化反应的活化温度为15-65℃，例如为21℃、26℃、32℃、36℃、40℃、42℃、48℃、54℃、59℃、63℃等，优选25-65℃。
优选地，所述活化反应的反应时间为0.5-24h，例如为0.8h、1h、2.5h、4.5h、6h、8h、11h、13h、18h、20h、24h等，优选为0.5-10h，进一步优选为3-6h。
在碱性条件下，活化剂的一端的环氧基打开与KGM微球的羟基进行反应。活化反应时的搅拌速度为50-300rpm，例如为80rpm、100rpm、150rpm、200rpm、230rpm、260rpm、290rpm等。
作为优选技术方案本发明所提供的制备方法，步骤b)中所述的NaHCO3-Na2CO3缓冲液的pH为8-12，例如为8.5、9.0、9.3、9.8、10.5、10.9、11.3等，优选9-12，进一步优选10-12。
优选地，所述的偶联反应的反应温度为15-65℃，例如为20℃、25℃、33℃、36℃、40℃、42℃、48℃、51℃、59℃、63℃等，优选30-65℃。
优选地，所述的偶联反应的反应时间为0.5-24h，例如为0.8h、1.3h、2.6h、4.7h、6h、8h、10h、12h、16h、21h、24h等，优选为0.5-10h，进一步优选为3-6h。
偶联反应时的搅拌速度为50-300rpm，例如为80rpm、100rpm、150rpm、200rpm、230rpm、260rpm、290rpm等。缓冲液体系也是提供一个碱性环境使活化试剂另一端环氧基团打开，能与蛋白进行偶联反应。
作为优选技术方案本发明所提供的制备方法，步骤c)中所述的水为0-10℃的水，优选为0-10℃的去离子水。加入冷的去离子水中，使蛋白质凝聚，形成良好的覆层。
优选地，所述的水的加入量为5-100mL/g微球，例如为10mL、15mL、22mL、34mL、45mL、56mL、70mL、90mL等，优选水的温度为0-10℃，例如为2℃、3℃、5℃、6℃、8℃等。
作为优选技术方案本发明所提供的制备方法，步骤d)中所述的交联试剂为双醛基类、双环氧类、二亚胺类或叠氮类分子或其混合物，优选为丙二醛、丁二醛、碳化二亚胺、二异氰酸酯、京尼平、戊二醛或叠氮二苯基磷或其混合物，进一步优选为丁二醛、碳化二亚胺、二异氰酸酯或其混合物。
优选地，所述的交联试剂的用量为1-10mmol/g微球，例如为1.5mmol、2.0mmol、2.8mmol、3.6mmol、4.0mmol、5.1mmol、7.2mmol、8.1mmol、8.9mmol、9.4mmol等，优选为2.5-10mmol。
优选地，所述的交联反应温度为15-65℃，例如为20℃、25℃、33℃、36℃、40℃、42℃、48℃、51℃、59℃、63℃等，交联反应时间为0.5-24h，例如为0.8h、1.3h、2.6h、4.7h、6h、8h、10h、12h、16h、21h、24h等。
优选地，所述的PBS缓冲液的pH为7-8，；例如为7.05、7.14、7.25、7.30、7.45、7.56、7.77、7.80、7.94等，用量为2-10mL/g微球，例如每克微球为2.5mL、3.0mL、4.2mL、4.8mL、5.5mL、6.4mL、7.8mL、8.6mL、9.2mL等。
上述制备过程，本领域的技术人员可以根据实际操作进行用量与时间的调整，可以适当增加或缩减。
在胶原蛋白覆层完成后，在胶原蛋白之间再进行一步交联，以提高胶原蛋白层的稳定性。
作为优选技术方案本发明所提供的制备方法，所述的胶原蛋白为猪明胶、鱼明胶、牛明胶或其混合物。
作为优选技术方案本发明所提供的制备方法，所述胶原蛋白浓度为0.01-0.5g/mL，优选为0.04-0.3g/mL，进一步优选为0.04-0.1g/mL。
作为优选技术方案本发明所提供的制备方法，所述胶原蛋白分子量为3,000-50,000，优选5,000-50,000，进一步优选5,000-20,000。
如果明胶分子量太小，浓度太低，在步骤c)滴加入冷水步骤中蛋白无法凝聚在微球表面，可能会造成覆层的不完全、不均匀，导致细胞培养效果不佳。若蛋白的分子量过高或浓度过大，步骤c)滴加入冷水的步骤中蛋白之间会凝聚，造成原材料的浪费。另外，也可能会遮蔽活化剂的疏水链段，使疏水作用减弱。
本发明的目的之一还在于提供本发明所制得的微载体用于动物细胞培养。
本发明所提供的微载体表面蛋白覆盖均匀，连接牢固，利于细胞的快速贴附和高密度生长，能够在低的胶原蛋白覆层量下实现较Cytodex3相当甚至更优的细胞培养效果；且制成的微载体成本低廉，周期较短，有利于工业化生产。
附图说明
图1是微载体培养Vero细胞接种2h后的显微镜照片，左侧为实施例3所制微载体，右侧为Cytodex3；
图2是微载体培养Vero细胞接种24h后的显微镜照片，左侧为实施例3所制微载体，右侧为Cytodex3；
图3是微载体培养Vero细胞接种48h后的显微镜照片，左侧为实施例3所制微载体，右侧为Cytodex3；
图4是微载体培养Vero细胞接种72h后的显微镜照片，左侧为实施例3所制微载体，右侧为Cytodex3；
图5是实施例3所制微载体与Cytodex3(CT3)培养Vero细胞的生长曲线；
图6是微载体培养Wish细胞接种2h后的显微镜照片，左侧为实施例4所制微载体，右侧为Cytodex3；
图7是微载体培养Wish细胞接种24h后的显微镜照片，左侧为实施例4所制微载体，右侧为Cytodex3；
图8是微载体培养Wish细胞接种48h后的显微镜照片，左侧为实施例4所制微载体，右侧为Cytodex3；
图9是微载体培养Wish细胞接种72h后的显微镜照片，左侧为实施例4所制微载体，右侧为Cytodex3；
图10是微载体培养L929细胞接种2h后的显微镜照片，左侧为实施例5所制微载体，右侧为Cytodex3；
图11是微载体培养L929细胞接种24h后的显微镜照片，左侧为实施例5所制微载体，右侧为Cytodex3；
图12是微载体培养L929细胞接种48h后的显微镜照片，左侧为实施例5所制微载体，右侧为Cytodex3；
图13是微载体培养L929细胞接种72h后的显微镜照片，左侧为实施例5所制微载体，右侧为Cytodex3。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1胶原蛋白覆层微载体的制备
选取粒径50μm-100μm魔芋葡甘聚糖微球，用砂芯漏斗清洗抽干，称取20g，置于三口瓶中，加入活化试剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚20mmol，硼氢化钠40mg，0.1M NaOH溶液40mL，于25℃下300rpm反应18h。反应完将微球清洗抽干，加入10mL pH=8的NaHCO3-Na2CO3缓冲液中，加入平均分子量为5,000的鱼明胶5g，于15℃下200rpm反应24h，偶联蛋白。然后将反应完的体系混匀后，加入100mL10℃的水中，再用pH=7的PBS漂洗两次。处理后的微球加入烧瓶中，再加入交联试剂丙二醛20mmol和PBS缓冲液40mL，65℃下搅拌反应0.5h，反应完后用砂芯漏斗清洗微球，保存于磷酸盐(PBS)缓冲液中，高压灭菌即得细胞培养用微载体。
实施例2胶原蛋白覆层微载体的制备
选取粒径100μm-160μm魔芋葡甘聚糖微球，用砂芯漏斗清洗抽取20g，置于三口瓶中，加入活化试剂双环氧化丁二烯0.1moL，硼氢化钠1g，0.5M NaOH溶液100mL，于65℃下50rpm反应0.5h。反应完将微球清洗抽干，加入80mL pH=10的NaHCO3-Na2CO3缓冲液中，加入平均分子量5,000的牛明胶5g，于40℃下300rpm反应5h，偶联蛋白。然后将反应完的体系混匀后，加入500mL5℃的去离子水中，再用pH=7.2的PBS漂洗两次。处理后的微球加入烧瓶中，再加入交联试剂戊二醛0.2mol和PBS缓冲液100mL，15℃搅拌反应24h，反应完用砂芯漏斗清洗微球，保存于PBS缓冲液中。高压灭菌即得细胞培养用微载体。
实施例3胶原蛋白覆层微载体的制备
选取粒径160μm-250μm魔芋葡甘聚糖微球，用砂芯漏斗清洗抽取20g，置于三口瓶中，加入活化试剂正丁基缩水甘油醚0.2mol，硼氢化钠10mg，1.5M KOH溶液20mL，于25℃下150rpm反应16h。反应完将微球清洗抽干，加入100mL pH=12的NaHCO3-Na2CO3缓冲液中，加入平均分子量10,000的猪明胶1g，于65℃下50rpm反应0.5h，偶联蛋白。然后将反应完的体系混匀后，滴加进入1L0℃的去离子水中，再用pH=7.4的PBS漂洗两次。处理后的微球加入烧瓶中，再加入交联试剂丁二醛50mmol和PBS缓冲液150mL，50℃搅拌反应5h，反应完用砂芯漏斗清洗微球，保存于PBS缓冲液中。高压灭菌即得细胞培养用微载体。
实施例4胶原蛋白覆层微载体的制备
选取粒径160μm-250μm魔芋微球，用砂芯漏斗清洗抽取20g，置于三口瓶中，加入活化试剂双环氧化丁二烯50mmol，硼氢化钠0.5g，2M NaOH溶液50mL，于30℃下150rpm反应10h。反应完将微球清洗抽干，加入50mL pH=9的NaHCO3-Na2CO3缓冲液中，加入平均分子量为20,000的鱼明胶10g，于30℃下150rpm反应18h，偶联蛋白。然后将反应完的体系混匀后，滴加进入2L2.5℃的去离子水中，再用pH=7.6的PBS漂洗两次。处理后的微球加入烧瓶中，再加入交联试剂碳化二亚胺0.1moL和PBS缓冲液200mL，30℃搅拌反应12h，反应完用砂芯漏斗清洗微球，保存于PBS缓冲液中。高压灭菌即得细胞培养用微载体。
实施例5胶原蛋白覆层微载体的制备
选取粒径250μm-300μm魔芋微球，用砂芯漏斗清洗抽取20g，置于三口瓶中，加入活化试剂烯丙基缩水甘油醚0.1mol，硼氢化钠0.2g，3M KOH溶液20mL，于15℃下150rpm反应24h。反应完将微球清洗抽干，加入80mL pH=8的NaHCO3-Na2CO3缓冲液中，加入平均分子量为50,000的猪明胶10g，于37℃下150rpm反应12h。然后将反应完的体系混匀后，滴加进入2L7℃的去离子水中，再用pH=8.0的PBS漂洗两次。处理后的微球加入烧瓶中，再加入交联试剂二异氰酸酯50mmol和PBS缓冲液100mL，40℃搅拌反应8h，反应完后用砂芯漏斗清洗微球，保存于PBS缓冲液中。高压灭菌即得细胞培养用微载体。
实施例6用微载体培养非洲绿猴肾细胞系（Vero细胞）
1、细胞培养
用非洲绿猴肾细胞系（Vero细胞）的培养效果来检验制备的微载体的性能，并与商品化的胶原蛋白覆层微载体(Cytodex3)作对照试验，方法如下：
首先将本发明实施例3制成的微载体与Cytodex3分别在磷酸盐（PBS）缓冲液中溶胀3h以上，用PBS缓冲液清洗至中性后再高压灭菌，置于4℃冰箱，接种前将微载体用含DMEM/M199培养基(含5%的胎牛血清，1%青-链霉素)洗涤两次。将浸泡后的微载体接种到硅化过的小培养瓶中。备好所用器皿，消化细胞，细胞计数，以培养液、介质、细胞的顺序加入到培养瓶中，总体积8mL；细胞量采用2.0×105cells/mL的密度接种，溶液中微载体浓度为2.0g/L。
2、细胞观察与计数
接种完后分别在2h、24h、48h、72h取样拍照，显微镜下观察细胞生长情况。图1～图4中显示为实施例3制备微载体及Cytodex3培养Vero细胞的显微镜照片。结果显示，接种2小时后细胞开始附着，培养24小时后细胞已贴壁生长；培养72小时后，微载体表面已全被细胞覆盖。
于24h、48h、72h、96h、120h、144h等各时间段取样，自然沉降，弃去上清液，加入等量的结晶紫溶液，混匀后在37℃下温浴1h，用血球计数板计算细胞核数。接种后在48h、96h、120h、144h、168h换液50mL。将所记录的数据整理绘制成细胞生长曲线，如图5所示为实施例3所制微载体的培养效果，实验表明，本发明的胶原蛋白覆层魔芋微载体适于Vero细胞贴壁生长，细胞计数显示细胞密度可达到2.13×106cells/mL，能实现细胞高密度培养。Vero细胞在本发明的微球表面贴附与生长的效果与Cytodex3相当。
实施例7偶联蛋白稳定性分析
将实施例3制备的微载体浸泡于PBS缓冲液中，分别于15天、1个月、3个月、6个月取上清液，用考马斯亮蓝染色法测蛋白浓度，结果显示，各时间段微载体上清液中无蛋白存留，这表明胶原蛋白在基质微球上覆层稳固，不会脱落。将放置6个月后的微载体灭菌后培养Vero细胞，培养144h后，细胞密度达2.10×106cells/mL，与新制微载体效果相同，说明蛋白覆层稳定。
实施例8人羊膜细胞（Wish细胞）微载体培养
利用实施例4所得微载体进行培养。微载体前期操作、接种密度与分析方法均参照实施例6，培养液为MEM培养基（含10%胎牛血清，1%青-链霉素）分别于各阶段取样，照相（图6～图9）和细胞计数。试验结果表明，本发明的微载体Wish细胞培养效果佳，细胞计数最高可达1.01×106cells/mL。同时使用Cytodex3为对照，结果表明，本发明的微载体培养Wish细胞效果与CT3相当。
实施例9小鼠成纤维细胞（L929细胞）微载体培养
利用实施例5所得微载体进行培养。微载体前期操作、接种密度与分析方法均参照实施例6，所用培养液与Wish细胞一致。分别于各阶段取样，照相（图10～图13）和细胞计数。实验结果表明，本发明的胶原蛋白包被微载体培养L929细胞细胞密度峰值为0.5×106cells/mL。培养效果与CT3相当。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (46)
1.一种胶原蛋白覆层微载体，其特征在于，所述微载体的基质为魔芋葡甘聚糖微球，胶原蛋白的覆层量为基质微球质量的1％-10％，覆层的胶原蛋白通过活化试剂与基质微球共价偶联；
其中，所述的胶原蛋白分子量为3,000-50,000，所述的活化试剂为1，4-丁二醇二缩水甘油醚、双环氧化丁二烯、正丁基缩水甘油醚、烯丙基缩水甘油醚或其混合物。
2.根据权利要求1所述的微载体，其特征在于，所述的基质微球的粒径为50-500μm。
3.根据权利要求2所述的微载体，其特征在于，所述的基质微球的粒径为100-300μm。
4.根据权利要求3所述的微载体，其特征在于，所述的基质微球的粒径为160-250μm。
5.根据权利要求1或2所述的微载体，其特征在于，所述的基质微球含水量为80％以上。
6.根据权利要求1或2所述的微载体，其特征在于，所述的胶原蛋白为猪明胶、鱼明胶、牛明胶或其混合物。
7.根据权利要求1或2所述的微载体，其特征在于，所述的胶原蛋白分子量为5,000-50,000。
8.根据权利要求7所述的微载体，其特征在于，所述的胶原蛋白分子量为5,000-20,000。
9.权利要求1-8任一项所述的微载体的制备方法，包括如下步骤：
a)在魔芋葡甘聚糖微球中加入活化试剂与催化剂，在碱性环境下进行活化反应，得到活化的魔芋葡甘聚糖微球；
b)将步骤a)得到的所述微球清洗抽干后，加入NaHCO3-Na2CO3缓冲液中，加入胶原蛋白，进行偶联反应；
c)将步骤b)反应完毕的体系混匀后，加入水中，胶原蛋白在微球表面覆层凝聚后，清洗微球；
d)将步骤c)处理好的微球加入反应容器中，再加入交联试剂与PBS缓冲液，搅拌使其反应，反应完毕清洗后即得所述的微载体产品；
步骤a)中所述的活化试剂为1，4-丁二醇二缩水甘油醚、双环氧化丁二烯、正丁基缩水甘油醚、烯丙基缩水甘油醚或其混合物，
所述胶原蛋白分子量为3,000-50,000，所述胶原蛋白浓度为0.01-0.5g/mL；
步骤c)中所述的水的加入量为5-100mL/g微球。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中所述活化剂的用量为1-10mmol/g微球。
11.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中所述的催化剂为硼氢化钠。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述的催化剂加入量为0.5-50mg/g微球。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述的催化剂加入量为0.5-25mg/g微球。
14.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中所述的碱性环境由阳离子为碱金属离子，阴离子为氢氧根离子的碱性溶液提供。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述的碱性环境由NaOH或KOH溶液提供。
16.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述碱性溶液浓度为0.1-3M。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述碱性溶液浓度为0.5-3M。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述碱性溶液浓度为0.5-2M。
19.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述的碱性溶液的加入量为0.5-5mL/g微球。
20.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中所述活化反应的活化温度为15-65℃。
21.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述活化反应的活化温度为25-65℃。
22.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，步骤a)中所述活化反应的反应时间为0.5-24h。
23.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述活化反应的反应时间为0.5-10h。
24.根据权利要求23所述的制备方法，其特征在于，所述活化反应的反应时间为3-6h。
25.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，步骤b)中所述的NaHCO3-Na2CO3缓冲液的pH为8-12。
26.根据权利要求25所述的制备方法，其特征在于，所述的NaHCO3-Na2CO3缓冲液的pH为9-12。
27.根据权利要求26所述的制备方法，其特征在于，所述的NaHCO3-Na2CO3缓冲液的pH为10-12。
28.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，步骤b)中所述偶联反应的反应温度为15-65℃。
29.根据权利要求28所述的制备方法，其特征在于，所述偶联反应的反应温度为30-65℃。
30.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，步骤b)中所述偶联反应的反应时间为0.5-24h。
31.根据权利要求30所述的制备方法，其特征在于，所述偶联反应的时间为0.5-10h。
32.根据权利要求31所述的制备方法，其特征在于，所述偶联反应的时间为3-6h。
33.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，步骤c)中所述的水为0-10℃的水。
34.根据权利要求33所述的制备方法，其特征在于，所述的水为0-10℃的去离子水。
35.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，步骤d)中所述的交联试剂为双醛基类、双环氧类、二亚胺类、叠氮类分子或其混合物。
36.根据权利要求35所述的制备方法，其特征在于，所述的交联试剂为丙二醛、丁二醛、碳化二亚胺、二异氰酸酯、京尼平、戊二醛或叠氮二苯基磷或其混合物。
37.根据权利要求36所述的制备方法，其特征在于，所述的交联试剂为丁二醛、碳化二亚胺、二异氰酸酯或其混合物。
38.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，步骤d)中所述的交联试剂的量为1-10mmol/g微球。
39.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，步骤d)中所述的交联反应温度为15-65℃，交联反应时间为0.5-24h。
40.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，步骤d)中所述的PBS缓冲液的pH为7-8，用量为2-10mL/g微球。
41.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，所述的胶原蛋白为猪明胶、鱼明胶、牛明胶或其混合物。
42.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白浓度为0.04-0.3g/mL。
43.根据权利要求42所述的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白浓度为0.05-0.1g/mL。
44.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白分子量为5,000-50,000。
45.根据权利要求44所述的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白分子量为5,000-20,000。
46.根据权利要求1-8任一项所述的微载体的用途，其特征在于，所述的微载体用于动物细胞培养。
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