CN106567252B - 纤维载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种细胞培养用纤维载体，并且还提供了该细胞培养用纤维载体的制备方法以及应用，该细胞培养用纤维载体包括聚合物纤维和覆盖在所述聚合物纤维表面的胶原覆层，所述聚合物纤维的直径为15～30μm，所述胶原覆层的厚度为1.5nm～300nm。该细胞培养用纤维载体空隙大、机械强度高，具有良好的亲水性，是一种具有优良性能的细胞培养用纤维载体。本发明提供的细胞培养用纤维载体制备方法步骤简单，对仪器设备要求不高，适合于各种规模的生产。

Description

纤维载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种纤维载体及其制备方法和应用。
背景技术
微载体培养目前主要运用于动物细胞大规模培养技术中。由于细胞具有贴壁生长的特点，而微载体能够增加细胞贴附生长的面积，因此广泛被运用于各类细胞及细胞产品的生产，包括酶、生长因子、疫苗和抗体等生物制品。
目前国内外市场上所使用的微载体绝大多数都是微球形式。根据其带有的不同基团的葡聚糖交联而成的大分子，微载体主要分为两类：一类是以带正电荷的化合物二乙基氨基乙基(DEAE)作为配基，用于一般的动物细胞培养，如法玛西亚(Pharmacia)公司开发的的Cytodex 1；另一类微载体用猪皮变性胶原作为配基，通过环氧氯丙烷共价交联在葡聚糖微球表面形成一层明胶膜，为细胞的贴壁生长提供附着，从而增加细胞附着和增殖，例如法玛西亚(Pharmacia)公司开发的Cytodex 3。其它形式的微载体还包括混合材料制备的微载体，如丝素蛋白和壳聚糖大孔微载体，壳聚糖和明胶混合微载体等。但是微球微载体本身也存在一些不足，例如实心微球微载体，细胞只能在其表面贴附生长，缺乏多孔结构，细胞密集时不利于营养物质供给及废物的清除；而多孔微球微载体虽然有较多的孔隙，但是当细胞密度较高时，孔隙容易被堵塞，最后也导致出现细胞养分供应不足的情况。
因而，研究制备具有较大比表面积、较大空隙的微载体是解决现有商业化微球微载体不足的一个重要出路。纤维载体由于其由多根纤维交叉组成，具有较大的比表面积，且孔隙率较高，空隙较大，能够保证营养物质的充分供应，为细胞提供一个三维培养环境。
然而目前国内外研究供细胞培养用的纤维状载体甚少。比较热门的纤维状生物材料主要为静电纺丝材料，且主要应用于组织工程支架上，作为反应器载体的应用则甚少报道。该材料的优点在于具有纳米微细结构，可以简单的模仿细胞外基质纤维分布，存在多孔性，有利于营养物质的供给及细胞代谢废物的排除。但是，由于其空隙较小，细胞繁殖达到一定规模后空隙会被完全覆盖，还是会限制细胞营养物质的供给及废物的排除。另外，其机械强度较弱，若置于细胞培养反应器中容易变形，不利于取样观察，且其易于漂浮在培养液顶部，造成反应器中培养液顶部及底部消耗不平衡。
发明内容
基于此，有必要针对存在空隙小、机械强度低和不亲水等问题的纤维载体，提供一种细胞培养用纤维载体及其制备方法和应用。
为实现该目的，本发明提供了一种细胞培养用纤维载体，
该细胞培养用纤维载体包括聚合物纤维和覆盖在所述聚合物纤维表面的胶原覆层，所述聚合物纤维的直径为15～30μm，所述胶原覆层的厚度为1.5nm～300nm。
在其中一个实施例中，所述胶原覆层由外而内依次包括封闭层、胶原偶联层和联接层。
在其中一个实施例中，所述联接层由戊二醛和氨基硅烷形成。
在其中一个实施例中，所述氨基硅烷选自3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧基硅烷、N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷或N-氨乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述胶原偶联层由具有三螺旋结构的Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和Ⅲ型胶原中的至少一种所形成。
在其中一个实施例中，所述封闭层由赖氨酸、精氨酸或甘氨酸中的至少一种形成。
在其中一个实施例中，所述聚合物纤维交织形成片状结构或布状结构。
在其中一个实施例中，所述聚合物纤维由聚丙烯、聚乙烯、聚酯或聚酰胺中的至少一种形成。
在其中一个实施例中，形成所述聚合物纤维的原料的纯度为医用级。
本发明还提供了一种细胞培养用纤维载体制备方法，制备上述细胞培养用纤维载体的方法包括以下步骤：
由聚合物纤维交织形成片状结构或布状结构的纤维片；
对所述纤维片进行清洗和干燥；
对干燥后的所述纤维片制备联接层；
对制备了所述联接层的纤维片进行胶原偶联；
对进行胶原偶联后的所述纤维片进行封闭，得到所述细胞培养用纤维载体。
在其中一个实施例中，对所述纤维片进行清洗用的液体为双蒸水或超纯水；清洗方式为超声波清洗。
在其中一个实施例中，还包括用5～30％过氧化氢对所述纤维片进行浸泡的工序。
在其中一个实施例中，对所述纤维片进行干燥的方式为在60～90℃的条件下烘干。
在其中一个实施例中，所述联接层的制备方法为：
将干燥后的所述纤维片浸泡在溶解了氨基硅烷的有机溶剂中进行第一次活化处理；所述氨基硅烷在有机溶剂中的体积百分数为1～10％；将第一次活化处理的所述纤维片浸泡在戊二醛中进行第二次活化处理；所述戊二醛的体积百分数为0.5～5％，浸泡温度为40～60℃。
在其中一个实施例中，所述第一次活化处理之后和第二次活化处理之后还包括对处理过的所述纤维片进行清洗和干燥的工序。
在其中一个实施例中，所述干燥方式为自然晾干、烘干或氮气吹干。
在其中一个实施例中，所述有机溶剂选自甲苯、乙苯、甲醇、乙醇或异丙醇中的一种。
在其中一个实施例中，进行胶原偶联用的胶原溶液为pH值为7.5～8.0的、浓度为0.1～1％的胶原乙酸溶液；所述乙酸的浓度为0.01～0.2mol/L。
在其中一个实施例中，所述胶原偶联的进行步骤为将具备联接层的所述纤维片浸泡在所述胶原乙酸溶液中4～48h。
在其中一个实施例中，进行封闭用的封闭剂选自赖氨酸、精氨酸或甘氨酸中的一种；所述封闭剂的浓度为5～20mg/ml。
在其中一个实施例中，所述封闭的进行步骤为将具备胶原层的所述纤维片浸泡在所述封闭剂中2～3h，然后进行清洗和干燥。
在其中一个实施例中，获得所述纤维载体之后，将所述纤维载体在0～6℃下保存，并且进行辐照灭菌处理。
在其中一个实施例中，所述辐照灭菌处理的辐射源采用Co60同位素。
本发明还提供了一种动物细胞的培养方法，该培养方法包括下列步骤：
采用生物反应器进行动物细胞的培养，所述生物反应器采用上述的纤维载体。
在其中一个实施例中，采用生物反应器进行动物细胞的培养，所述生物反应器采用的细胞培养载体通过上述的纤维载体制备方法制备得到。
与现有技术相比，本发明提供的纤维载体空隙大，即使是高密度生长的细胞也难以将其堵塞；机械强度高，在反应器内部不易变形。此外，纤维载体的亲水性大大提高，可完全沉浸在培养液当中，并且其由多根纤维多层面交叉组成，能够提供较大的比表面积，而纤维直径与大部分上皮样贴壁细胞接近，也有利于细胞在纤维上大量的贴附生长且互相迁移聚集，因而该材料是一种具有优良性能的细胞培养用纤维载体。本发明提供的制备方法步骤简单，对仪器设备要求不高，适合于各种规模的生产。
附图说明
图1为本发明制备方法流程图；
图2为未处理聚丙烯纤维片的XPS分析图谱；
图3为纤维片经氨基硅烷修饰后XPS分析图谱；
图4为纤维片经胶原涂覆后的XPS分析图谱；
图5为纤维片未处理与胶原涂覆后FTIR对比图谱；
图6为未经胶原涂覆的纤维片SEM图；
图7为另一未经胶原涂覆的纤维片SEM图；
图8为HepG2细胞与纤维载体共培养第7天时SEM图；
图9为HepG2细胞与纤维载体共培养第7天时另一SEM图；
图10为HepG2细胞与纤维载体共培养第4天时死活细胞荧光染色激光图谱；
图11为HepG2细胞与纤维载体共培养第4天时死活细胞另一荧光染色激光图谱。
具体实施方式
下面结合附图和示例性实施例对本发明作进一步地阐述。
本发明的细胞培养用纤维载体包括聚合物纤维和胶原覆层，胶原覆层覆盖在聚合物纤维表面，其中聚合物纤维的直径为15～30μm，而胶原覆层的厚度为1.5nm～300nm。另外，从结构上来表征该细胞培养用纤维载体，特别是胶原覆层，则该胶原覆层由外而内依次包括封闭层、胶原偶联层和联接层。其中，联接层由戊二醛和氨基硅烷形成。优选的，氨基硅烷选自3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧基硅烷、N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷或N-氨乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷中的一种或者几种混合物。
优选的，细胞培养用纤维载体中的胶原偶联层由具有三螺旋结构的Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和Ⅲ型胶原中的至少一种所形成。
优选的，细胞培养用纤维载体中的封闭层由赖氨酸、精氨酸或者甘氨酸中的一种或者几种形成。
优选的，细胞培养用纤维载体的原材料聚合物纤维可以选择具备特定形状，以便于细胞培养用纤维载体的制备以及后期的应用，因此聚合物纤维交织形成片状结构或布状结构。优选的，从材质上选择，聚合物纤维选自聚丙烯、聚乙烯、聚酯或聚酰胺中的至少一种，而且其纯度最好为医用级。
所述细胞培养用纤维载体的制备方法，如图1所示，该制备方法包括：
S100：将聚合物纤维交织形成片状结构或布状结构的纤维片。
为了便于细胞培养用纤维载体的制备以及保证其在细胞培养中的方便应用，首先将其制备成片状或者布状结构的纤维片。
S200：对所述纤维片进行清洗和干燥。
这一步骤是进行细胞培养用纤维载体制备的必要准备步骤，优选的，清洗所用液体为双蒸水甚至是超纯水，而清洗方式采用超声波清洗。优选的，还需要对清洗前的纤维片进行浸泡，进一步排除细菌微生物等杂质对纤维片的干扰，浸泡处理为在过氧化氢溶液中浸泡，并且浸泡在60～90℃的温度下进行，浸泡时间为2～4h。优选的，对清洗后的纤维的干燥处理则在60～90℃的环境中进行。步骤S200是为了保证纤维片在进行下一步处理之前保持高清洁度。
S300：对干燥后的所述纤维片制备联接层。
优选的，联接层的制备方法具体为：首先将干燥后的纤维片浸泡在加入溶解了氨基硅烷的有机溶剂中进行第一次活化处理，氨基硅烷在有机溶剂的体积百分数为1～10％；其次，将第一次活化处理的纤维片浸泡在戊二醛中，进行第二次活化处理，其中戊二醛的体积百分数为0.5～5％，浸泡温度为40～60℃。优选的，在第一次活化处理之后和第二次活化处理之后还包括对各自所处理过的纤维片进行清洗和干燥的工序，干燥的方式为自然晾干、烘干或者用氮气吹干。优选的，溶解氨基硅烷的有机溶剂选自甲苯、乙苯、甲醇、乙醇或异丙醇中的一种。
S400：对制备了所述联接层的纤维片进行胶原偶联。
优选的，进行胶原偶联用的胶原溶液为pH值7.5～8.0的、浓度为0.1～1％的胶原乙酸溶液，其中乙酸的浓度为0.01～0.2mol/L。优选的，胶原偶联的进行步骤为将具备联接层的纤维片浸泡在胶原乙酸溶液中4～48h。
S500：对进行胶原偶联后的所述纤维片进行封闭，得到所述细胞培养用纤维载体。
优选的，进行封闭用的封闭剂选自赖氨酸、精氨酸或甘氨酸中的一种，封闭剂的浓度为5～20mg/ml。具体地，封闭的进行步骤为将具备胶原层的纤维片浸泡在封闭剂中2～3h，然后进行清洗和干燥。
优选的，在步骤S500之后还包括步骤：将所述细胞培养用纤维载体在0～6℃下保存，并且进行辐照灭菌处理。优选的，辐照灭菌处理的辐射源采用Co60同位素。
一种动物细胞的培养方法，具体为采用生物细胞培养常用的设备进行，在合适的生物反应器中进行动物细胞的培养，而生物反应器选择上述的细胞培养用纤维载体。其中生物反应器的制备方法就采取上述细胞培养用纤维载体制备方法制备得到。
本发明所提供的细胞培养用纤维载体的表面均匀覆盖胶原，二者结合牢固，使得纤维载体具有良好的亲水性，可以为细胞生长提供充足的营养物质。该纤维载体具有较大的空隙，能够良好地满足细胞的高密度生长需求，能够实现较优的细胞培养效果。另外，本发明提供的纤维载体制备方法十分简单，成本低廉并且周期短，有利于工业化生产。
以下为具体实施例。
实施例一
细胞培养用纤维载体的制备
预处理：选取纤维直径25±2μm的聚丙烯聚合物纤维作为原材料，使其交织形成大小2.5±0.2cm×0.5±0.2cm的聚丙烯无纺布纤维片30片，将30片纤维片置于50ml超纯水中超声清洗10min，取出清洗后的纤维片并用氮气吹干。再将其置于20ml的体积分数为30％的过氧化氢溶液中浸泡2h，浸泡温度为90℃，再用超纯水超声波清洗浸泡过的纤维片20min，90℃下干燥3h。
氨基硅烷处理：将预处理得到的纤维片加入含3-氨丙基三乙氧基硅烷5％的甲苯溶液中，反应后取出置于甲苯溶液中超声波清洗10min，再用氮气吹干。
戊二醛偶联：将用氨基硅烷处理得到的纤维片浸泡在2.5％戊二醛水溶液中，在40℃下浸泡处理3h，再用超纯水超声波清洗后在90℃的干燥箱中干燥2h。
胶原偶联：将Ⅰ型胶原溶于0.01mol/L乙酸溶液中，配制成0.5％胶原乙酸溶液，逐渐滴加1mol/L NaOH溶液调胶原乙酸溶液的pH值到8.0。将戊二醛偶联处理过的纤维片置于上述胶原乙酸溶液中反应24h。之后，将反应后的纤维片采用超纯水洗涤。
封闭：将胶原偶联处理后的纤维片置于10mg/mL的赖氨酸溶液中浸泡2h，然后采用超纯水洗涤，再用氮气吹干，在4℃下保存，采用Co60辐射灭菌即得细胞培养用纤维载体。
实施例二
细胞培养用纤维载体的制备
预处理：选取纤维直径20±2μm的聚丙烯聚合物纤维作为原材料，使其交织形成大小2.5±0.2cm×0.5±0.2cm的聚丙烯无纺布纤维片30片，将纤维片置于50ml超纯水中超声清洗20min，取出清洗后的纤维片并用氮气吹干。再将其置于20ml的体积分数为30％的过氧化氢溶液中浸泡3h，浸泡温度为90℃，再用超纯水超声波清洗浸泡过的纤维片30min，90℃下干燥4h。
氨基硅烷处理：将预处理得到的纤维片加入含3-氨丙基三甲氧基硅烷5％的甲苯溶液中，反应后取出置于甲苯溶液中超声波清洗20min，再用氮气吹干。
戊二醛偶联：将用氨基硅烷处理得到的纤维片浸泡在2.5％戊二醛水溶液中，在40℃下浸泡处理4h，再用超纯水超声波清洗后在90℃的干燥箱中干燥3h。
胶原偶联：将Ⅱ型胶原溶于0.01mol/L乙酸溶液中，配制成0.5％胶原乙酸溶液，逐渐滴加1mol/L NaOH溶液调胶原乙酸溶液的pH值到7.5。将戊二醛偶联处理过的纤维片置于上述胶原乙酸溶液中反应48h。之后，将反应后的纤维片采用超纯水洗涤。
封闭：将胶原偶联处理后的纤维片置于10mg/mL的精氨酸溶液中浸泡3h，然后采用超纯水洗涤，再用氮气吹干，在2℃下保存，采用Co60辐射灭菌即得细胞培养用纤维载体。
实施例三
细胞培养用纤维载体的制备
预处理：选取纤维直径20±2μm的聚丙烯聚合物纤维作为原材料，使其交织形成大小2.5±0.2cm×0.5±0.2cm的聚丙烯无纺布纤维片30片，将纤维片置于50ml超纯水中超声清洗20min，取出清洗后的纤维片并用氮气吹干。再将其置于20ml的体积分数为30％的过氧化氢溶液中浸泡3h，浸泡温度为90℃，再用超纯水超声波清洗浸泡过的纤维片30min，90℃下干燥3h。
氨基硅烷处理：将预处理得到的纤维片加入含N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷5％的甲醇溶液中，反应后取出置于甲醇溶液中超声波清洗20min，晾干。
戊二醛偶联：将用氨基硅烷处理得到的纤维片浸泡在2.5％戊二醛水溶液中，在40℃下浸泡处理3h，再用超纯水超声波清洗后在90℃的干燥箱中干燥2h。
胶原偶联：将Ⅲ型胶原溶于0.01mol/L乙酸溶液中，配制成0.5％胶原乙酸溶液，逐渐滴加1mol/L NaOH溶液调胶原乙酸溶液的pH值到7.8。将戊二醛偶联处理过的纤维片置于上述胶原乙酸溶液中反应36h。之后，将反应后的纤维片采用超纯水洗涤。
封闭：将胶原偶联处理后的纤维片置于10mg/mL的精氨酸溶液中浸泡3h，然后采用超纯水洗涤，再用氮气吹干，在0℃下保存，采用Co60辐射灭菌即得细胞培养用纤维载体。
实施例四
细胞培养用纤维载体的制备
预处理：选取纤维直径20±2μm的聚乙烯聚合物纤维作为原材料，使其交织形成大小2.5±0.2cm×0.5±0.2cm的聚乙烯无纺布纤维片30片，将纤维片置于50ml超纯水中超声清洗20min，取出清洗后的纤维片并用氮气吹干。再将其置于20ml的体积分数为5％的过氧化氢溶液中浸泡4h，浸泡温度为60℃，再用超纯水超声波清洗浸泡过的纤维片30min，80℃下干燥3h。
氨基硅烷处理：将预处理得到的纤维片加入含N-氨乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷1％的甲醇溶液中，反应后取出置于甲醇溶液中超声波清洗30min，晾干。
戊二醛偶联：将用氨基硅烷处理得到的纤维片浸泡在0.5％戊二醛水溶液中，在40℃下浸泡处理3h，再用超纯水超声波清洗后在90℃的干燥箱中干燥2h。
胶原偶联：将Ⅲ型胶原溶于0.2mol/L乙酸溶液中，配制成0.8％胶原乙酸溶液，逐渐滴加1mol/L NaOH溶液调胶原乙酸溶液的pH值到7.5。将戊二醛偶联处理过的纤维片置于上述胶原乙酸溶液中反应24h。之后，将反应后的纤维片采用超纯水洗涤。
封闭：将胶原偶联处理后的纤维片置于20mg/mL的精氨酸溶液中浸泡1h，然后采用超纯水洗涤，再用氮气吹干，在0℃下保存，采用Co60辐射灭菌即得细胞培养用微载体。
实施例五
细胞培养用纤维载体的制备
预处理：选取纤维直径20±2μm的聚酰胺聚合物纤维作为原材料，使其交织形成大小2.5±0.2cm×0.5±0.2cm的聚酰胺无纺布纤维片30片，将纤维片置于50ml蒸馏水中超声清洗30min，取出清洗后的纤维片并用氮气吹干。再将其置于20ml的体积分数为20％的过氧化氢溶液中浸泡3h，浸泡温度为60℃，再用超纯水超声波清洗浸泡过的纤维片40min，80℃下干燥3h。
氨基硅烷处理：将预处理得到的纤维片加入含N-氨乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷10％的乙醇溶液中，反应后取出置于乙醇溶液中超声波清洗20min，晾干。
戊二醛偶联：将用氨基硅烷处理得到的纤维片浸泡在5％戊二醛水溶液中，在50℃下浸泡处理3h，再用蒸馏水超声波清洗后用氮气吹干。
胶原偶联：将Ⅰ型胶原溶于0.01mol/L乙酸溶液中，配制成0.1％胶原乙酸溶液，逐渐滴加1mol/L KOH溶液调胶原乙酸溶液的pH值到8。将戊二醛偶联处理过的纤维片置于上述胶原乙酸溶液中反应48h。之后，将反应后的纤维片采用超纯水洗涤。
封闭：将胶原偶联处理后的纤维片置于5mg/mL的甘氨酸溶液中浸泡4h，然后采用超纯水洗涤，再用氮气吹干，在6℃下保存，采用Co60辐射灭菌即得细胞培养用纤维载体。
实施例六
细胞培养用纤维载体的制备
预处理：选取纤维直径20±2μm的聚酯聚合物纤维作为原材料，使其交织形成大小2.5±0.2cm×0.5±0.2cm的聚酯无纺布纤维片30片，将纤维片置于50ml蒸馏水中超声清洗30min，取出清洗后的纤维片并用氮气吹干。再将其置于20ml的体积分数为15％的过氧化氢溶液中浸泡4h，浸泡温度为80℃，再用超纯水超声波清洗浸泡过的纤维片40min，80℃下干燥3h。
氨基硅烷处理：将预处理得到的纤维片加入含N-氨乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷和3-氨丙基三乙氧基硅烷8％的异丙醇溶液中，其中N-氨乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷和3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量比为1:1，反应后取出置于异丙醇溶液中超声波清洗30min，采用氮气吹干。
戊二醛偶联：将用氨基硅烷处理得到的纤维片浸泡在3％戊二醛水溶液中，在50℃下浸泡处理4h，再用超纯水超声波清洗后用氮气吹干。
胶原偶联：将Ⅰ型胶原溶于0.2mol/L乙酸溶液中，配制成1％胶原乙酸溶液，逐渐滴加1mol/L NaOH溶液调胶原乙酸溶液的pH值到8。将戊二醛偶联处理过的纤维片置于上述胶原乙酸溶液中反应4h。之后，将反应后的纤维片采用超纯水洗涤。
封闭：将胶原偶联处理后的纤维片置于15mg/mL的甘氨酸溶液中浸泡3h，然后采用超纯水洗涤，再用氮气吹干，在3℃下保存，采用Co60辐射灭菌即得细胞培养用纤维载体。
实施例七
将细胞培养用纤维载体进行相关测试，并将其用于动物细胞培养试验，结果显示：
将制备过程中的纤维片以及所得细胞培养用纤维载体进行X射线光电子能谱(XPS)分析和傅里叶红外(FTIR)分析，分别得到如图2～4和图5所示的XPS图谱和FTIR图谱。将未经胶原涂覆的细胞培养用纤维载体在扫描电镜(SEM)下观察，得到如图6～7所示的图像。其中，图2为未处理聚丙烯纤维片的XPS图谱分析，提示未处理纤维片只含有碳元素。图3为纤维片经氨基硅烷修饰后的XPS分析图谱，提示除了碳元素外，还检测出氧、氮、硅元素，证明氨基硅烷成功地附着在纤维片上。图3为纤维片进一步进行胶原涂覆后的XPS分析图谱，可见氮元素比例明显升高，证明胶原成功覆盖在纤维片上。图5为未处理纤维片与胶原涂覆后纤维片对比的FTIR谱图，曲线1代表胶原覆层的纤维片，曲线2代表未处理的纤维片，两者有明显的差异，箭头A所示为胶原上酰胺Ⅰ带的C＝O伸缩振动吸收峰1660cm-1，箭头B所示为酰胺Ⅱ带的N-H弯曲振动吸收峰1550cm-1，再加上1450～1250cm-1附近的吸收峰，表明了胶原的3股螺旋结构的完整性；另外，箭头C所示胶原的N-H伸缩振动位于3340cm-1说明了肽链间氢键的存在。图6和图7分别为未经胶原涂覆的纤维片扫描电镜图，可见纤维片各纤维交叉连接，构成多层网状多孔结构，细胞能够通过纤维迁移生长，且孔与孔之间互相连通，有利于内部的物质交换。
将本发明的细胞培养用纤维载体进行Co60灭菌后，将细胞培养用纤维载体加入6孔培养板中，然后滴加肝细胞HepG2悬液，将HepG2细胞与上述细胞培养用纤维载体材料共培养，隔日换液，换液时观察肝细胞在材料上的贴附、增殖及细胞形态变化等生长情况。图8和图9显示HepG2细胞与细胞培养用纤维载体共培养第7天时在扫描电镜下观察到的图像，可见细胞呈梭形或多角形，各纤维层面均有大量细胞贴附生长，且分泌较多的细胞外基质，并可见细胞聚集的团块。图10和图11显示HepG2细胞与细胞培养用纤维载体共培养第4天时死活细胞荧光染色激光共聚焦显微镜下观察到的图像，可见细胞在细胞培养用纤维载体上贴附生长，具有良好的生物活性，在4天培养周期内未见有明显死细胞。
虽然上面已经示出了本发明的一些示例性实施例，但是本领域的技术人员将理解，在不脱离本发明的原理或精神的情况下，可以对这些示例性实施例做出改变，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (22)

1.一种细胞培养用纤维载体，该纤维载体包括聚合物纤维和覆盖在所述聚合物纤维表面的胶原覆层，所述聚合物纤维的直径为15～30μm，所述胶原覆层的厚度为1.5nm～300nm，所述聚合物纤维交织形成片状结构或布状结构；所述胶原覆层由外而内依次包括封闭层、胶原偶联层和联接层，所述联接层由戊二醛和氨基硅烷形成。
2.根据权利要求1所述的细胞培养用纤维载体，其特征在于，所述氨基硅烷选自3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧基硅烷、N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷或N-氨乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的细胞培养用纤维载体，其特征在于，所述胶原偶联层由具有三螺旋结构的Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和Ⅲ型胶原中的至少一种所形成。
4.根据权利要求1所述的细胞培养用纤维载体，其特征在于，所述封闭层由赖氨酸、精氨酸或甘氨酸中的至少一种形成。
5.根据权利要求1所述的细胞培养用纤维载体，其特征在于，所述聚合物纤维由聚丙烯、聚乙烯、聚酯或聚酰胺中的至少一种形成。
6.根据权利要求5所述的细胞培养用纤维载体，其特征在于，形成所述聚合物纤维的原料的纯度为医用级。
7.一种纤维载体制备方法，其特征在于，制备如权利要求1～6任意一项所述的细胞培养用纤维载体，其包括以下步骤：
由聚合物纤维交织形成片状结构或布状结构的纤维片；
对所述纤维片进行清洗和干燥；
对干燥后的所述纤维片制备联接层；
对制备了所述联接层的纤维片进行胶原偶联；
对进行胶原偶联后的所述纤维片进行封闭，得到所述纤维载体。
8.根据权利要求7所述的细胞培养用纤维载体制备方法，其特征在于，对所述纤维片进行清洗用的液体为双蒸水或超纯水；清洗方式为超声波清洗。
9.根据权利要求8所述的细胞培养用纤维载体制备方法，其特征在于，还包括用5～30％过氧化氢对所述纤维片进行浸泡的工序。
10.根据权利要求8所述的细胞培养用纤维载体制备方法，其特征在于，对所述纤维片进行干燥的方式为在60～90℃的条件下烘干。
11.根据权利要求7所述的细胞培养用纤维载体制备方法，其特征在于，所述联接层的制备方法为：
将干燥后的所述纤维片浸泡在溶解了氨基硅烷的有机溶剂中进行第一次活化处理；所述氨基硅烷在有机溶剂中的体积百分数为1～10％；
将第一次活化处理的所述纤维片浸泡在戊二醛中进行第二次活化处理；所述戊二醛的体积百分数为0.5～5％，浸泡温度为40～60℃。
12.根据权利要求11所述的细胞培养用纤维载体的制备方法，其特征在于，所述第一次活化处理之后和第二次活化处理之后还包括对处理过的所述纤维片进行清洗和干燥的工序。
13.根据权利要求12所述的细胞培养用纤维载体的制备方法，其特征在于，所述干燥方式为自然晾干、烘干或氮气吹干。
14.根据权利要求11所述的细胞培养用纤维载体制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自甲苯、乙苯、甲醇、乙醇或异丙醇中的一种。
15.根据权利要求7所述的细胞培养用纤维载体制备方法，其特征在于，进行胶原偶联用的胶原溶液为pH值为7.5～8.0的、浓度为0.1～1％的胶原乙酸溶液；所述乙酸的浓度为0.01～0.2mol/L。
16.根据权利要求15所述的细胞培养用纤维载体的制备方法，其特征在于，所述胶原偶联的进行步骤为将具备联接层的所述纤维片浸泡在所述胶原乙酸溶液中4～48h。
17.根据权利要求7所述的细胞培养用纤维载体制备方法，其特征在于，进行封闭用的封闭剂选自赖氨酸、精氨酸或甘氨酸中的一种；所述封闭剂的浓度为5～20mg/ml。
18.根据权利要求17所述的细胞培养用纤维载体制备方法，其特征在于，所述封闭的进行步骤为将具备胶原层的所述纤维片浸泡在所述封闭剂中2～3h，然后进行清洗和干燥。
19.根据权利要求7所述的细胞培养用纤维载体制备方法，其特征在于，获得所述纤维载体之后，将所述纤维载体在0～6℃下保存，并且进行辐照灭菌处理。
20.根据权利要求19所述的细胞培养用纤维载体制备方法，其特征在于，所述辐照灭菌处理的辐射源采用Co60同位素。
21.一种动物细胞培养方法，其特征在于，采用生物反应器进行动物细胞的培养，所述生物反应器采用如权利要求1～6任意一项所述的细胞培养用纤维载体。
22.一种动物细胞培养方法，其特征在于，采用生物反应器进行动物细胞的培养，所述生物反应器采用的细胞培养载体通过如权利要求7～20任意一项所述的细胞培养用纤维载体制备方法制备得到。
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