CN113123120B - 一种可耐高温灭菌的pet细胞载体的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞培养负载材料技术领域，具体涉及一种可耐高温灭菌的PET细胞载体的制备方法及其应用，本发明首先利用热处理工艺使PET结晶充分，再经溶液氧化法附着高吸附性的聚多巴胺颗粒，最后使用京尼平作为偶联剂固定明胶大分子后制备得到一种PET细胞载体。该载体具备良好的热稳定性，可耐受常规高温高压灭菌且保持良好的机械性能和细胞相容性；同时，该载体具有疏松多孔结构，可为细胞提供三维的生长空间，可容纳大量细胞生长，在各类常用的培养装置中均可使用，尤其适合在必须整体封装高温灭菌的大型生物反应器中，作为支持细胞生长的固定床填料使用；此外，本发明制备工艺简单，使用简单灵活，适用性广。

Description

一种可耐高温灭菌的PET细胞载体的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于细胞培养负载材料技术领域，具体涉及一种可耐高温灭菌的PET细胞载体的制备方法及其应用。
背景技术
细胞培养是指在合适的培养条件下，动物细胞离体生长和增殖，并保持其特征和功能的技术。来自于动物实体组织的大多数细胞需要贴壁单层生长，只要它们没有转化为非贴壁依赖性的，必须贴附在合适的固体介质上并铺展，才能开始生长，这个固体介质即指本领域技术人员常说的细胞培养载体。
传统的细胞培养是使用细胞培养皿进行培养，培养皿经过处理适于细胞贴附和生长，一个传统的培养皿提供了78.52cm2并可以可支持106-107个细胞贴附生长。随后，人们开始使用细胞转瓶，滚瓶、以及中空纤维等装置进行细胞培养。但此种方法工艺劳动强度大，细胞产量低，产品批间差异大，且容易造成污染，耗时耗力，并不能满足现今社会上对细胞产物大批量培养的需求。
目前，随着生物制造、疫苗生产、细胞治疗和组织工程等技术领域突飞猛进的发展，对大规模细胞培养技术的需求日益增加。工程化细胞生产中一般使用的细胞培养技术包括转瓶培养、微载体培养、生物反应器培养等。其中生物反应器培养技术可用于模拟细胞体内生长微环境，为细胞生长提供营养物质、物理环境和化学环境，并可进行实时监控和程序化管理，从而实现细胞体外大量扩增，展现出极大的应用潜力。但是生物反应器设备结构复杂，体积大，元件多，包含精密传感元件和控制原件，一般只能采用湿热法进行高温灭菌，而无法进行辐照灭菌或环氧乙烷灭菌。
但目前用于生物反应器的细胞培养载体普遍存在热稳定性差，机械性能不好等问题，导致其不能与生物反应器一起进行高温灭菌，极大的增加了细胞培养的操作复杂性。因此，开发可以与反应器设备整体封装并高温灭菌的细胞负载材料，对生物反应器的应用有非常重要的意义。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种可耐高温灭菌的PET细胞载体的制备方法，制备得到的PET细胞载体具备良好的热稳定性，可耐受常规高温高压灭菌且保持良好的机械性能和细胞相容性，该载体具有疏松多孔结构，利于细胞的黏附，可容纳大量细胞生长，可应用于各类常用的细胞培养装置，特别是必须整体封装高温灭菌的大型生物反应器。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供了一种可耐高温灭菌的PET细胞载体的制备方法，包括以下步骤：
S1、在低氧或无氧环境下，对聚对苯二甲酸已二酯(PET)纤维材料进行热处理，使其结晶充分；
S2、利用溶液氧化法在热处理后的PET纤维材料表面附着聚多巴胺颗粒，引入氨基反应位点；PET海绵具有多孔、高比表面积的特性，而聚多巴胺颗粒具备很强的吸附能力，从而可以牢固附着于PET海绵纤维上。
S3、通过京尼平的偶联作用，将明胶大分子固定在步骤S2的PET纤维材料表面，制备得到PET细胞载体。
优选地，所述热处理为：在低氧或无氧环境下，将PET纤维材料油浴加热至130-150℃的结晶温度热处理2-4h。PET海绵材料为纤维结构，工业加工过程中有较高的结晶，但由于加工过程冷却时间较快，结晶不充分，材料的热稳定性较差，在PET玻璃化温度(80℃)以上会出现一定程度的软化，无法制备体积较大的培养材料。本发明将PET海绵材料加热至其冷结晶温度附近进行热处理，促使PET海绵中的聚合物结晶进一步完善，提高材料的热稳定性能和力学性能。
具体地，所述热处理为：在低氧或无氧环境下，将PET纤维材料油浴加热至140℃的结晶温度热处理3h。
优选地，步骤S2的溶液氧化法为：将热处理后的PET纤维材料浸泡在多巴胺溶液中，待溶剂挥发后，使黏附在PET材料上的多巴胺在弱碱环境下发生氧化作用自聚成聚多巴胺颗粒。
进一步地，步骤S2的溶液氧化法具体为：将热处理后的PET纤维材料浸泡在4-6mg/mL的多巴胺溶液中，缓慢振荡2-4h，待溶剂挥发后，加入pH＝8-9的Tris溶液浸没PET，避光处理7-9h后用水清洗即可。
具体地，步骤S2的溶液氧化法具体为：将热处理后的PET纤维材料浸泡在5mg/mL的多巴胺溶液中，缓慢振荡3h，待溶剂挥发后，加入pH＝8.8的Tris溶液浸没PET，避光处理8h后用水清洗即可。
具体地，多巴胺溶液的溶剂为75％乙醇溶液。
优选地，步骤S3中固定明胶大分子的方法为：将步骤S2的PET纤维材料浸泡在由明胶溶液和京尼平溶液组成的混合溶液中，35-40℃下水浴处理25-35min，期间震荡多次，随后在35-40℃下静置处理10-15h。
具体地，步骤S3中固定明胶大分子的方法为：将步骤S2的PET纤维材料浸泡在由明胶溶液和京尼平溶液组成的混合溶液中，37℃下水浴处理30min，每5分钟震荡1次，随后在37℃下静置处理12h。
优选地，所述明胶在明胶溶液中的质量浓度为8-12％，所述京尼平在京尼平溶液中的质量浓度为0.5-2％，所述明胶溶液和京尼平溶液的混合体积比为1:1。
具体地，所述明胶在明胶溶液中的质量浓度为10％，所述京尼平在京尼平溶液中的质量浓度为0.1％。
本发明还提供了采用上述的方法制备得到的可耐高温灭菌的PET细胞载体。
本发明还提供了上述的可耐高温灭菌的PET细胞载体在细胞培养中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种可耐高温灭菌的PET细胞载体的制备方法，首先利用热处理工艺使PET结晶充分，再经溶液氧化法附着高吸附性的聚多巴胺颗粒，最后使用京尼平作为偶联剂固定明胶大分子后制备得到。所制备得到的PET细胞载体具备良好的热稳定性，可耐受常规高温高压灭菌且保持良好的机械性能和细胞相容性；同时，该载体具有疏松多孔结构，可为细胞提供三维的生长空间，可容纳大量细胞生长，纤维表面引入的生物活性官能团，可促进细胞黏附增殖及正常功能的表达，可为工程化细胞的大规模培养提供一种具有良好生物相容性的三维细胞负载材料，在各类常用的培养装置中均可使用，尤其适合在必须整体封装高温灭菌的大型生物反应器中，作为支持细胞生长的固定床填料使用；此外，本发明制备工艺简单，使用简单灵活，适用性广。
附图说明
图1为PET材料经过不同改性处理后SEM形貌图；
图1中，(A)PET；(B)PET-sterilization；(C)PET-thermal；(D)PET-thermal-sterilization；(E)PET-thermal-PDA；(F)PET-thermal-PDA-sterilization；(G)PET-thermal-PDA-Gel；(H)PET-thermal-PDA-Gel-sterilization。
图2为PET材料经过不同改性处理后的XPS分析结果；
图2中，(A)PET；(B)PET-thermal-PDA；(C)PET-thermal-PDA-sterilization；(D)PET-thermal-PDA-Gel；(E)PET-thermal-PDA-Gel-sterilization。
图3为PET材料经过不同改性处理后的傅里叶红外光谱图；
图3中，A为PET、PET-sterilization、PET-thermal和PET-thermal-sterilization的傅里叶红外光谱图；B为PET-thermal-PDA、PET-thermal-PDA-sterilization、PET-thermal-PDA-Gel和PET-thermal-PDA-Gel-sterilization的傅里叶红外光谱图。
图4为PET材料经过不同改性处理后的热失重曲线；
图4中，A为100-700℃的热失重曲线；A为100-400℃的热失重曲线。
图5为PET材料经过不同改性处理后的差示扫描量热曲线
图5中，A为第一次升温曲线；B为第一次降温曲线。
图6为PET材料经过不同改性处理后的XRD衍射图谱；
图7为PET材料经过不同改性处理后的应力应变曲线图；
图8为PET材料经过不同改性处理后的溶胀曲线；
图9为MTT测量实施例1的PET细胞载体浸提液对细胞毒性的吸光值；
图10为hUC-MSCs分别种植在TCPS(A、D)、PET-thermal-PDA-sterilization(B、E)、PET-thermal-PDA-Gel-sterilization(C、F)三组材料上的细胞FDA染色照片(A,B,C表示第七天；D,E,F表示第14天)；
图11为hUC-MSCs分别种植在玻璃底细胞培养皿(A、D)、PET-thermal-PDA-sterilization(B、E)、PET-thermal-PDA-Gel-sterilization(C、F)三组材料上细胞肌动蛋白丝和细胞核(A、D图中的椭圆形圆点)结构的染色图(A,B,C表示第七天；D,E,F表示第14天)；
图12为hUC-MSCs在PET-thermal-PDA-sterilization(A、C)，PET-thermal-PDA-Gel-sterilization(B、D)载体上培养第7、14天的细胞电镜图(A,B为第7天；C,D为第14天)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
实施例1对PET材料进行表面改性制备可用于生物反应器高温高压灭菌的细胞负载材料(PET-热处理-PDA-灭菌，PET-thermal-PDA-Gel)
利用溶液氧化法制备表面附着高吸附性聚多巴胺颗粒的聚对苯二甲酸已二酯(PET)纤维材料，再经过京尼平的偶联作用将明胶大分子固定在PET材料表面制备得到细胞载体材料，其制备过程包括：
(1)对PET海绵材料进行热处理：将PET海绵片状材料放置在蓝口瓶中，通氩气排走瓶内的空气，防止加热过程中PET材料被氧化，随后置于140℃油浴下加热(DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器)处理3h，自然冷却后再进行后续的改性处理。
(2)利用溶液氧化法制备表面附着聚多巴胺颗粒的PET纤维材料：配置浓度为5mg/mL的多巴胺溶液(溶剂为75％乙醇溶液)，将PET块状纤维材料放置在离心管中后加入多巴胺溶液至浸没材料，缓慢震荡3h，使多巴胺分子均匀的分布在PET材料表面。随后将材料转移至干净的培养皿中，待酒精挥发完毕后，加入足量PH＝8.8的Tris溶液至浸没材料，避光处理8h，上述操作均在超净台中进行，制备得到表面附着聚多巴胺颗粒的PET纤维材料。
(3)明胶和京尼平溶液的配制：取25mL蓝口瓶，称量500mg明胶溶于5mL去离子水中，拧紧瓶口，置于800W微波炉中加热3次，每次15s，直至明胶沸腾溶解，并转移至37℃水浴锅中备用；避光称量50mg京尼平溶于5mL去离子水中，充分溶解后将京尼平溶液用0.22μm的滤器过滤，然后加入到装有明胶溶液的蓝口瓶中，充分混合，制备得到明胶和京尼平的混合溶液(混合体积比1：1)。
(4)将明胶大分子固定在PET材料表面：将步骤(2)中表面吸附有聚多巴胺颗粒的PET纤维材料转移至新的培养皿中，用去离子水清洗干净(用去离子水清洗3遍)后，去除未反应的多巴胺；随后将PET纤维材料浸泡在明胶和京尼平的混合溶液中，37℃水浴处理30min，每5分钟震荡1次(频率为3-5Hz)，随后转移至37℃培养箱(无CO2)中静置处理12h。
(5)后处理：培养箱中过夜处理(12h)的PET纤维材料，可发现表面镀有一层蓝色的明胶涂层，用去离子水浸泡清洗，去除未完全反应的明胶或京尼平，清洗3次后转移至烘箱中以60℃处理4h，待凝胶涂层干燥后，将材料取出，制备得到细胞负载材料(PET-thermal-PDA-Gel)。
实施例2对细胞负载材料进行高温高压灭菌处理(PET-thermal-PDA-Gel-sterilization)
将实施例1制备得到的细胞负载材料置于高温高压灭菌锅(型号：BBS-H1100，品牌：BIOBASE)进行高温高压灭菌处理(120℃，30min)。
对比例1PET(PET)
直接购买的商业PET海绵材料。
对比例2PET-灭菌(PET-sterilization)
对PET海绵材料进行高温高压灭菌处理，高温高压灭菌处理的方法同实施例2。
对比例3PET-热处理(PET-thermal)
对PET海绵材料进行热处理，热处理的方法同实施例1的步骤(1)。
对比例4PET-热处理-灭菌(PET-thermal-sterilization)
对PET海绵材料进行热处理和高温高压灭菌处理，热处理的方法同实施例1的步骤(1)，高温高压灭菌处理同实施例2。
对比例5PET-热处理-PDA(PET-thermal-PDA)
对PET海绵材料进行热处理后利用溶液氧化法制备在其表面附着聚多巴胺颗粒，热处理的方法同实施例1的步骤(1)，附着聚多巴胺颗粒的方法同实施例1的步骤(2)。
对比例6PET-热处理-PDA-灭菌(PET-thermal-PDA-sterilization)
对PET海绵材料进行热处理后利用溶液氧化法制备在其表面附着聚多巴胺颗粒，最后进行高温高压灭菌处理，热处理的方法同实施例1的步骤(1)，附着聚多巴胺颗粒的方法同实施例1的步骤(2)，高温高压灭菌处理同实施例2。
实验例1扫描电镜分析
对实施例1(PET-thermal-PDA-Gel)、实施例2(PET-thermal-PDA-Gel-sterilization)、对比例1(PET)、对比例2(PET-sterilization)、对比例3(PET-thermal)、对比例4(PET-thermal-sterilization)、对比例5(PET-thermal-PDA)和对比例6(PET-thermal-PDA-sterilization)的PET材料进行扫描电镜观察，其SEM形貌分析如图1所示，其中A为对比例1，为多孔纤维结构；B为对比例2，纤维的形貌未发生明显变化；C为对比例3，可以发现纤维出现较多的节点现象，推测是纤维内部出现了不同尺寸的晶粒导致；D为对比例4，PET纤维形貌没有发生明显变化；E图为对比例5，聚多巴胺是以颗粒的形式黏附在纤维表面，并且在高温高压灭菌后未发生明显变化(F-对比例6)，表明聚多巴胺颗粒具有一定的耐热性；G图为实施例1，原本多孔的纤维结构被涂敷了一层明胶大分子涂层，在高温高压灭菌后，明胶涂层结构未发生明胶变化(H-实施例2)，表明制备得到的细胞负载材料较好的耐热性和稳定性。
实验例2X射线光电子能谱扫描和傅里叶红外光谱扫描分析
分别对实施例1(PET-thermal-PDA-Gel)、实施例2(PET-thermal-PDA-Gel-sterilization)、对比例1(PET)，对比例5(PET-thermal-PDA)，对比例6(PET-thermal-PDA-sterilization)的PET材料进行X射线光电子能谱(XPS)扫描，分析经过不同改性处理后PET材料表面的元素成分及对应的元素含量。采用X-射线光电子能谱在0-1350eV的结合能之间对样品进行扫描，分析样品中的元素(C,N,O)及含量。
同时，采用傅里叶变换红外光谱分析仪分析(FTIR，4000-400cm-1)分别对实施例1(PET-thermal-PDA-Gel)、实施例2(PET-thermal-PDA-Gel-sterilization)、对比例1(PET)、对比例2(PET-sterilization)、对比例3(PET-thermal)、对比例4(PET-thermal-sterilization)、对比例5(PET-thermal-PDA)和对比例6(PET-thermal-PDA-sterilization)的PET材料进行傅里叶红外光谱扫描，分析相关化学键。测量过程中要注意保持样品的干燥，不要引入水分子制备的纤维细胞负责材料。
XPS检测结果如图2所示，PET在接枝聚多巴胺后，表面的N元素分布增加，并且在接枝明胶后，N元素含量进一步提升约15％(表1)，表明聚多巴胺和明胶的成功接枝；接枝聚多巴胺和明胶的PET材料，在高温高压灭菌后表面元素都有一定的损失，推测是高温高压过程使部分聚多巴胺颗粒和明胶部分分解。
相关化学键的分析结果如图3所示，图中显示：PET曲线中，721cm-1处的峰是对位取代苯环上的氢引起的振动；1000cm-1附件的峰主要是C-O伸缩引起的振动，1740cm-1的峰是由C＝O伸缩振动引起的；从图中还可以发现，PET在经过高温高压灭菌以及热处理前后，红外光谱图未发生明显变化，表明热处理和高温高压处理并没有破坏材料；PET在接枝聚多巴胺后，3000-3500cm-1处出现宽的强峰，主要是O-H和N-H键的振动引起的，表面聚多巴胺的成功接枝；并且该峰在高温高压灭菌后仍然存在，表明改性物聚多巴胺的耐热性和稳定性。如PET-thermal-PDA-Gel曲线所示，可明显看到明胶的特征峰；3282cm-1处的酰胺峰主要与N-H的伸缩振动有关，1630cm-1处的酰胺Ⅰ带是C＝O的伸缩振动引起的；1531cm-1处的酰胺Ⅱ带吸收峰是由于N-H弯曲振动和C-N伸缩振动的耦合引起的；1241cm-1处的酰胺III带吸收峰是来自于酰胺键的C-N伸缩振动和N-H的弯曲振动；且在经过高温高压灭菌处理后，主要峰位未发生明显变化，表明高温高压灭菌并没有显著破坏PET载体的分子结构。
表1不同改性处理的PET材料表面元素含量的光电子能谱分析结果
Figure BDA0003079549460000071
实验例3热失重分析
分别对实施例1(PET-thermal-PDA-Gel)、实施例2(PET-thermal-PDA-Gel-sterilization)、对比例1(PET)、对比例2(PET-sterilization)、对比例3(PET-thermal)、对比例4(PET-thermal-sterilization)、对比例5(PET-thermal-PDA)和对比例6(PET-thermal-PDA-sterilization)的PET材料进行热失重检测。测量方法如下：分别取各组样品5-10mg，测试条件为：从30℃以10℃/min升温至800℃，保护气体为N2，通气速率为40mL/min。
测量结果如图4所示，PET未处理时，其失重主要是高分子链的断裂过程，热处理和热处理灭菌后并没有影响PET材料的分解温度，失重趋势没有明显变化；PET在接枝聚多巴胺和明胶后，100℃之前主要是样品由于潮汐所含的水分，100℃-200℃主要是分子间脱水，高分子链的分解温度未发生明显变化，由于常规高温高压灭菌的温度在120℃左右，因此高温高压灭菌过程不影响材料的热稳定性。
实验例4差示扫描量热检测分析
分别对实施例1(PET-thermal-PDA-Gel)、实施例2(PET-thermal-PDA-Gel-sterilization)、对比例1(PET)、对比例2(PET-sterilization)、对比例3(PET-thermal)、对比例4(PET-thermal-sterilization)、对比例5(PET-thermal-PDA)和对比例6(PET-thermal-PDA-sterilization)的PET材料进行差示扫描量热检测。检测方法如下：取PET各组材料，每组大约5-10mg，放置在样品盘中，以10℃/min的升温速度从室温升温至280℃，再以10℃/min的降温速度降至室温；第二次又以10℃/min升温至280℃，以N2作为保护气，速率为50mL/min。
检测结果图5所示，各组曲线在第一次升温过程中，均未出现结晶峰，表明PET材料本身具有较高的结晶，热处理可能使材料的晶区和非晶区发生了融合，结晶更加完善，在热力学上没有表现出明显的变化，双熔融峰的出现可能是纤维内部出现不同晶粒尺寸的晶体所导致的。
实验例5X-粉末衍射检测(XRD)
为分析高温高压灭菌过程以及热处理对PET纤维材料性能的影响，对对比例1(PET)、对比例2(PET-sterilization)、对比例3(PET-thermal)和对比例4(PET-thermal-sterilization)进行X-粉末衍射检测。检测方法如下：使用X射线粉末衍射仪对样品进行测试，以2θ的衍射角在10°至40°范围内扫描PET样品，扫描速率为2°/min，测试电压为40kV，电流为30mA，入射光波长为0.154nm，整个测试过程在室温条件下操作。
检测结构如图6所示，在2θ从17-30°范围内出现了三个主要的衍射峰，分布于PET的(010)、(110)、(100)三个晶面。从中可以看出，PET材料经过不同处理方式后，各晶面衍射峰的位置没有发生明显的变化，这表明PET材料的晶型没有发生改变，体现了较好的热稳定性。如表2所示，在经过高温高压灭菌后，PET材料
Figure BDA0003079549460000092
和(100)的晶粒尺寸有所增加，(010)晶面对应的晶粒尺寸减小，且小于其他两个晶面晶粒的尺寸，纤维内出现了晶粒尺寸不同的晶体。
表2不同改性处理的PET材料的衍射峰位置(2θ)、半峰宽(FWHM)和晶粒尺寸(crystallite size)
Figure BDA0003079549460000091
实验例6力学拉伸检测
分别对实施例1(PET-thermal-PDA-Gel)、实施例2(PET-thermal-PDA-Gel-sterilization)、对比例1(PET)、对比例2(PET-sterilization)、对比例3(PET-thermal)、对比例4(PET-thermal-sterilization)、对比例5(PET-thermal-PDA)和对比例6(PET-thermal-PDA-sterilization)的PET材料进行力学拉伸检测。检测方法如下：使用万能材料试验机对标准样品进行拉伸测试，记录初始长度、材料的宽和厚，设置拉伸速率为20mm/min进行拉伸。
检测结果如图7及表3所示，与未处理PET相比，干态情况下，PET-热处理使材料的杨氏模量和抗拉强度都得到提升，并在高温高压灭菌后提升，这是因为在热处理和高温高压灭菌过程中，高温使PET纤维内晶区和非晶区发生了融合，晶区更加完善，导致了强度的提升和较好的热稳定性。在表面接枝了明胶大分子后，PET的力学性能得到进一步提升，高温高压灭菌后，性能又得到增强，这是因为高温高压过程中，明胶中的蛋白分子发生了热交联，增强了其力学特征。总之，通过热处理工艺以及明胶改性获得的PET-Gel细胞载体具备良好的机械性能。
表3室温下不同改性处理的PET的力学性能
Figure BDA0003079549460000101
实验例7溶胀性能检测
对实施例1(PET-thermal-PDA-Gel)、实施例2(PET-thermal-PDA-Gel-sterilization)、对比例1(PET)、对比例5(PET-thermal-PDA)和对比例6(PET-thermal-PDA-sterilization)的PET材料进行溶胀性能检测。
测量方法如下：将各组材料做成24孔板大小，每组3个平行样，事先在37℃烘箱中预处理8h，然后转移至15mL离心管(事先称重)中，称重，记录初始重量W0，经PBS浸没后放置在六孔板中，并加入5mL PBS，接着放置在37℃水浴锅中，分别在3、6、12、24、36、…、336h后取出，用滤纸吸干水分，记录重量Wt；称重后放回24孔板中，换上新的PBS至浸没材料，最后按照以下公式计算溶胀率：
Figure BDA0003079549460000102
检测结果如图8所示，PET、PET-PDA、PET-PDA-灭菌三组材料的吸水溶胀性能无明显差异，在72h后基本达到溶胀平衡。经过明胶改性后，PET材料的吸水特性得到较大提升，约为PET未处理材料的13倍，并且在72h基本达溶胀平衡。同时PET接枝明胶并高温高压灭菌后，材料的吸水溶胀性能下降，可能是高温高压灭菌导致部分明胶分解以及部分蛋白发生热交联，但是材料的溶胀较为稳定，在24h内达到溶胀平衡。总之，经过明胶改性后，此细胞载体可用于细胞长期培养且明胶不发生降解。
实验例8细胞毒性检测
对实施例1的PET材料(PET-thermal-PDA-Gel)进行细胞毒性检测：称取0.5g材料经高温高压灭菌后转移至洁净的离心管中，加入5mL完全培养基浸泡，37℃培养箱中放置72h，随后用0.22mm的滤器过滤；实验分三组：A，正常完全培养基组；B，PET浸提液组；C，正常完全培养基：PET浸提液＝1：1组。
(1)取指数生长期的3T3细胞(购自湖南谱诺赛生物科技有限公司)，以6000cells/cm2的量接种在24孔板中，每组4个平行样，培养箱孵育24h，并记录细胞的状态，确保细胞生长状态大致相同。
(2)24h后，加入对应的培养基500mL，继续在培养箱中孵育24h。
(3)24h后，用显微镜记录每组细胞的状态，移除孔中的培养基，PBS清洗一遍，加入500mL正常完全培养基和50mL MTT溶液(使用时需过滤)，37℃避光孵育2h。
(4)避光移除含MTT的培养液，加入500mL的DMSO，轻微摇晃均匀约10min，吸取100mL转移至96孔板中，酶标仪570nm处测其吸光度。
测量结果如图9所示，可以明显看出经过多巴胺和明胶改性的PET材料没有细胞毒性，安全性很好。并且在接枝明胶后，溶液的吸光值比正常培养基还要大，表明此PET细胞载体不仅没有细胞毒性，还会析出有利于细胞生长的因子。
实验例9检测hUC-MSCs(人脐带间充质干细胞)在PET细胞载体表面的增殖和黏附效果
检测方法如下：
(1)FDA荧染色：PET材料经过热处理及聚多巴胺和明胶改性后【实施例2(PET-thermal-PDA-Gel-sterilization)记为PET-Gel组、对比例6(PET-thermal-PDA-sterilization)记为PET-PDA组】，制成24孔板大小形状，高温高压灭菌后接种hUC-MSCs(购自广州泰勒生物科技有限公司)，以10万细胞/每孔进行高密度种植(以24孔细胞培养板为对照，记为TCPS，细胞以8000cells/cm2接种在孔板上)，在第七天进行荧光素二乙酸脂(FDA)染色：移走培养基，用PBS清洗两遍后，加入浓度为2mg/mL的FDA工作液，避光孵育5min，随后移走FDA溶液，用PBS润洗两遍后，倒置荧光显微镜蓝光(488nm激发)观察细胞形态。
(2)细胞骨架染色：分别取第7、14天的样品，用PBS润洗几遍后，用4％多聚甲醛固定，按照Actin Cytoskeleton and Focal Adgesion Staining Kit试剂盒【购自默克密理博公司(Merck millipore)】进行细胞骨架染色。
(3)细胞电镜；分别取第7、14天的样品，用PBS润洗几遍后，4％多聚甲醛固定24h，快速用去离子水清洗后，-20℃过夜，冷冻干燥，喷金处理，扫描电镜(SEM)拍照。
(4)测量结果如下：
FDA染色的结果如图10所示，14天培养过程中，TCPS组的细胞密度极高，几乎贴满整个孔板，细胞进入接触抑制期；而PET-PDA组，细胞沿着PET的纤维结构生长，细胞密度较低，这是因为聚多巴胺处理后，PET仍呈现多孔的纤维状，细胞接种时沿着孔隙掉落在底板上，造成了细胞的损失，因此细胞密度较低，积聚成团。而PET接枝明胶后(PET-Gel组)，由于在原本多孔的纤维表面涂敷了一层明胶涂层，细胞接种时直接落在材料表面，因此细胞沿着材料表面生长，具有很高的密度。说明耐热聚合物聚多巴胺和明胶改性后的PET可以很好的支持脐带间充质干细胞的增殖和黏附。
细胞骨架染色结果如图11所示，对照组可以清晰的看到细胞的骨架结构，相邻细胞通过胞间连丝相通。PET-PDA组可以看到肌动蛋白丝包裹在PET纤维表面，细胞间未实现紧密联系，这与FDA观察的活细胞分布现象一致，PET-Gel组肌动蛋白丝大量分泌，细胞间紧密联系，呈现出很好的拉伸状态，可见PET在接枝了明胶后，细胞在材料上的黏附和增殖情况良好，进行着较为旺盛的代谢活动，这与FDA染色结果保持一致。
细胞电镜照片如图12所示，在培养的第7天，可看出PET-PDA组(图A)细胞密度较低，仅沿着纤维表面铺展，这与FDA染色和细胞骨架染色的结果保持一致，还可看到在PET-PDA组细胞分泌的细胞外基质较少。而PET-Gel组几乎看不到单个的细胞形态，细胞夹杂着细胞外基质(ECM)成片的铺展在PET载体上，并且在第14天时密度更大，形成的片状“薄膜”几乎覆盖了整个载体。而PET-PDA组细胞仍沿着纤维的节点生长，密度较第7天有所提高，但ECM沉积仍不太明显。说明hUC-MSCs可在PET-Gel组上很好的黏附生长，且可大量分泌细胞外基质。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种可耐高温灭菌的PET细胞载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、在低氧或无氧环境下，将PET纤维材料油浴加热至130-150℃的结晶温度热处理2-4h，使其结晶充分；
S2、将热处理后的PET纤维材料浸泡在多巴胺溶液中，待溶剂挥发后，使黏附在PET材料上的多巴胺在弱碱环境下发生氧化作用自聚成聚多巴胺颗粒，使热处理后的PET纤维材料表面附着聚多巴胺颗粒，引入氨基反应位点；
S3、将步骤S2的PET纤维材料浸泡在由明胶溶液和京尼平溶液组成的混合溶液中，35-40℃下水浴处理25-35 min，期间震荡多次，随后在35-40℃下静置处理10-15 h，通过京尼平的偶联作用，将明胶大分子固定在步骤S2的PET纤维材料表面，制备得到PET细胞载体。
2.根据权利要求1所述的一种可耐高温灭菌的PET细胞载体的制备方法，其特征在于，步骤S2具体为：将热处理后的PET纤维材料浸泡在4-6 mg/mL的多巴胺溶液中，缓慢振荡2-4h，待溶剂挥发后，加入pH=8-9的Tris溶液浸没PET，避光处理7-9 h后用水清洗即可。
3.根据权利要求2所述的一种可耐高温灭菌的PET细胞载体的制备方法，其特征在于，步骤S2具体为：将热处理后的PET纤维材料浸泡在5 mg/mL的多巴胺溶液中，缓慢振荡3 h，待溶剂挥发后，加入pH=8.8的Tris溶液浸没PET，避光处理8 h后用水清洗即可。
4.根据权利要求1所述的一种可耐高温灭菌的PET细胞载体的制备方法，其特征在于，步骤S3具体为：将步骤S2的PET纤维材料浸泡在由明胶溶液和京尼平溶液组成的混合溶液中，37℃下水浴处理30 min，每5分钟震荡1次，随后在37℃下静置处理12 h。
5.根据权利要求4所述的一种可耐高温灭菌的PET细胞载体的制备方法，其特征在于，所述明胶在明胶溶液中的质量浓度为8-12%，所述京尼平在京尼平溶液中的质量浓度为0.5-2%，所述明胶溶液和京尼平溶液的混合体积比为1:1。
6.采用权利要求1-5任一项所述的方法制备得到的可耐高温灭菌的PET细胞载体。
7.权利要求6所述的可耐高温灭菌的PET细胞载体在细胞培养中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108588006A (zh) * 2018-05-10 2018-09-28 华东理工大学 一种用于肝细胞三维培养的生物支架及其制备方法和应用
CN113621169B (zh) * 2021-08-12 2022-10-28 中山大学 一种聚对苯二甲酸乙二醇酯-肺组织脱细胞外基质复合材料的制备方法及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101415815A (zh) * 2006-04-04 2009-04-22 3M创新有限公司 用于细胞生长的片状微纤维化制品
CN101956318A (zh) * 2010-09-26 2011-01-26 中国人民解放军第四军医大学 在聚酯纤维表面化学接枝并稳定涂层生物大分子的方法
CN102108130A (zh) * 2011-02-14 2011-06-29 东南大学 疏水性医用高分子材料的表面生物功能化方法
CN106567252A (zh) * 2016-10-19 2017-04-19 南方医科大学珠江医院 纤维载体及其制备方法和应用
KR101815771B1 (ko) * 2016-07-07 2018-01-05 연세대학교 산학협력단 줄기세포 증식 또는 분화용 지지체 및 이의 제조방법
CN109196152A (zh) * 2016-06-13 2019-01-11 阿莫绿色技术有限公司 细胞培养支架用纱线及包含其的织物
CN111840640A (zh) * 2020-06-22 2020-10-30 嘉兴市爵拓科技有限公司 可降解复合纳米纤维三维材料及其在组织修复中的用途

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101415815A (zh) * 2006-04-04 2009-04-22 3M创新有限公司 用于细胞生长的片状微纤维化制品
CN101956318A (zh) * 2010-09-26 2011-01-26 中国人民解放军第四军医大学 在聚酯纤维表面化学接枝并稳定涂层生物大分子的方法
CN102108130A (zh) * 2011-02-14 2011-06-29 东南大学 疏水性医用高分子材料的表面生物功能化方法
CN109196152A (zh) * 2016-06-13 2019-01-11 阿莫绿色技术有限公司 细胞培养支架用纱线及包含其的织物
KR101815771B1 (ko) * 2016-07-07 2018-01-05 연세대학교 산학협력단 줄기세포 증식 또는 분화용 지지체 및 이의 제조방법
CN106567252A (zh) * 2016-10-19 2017-04-19 南方医科大学珠江医院 纤维载体及其制备方法和应用
CN111840640A (zh) * 2020-06-22 2020-10-30 嘉兴市爵拓科技有限公司 可降解复合纳米纤维三维材料及其在组织修复中的用途

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