CN108118023B - 纤维支架及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种纤维支架，并且提供了该纤维支架的制备方法及其在动物细胞培养中的应用，该纤维支架包括聚合物纤维和覆盖在所述聚合物纤维表面的正电荷修饰层；所述聚合物纤维的直径为10～60μm，表面正电荷浓度为0.2～0.3mmol/g。本发明提供的纤维支架具有更大的空隙，纤维支架机械强度高，性能稳定可重复利用，具有完全亲水性，有利于细胞的培养生长。本发明提供的纤维支架制备方法步骤简单，适合于各种规模的生产。

Description

纤维支架及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种纤维支架及其制备方法和应用。
背景技术
目前，在大规模细胞培养的技术中，例如细胞培养，抗体、细胞因子以及病毒等生物制品的生产上，微载体都有广泛运用。得到广泛应用的原因在于它是一类无毒性、与细胞结合力好的物质，并且拥有较大的比表面积与比体积，细胞培养面积大，并且节省空间。
目前的微载体有丝素蛋白和壳聚糖大孔微载体，壳聚糖和明胶混合微载体等。然而球状微载体存在细胞仅能贴附表面、面积体积比小的问题，而多孔微载体虽然存在空隙从而有利于供细胞贴附，但其空隙容易被阻塞并进而影响氧气及物质交换。因此，同时具有比表面积大、细胞亲和力良好、物质交换效率高等优点的纤维支架型微载体可解决此类问题。纤维支架微载体由纤维丝成网状构成，空隙大，细胞贴附于纤维生长，便于细胞与细胞之间形成紧密连接、桥粒连接等连接结构，是一种可以实现细胞三维培养模式的微载体。
然而，目前对于纤维支架载体的研究较为稀少，主要的纤维支架为电纺丝类物质，主要运用在组织工程体内移植方面，而纯粹用于体外大规模细胞培养的则较为罕见。电纺丝类纤维支架其结构特点在于电纺丝为纳米级微细结构，空隙多，可供细胞贴附生长，但空隙小，细胞成片贴附后极易阻塞相关空隙，使得物质交换严重受限，此外其机械强度较低，经过酸碱、高温等处理后容易变形变性，不利于重复利用，并且其具有很强的憎水性，容易漂浮于培养基的表面上，不利于细胞与培养基接触。
发明内容
基于此，有必要针对存在空隙小、不耐酸碱高温和憎水性等问题的纤维支架，提供一种纤维支架及其制备方法和应用。
为实现该目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种纤维支架，其包括聚合物纤维和覆盖在所述聚合物纤维表面的正电荷修饰层；所述聚合物纤维的直径为10～60μm，表面正电荷浓度为0.2～0.3mmol/g。
在其中一个实施例中，所述正电荷修饰层为带正电荷的赖氨酸层。
在其中一个实施例中，所述纤维支架为由聚合物纤维交织形成的片状结构或布状结构。
在其中一个实施例中，所述聚合物纤维由碳酸聚酯、聚丙烯或聚酰胺中的至少一种形成。
进一步的，所述纤维支架的原料的纯度为医用级。
本发明提供了一种制备如上所述的纤维支架的制备方法，其包括以下步骤：由聚合物纤维交织形成片状结构或布状结构的纤维片；将纤维片进行清洗并干燥；对干燥后的所述纤维片进行修饰前活化处理，得到活化纤维片；对所述活化纤维片制备贴附修饰层；对所述贴附修饰层进行阴离子交换，得到所述纤维支架。
进一步地，将纤维片进行清洗并干燥的步骤中还包括用20％～30％的过氧化氢对所述纤维片进行浸泡的工序。
在其中一个实施例中，对干燥后的所述纤维片进行修饰前活化处理的步骤包括：将所述纤维片进行清洗并干燥后加入浓度为2～10mmol/g的活化剂中，活化处理8～24小时后取出纤维片清洗并干燥，得到活化纤维片。
在其中一个实施例中，所述活化剂为至少含有6个碳原子的含环氧基团的长链活化剂。
进一步的，所述长链活化剂选自1,4-丁二醇二缩水甘油醚、双环氧化丁二烯、正丁基缩水甘油醚或烯丙基缩水甘油醚中的至少一种。
在其中一个实施例中，对活化纤维片制备贴附修饰层的步骤包括：将赖氨酸溶解于0.1～1.5mol/L的强碱溶液中，配制成质量分数为0.1％～1％赖氨酸碱溶液，将活化纤维片加入所述赖氨酸碱溶液中反应12～24小时，反应温度35～60℃，反应后清洗干燥，得到具备贴附修饰层的纤维片。
进一步的，所述对活化纤维片制备贴附修饰层的步骤还包括：将所述具备贴附修饰层的纤维片加入到交联剂和缓冲液中反应，反应后清洗干燥。
进一步的，所述交联剂选自二异氰酸酯、京尼平、丁二醛、碳化二亚胺或二异氰酸酯中的至少一种；所述缓冲液选自PBS缓冲液或Tris缓冲液。
进一步的，所述步骤中的反应温度为35～55℃中的任一取值，反应时间为4～5小时中的任一取值。
在其中一个实施例中，对所述贴附修饰层进行阴离子交换的步骤包括：将对活化纤维片制备贴附修饰层后得到的纤维片加入碱液中碱化处理；再加入二乙氨乙基和硼氢化钠反应，其中二乙氨乙基的质量分数为25～35％，硼氢化钠的质量分数为2～7％，反应后水洗干燥即得纤维载体。
进一步的，所述碱化处理温度为30～70℃，时间为0.5～2小时；所述再加入二乙氨乙基和硼氢化钠反应的反应温度为55～65℃，反应时间为4～8小时。
在其中一个实施例中，对所述纤维片进行清洗用的液体为双蒸水或超纯水；清洗方式为超声波清洗。
在其中一个实施例中，所述干燥的方式为用氮气吹干。
在其中一个实施例中，所述对所述贴附修饰层进行阴离子交换的步骤之后还包括：将所述纤维支架用强酸洗涤，在110～130℃环境中处理20～60min。
进一步的，所述强酸选自盐酸或醋酸。
本发明还提供了一种动物细胞培养方法，采用生物反应器进行动物细胞的培养，所述生物反应器采用如上述所述的纤维支架。
进一步地，采用生物反应器进行动物细胞的培养，所述生物反应器采用的纤维支架通过如上述所述的纤维支架制备方法制备得到。
与现有技术相比，本发明具备如下优点：
本发明提供的纤维支架采用聚合物纤维形成片状或布片状，具有更大空隙，使得细胞生长不会轻易受到阻塞，且纤维直径较电纺丝大，因此更接近上皮细胞生理状态，同时赖氨酸为细胞外基质类似物，可增加细胞贴附能力。此外还有机械强度高，耐高温和在强酸处理中处理时稳定性好等特点，因此可重复利用。再者，该纤维支架完全亲水，不会在培养基中漂浮，有利于保证对细胞提供充分的营养物质供应。本发明提供的制备方法步骤简单，对仪器设备要求不高，适合于各种规模的生产。
附图说明
图1为本发明的纤维支架制备方法流程图；
图2为本发明另一实施例的纤维支架制备方法流程图；
图3为本发明的纤维片X射线光电子能谱分析(XPS，下同)分析图谱(横坐标为电子结合能，纵坐标表示光电子的测量强度，下同)；
图4为具有贴附修饰层的纤维片的XPS分析图谱；
图5为纤维支架与水的接触角图；
图6为纤维片的扫描电镜测试(SEM，下同)图；
图7为纤维支架的SEM图；
图8为纤维支架的局部放大SEM图；
图9为纤维支架经强酸和高温高压处理后的SEM图；
图10为纤维支架经强酸和高温高压处理后的局部放大SEM图；
图11为在纤维支架中C3A细胞培养第7天SEM图；
图12为在纤维支架中原代猪肝细胞培养第7天细胞活死染色荧光激光共聚焦图；
图13为在纤维支架中原代猪肝细胞培养第7天SEM图。
具体实施方式
下面结合附图和示例性实施例对本发明作进一步地阐述。
一实施方式的纤维支架，由聚合物纤维交织形成，并且在其表面覆盖有正电荷修饰层，该正电荷修饰层为带正电荷的赖氨酸层，所用到的聚合物纤维的纤维直径为10～60μm，表面正电荷浓度为0.2～0.3mmol/g。10～60μm的纤维直径较一般电纺丝大，因此能够更加接近上皮细胞生理状态，有利于上皮细胞的生长。氨基酸表面普遍带有负电荷，而在聚合物纤维表面上对赖氨酸进行了正电荷修饰，使其存在一定的正电荷浓度，能够有效改善纤维支架的亲水性，使其变得完全亲水，进而使得纤维支架不会在培养基中漂浮，有利于保证对细胞提供充分的营养物质供应。优选表面正电荷浓度为0.2254mmol/g。
优选的，原材料聚合物纤维形成的纤维支架可以选择具备特定形状，以便于纤维支架的制备以及后期的应用，因此聚合物纤维交织形成片状结构或布状结构。优选的，从材质上选择，聚合物纤维选自碳酸聚酯、聚丙烯或聚酰胺中的至少一种，而且其纯度最好为医用级。
如图1所示，纤维支架的制备方法包括：
S100：由聚合物纤维交织形成片状结构或布状结构的纤维片
S200：将纤维片进行清洗并干燥。
优选的，清洗用水采用双蒸水甚至是超纯水，清洗方式可采用超声波清洗，清洗时间为15～35分钟。干燥方式可采用在60～80℃的烘箱或者类似环境中进行。
优选的，在步骤S100中还包括用20～30％的过氧化氢对所述纤维片进行浸泡的工序。过氧化氢溶液浓度优选为20％～30％，可以在温度为65～80℃时浸泡时间为3～6小时。
S300：对干燥后的纤维片进行修饰前活化处理，得到活化纤维片。
具体地，将纤维片加入浓度为2～10mmol/g的活化剂中，活化处理8～24小时后取出纤维支架水洗并干燥；所述活化剂为至少含有6个碳原子的含环氧基团的长链试剂。优选的，活化处理的温度在45～65℃。这样的温度范围有利于活化反应的充分和有效进行。优选的，活化剂为至少含有6个碳原子的含环氧基团的长链活化剂。进一步的，长链活化剂选自1,4-丁二醇二缩水甘油醚、双环氧化丁二烯、正丁基缩水甘油醚或烯丙基缩水甘油醚中的至少一种。
S400：对所述活化纤维片制备贴附修饰层。
具体地，将赖氨酸溶解于0.1～1.5mol/L的强碱溶液中，配制成质量分数为0.1％～1％的赖氨酸碱溶液，将步骤S300得到的活化纤维片加入所述赖氨酸碱溶液中反应12～24小时，反应温度35～60℃，反应后清洗干燥。优选的，强碱选自NaOH或KOH中的一种。
优选的，对活化纤维片制备贴附修饰层的步骤还包括将所述具备贴附修饰层的纤维片加入到交联剂和缓冲液中反应，反应后清洗干燥。其中交联剂选择自二异氰酸酯、京尼平、丁二醛、碳化二亚胺或二异氰酸酯中的至少一种，而缓冲液则选择PBS缓冲液或Tris缓冲液。PBS缓冲液是磷酸缓冲盐溶液的简称，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，一般有活性的生物制剂都要用它来稀释。而Tris缓冲液也是生物化学领域一种常见的缓冲液，有效缓冲范围在pH7.0到9.2之间，有很高的缓冲能力，在水中溶解度高，对很多酶反应是惰性的。进一步优选的，在交联剂和缓冲液中的反应温度为35～55℃中的任一值，反应时间为4～5小时中的任一值。
S500：对所述贴附修饰层进行阴离子交换，得到所述纤维支架。
具体地，将步骤S400得到的制备有贴附修饰层的纤维片加入碱液中碱化处理；再加入二乙氨乙基和硼氢化钠反应，其中二乙氨乙基的质量分数为25～35％，硼氢化钠的质量分数为2～7％，反应后清洗干燥即得纤维支架。
优选的，步骤S500中碱液为NaOH溶液或KOH溶液，所述碱液浓度为15％～25％(以质量分数计)。碱化处理温度为30～70℃，碱化处理时间为0.5～2小时。再加入二乙氨乙基和硼氢化钠反应的反应温度为55～65℃，反应时间为4～8小时。
优选的，如图2所示，纤维支架的制备方法还包括：
S600：将纤维支架用强酸洗涤，在110～130℃环境中处理20～60min。
该细胞培养用纤维支架经过强酸，如盐酸、硫酸、醋酸等洗涤之后，再放入110～130℃的高温环境中处理20～60分钟，其性质仍然稳定可靠，说明该细胞培养用纤维支架可以实现良好的反复利用性。
上述制备方法中，清洗干燥操作中可以使用双蒸水作为清洗介质，最好使用超纯水作为清洗介质，干燥操作可以采用氮气吹干的操作，另外可以使用超声清洗的方式加快清洗过程。
一种动物细胞的培养方法，具体为采用生物细胞培养常用的设备进行，在合适的生物反应器中进行动物细胞的培养，而生物反应器选择上述的纤维支架。其中生物反应器的制备方法就采取上述纤维支架制备方法制备得到。
以下为具体实施例。
实施例一
纤维支架及其制备
选用碳酸聚酯材质的聚合物纤维交织形成片状的纤维片，经过下面一系列处理：
清洗预处理：将纤维片加入超纯水中，采用超声波清洗20分钟后用氮气吹干，采用在65℃的体积百分数为25％的过氧化氢溶液中浸泡4小时，再次使用超纯水超声清洗30分钟，在75℃的干燥箱中干燥待用。
纤维片活化催化：将预处理得到的纤维片加入到浓度为5mmol/g的双环氧化丁二烯，正丁基缩水甘油醚混合物(双环氧化丁二烯与正丁基缩水甘油醚的摩尔比为1:1)，活化催化的温度为50℃，经过18小时后取出用超纯水超声清洗30分钟，再以氮气吹干，得到活化纤维片。
贴附修饰：将赖氨酸溶解于1mol/L的NaOH溶液中，配制成质量分数为0.5％的赖氨酸碱溶液中，将活化纤维片加入到赖氨酸碱溶液中反应15小时，反应温度为45℃，反应后用超纯水超声清洗30分钟，再用氮气吹干。将经过上述处理后得到的纤维片加入到丁二醛中，并加入PBS缓冲液搅拌反应，反应温度45℃，反应时间4.5小时，反应完毕后用超纯水超声清洗30分钟，再以氮气吹干，即得到具有贴附修饰层的纤维片。
正电荷修饰：对上述步骤制得的贴附修饰层进行阴离子交换，将具有贴附修饰层的纤维片加入到质量分数为20％的NaOH中进行碱化处理，反应温度50℃，反应时间1.5小时。再加入二乙氨乙基，质量分数为30％，再加入硼氢化钠，其质量分数为5％，反应时间6小时，反应温度60℃。反应完毕后用超纯水超声清洗30分钟，氮气吹干后即得到纤维支架。
将得到的纤维支架在质量分数为30％的盐酸中洗涤，之后再在120℃的干燥炉中干燥处理45min，制得纤维支架。
实施例二
纤维支架及其制备
选用聚丙烯材质的聚合物纤维交织形成片状的纤维片，经过下面一系列处理：
清洗预处理：将纤维片加入超纯水中，采用超声波清洗15分钟后用氮气吹干，采用在70℃的体积百分数为30％的过氧化氢溶液中浸泡3小时，再次使用超纯水超声清洗30分钟，在75℃的干燥箱中干燥待用。
纤维片活化催化：将预处理得到的纤维片加入到浓度为2mmol/g的双环氧化丁二烯，活化催化的温度为45℃，经过24小时后取出用超纯水超声清洗30分钟，再以氮气吹干，得到活化纤维片。
贴附修饰：将赖氨酸溶解于0.5mol/L的KOH溶液中，配制成质量分数为0.1％的赖氨酸碱溶液中，将活化纤维片加入到赖氨酸碱溶液中反应18小时，反应温度为50℃，反应后用超纯水超声清洗30分钟，再用氮气吹干。
将经过上述处理后得到的纤维片加入到二异氰酸酯中，并加入PBS缓冲液搅拌反应，反应温度35℃，反应时间5小时，反应完毕后用超纯水超声清洗30分钟，再以氮气吹干，即得到具有贴附修饰层的纤维片。
正电荷修饰：对上述步骤制得的贴附修饰层进行阴离子交换，将具有贴附修饰层的纤维片加入到质量分数为15％的KOH中进行碱化处理，反应温度65℃，反应时间0.5小时。再加入二乙氨乙基，质量分数为25％，再加入硼氢化钠，其质量分数为2％，反应温度65℃，反应时间8小时。反应完毕后用超纯水超声清洗30分钟，氮气吹干即得到纤维支架。
将得到的纤维支架在质量分数为38％的醋酸中洗涤，之后再在110℃的干燥炉中干燥处理60min，制得纤维支架。
实施例三
纤维支架及其制备
选用聚酰胺材质的聚合物纤维交织形成布片状的纤维片，经过下面一系列处理：
清洗预处理：将纤维片加入超纯水中，采用超声波清洗30分钟后用氮气吹干，采用在80℃的体积百分数为20％的过氧化氢溶液中浸泡3小时，再次使用超纯水超声清洗30分钟，在80℃的干燥箱中干燥待用。
纤维片活化催化：将预处理得到的纤维片加入到浓度为8mmol/g的烯丙基缩水甘油醚，活化催化的温度为65℃，经过12小时后取出用超纯水超声清洗30分钟，再以氮气吹干，得到活化纤维片。
贴附修饰：将赖氨酸溶解于1.5mol/L的NaOH溶液中，配制成质量分数为1％的赖氨酸碱溶液中，将活化纤维片加入到赖氨酸碱溶液中反应12小时，反应温度为35℃，反应后用超纯水超声清洗30分钟，再用氮气吹干。
将经过上述处理后得到的纤维片加入到溶解有1-10mmol京尼平的Tris缓冲溶液中搅拌反应，反应温度55℃，反应时间4小时，反应完毕后用超纯水超声清洗35分钟，再以氮气吹干，即得到具有贴附修饰层的纤维片。
正电荷修饰：对上述步骤制得的贴附修饰层进行阴离子交换，将具有贴附修饰层的纤维片加入到质量分数为25％的NaOH中进行碱化处理，反应温度35℃，反应时间1小时。再加入二乙氨乙基，质量分数为35％，再加入硼氢化钠，其质量分数为7％，反应温度55℃，反应时间4小时。反应完毕后用超纯水超声清洗35分钟，氮气吹干即得到纤维支架。
将得到的纤维支架在质量分数为65％的硫酸中洗涤，之后再在130℃的干燥炉中干燥处理20min，制得纤维支架。
实施例四
纤维支架及其制备
选用碳酸聚酯材质的聚合物纤维交织形成片状的纤维片，经过下面一系列处理：
清洗预处理：将纤维片加入超纯水中，采用超声波清洗25分钟后晾干，采用在65℃的体积百分数为25％的过氧化氢溶液中浸泡5小时，再次使用超纯水超声清洗30分钟，在60℃的干燥箱中干燥待用。
纤维片活化催化：将预处理得到的纤维片加入到浓度为4mmol/g的1,4-丁二醇二缩水甘油醚中，活化催化的温度为55℃，经过20小时后取出用超纯水超声清洗30分钟，再以氮气吹干，得到活化纤维片。
贴附修饰：将赖氨酸溶解于0.8mol/L的NaOH溶液中，配制成质量分数为0.8％的赖氨酸碱溶液中，将活化纤维片加入到赖氨酸碱溶液中反应18小时，反应温度为50℃，反应后用超纯水超声清洗30分钟，再用氮气吹干。
将经过上述处理后得到的纤维片加入到碳化二亚胺中，并加入PBS缓冲液搅拌反应，反应温度40℃，反应时间5小时，反应完毕后用超纯水超声清洗30分钟，再以氮气吹干，即得到具有贴附修饰层的纤维片。
正电荷修饰：对上述步骤制得的贴附修饰层进行阴离子交换，将具有贴附修饰层的纤维片加入到质量分数为18％的NaOH中进行碱化处理，反应温度40℃，反应时间1小时。再加入二乙氨乙基，质量分数为28％，再加入硼氢化钠，其质量分数为4％，反应时间5小时，反应温度60℃。反应完毕后用超纯水超声清洗30分钟，氮气吹干即得到细胞培养用纤维支架。
实施例五
将纤维片或纤维支架进行相关测试，并将其用于动物细胞培养试验，结果显示：
通过对纤维片或纤维支架进行X射线光电子能谱(XPS)分析、傅里叶红外(FTIR)分析、水接触角表征，分别得到如图3、图4和图5所示的纤维片XPS分析图谱、具有贴附修饰层的纤维片的XPS分析图谱和纤维支架与水的接触角图。将纤维支架在扫描电镜下观察，得到如图7～8的图像，对纤维支架经强酸和高温高压处理后再在扫描电镜下观察，得到如图9～10的图像。其中，图3显示测试材料各主要元素含量分别为：C(68.38％)、N(1.68％)、O(28.43％)，图4显示纤维支架上元素含量分别为C(61.89％)、N(14.47％)、O(20.04％)，可见N元素明显增加，证明赖氨酸成功交联在纤维片上。图5为水接触角实验图，接触角接近为0°，说明制备所得的纤维支架的亲水性良好。从图6可见，未经处理的纤维片各纤维交叉连接，构成多层网状结构，这种结构使得细胞能够通过纤维迁移生长，且网孔与网孔之间互相连通，内部的物质交换十分顺畅。而图7～10则反映出制备得到的纤维支架其结构并没有明显变化，仍然呈现各纤维交叉连接，构成多层网状结构，网孔之间可以相互连通，有利于细胞在其中的内部物质交换，而且经过强酸、高温、高压处理后，也未使纤维支架发生明显变化，说明其反复利用性能良好。
将本发明的纤维支架经高温高压灭菌后分别加入C3A细胞与原代猪肝细胞进行培养，2天更换一次培养液，持续观察细胞贴附、增殖等形态变化。图11所示的SEM图显示C3A细胞贴附良好，细胞间形成细胞连接。图12为用激光共聚焦显微镜观察的原代猪肝细胞培养第7天的情况，其中绿色代表存活细胞，红色代表死亡细胞，从图12的最右边对比情形可以看出存活细胞量占大多数，说明原代猪肝细胞生长状态好。图13为扫描电镜得到的原代肝细胞培养第7天的SEM图，从中可以看出细胞与纤维支架贴附良好，并且细胞连接紧密，细胞绒毛呈朵状、球状地三维聚集生长，显示出纤维支架十分有利于细胞的培养生长。
虽然上面已经示出了本发明的一些示例性实施例，但是本领域的技术人员将理解，在不脱离本发明的原理或精神的情况下，可以对这些示例性实施例做出改变，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (17)

1.一种纤维支架制备方法，其特征在于，所述纤维支架包括聚合物纤维和覆盖在所述聚合物纤维表面的正电荷修饰层；所述聚合物纤维的直径为10~60μm，表面正电荷浓度为0.2~0.3mmol/g，所述正电荷修饰层为带正电荷的赖氨酸层；
制备该纤维支架，其包括以下步骤：
由聚合物纤维交织形成片状结构或布状结构的纤维片；
将纤维片进行清洗并干燥；
对干燥后的所述纤维片进行修饰前活化处理，得到活化纤维片；
对所述活化纤维片制备贴附修饰层，将赖氨酸溶解于0.1~1.5mol/L的强碱溶液中，配制成质量分数为0.1%~1%赖氨酸碱溶液，将活化纤维片加入所述赖氨酸碱溶液中反应12~24小时，反应温度35~60°C，反应后清洗干燥，得到具备贴附修饰层的纤维片；
对所述贴附修饰层进行阴离子交换，得到所述纤维支架。
2.根据权利要求1所述的纤维支架制备方法，其特征在于，所述聚合物纤维由碳酸聚酯、聚丙烯或聚酰胺中的至少一种形成。
3.根据权利要求1所述的纤维支架制备方法，其特征在于，所述纤维支架的原料的纯度为医用级。
4.根据权利要求1所述的纤维支架制备方法，其特征在于，将纤维片进行清洗并干燥的步骤中还包括用20%～30%的过氧化氢对所述纤维片进行浸泡的工序。
5.根据权利要求1所述的纤维支架制备方法，其特征在于，对干燥后的所述纤维片进行修饰前活化处理的步骤包括：
将所述纤维片进行清洗并干燥后加入浓度为2~10mmol/g的活化剂中，活化处理8~24小时后取出纤维片清洗并干燥，得到活化纤维片。
6.根据权利要求5所述的纤维支架制备方法，其特征在于，所述活化剂为至少含有6个碳原子的含环氧基团的长链活化剂。
7.根据权利要求6所述的纤维支架制备方法，其特征在于，所述长链活化剂选自1,4-丁二醇二缩水甘油醚、双环氧化丁二烯、正丁基缩水甘油醚或烯丙基缩水甘油醚中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的纤维支架制备方法，其特征在于，对所述活化纤维片制备贴附修饰层的步骤还包括：将所述具备贴附修饰层的纤维片加入到交联剂和缓冲液中反应，反应后清洗干燥。
9.根据权利要求8所述的纤维支架制备方法，其特征在于，所述交联剂选自二异氰酸酯、京尼平、丁二醛、碳化二亚胺中的至少一种；所述缓冲液选自PBS缓冲液或Tris缓冲液。
10.根据权利要求9所述的纤维支架制备方法，其特征在于，所述步骤中的反应温度为35~55℃，反应时间为4~5小时。
11.根据权利要求1所述的纤维支架制备方法，其特征在于，对所述贴附修饰层进行阴离子交换的步骤包括：将对活化纤维片制备贴附修饰层后得到的纤维片加入碱液中碱化处理；再加入二乙氨乙基和硼氢化钠反应，其中二乙氨乙基的质量分数为25~35%，硼氢化钠的质量分数为2~7%，反应后水洗干燥即得纤维载体。
12.根据权利要求11所述的纤维支架制备方法，其特征在于，所述碱化处理温度为30~70℃，时间为0.5~2小时；所述再加入二乙氨乙基和硼氢化钠反应的反应温度为55~65℃，反应时间为4~8小时。
13.根据权利要求1~12任一所述的纤维支架制备方法，其特征在于，对所述纤维片进行清洗用的液体为双蒸水或超纯水；清洗方式为超声波清洗。
14.根据权利要求5~12任一所述的纤维支架制备方法，其特征在于，所述干燥的方式为用氮气吹干。
15.根据权利要求1所述的纤维支架制备方法，其特征在于，所述对所述贴附修饰层进行阴离子交换的步骤之后还包括:
将所述纤维支架用强酸洗涤，在110~130℃环境中处理20~60min。
16.根据权利要求15所述的纤维支架制备方法，其特征在于，所述强酸选自盐酸、硫酸。
17.一种动物细胞培养方法，其特征在于，采用生物反应器进行动物细胞的培养，所述生物反应器采用的纤维支架通过如权利要求1~16任意一项所述的纤维支架制备方法制备得到。
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